CN102549154A - 核酸扩增方法 - Google Patents

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CN102549154A CN2010800413907A CN201080041390A CN102549154A CN 102549154 A CN102549154 A CN 102549154A CN 2010800413907 A CN2010800413907 A CN 2010800413907A CN 201080041390 A CN201080041390 A CN 201080041390A CN 102549154 A CN102549154 A CN 102549154A
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Abstract

本发明的目的在于提供一种基于新原理的核酸扩增方法，该方法能够简便地且在短时间内高效扩增具有特定碱基序列的核酸；另外提供利用了该方法的核酸检测方法。本发明提供一种核酸扩增方法，其特征在于，包括：(a)使用含有扩增对象碱基序列的模板DNA、和包含具有与上述碱基序列的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列且3’端经化学修饰的引物的引物对来进行DNA聚合酶延伸反应，得到直链状DNA片段；和(b)以含有扩增对象碱基序列的环状单链DNA作为模板，以由(a)得到的直链状DNA片段的3’端作为复制起点，进行链取代型DNA聚合酶延伸反应。

Description

核酸扩增方法
技术领域
本发明涉及核酸扩增方法，特别是使用经化学修饰的引物和环状单链DNA的组合的核酸扩增方法、利用上述方法检测是否存在目标基因的方法以及在上述方法中使用的检测用试剂盒。
背景技术
现在，在研究机构、医疗机构、检查机构及其它各种现场，基于目标基因的特异性碱基序列的分析方法和检测方法被广泛使用。例如，在分析和检测人和动物等生物体来源的试样(体液或细胞片)或来源于环境的试样中所含的病原菌、霉菌、螨等过敏原等病原性的微生物和微小动物、病毒和花粉等的存在时，也采用了检测这些检测对象所具有的目标基因的特异性碱基序列的方法。检测这些核酸(DNA、RNA)的方法与检测蛋白质的方法相比，能够在短时间内以高灵敏度进行。而且，即使试样中原本所含的核酸量在检出限(detection limit)以下，也可以使用无细胞系较为简单且特异性地扩增。由于这些优点，利用扩增核酸的方法或与扩增核酸的方法组合来检测目标基因中的特异性碱基序列的方法被广泛开发。
目前，作为最常用的核酸扩增方法，可以列举利用温度循环进行数十次的模板的变性、引物与模板的退火、DNA聚合酶延伸反应的循环，从而扩增夹在引物对之间区域的核酸的PCR法。但是，在利用温度循环扩增核酸的方法中，存在用于控制温度循环的机器(热循环仪等)价格高、需要对核酸扩增的最佳温度循环进行研究和设定等问题，因此近年来开始考虑不利用温度循环而在一定温度条件下进行DNA聚合酶延伸反应的核酸扩增方法。其代表性的方法可列举LAMP(环介导等温扩增，Loop-Mediated Isothermal Amplification)法(专利文献1)，除此之外，为了克服成本、检测方法的设计和操作、检测灵敏度等问题，还正在开发利用与环状单链DNA的组合的核酸扩增方法(专利文献2)。
但是，即使利用上述方法，在试样中所含有的检测对象核酸为微量的情况下，也存在检测灵敏度未必充分的情况。因此，需要扩增效率和检测灵敏度进一步提高的新的核酸扩增方法和检测方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2000/28082号小册子
专利文献2：国际公开第2008/026719号小册子
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种基于新原理的核酸扩增方法，该方法能够简便地且在短时间内高效扩增具有特定碱基序列的核酸；另外提供利用了该方法的核酸检测方法。
用于解决问题的方案
本发明人发现，对具有特异性碱基序列的模板核酸分子，通过使用具有与上述碱基序列的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列且3’端经化学修饰的引物以及含有上述特异性碱基序列的环状单链DNA的组合，连锁地进行DNA聚合酶延伸反应，能够解决上述课题，由此完成了本申请发明。
即，本发明提供一种核酸扩增方法，其特征在于，包括：
(a)使用含有扩增对象碱基序列的模板DNA、和包含具有与上述碱基序列的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列且3’端经化学修饰的引物的引物对来进行DNA聚合酶延伸反应，得到直链状DNA片段；和
(b)以含有扩增对象碱基序列的环状单链DNA作为模板，以由(a)得到的直链状DNA片段的3’端作为复制起点，进行链取代型DNA聚合酶延伸反应。
