CN105695600A - 用于等温扩增的引物、其设计方法与应用 - Google Patents

用于等温扩增的引物、其设计方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于等温扩增的引物、其设计方法与应用，属于分子生物学领域。本发明的引物的设计方法包括以下步骤：根据靶序列设计常规引物；采用化学基团封闭常规引物的3’末端羟基；用四氢呋喃取代常规引物中部的一个核苷酸；本发明方法设计得到的引物可应用于等温扩增中。本发明的引物设计方法扩增大大提高了等温扩增的严谨性和特异性，增加了特异性产物的得率，可以扩大等温扩增技术的应用范围。

Description

用于等温扩增的引物、其设计方法与应用
技术领域
本发明涉及一种引物、其设计方法与应用，具体涉及一种用于等温扩增的引物、其设计方法与应用。
背景技术
等温扩增技术是继PCR技术后发展起来的一门新型的体外核酸扩增技术，主要有重组酶聚合酶扩增(RPA)、滚环核酸扩增(RCA)、环介导等温扩增(LAMP)、链替代扩增(SDA)、依赖核酸序列扩增(NASBA)等。由于具备高效、特异、无需特殊仪器等特点，等温扩增技术在很多应用领域有取代PCR的趋势。
不论PCR还是等温扩增，都面临一个非特异扩增的问题，即不论哪种用于扩增的DNA聚合酶，在常温下都是有活性的。当配制反应体系时，未和模板完全正确配对的引物亦可能引起少量非特异扩增，这些非特异性产物将会在后续的反应中被指数级扩增，大大增加反应的背景，出现非特异性产物并降低目标产物的得率。为此，PCR反应中往往利用热启动PCR来规避这类非特异性扩增，即PCR的聚合酶经过特殊抑制物处理，使其在常温下不具备活性，只有当第一次加热到90℃以上，破坏掉抑制物的抑制效果后，扩增反应才会发生。但等温扩增过程中没有90℃以上高温的过程，用于等温扩增的聚合酶也不具备耐高温的属性，所以无法将热启动这种简单的方法应用到等温扩增反应中，等温扩增急需更有效解决非特异性扩增的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于等温扩增的引物的设计方法，由该设计方法得到的引物能提高等温扩增的特异性。
与此相应，本发明还提供了采用上述设计方法得到的引物及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于等温扩增的引物的设计方法，其包括以下步骤：
根据靶序列设计常规引物；
采用化学基团封闭常规引物的3’末端羟基；
用四氢呋喃取代常规引物中部的一个核苷酸。
由于等温扩增反应所需的聚合酶在常温下就有活性，往往混合过程中扩增反应就开始了，导致反应背景较高，甚至有非特异性扩增出现。本发明通过封闭引物的3’末端羟基的方式，抑制扩增反应。同时，本发明在引物中间引入四氢呋喃位点，不影响引物和DNA模板的正常配对。当反应体系配制完成后，用大肠杆菌核酸内切酶IV切开四氢呋喃位点，形成自由的3’末端，即可开始扩增反应，从而提高了扩增反应的特异性和严谨性，并提高特异性DNA产物的得率。
作为本发明所述用于等温扩增的引物的设计方法的优选实施方式，所述方法还包括以下步骤：将所述常规引物位于四氢呋喃两侧的核苷酸上，分别标记荧光基团和猝灭基团。更优选地，所述荧光基团为FITC、FAM或Cy3；所述猝灭基团为DABCYL、BDH或TANRA。在常规引物位于四氢呋喃两侧的核苷酸上分别标记荧光基团和猝灭基团，可便于后续检测方法的选择。
作为本发明所述用于等温扩增的引物的设计方法的优选实施方式，所述化学基团为生物素。
另外，本发明还提供了一种采用上述方法设计得到的引物。
最后，本发明还提供了上述引物在等温扩增中的应用。
作为本发明所述引物在等温扩增中的应用的优选实施方式，所述应用包括以下步骤：
(1)提取样本RNA或DNA；
(2)配置含有所述引物的反应体系；
(3)混匀步骤(2)所配置的反应体系，加入核酸内切酶，进行等温扩增；
(4)检测等温扩增的产物。
作为本发明所述引物在等温扩增中的应用的更优选实施方式，所述步骤(3)中，核酸内切酶为大肠杆菌核酸内切酶IV。
作为本发明所述引物在等温扩增中的应用的优选实施方式，所述步骤(4)中，检测等温扩增的产物的方法为电泳法、试纸条法、比浊法或荧光定量法。
作为本发明所述引物在等温扩增中的应用的优选实施方式，所述引物用于重组酶聚合酶扩增、滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增或依赖核酸序列扩增中。
本发明的有益效果为：本发明通过封闭引物的3’末端羟基的方式，抑制扩增反应。同时，本发明在引物中间引入四氢呋喃位点，不影响引物和DNA模板的正常配对。当反应体系配制完成后，用大肠杆菌核酸内切酶IV切开四氢呋喃位点，形成自由的3’末端，即可开始扩增反应，从而提高了扩增反应的特异性和严谨性，并提高特异性DNA产物的得率。
本发明的引物设计方法增加了特异性产物的得率，可以扩大等温扩增技术的应用范围。
附图说明
图1为本发明所述引物在等温扩增中应用的工作原理图；
