KR20170021633A - 온도감응성 격막을 구비하는 이중중합효소연쇄반응용 튜브 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이중중합효소연쇄반응에 사용되는 시험 튜브로서, 하나의 튜브 내에서 1차 시발체를 수용하는 제1챔버, 2차 시발체를 수용하는 제2챔버, 및 2차 시발체를 공간적으로 분리하는 온도감응성 격막을 포함하는, 이중중합효소연쇄반응용 튜브를 제공한다.

Description

온도감응성 격막을 구비하는 이중중합효소연쇄반응용 튜브{TUBE FOR NESTED PCR COMPRISING THERMOSENSITIVE SEPARATOR}

본 발명은 온도감응성 격막을 구비하는 이중중합효소연쇄반응용 튜브 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

PCR-관련 기술들은 생물학과 의학의 연구 분야에서 다양한 응용과 방법에 널리 이용되고 있으며, 예컨대, 표적 서열의 검출, 역전사 효소 PCR(RT-PCR), DD-PCR(Differential Display PCR), 공지된 유전자 또는 미지의 유전자의 클로닝, cDNA 말단의 고속 증폭(RACE), DNA 시퀀싱 및 PCR-관여 게놈 분석(McPherson and Moller, 2000) 등이 있다.

이러한 연구들 중에서, 실시간 유전자 증폭법(Real-time PCR)은 실시간으로 증폭산물을 측정하고 교차-오염(cross-contamination)을 감소시키며, 보다 정확한 정량적 분석을 가능하게 한다. 실시간 유전자 증폭법에 관한 종래 특허문헌으로는, 미국 특허 등록 제5,210,015호, 제5,538,848호 및 제6,326,145호가 있다. 기존의 실시간 유전자 증폭법은 증폭과 검출이 동시에 수행되는 균일 검정(homogeneous assay) 방식의 장점을 가지고 있지만, 형광 리포터 분자 종류의 한계로 인하여 동시에 검출할 수 있는 표적 핵산서열 수가 제한적인 다중도 문제점 및 높은 처리량에 있어서 가장 큰 단점을 가지고 있다. 실시간 표적 핵산서열을 검출할 수 있는 현존의 서모사이클러(thermocycler)는 최대 5-plex까지 동시 검출이 가능하기 때문에, 동시에 검출할 수 있는 표적 핵산서열의 수가 제한적이며, 또한 대용량의 시료를 분석하기 위하여 많은 시간과 추가적인 고가의 실시간 모니터링 장비가 요구된다.

따라서, 상술한 종래의 다수의 표적 서열 검출과 실시간 유전자 증폭 장비의 높은 처리 적용을 위한 기술들의 문제점을 획기적으로 극복할 수 있을 뿐만 아니라, 형광 이중-표지된 프로브의 사용량을 감소시켜 분석 비용을 크게 줄일 수 있고, 또한 이용되는 시료의 양과 분석 시간도 줄일 수 있고, 검출 민감도를 크게 개선할 수 있는 기술에 대한 요구가 대두되고 있다.

특히, 이중중합효소연쇄반응(Two-step PCR)법은 첫 번째 증폭 시발체(primer)로 증폭을 한 후 다시 2차 시발체를 첨가하여 증폭하는 방법으로 민감도를 높이거나 특수한 목적의 증폭이 필요할 경우 많이 쓰이는 방법이다. 하지만, 이중중합효소연쇄반응법은 보통 두 번 다른 튜브를 써야 하기 때문에 실험자의 손이 많이 가고 불편하며, 증폭 산물을 다루는 도중 오염을 일으킬 수 있는 문제점이 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출한 것으로서, 하나의 튜브 내에서 이중중합효소연쇄반응을 실시할 수 있도록 온도감응성 격막을 포함하는 이중중합효소연쇄반응용 튜브를 제공하여, 사용하기 편리하고 증폭 실험 도중에 오염의 발생을 감소시키는 이중중합효소연쇄반응용 튜브를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상을 함께 실행하지 않거나, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미가 있다.