另外，本发明提供一种核酸扩增用试剂盒，其含有：
(i)包含具有与扩增对象碱基序列的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列且3’端经化学修饰的引物的引物对；
(ii)含有扩增对象碱基序列的环状单链DNA；
(iii)链取代型DNA聚合酶；
(iv)dNTP。
另外，本发明提供一种检测双链的目标核酸分子的方法，其包括：
(a)在检测对象试样中添加包含具有与目标核酸分子的目标碱基序列的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列且3’端经化学修饰的引物的引物对、含有目标碱基序列的环状单链DNA、链取代型DNA聚合酶和dNTP，在上述链取代型DNA聚合酶具有活性的温度下进行酶反应；
(b)确认在进行了酶反应的试样中核酸是否被扩增；和
(c)在核酸被扩增时，确定检测对象试样中存在双链的目标核酸分子。
另外，本发明提供一种检测单链的目标核酸分子的方法，其包括：
(a)在检测对象试样中添加具有与目标核酸分子的目标碱基序列的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列且3’端经化学修饰的引物、具有与目标核酸分子的上述目标碱基序列的区域不同区域的目标碱基序列的3’端侧相邻的区域的碱基序列且3’端经化学修饰的引物、含有上述目标碱基序列的环状单链DNA、链取代型DNA聚合酶和dNTP，在上述链取代型DNA聚合酶具有活性的温度下进行酶反应；
(b)确认在进行了酶反应的试样中核酸是否被扩增；和
(d)在核酸被扩增时，确定检测对象试样中存在单链的目标核酸分子。
另外，本发明提供一种双链的目标核酸分子的检测用试剂盒，其含有：
(i)包含具有与双链的目标核酸分子的目标碱基序列的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列且3’端经化学修饰的引物的引物对；
(ii)含有目标碱基序列的环状单链DNA；
(iii)链取代型DNA聚合酶；和
(iv)dNTP。
另外，本发明提供一种单链的目标核酸分子的检测用试剂盒，其含有：
(i)具有与单链的目标核酸分子的目标碱基序列的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列且3’端经化学修饰的引物；
(ii)具有与目标核酸分子的上述目标碱基序列的区域不同区域的3’端侧相邻的区域的碱基序列且3’端经化学修饰的引物；
(iii)含有目标碱基序列的环状单链DNA；
(iv)链取代型DNA聚合酶；和
(v)dNTP。
发明的效果
通过本发明，得到能够在短时间内且特异性地扩增核酸的核酸扩增方法，通过利用该方法，能够提高核酸的检测灵敏度。
附图说明
图1示出本发明的核酸扩增方法的原理(第一阶段)。
图2示出由第一阶段生成的直链状单链DNA和环状单链DNA的对应。
图3示出本发明的核酸扩增方法的原理(第二阶段)。
图4示出以λDNA作为模板时的引物F-in、R-in、F-out、R-out的对应区域和目标序列的区域A和B。
图5示出实验1～实验3的结果。
图6示出实验4～实验6的结果。
图7示出实验7～实验9的结果。
图8示出实验10～实验13的结果。
图9示出比较实验1～比较实验4的结果。
图10示出实验14～实验15的结果。
图11示出实验16～实验17的结果。
图12示出实验18～实验21的结果。
图13示出实验22～实验25的结果。
图14示出表5的实验3的样品的电泳结果。
具体实施方式
在本发明的核酸扩增方法中，通过DNA聚合酶延伸反应，可获得含有一个作为扩增对象的碱基序列或含有作为扩增对象的碱基序列多次重复而成的多种链长的扩增产物，连锁进行这些扩增产物发挥模板或复制起点作用的进一步的DNA聚合酶延伸反应，能够高效扩增作为扩增对象的碱基序列。
本发明的含有扩增对象碱基序列(本说明书中也称为“目标碱基序列”)的模板DNA为单链或双链的直链状或环状的DNA，包含于该模板DNA中的扩增对象碱基序列是模板DNA中特异性区域中的碱基序列。而且，本发明的方法还可以使用cDNA作为模板DNA而进行，所述cDNA是采用逆转录酶合成的与RNA分子互补的碱基序列。此时，本发明的扩增对象碱基序列是RNA分子中的尿嘧啶(U)碱基换成胸腺嘧啶(T)的碱基序列。
在本发明的扩增方法中使用的引物对包含具有与模板DNA中的作为扩增对象的目标碱基序列的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列的引物，只要是能够基于模板DNA获得作为直链状DNA片段的夹在引物对之间的区域即可。因此，模板DNA为双链DNA时，引物对的各引物具有各个链上的目标碱基序列。模板DNA为单链DNA时，引物对中的一条引物具有与存在于模板DNA链上的扩增对象碱基序列不同区域的目标碱基序列。