图2为应用实施例1设计得到的引物(6110B-f和6110B-r)和常规引物(实施例1中的6110A-f和6110A-r)RPA扩增检测结核分枝杆菌的结果图。
图2中，M表示DNAMarker，A表示实施例1设计得到的引物(6110B-f和6110B-r)RPA扩增后的DNA产物，B表示常规引物(实施例1中的6110A-f和6110A-r)RPA扩增后的DNA产物。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。
下述实施例是以RPA检测结核分枝杆菌为例，说明本发明的引物、其设计方法与应用。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明所述引物在等温扩增中应用的工作原理如图1所示。
实施例1：结核分枝杆菌RPA检测引物的设计方法
本实施例所述的结核分枝杆菌RPA检测引物的设计方法，其包括以下步骤：
(1)选择出能特异性地检测结核分枝杆菌的IS6110基因作为靶点，在该段靶序列上根据热力学特征和高级结构，设计RPA常规引物。上游引物6110A-f的碱基序列如SEQIDNO:1所示，下游引物6110A-r的碱基序列如SEQIDNO:2所示，具体为：
6110A-f：
5’-GATCCTGCGAGCGTAGGCGTCGGTGACAAAGGCCACGTAG-3’；
6110A-r：
5’-CTGATCCGGCCACAGCCCGTCCCGCCGATCTCGTCCAGC-3’；
(2)采用生物素封闭上述常规引物的3’末端羟基，并用四氢呋喃取代常规引物中部的一个核苷酸，得到结核分枝杆菌RPA检测引物，所得到的结核分枝杆菌RPA检测引物的序列如下：
6110B-f：
5’-GATCCTGCGAGCGTAGGCGTCGGTGACAA-(THF)-GGCCACGTAG-biotin-3’；
6110B-r：5’-CTGATCCGGCCACAGCCCGTCCCGCCGAT-(THF)-TCGTCCAGC-biotin-3’；
引物中的THF为四氢呋喃，biotin为3’末端羟基的封闭基团。
实施例2：实施例1设计得到的引物(6110B-f和6110B-r)在结核分枝杆菌RPA检测中的应用
将实施例1设计得到的引物(6110B-f和6110B-r)应用于结核分枝杆菌RPA检测中，具体步骤如下：
(1)取少量培养的结核分枝杆菌，提取DNA；
(2)按表1配置RPA反应体系：
(3)震荡混匀后，加入200ng/μl大肠杆菌核酸内切酶IV；
(4)震荡混匀后，37℃或42℃恒温反应20分钟；
(5)电泳检测扩增后的DNA产物。
表1
提取的结核分枝杆菌DNA 1μL
本发明引物(6110B-f和6110B-r) 各1μL
RPA反应buffer 5μL
重组酶T4uvsX/uvsY 130ng/μL，1μL
Bsu DNA聚合酶 30ng/μL，1μL
T4gp32 900ng/μL，1μL
ddH2O 补足至50μL
应用实施例1设计得到的引物(6110B-f和6110B-r)检测结核分枝杆菌RPA的结果如图2所示。
对比例1：常规引物(实施例1中的6110A-f和6110A-r)RPA扩增检测结核分枝杆菌检测
常规引物(实施例1中的6110A-f和6110A-r)RPA扩增检测结核分枝杆菌检测的具体步骤如下：
(1)取少量培养的结核分枝杆菌，按标准步骤提取DNA；
(2)按表2配置RPA反应体系；
(3)震荡混匀后，37℃或42℃恒温反应20分钟；
(4)电泳检测扩增后的DNA产物。
表2
提取的结核分枝杆菌DNA 1μL
常规引物(6110A-f和6110A-r) 各1μL
RPA反应buffer 5μL
重组酶T4 uvsX/uvsY 130ng/1μL，1μL
Bsu DNA聚合酶 30ng/μL，1μL
T4 gp32 900ng/μL，1μL
ddH2O 补足50μL
应用常规引物(实施例1中的6110A-f和6110A-r)RPA扩增检测结核分枝杆菌的结果如图2所示。
对比应用实施例1设计得到的引物(6110B-f和6110B-r)和常规引物(实施例1中的6110A-f和6110A-r)RPA扩增检测结核分枝杆菌的结果(图2)可见，虽然两组引物的核苷酸序列基本相同，但其扩增效率差别极大。不论是37℃还是42℃下，按照本发明方法设计的引物，其特异性与目标产物得率，都远远高于普通引物。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
<110>苏州达麦迪生物医学科技有限公司
<120>用于等温扩增的引物、其设计方法与应用
<160>2
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
gatcctgcgagcgtaggcgtcggtgacaaaggccacgtag40
<210>2
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ctgatccggccacagcccgtcccgccgatctcgtccagc39