표적 핵산을 검출하기 위한 대부분의 기술은 표적 핵산 증폭 과정을 포함하고 있다. 핵산 증폭은 분자 생물학 분야에서 흔히 이용되는 필수적인 과정이고, 다양한 증폭 방법이 제시되었다. 예를 들어, Miller, H. I. 등(WO 89/06700)은, 프로모터/시발체 서열을 타깃 단일가닥 DNA("ssDNA")에 혼성화시킨 다음, 상기 서열의 많은 DNA 카피를 전사하는 과정을 포함하는 핵산 서열 증폭 방법을 개시하고 있다. 다른 공지의 핵산 증폭 방법들은 전사 증폭 시스템을 포함한다(Kwoh, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:1173(1989); 및 Gingeras T.R. et al., WO 88/10315).

중합효소 연쇄반응(이하, "PCR"이라 한다)으로 공지된 가장 많이 이용되는 핵산 증폭 방법은 이중가닥 DNA의 변성, DNA 주형에 올리고뉴클레오타이드 시발체의 어닐링 및 DNA 중합효소에 의한 시발체 연장의 반복된 사이클 과정을 포함한다(Mullis 등, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki et al., (1985) Science 230, 1350-1354).

본 명세서에서 사용되는 용어 시발체(primer)는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 시발체 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 시발체는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 시발체는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 시발체는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