这里，本发明的上述引物对包含3’端经化学修饰的引物。在以3’端经化学修饰的引物作为起点进行DNA聚合酶延伸反应时，生成在途中含有经化学修饰的碱基残基的DNA片段。若以上述DNA片段作为模板进一步进行DNA聚合酶延伸反应，则DNA聚合酶无法追加与上述经化学修饰的碱基的部分对应的碱基，因此DNA的延伸在即将到经化学修饰的碱基之前停止(参照附图，在后文中说明)。
如上所述，本发明中能够使用的化学修饰只要能够使以包含其的DNA片段作为模板的DNA聚合酶延伸反应停止则没有特别限定，本领域技术人员可以适当选择。本发明中，通过将引物上的3’端的碱基变更为RNA残基、LNA(锁核酸：LockedNucleic Acid)残基或ENA(2′-O，4′-C-Ethylene Bridged NucleicAcid，乙烯桥接核酸)残基，或者变更为肌苷残基，从而能够进行上述化学修饰。进行化学修饰的3’端的碱基数目没有特别制限，从3’端起例如能够对1个、2个或3个碱基进行化学修饰，通常只要仅对3’端的最末端的1个碱基进行化学修饰即能够实施本发明。
本发明中使用的引物对中只要对构成引物对的2种引物中的至少一种进行了化学修饰即可，但优选对2种引物均进行了化学修饰。
本发明的方法可以使用至少一个引物对进行，使用多个引物对时，其数目并没有上限，例如还可以设计为嵌套式来使用。例如为1～5对，优选为1～3对，更优选为2～3对，特别优选为2对。
各引物与配对的引物和其它引物对的引物间优选不具有相同的序列或互补序列。
配对的引物所结合的区域之间的相对距离(碱基数)只要能够进行本发明的反应即可，没有特别限制，但优选最内侧引物对的引物所结合的区域间的相对距离更小者，并且优选其外侧的引物对与邻接的内侧引物对所结合的区域间的相对距离更小者。上述相对距离(碱基数)优选为5b～1kb，更优选为10～100b。
作为本发明中使用的引物，只要能够形成与模板DNA互补的双链即可，没有特别限制，优选8～40mer的引物，更优选16～25mer的引物。而且，模板DNA(目标碱基序列)或引物的GC含量、二级结构形成的容易程度等以及其它在引物设计中一般考虑的性质也都包含在本领域技术人员的技术常识范围之内。这种引物的设计和合成可以使用本技术领域中通常使用的设计程序等手法来进行。
以采用逆转录酶合成RNA分子中的碱基序列而得的cDNA作为模板DNA使用时，同样，可以根据该RNA分子是双链还是单链而如上述那样设计引物对。
在本发明的方法中使用的环状单链DNA含有上述扩增对象碱基序列。
环状单链DNA可以设计为以一定间隔反复含有多个上述扩增对象碱基序列(即目标碱基序列)，另外在对引物对的两个引物均进行了化学修饰时，还可以含有一个各自的扩增对象碱基序列或反复含有多个各自的扩增对象碱基序列。
环状单链DNA中，目标序列以外的区域的碱基序列只要是本发明特异性反应即可，没有特别限定，但优选较小者。另外，使用不具有3’→5’核酸外切酶活性的链取代型DNA聚合酶时，优选在与引物相同的碱基序列的5’侧上添加1个胸腺嘧啶(T)。
关于环状单链DNA的链长，只要使本发明特异性反应即可，没有特别限定，但优选为16b～100kb，更优选为20～100b。这种环状单链DNA的设计和合成可以使用本技术领域中通常使用的设计程序等手法而进行。而且，环状单链DNA还可以通过国际公开第2008/026719号小册子的图6中所示的环状单链DNA的制造方法来制造。
本发明的方法中使用的DNA聚合酶优选具有链取代型5’→3’DNA聚合酶活性，正确合成碱基对的互补链。而且，所述DNA聚合酶可以具有3’→5’核酸外切酶活性，但优选不具有此活性，而且也优选不具有5’→3’核酸外切酶活性。DNA聚合酶的最适温度优选为50～90℃，更优选为60～72℃。作为这种DNA聚合酶，例如可以单独或以试剂盒的形式获得嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)来源的Bst DNA聚合酶大片段、火球菌(Pyrococcus)属细菌来源的Deep VentR (R)(exo-)DNA聚合酶、嗜热球菌(Thermococcus)属细菌来源的9degrees NorthDNA聚合酶(New England Biolabs Incorporation制)、Herculase(R)II Fusion DNA聚合酶(STRATAGENE公司制)、嗜热球菌(Thermococcus)属来源的VentR (R)(exo-)DNA聚合酶、TherminatorTMDNA聚合酶、TherminatorTMII DNA聚合酶(NewEngland Biolabs Incorporation制)、KOD Dash DNA聚合酶(东洋纺公司制)等。只要不抑制相互的酶活性，还可以同时使用两种以上DNA聚合酶。
利用DNA聚合酶进行的延伸反应还可以使用在一般的核酸扩增中使用的缓冲液(含有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4等盐类)，例如所使用的DNA聚合酶附带的优化组成的缓冲液。