Claims (10)

1.一种用于等温扩增的引物的设计方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
根据靶序列设计常规引物；
采用化学基团封闭常规引物的3’末端羟基；
用四氢呋喃取代常规引物中部的一个核苷酸。
2.如权利要求1所述的用于等温扩增的引物的设计方法，其特征在于：所述方法还包括以下步骤：将所述常规引物位于四氢呋喃两侧的核苷酸上，分别标记荧光基团和猝灭基团。
3.如权利要求2所述的用于等温扩增的引物的设计方法，其特征在于：所述荧光基团为FITC、FAM或Cy3；所述猝灭基团为DABCYL、BDH或TANRA。
4.如权利要求1所述的用于等温扩增的引物的设计方法，其特征在于：所述化学基团为生物素。
5.一种采用如权利要求1～4任一项所述方法设计得到的引物。
6.一种如权利要求5所述引物在等温扩增中的应用。
7.如权利要求6所述的引物在等温扩增中的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤：
(1)提取样本RNA或DNA；
(2)配置含有所述引物的反应体系；
(3)混匀步骤(2)所配置的反应体系，加入核酸内切酶，进行等温扩增；
(4)检测等温扩增的产物。
8.如权利要求7所述的引物在等温扩增中的应用，其特征在于：所述步骤(3)中，核酸内切酶为大肠杆菌核酸内切酶IV。
9.如权利要求7所述的引物在等温扩增中的应用，其特征在于：所述步骤(4)中，检测等温扩增的产物的方法为电泳法、试纸条法、比浊法或荧光定量法。
10.如权利要求6所述的引物在等温扩增中的应用，其特征在于：所述引物用于重组酶聚合酶扩增、滚环核酸扩增、环介导等温扩增、链替代扩增或依赖核酸序列扩增中。
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