시발체는 중합제(예컨대, DNA 폴리머라제)의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 시발체의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 시발체의 소스(source)에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15~30 뉴클레오타이드이다. 짧은 시발체 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 시발체는 컴퓨터 프로그램인 Per1 프로그램을 이용하여 제작되지만, 이에 한정되는 건은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 어닐링 또는 프라이밍은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 혼성화(hybridization)" 는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 어닐링과 혼성화는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 이중중합효소연쇄반응에 사용되는 시험 튜브로서, 하나의 튜브 내에서 1차 시발체를 수용하는 제1챔버, 2차 시발체를 수용하는 제2챔버, 및 2차 시발체를 공간적으로 분리하는 온도감응성 격막을 포함하는, 이중중합효소연쇄반응용 튜브를 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 온도감응성 격막은 상기 이중중합효소연쇄반응용 튜브의 높이 방향과 수직하는 방향, 즉 횡방향이고, 튜브의 하면으로부터 일정 간격 이격된 높이에 형성된다. 본 발명의 다른 실시예에서, 상기 온도감응성 격막은 상기 이중중합효소연쇄반응용 튜브의 높이 방향, 즉 종방향이고, 튜브의 하면으로부터 튜브의 개구까지 연결되어 형성된다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 온도감응성 격막은 2차 시발체를 둘러싸는 캡슐 형상으로 형성된다. 또한, 상기 온도감응성 격막은 녹는점이 87~99℃의 범위 내이고, 바람직하게는 90~99℃의 범위 내인 물질로서, 상기 이중중합효소연쇄반응용 튜브 내 온도가 90℃ 이하에서는 고체 상태이고, 90℃ 이상에서는 상변이를 일으켜 용융되는 물질이다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브를 사용하는 방법으로서, 1차 시발체를 사용하여 25℃ 이상 90℃ 이하의 온도 범위에서 1차 증폭 사이클을 실시하는 단계, 90℃ 이상으로 상승시켜 온도감응성 격막의 상변이를 일으키는 단계, 및 2차 시발체를 사용하여 2차 증폭 사이클을 실시하는 단계를 포함하는, 이중중합효소연쇄반응용 튜브의 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 온도감응성 격막은 상기 이중중합효소연쇄반응용 튜브의 높이 방향과 수직하는 방향, 즉 횡방향이고, 튜브의 하면으로부터 일정 간격 이격된 높이에 형성된다. 본 발명의 다른 실시예에서, 상기 온도감응성 격막은 상기 이중중합효소연쇄반응용 튜브의 높이 방향, 즉 종방향이고, 튜브의 하면으로부터 튜브의 개구까지 연결되어 형성된다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 온도감응성 격막은 2차 시발체를 둘러싸는 캡슐 형상으로 형성된다. 또한, 상기 온도감응성 격막은 녹는점이 87~99℃의 범위 내이고, 바람직하게는 90~99℃의 범위 내인 물질로서, 상기 이중중합효소연쇄반응용 튜브 내 온도가 90℃ 이하에서는 고체 상태이고, 90℃ 이상에서는 상변이를 일으켜 용융되는 물질이다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브 제조 방법으로서, 2차 시발체를 포함하는 시험 튜브의 내측 공간에 수평방향으로 온도감응성 격막을 설치하여 제1챔버 및 제2챔버를 형성하는 단계를 포함하는 이중중합효소연쇄반응용 튜브 제조 방법을 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브 제조 방법으로서, 시험 튜브의 내측 공간에 수직방향으로 온도감응성 격막을 설치하는 단계를 포함하는 이중중합효소연쇄반응용 튜브 제조 방법을 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브 제조 방법으로서, 2차 시발체를 둘러싸는 캡슐 형상으로 온도감응성 격막을 형성하는 단계를 포함하는 이중중합효소연쇄반응용 튜브 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브는 상기한 바와 같이 형성됨으로써, 시료 DNA 샘플에 시발체를 2중으로 결합시키는 경우에 하나의 튜브 내에서 용이하게 이중중합효소연쇄반응을 실시할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브는 상기한 바와 같이 형성됨으로써, 시료 DNA 샘플에 시발체를 2중으로 결합시키는 경우에 하나의 튜브 내에서 용이하게 이중중합효소연쇄반응을 실시할 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 실시예에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브는 시판시에 2차 시발체를 미리 준비하지 않고, 실험자의 필요에 따라 임의로 넣을 수 있다는 효과가 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브는 상기한 바와 같이 형성됨으로써, 시료 DNA 샘플에 시발체를 2중으로 결합시키는 경우에 하나의 튜브 내에서 용이하게 이중중합효소연쇄반응을 실시할 수 있다. 또한, 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브는 1차 증폭 동안에 2차 시발체에 영향을 줄 수 있는 어떠한 오염도 방지할 수 있다는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 온도감응성 격막을 구비하는 이중중합효소연쇄반응용 튜브를 사용하여 이중중합효소연쇄반응을 진행하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 온도감응성 격막을 구비하는 이중중합효소연쇄반응용 튜브를 사용하여 이중중합효소연쇄반응을 진행하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 온도감응성 격막을 구비하는 이중중합효소연쇄반응용 튜브를 사용하여 이중중합효소연쇄반응을 진행하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 4는 본 발명에 따른 온도감응성 격막을 구비하는 이중중합효소연쇄반응용 튜브를 사용하여 이중중합효소연쇄반응을 진행하고, 전기영동을 실시한 결과를 나타내는 사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 하나의 튜브 내에서 이중중합효소연쇄반응을 진행할 있는 이중중합효소연쇄반응용 튜브를 제공하는 것에 목적이 있다.

이중중합효소연쇄반응은 일반적으로 2개의 튜브를 사용하며, 2번에 걸쳐 유전물질의 증폭 단계를 진행해야 한다. 따라서, 실험자가 불편하고 증폭 산물을 다루는 도중에 오염을 일으킬 수 있는 문제점이 있다. 본 발명은 종래의 이중중합효소연쇄반응 방법에서 불필요한 과정을 줄이고 오염 발생의 감소가 필요하다는 인식에 기초하고 있다. 본 발명에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브는 이를 방지하기 위해 고안된 것으로, 이하 본 발명에 대하여 실시예를 통하여 본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용을 첨부한 도면을 참조하여 더욱 상세하게 설명한다.

실시예 1: 이중중합효소연쇄반응용 튜브(1)

먼저, 본 발명의 일 실시예에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브룰 설명한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 온도감응성 격막을 구비하는 이중중합효소연쇄반응용 튜브를 사용하여 이중중합효소연쇄반응을 진행하는 과정을 나타내는 모식도이다.