在上述这种合适的缓冲液中添加模板DNA、本发明的引物对、本发明的环状单链DNA、链取代型DNA聚合酶和作为底物的4种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，将该反应溶液保持在链取代型DNA聚合酶具有该酶活性的温度例如50～90℃、优选60～72℃，则不用进行温度循环控制即可在同一容器中通过1次操作来高效扩增核酸。而且，使用多个引物对时，能够将本发明的反应温度条件进一步设定在更低的条件，例如30～50℃。DNA聚合酶延伸反应的温度条件依赖于使用的链取代型DNA聚合酶具有活性的温度。只要在使用的链取代型DNA聚合酶具有该酶活性的温度范围内即可，扩增反应整个过程不必都保持在相同温度(等温)亦可，但优选扩增反应整个过程保持在相同温度(等温)(同一温度条件下)。
核酸的扩增可以通过DNA聚合酶延伸反应中核酸被扩增时反应溶液中生成的焦磷酸镁的沉淀来确认(国际公开第2001/083817号小册子)。另外，还可以使用本技术领域中通常使用的核酸染色荧光染料等例如溴化乙锭、SYBR GreenI(Lonza公司制)等，按照常规方法根据荧光的有无和强度来确认核酸扩增。
接着，用附图具体说明本发明的核酸扩增方法的方式。
首先，在第一阶段，通过含作为扩增对象的特异性碱基序列的模板DNA与引物对的DNA聚合酶延伸反应，获得直链状DNA片段(图1)。
以双链的模板DNA中的两个特异性碱基序列区域A、B作为扩增对象时，将各区域在其中一条链上的序列设定为A1和B1，另一条链上的序列设定为A2和B2(图1、(i))。引物对中，将一条引物P1设计为具有与A1的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列，另一条引物P2设计为具有与B2的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列。图1中，引物P1和P2的3’端经修饰的情况以圆形符号表示。
使用该引物对与上述模板DNA来进行DNA聚合酶延伸反应。以下，为了简化说明，仅着眼于包含区域A1和B1的链(图1的双链的模板DNA的上侧的链)上的反应进行说明。首先，引物P1与序列A1的3端侧的区域结合(图1、(ii))。然后，通过延伸反应，生成片段C1，该片段C1接着P1的序列合成与A2相同的碱基序列，然后隔开间隔合成与B2相同的碱基序列(图1、(iii))。所生成的片段还可以通过酶的作用而在延伸反应条件下自然地从模板DNA离开，解离成双链(参照例如国际公开第2008/026719号小册子的例1)，但通过在引物P1的外侧(5’端侧)进一步设计引物P1-out并使其退火而同样地进行延伸，从而将由引物P1合成的DNA片段从模板DNA剥离，能够高效地解离成单链(图1、(iv))。
接着，将如上扩增的片段C1作为模板，引物P2退火而进行反向的DNA延伸反应(图1、(v))。这里，作为模板的DNA片段在A2的序列的5’端侧含有化学修饰，因此该部分的延伸不进行，DNA的延伸在即将到含有化学修饰的碱基之前停止(图1、(vi))，生成DNA片段C2。如对图1的(iv)所说明的那样，所生成的DNA片段C2还可以在延伸反应条件下自然地从模板DNA离开，解离成双链，但与(iv)同样地通过在反应中同时加入外侧的引物P2-out，从而将由引物P2合成的DNA片段从模板DNA剥离，能够高效地解离成单链(图1、(vii))。
通过上述反应，得到5’端具有引物P2的序列、连续地具有与B1相同的序列、然后隔开间隔具有与A1相同的序列、且延伸在此中断的直链状DNA片段。如上所述，这示出了将图1的(i)的上侧的链作为模板的情况，对于将下侧的链作为模板的情况，也同样地首先将引物P2作为模板而生成片段D1(未图示)，以该片段D1作为模板，得到DNA延伸在途中停止而生成的直链状DNA片段D2。由作为模板的双链DNA的两个链生成直链状DNA片段C2和D2，其在后述的第二阶段与环状单链DNA结合，该情况示于图2。该所获得的直链状DNA片段C2和D2成为第二阶段的扩增反应开始时的复制起点。
在第二阶段作为模板的环状单链DNA被设计为含有目标碱基序列A2和/或B1(图3、(i))。若使用这样的环状单链DNA，则在第一阶段得到的直链状DNA片段C2和D2均在环状DNA上退火(参照图2)，能够进行以环状单链DNA为起点的连锁扩增反应。以下，为了简化说明，仅对将直链状DNA片段C2作为复制起点的情况进行说明。图3中示出了含有与A2、B1和P2分别相同的碱基序列的环状单链DNA。如上所述，由于在第一阶段获得的直链状DNA片段C2在3’端各自具有与目标序列互补的碱基序列(A1)，因此该直链状DNA片段的3’端区域(A1)与环状单链DNA中的3’端部分的碱基序列(A2)区域退火，成为复制起点，以环状单链DNA作为模板发生DNA聚合酶延伸反应(图3、(i))。合成的DNA链通过链取代型DNA聚合酶而剥离，与此同时呈滚环式延伸(图3、(ii))。存在于反应溶液中的引物P2与该剥离延伸的DNA链发生退火，从而成为复制起点，发生DNA聚合酶延伸反应，以上述引物作为复制起点进行合成并剥离的DNA链与存在于反应溶液中的引物或环状单链DNA发生退火，从而发生DNA聚合酶延伸反应(图3、(iii))。
一旦作为第二阶段开始的诱因的直链状DNA片段被合成后，以上说明的第一阶段的过程和第二阶段的过程就平行地同时进行。而且，这样进行连锁的扩增反应，其结果是合成了含有1个作为扩增对象的特异性碱基序列或含有作为扩增对象的特异性碱基序列多次重复而成的多种链长的DNA链。
本发明的另一种方式是利用上述核酸扩增方法的原理的目标基因的检测方法。本检测方法可以根据检测目标、检测对象试样的来源、目标基因等，在多种产业中的各种情况下进行。
作为检测目标基因的试样，例如可以从人以及动物来源的体液或组织片来制备，也可以从环境来源的土壤、海水、植物来制备，还可以是在工厂制造加工的饮料或食品、药品等。它们直接或根据需要采用适当的操作制备出核酸(DNA、RNA)提取液，这种提取液可作为检测对象试样用于本发明的检测方法中。这种试样的制备可以按照一般的核酸检测方法中使用的常规方法进行。
目标基因可以为微生物(细菌、霉菌等)、过敏原(例如螨、花粉等)、病毒中特异性的遗传物质，而且也可以是人以及其它动物的基因组中的野生型或突变型基因。
本检测方法中，将上述核酸扩增方法的“模板DNA”和“扩增对象碱基序列”分别替换为本检测方法的“目标核酸分子(即目标基因)”和“目标基因中的目标碱基序列”，该方法利用的是试样中存在目标核酸分子(即目标基因)时，根据与上述核酸扩增方法相同的原理来扩增目标基因中的目标碱基序列的核酸。
在目标核酸分子为RNA时，通过在本发明的检测方法的工序(a)的酶反应的工序中，在试样中进一步添加逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)进行酶反应，可与上述核酸扩增方法同样确认是否发生了以基于试样中的RNA分子合成的cDNA链作为模板的核酸扩增，在核酸被扩增时，确定为存在目标RNA分子，由此可以检测目标RNA分子的存在。
核酸扩增可与上述同样地采用焦磷酸镁的沉淀、或本技术领域中通常使用的核酸染色荧光染料等，以沉淀或荧光的有无作为指标进行确认。而且，还可以以焦磷酸镁的生成量或荧光的强度作为指标，来比较作为检测对象的试样中存在的目标基因的核酸量的多少。
这样一来，通过使用本检测方法，即使试样中存在的目标基因的核酸极为微量，也可以在同一反应容器中通过一次操作高效扩增并检测出目标基因中的特异性碱基序列。本检测方法还可以在例如微管、微孔板、微芯片(microchip)等反应容器中进行，而且还可以使用HTS(高通量筛选，High-ThroughputScreening)等技术。
以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明。需要说明的是，药品名称后没有注明公司名的物质均为和光纯药工业公司制造。而且，只要没有特别的说明，则溶剂为水。
TE缓冲液
4mmol/lTris-HCl(三羟甲基氨基甲烷)盐酸
1mmol/l乙二胺四乙酸二钠二水合物(EDTA)
调整到pH8.0
1.5％TAE电泳用胶
1.5％琼脂糖
4mmol/lTris-HCl
1mmol/lEDTA
1mmol/l醋酸
LB培养基
蛋白胨1.0％
酵母浸膏0.5％
氯化钠1.0％
溶解后将pH调整到7.0
[环状单链DNA的合成]
以下示出的酶制品、试剂盒制品只要没有特别说明均按照使用说明书。
将环状单链DNA的合成中使用的引物记于下述表1和2。
表1：环状单链DNA的合成中使用的引物序列
Figure BDA0000144180350000141
*C60在5’端进行了磷酸化修饰，Bind在3’端进行了磷酸化修饰，均进行了HPLC纯化。
表2：环状单链DNA的合成中使用的引物序列(现有方法)
Figure BDA0000144180350000142
*60C在5’端进行了磷酸化修饰，Bind在3’端进行了磷酸化修饰，均进行了HPLC纯化。
上述表1中记载的引物序列用于合成在本发明的实施例中使用的环状单链DNA，用于本说明书的实施例中。另外，上述表2中记载的引物序列用于合成在现有方法、即国际公开第2008/026719号小册子中记载的发明的实施中使用的环状单链DNA，用于本说明书的比较例。
对于表1和表2，分别将各表中所示的2种引物(各1.0μmol/l)和9°N DNA连接酶(New England biolabs公司)混合，在以下所示的温度下进行反应。
Figure BDA0000144180350000151
反应结束后，添加Gen Toru Kun(Takara Bio Inc.)，进行乙醇沉淀。然后，用75％乙醇清洗2次，用99.5％乙醇清洗1次，于85℃干燥后，用超纯水溶解为1.0μmol/l。