도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브에서의 온도감응성 격막은 튜브의 높이 방향과 수직하는 방향, 즉 횡방향이고, 튜브의 하면으로부터 일정 간격 이격된 높이에 형성된다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브는 온도감응성 격막에 의해 2개의 공간으로 분리된다. 여기서, 온도감응성 격막의 상부에 있는 공간을 제1챔버, 온도감응성 격막의 하부에 있는 공간을 제2챔버라고 한다. 제1챔버는 1차 시발체 및 증폭 효소 등을 넣고 1차 증폭을 진행시킬 수 있다. 제2챔버는 2차 시발체를 포함하고 있다. 온도감응성 격막은 녹는점이 87~99℃의 범위 내이고, 바람직하게는 90~99℃의 범위 내인 물질로서, 튜브 내 온도가 90℃ 이하에서는 고체 상태이고, 90℃ 이상에서는 상변이를 일으켜 용융되는 물질이다. 구체적으로는, 온도감응성 격막으로 사용될 수 있는 폴리머의 구현예를 하기 표 1에 나타낸다.

실시예 1에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브는 상기한 바와 같이 형성됨으로써, 시료 DNA 샘플에 시발체를 2중으로 결합시키는 경우에 하나의 튜브 내에서 용이하게 이중중합효소연쇄반응을 실시할 수 있다.

실시예 2: 이중중합효소연쇄반응용 튜브(2)

도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 온도감응성 격막을 구비하는 이중중합효소연쇄반응용 튜브를 사용하여 이중중합효소연쇄반응을 진행하는 과정을 나타내는 모식도이다.

도 2를 참조하면, 본 발명의 다른 실시예에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브에서의 온도감응성 격막은 튜브의 높이 방향, 즉 종방향이고, 튜브의 하면으로부터 튜브의 개구까지 연결되어 형성된다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브는 온도감응성 격막에 의해 2개의 공간으로 분리된다. 여기서, 온도감응성 격막의 좌측에 있는 공간을 제1챔버, 온도감응성 격막의 우측에 있는 공간을 제2챔버라고 한다. 제1챔버는 1차 시발체 및 증폭 효소를 넣고 1차 증폭을 진행시킬 수 있다. 제2챔버는 2차 시발체를 포함하고 있다. 온도감응성 격막은 녹는점이 87~99℃의 범위 내이고, 바람직하게는 90~99℃의 범위 내인 물질로서, 튜브 내 온도가 90℃ 이하에서는 고체 상태이고, 90℃ 이상에서는 상변이를 일으켜 용융되는 물질이다.

실시예 2에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브는 상기한 바와 같이 형성됨으로써, 시료 DNA 샘플에 시발체를 2중으로 결합시키는 경우에 하나의 튜브 내에서 용이하게 이중중합효소연쇄반응을 실시할 수 있다. 또한, 실시예 2에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브는 시판시에 2차 시발체를 미리 준비하지 않고, 실험자의 필요에 따라 임의로 넣을 수 있다는 장점이 있다.

실시예 3: 이중중합효소연쇄반응용 튜브(3)

도 3은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 온도감응성 격막을 구비하는 이중중합효소연쇄반응용 튜브를 사용하여 이중중합효소연쇄반응을 진행하는 과정을 나타내는 모식도이다.

도 3을 참조하면, 본 발명의 다른 실시예에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브에서의 온도감응성 격막은 2차 시발체를 둘러싸는 캡슐 형상으로 형성되어, 격막 내측과 외측으로 구분되도록 형성된다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브는 온도감응성 격막에 의해 2개의 공간으로 분리된다. 즉, 이중중합효소연쇄반응용 튜브는 온도감응성 격막으로 인하여, 캡슐 형상의 외측에 있는 공간 및 캡슐 형상의 내측에 있는 공간을 형성한다. 하나의 튜브에 1차 시발체와 증폭 효소, 및 온도감응성 격막으로 둘러싸인 2차 시발체를 한번에 넣고, 이중중합효소연쇄반응을 실시할 수 있다. 온도감응성 격막은 녹는점이 87~99℃의 범위 내이고, 바람직하게는 90~99℃의 범위 내인 물질로서, 튜브 내 온도가 90℃ 이하에서는 고체 상태이고, 90℃ 이상에서는 상변이를 일으켜 용융되는 물질이다.