溶解后，添加RecJf(New England biolabs公司)专用缓冲液，在98℃加热1分钟后进行冰冷。然后，添加RecJf(New Englandbiolabs公司)，在37℃反应2小时后，添加Gen Toru Kun，进行乙醇沉淀。然后，用75％乙醇清洗2次，用99.5％乙醇清洗1次，于85℃干燥后，用TE缓冲液溶解为1.0μmol/l，制成环状单链DNA制备液。另外，将使用表1的引物对(primer set)的情况制成环状单链DNA制备液(1)，将使用表2的引物对(primer set)的情况制成环状单链DNA制备液(2)，在后述的实验中使用。
[特异性基因扩增]
基因检测中使用的引物记于表3。均进行了HPLC纯化。另外，[]中包括的碱基表示经化学修饰的碱基，对应于实施例中使用的化学修饰，示出RNA(Greiner公司制)、LNA(Greiner公司制)或ENA(SIGMA公司制)。
表3：基因检测中使用的引物序列
  名称   序列(5’-3’)
  F-in   CCACCGACCATCTATGACT[G]
  R-in   GGCATGCACCGAGAAGGAC[G]
  F-out   GTGCGGGTGTTGAATGATTT
  R-out   GCTAACCAATTCCTAGGCAG
将上述4种引物在作为模板利用的λDNA上的关系示于图4。图4示出了λDNA的第24217-24412位的碱基序列(编号根据NCBI数据库的注册号NC_001416)。另外，图4的区域A和B表示包含作为扩增对象的目标碱基序列的区域，这些序列存在于表1所示的环状单链DNA的C60中(C60的第11-25位的碱基与A对应，第26-40位的碱基与B的互补序列对应)。
另外，关于比较用的现有方法的实验中使用的60C的序列，60C的第11-30位的碱基与引物F-in的序列相同，第31-50位的碱基与引物R-in的互补序列相同。这是因为在现有方法中在包含F-in和R-in的整体的区域生成直链DNA片段，因而以包含与各片段的3’端(即复制的起点)对应的序列的方式设计环状DNA。
另外，关于使用肌苷碱基作为化学修饰的情况，代替上述表3的F-in和R-in而使用以下的引物FI-in和RI-in(F-out和R-out相同)，使用以下表4的引物。
表4：基因检测中使用的引物序列
  名称   序列(5’-3’)
  FI-in   CCACCGACCATCTATGACT I
  RI-in   GGCATGCACCGAGAAGGAC I
  F-out   GTGCGGGTGTTGAATGATTT
  R-out   GCTAACCAATTCCTAGGCAG
*I表示肌苷碱基(Greiner公司制)。
基因检测反应中使用下述物质。
酶：4U/25μl Bst DNA 聚合酶(New England BiolabsIncorporation)
模板：λ基因组(Takara Bio Inc.)1.0μl/20μl
关于枯草菌，用LB培养基培养枯草杆菌(Bacillus subtilis)后，利用基因组提取装置(Precision System Science公司制12PLUS)取得。
Figure BDA0000144180350000171
按表3的条件混合各试剂，于98℃加热1分钟，冰冷后，添加酶，于63℃培育60分钟。
[DNA扩增的确认]
将核酸染色试剂SYBR GreenI(Takara Bio Inc.)稀释到1/10，在20μl样品中混合1μl，在302nm的波长处用高灵敏度滤镜观察。
A.使用RNA作为化学修饰的情况
DNA的扩增结果示于以下的表5和图5、6。
表5
  酶   λ基因组(模板)   枯草菌   反应缓冲液   核酸扩增
  实验1   ×   ○   ×   ○   ×
  实验2   ○   ×   ×   ○   ×
  实验3   ○   ○   ×   ○   ○
  实验4   ×   ○   ○106   ○   ×
  实验5   ○   ×   ○106   ○   ×
  实验6   ○   ○   ○106   ○   ○
根据以上的结果，确认了在含有酶和模板的实验(实验3和6)中核酸迅速被扩增，在存在酶而不含模板的实验(实验2和5)中没有确认到核酸扩增。另外，即使含有目标序列以外的DNA，也没有确认到核酸扩增(实验5)，由此确认了能够特异性地识别序列。另外，不含酶的实验(实验1和4)未发生核酸扩增。
通过本发明能够特异性地识别核酸序列且迅速扩增核酸。
B.使用LNA作为化学修饰的情况
DNA的扩增结果示于表6和图7。
表6
  酶   λ基因组(模板)   反应缓冲液   核酸扩增
  实验7   ×   ○106   ○   ×
  实验8   ○   ×   ○   ×
  实验9   ○   ○106   ○   ○
根据以上的结果，确认到在表5的实验1～3和表6的实验7～9中发生了同样的反应。通过本发明，不仅是RNA，在使用LNA的情况下也得到优异的效果。
C.利用LNA进行化学修饰的情况与不进行化学修饰的现有方法的比较
实验10～13中，使用与上述B的实验同样地利用LNA对3’端进行了修饰的F-in和R-in的引物，将表1的C60环状化的环状单链DNA(环状单链DNA制备液(1))作为模板，扩增DNA。另外，比较实验1～4中，使用3’端未经化学修饰的引物，将表2的60C环状化的环状单链DNA(环状单链DNA制备液(2))作为模板，扩增DNA。
DNA的扩增结果示于表7和图8、9。
表7
  酶   λ基因组(模板)   反应缓冲液   核酸扩增
  实验10   ○   ×   ○   ×
  实验11   ○   ○104   ○   ×
  实验12   ○   ○105   ○   ○
  实验13   ○   ○106   ○   ○
  比较实验1   ○   ×   ○   ×
  比较实验2   ○   ○104   ○   ×
  比较实验3   ○   ○105   ○   ×
  比较实验4   ○   ○106   ○   ○
根据以上的结果，确认到在现有的方法中检测灵敏度为106(比较实验4)，但检测灵敏度升高至105(实验12、13)。两种方法均没有检测到104(实验11、比较实验2)。另外，不含模板的实验(实验10和比较实验1)未发生核酸扩增。
由上述结果可以确认，通过使用本发明，与现有的方法相比检测灵敏度上升约10倍以上。
D.使用ENA和肌苷碱基作为化学修饰的情况
使用肌苷碱基作为化学修饰的情况下的反应缓冲液如下所示。
Figure BDA0000144180350000191
实验14、15进行使用ENA的化学修饰，实验16、17进行使用肌苷碱基的化学修饰。
DNA的扩增结果示于表8和图10、11。
表8
  酶   λ基因组(模板)   反应缓冲液   核酸扩增
  实验14   ○   ×   ○   ×
  实验15   ○   ○106   ○   ○
实验16   ○   ×   ○   ×
  实验17   ○   ○105   ○   ○
根据以上的结果，确认到在使用ENA的情况(实验14、15)和使用肌苷碱基的情况(实验16、17)下，与表5、6同样地产生了高效的DNA扩增反应。
E.与环状单链DNA结合的序列为1种的情况
制作仅含有1种与直链状DNA片段结合的序列的环状单链DNA，并确认DNA的扩增程度。利用Bind的引物，将引物60F和60R分别环状化。另外，对60F和60R在5’端进行磷酸化修饰，对Bind在3’端进行磷酸化修饰，均进行了HPLC纯化。
表9：在环状单链DNA的合成中使用的引物序列
60F的第11-25位的碱基与图4的区域A的序列对应，60R的第26-40位的碱基与区域B的互补序列对应。与上述方法同样地合成环状DNA，利用上述的反应条件确认有无反应。
实验18和19进行了以60F的环状化DNA作为模板的DNA扩增，实验20-21进行了以60R的环状化DNA作为模板的DNA扩增。
DNA的扩增结果示于表10和图12。
表10
酶 λ基因组(模板) 反应缓冲液 核酸扩增
  实验18 ○ × ○ ×
  实验19 ○ ○106 ○ ○
  实验20 ○ × ○ ×
  实验21 ○ ○106 ○ ○
根据以上的结果，确认到即使在使用了表9的60F的情况(实验18、19)和使用了60R的情况(实验20、21)下，也与表5、6同样地发生了高效的DNA扩增。
通过本发明的方法，确认到若与环状DNA结合的部位存在至少1种以上，则能够高效地扩增DNA。
F.使用9 degrees North DNA聚合酶和LNA的高灵敏度的条件
表11在环状单链DNA的合成中使用的引物序列
Figure BDA0000144180350000211
*C65在5’端进行了磷酸化修饰，Bind-2在3’端进行了磷酸化修饰，均进行了HPLC纯化。另外，Bind-2的3’端进行了LNA修饰。
环状单链DNA的合成方法与上述同样进行。
表12基因检测中使用的引物序列
名称     序列(5’-3’)
F-in     CCACCGACCATCTATGACT[G]
R-in     GGCATGCACCGAGAAGGAC[G]
F-out     GTGCGGGTGTTGAATGATT[T]
R-out     GCTAACCAATTCCTAGGCA[G]
反应中使用的所有引物的3’端进行了LNA修饰。
反应缓冲液
Figure BDA0000144180350000212
Figure BDA0000144180350000221
按表3的条件混合各试剂，在下述条件下反应。
Figure BDA0000144180350000222
上述实验结果示于实验22～25。
DNA的扩增结果示于表13和图13。
表13
  酶   λ基因组(模板)   反应缓冲液   核酸扩增
  实验22   ○   ×   ○   ×
  实验23   ○   ○102   ○   ○
  实验24   ○   ○103   ○   ○
  实验25   ○   ○104   ○   ○
根据以上的结果，确认到若使用表11、12的环状DNA和引物、9 degrees North DNA聚合酶，利用热循环仪一边改变温度一边进行反应，则由实验23的结果确认到102以上的核酸扩增，由此灵敏度上升至102。
通过本发明的方法，通过改变温度的循环，确认到灵敏度的提高。
G.利用电泳法的DNA扩增的确认
对于表5的实验3的样品，使用1.5％TAE电泳用胶，利用作为电泳槽的Mupid-ex(ADVANCE公司)进行了电泳(100V、50分钟)。
然后，用核酸染色试剂SYBR Green I染色后，进行照片拍摄(图14)。
Figure IDA0000144180430000021
Figure IDA0000144180430000031
Figure IDA0000144180430000041
Figure IDA0000144180430000051

Claims (12)

1.一种核酸扩增方法，其特征在于，包括：
(a)使用含有扩增对象碱基序列的模板DNA、和包含具有与上述碱基序列的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列且3’端经化学修饰的引物的引物对来进行DNA聚合酶延伸反应，得到直链状DNA片段；和
(b)以含有扩增对象碱基序列的环状单链DNA作为模板，以由(a)得到的直链状DNA片段的3’端作为复制起点，进行链取代型DNA聚合酶延伸反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，化学修饰为向RNA残基、LNA残基或ENA残基的变更或者向肌苷残基的变更。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，对构成引物对的2种引物均进行了化学修饰。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，进一步添加第二引物对来进行工序(a)，该第二引物对由在构成工序(a)中使用的引物对的各引物的5’端侧分别进行了设计的2种引物构成。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，在同一温度条件下进行(a)和(b)。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，含有扩增对象碱基序列的模板DNA含有由以RNA为模板的逆转录所得到的DNA链。
7.一种核酸扩增用试剂盒，其含有：
(i)包含具有与扩增对象碱基序列的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列且3’端经化学修饰的引物的引物对；
(ii)含有扩增对象碱基序列的环状单链DNA；
(iii)链取代型DNA聚合酶；
(iv)dNTP。
8.一种检测双链的目标核酸分子的方法，其包括：
(a)在检测对象试样中添加包含具有与目标核酸分子的目标碱基序列的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列且3’端经化学修饰的引物的引物对、含有目标碱基序列的环状单链DNA、链取代型DNA聚合酶和dNTP，在上述链取代型DNA聚合酶具有活性的温度下进行酶反应；
(b)确认在进行了酶反应的试样中核酸是否被扩增；和
(c)在核酸被扩增时，确定检测对象试样中存在双链的目标核酸分子。
9.一种检测单链的目标核酸分子的方法，其包括：
(a)在检测对象试样中添加具有与目标核酸分子的目标碱基序列的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列且3’端经化学修饰的引物、具有与目标核酸分子的上述目标碱基序列的区域不同区域的目标碱基序列的3’端侧相邻的区域的碱基序列且3’端经化学修饰的引物、含有上述目标碱基序列的环状单链DNA、链取代型DNA聚合酶和dNTP，在上述链取代型DNA聚合酶具有活性的温度下进行酶反应；
(b)确认在进行了酶反应的试样中核酸是否被扩增；和
(d)在核酸被扩增时，确定检测对象试样中存在单链的目标核酸分子。
10.一种双链的目标核酸分子的检测用试剂盒，其含有：
(i)包含具有与双链的目标核酸分子的目标碱基序列的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列且3’端经化学修饰的引物的引物对；
(ii)含有目标碱基序列的环状单链DNA；
(iii)链取代型DNA聚合酶；和
(iv)dNTP。
11.一种单链的目标核酸分子的检测用试剂盒，其含有：
(i)具有与单链的目标核酸分子的目标碱基序列的3’端侧相邻的区域的互补碱基序列且3’端经化学修饰的引物；
(ii)具有与目标核酸分子的上述目标碱基序列的区域不同区域的3’端侧相邻的区域的碱基序列且3’端经化学修饰的引物；
(iii)含有目标碱基序列的环状单链DNA；
(iv)链取代型DNA聚合酶；和
(v)dNTP。
12.根据权利要求10或11所述的检测用试剂盒，其还含有(vi)逆转录酶。
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