실시예 3에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브는 상기한 바와 같이 형성됨으로써, 시료 DNA 샘플에 시발체를 2중으로 결합시키는 경우에 하나의 튜브 내에서 용이하게 이중중합효소연쇄반응을 실시할 수 있다. 또한, 실시예 3에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브는 1차 증폭 동안에 2차 시발체에 영향을 줄 수 있는 어떠한 오염도 방지할 수 있다는 장점이 있다.

실험예 : 본 발명에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브를 사용하여 증폭 방법

본 실험예는 본 발명에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브를 사용하여, 차세대염기서열분석(next-generation sequencing) 분석을 위한 라이브러리(library) 증폭 산물을 얻기 위한 이중중합효소연쇄반응의 일례이다. 본 발명에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브에 사용될 DNA 물질은 MLH1 유전자의 3개 엑손(exon 1, exon 2 및 exon 3)을 테스트 대상으로 하였다. 또한, 이하와 같이 PCR을 진행한 후 증폭 산물을 얻어 전기영동을 실행하였다.

·1차 증폭

1차 시발체 세트(이하, 표 2 참조). 1㎕ DNA 추출물, 5㎕ 10x PCR 완충액, 1㎕ dNTP 혼합액(각 dNTP의 최종농도는 400μM), 1㎕ Taq(Roche, Mannheim, 독일), 각각의 시발체 1㎕(10pM), 및 뉴클리아제-비함유 증류수를 함유하는 50㎕ 반응 용적으로 각각의 샘플에 대한 PCR 분석을 수행하였다. 1단계 PCR 반응은 87℃에서 5분간 전가열단계를 거치고 나서, 30싸이클 증폭(87℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초)하여 수행하였다. 이때, 본 발명에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브의 온도감응성 격막의 상변이에 영향을 주지 않도록 온도는 90℃ 이하에서 증폭을 실시하였다. 최종 연장 단계는 GeneAmp PCR system 9700 thermal cycler(어플라이드 바이오시스템즈사, Foster City, CA, USA)를 사용하고 72℃에서 10분간 수행하였다.

· 온도감응성 격막의 상변이

1차 증폭이 끝난 후, 온도를 90℃ 이상으로 상승시켰다. 온도 상승에 의해 온도감응성 격막이 용융되면서 1차 증폭이 실시된 공간으로 2차 시발체가 혼입되었다. 하나의 튜브 내에서 1차 증폭이 실시 후, 이하와 같이 2차 증폭을 실시하였다.

·2차 증폭

온도감응성 격막으로 분리된 공간에 배치된 2차 시발체 세트(이하, 표 3 참조). 1차 PCR 결과물인 DNA 추출물(동일 튜브 내에 있다), 5㎕ 10x PCR 완충액, 1㎕ dNTP 혼합액(각 dNTP의 최종농도는 400μM), 1㎕ Taq(Roche, Mannheim, 독일), 각각의 시발체 1㎕(10pM), 및 뉴클리아제-비함유 증류수를 함유하여 각각의 샘플에 대한 PCR 분석을 수행하였다. PCR 반응은 5싸이클 증폭(95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초)하여 수행하였다. 최종 연장 단계는 GeneAmp PCR system 9700 thermal cycler(어플라이드 바이오시스템즈사, Foster City, CA, USA)를 사용하고 72℃에서 10분간 수행했다. PCR 생성물을 1×TAE Migration 완충용액(pH 8.0; 40mM Tris-Acetate, 1mM EDTA)에서 2% 아가로스젤에 전개하고 EtBr(0.5㎍/㎖)로 염색하여 UV광선 하에서 육안관찰하였다(도 4 참조).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일뿐이며, 이에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (19)

1. 이중중합효소연쇄반응에 사용되는 시험 튜브로서,
   하나의 튜브 내에서 1차 시발체를 수용하는 제1챔버,
   2차 시발체를 수용하는 제2챔버, 및
   2차 시발체를 공간적으로 분리하는 온도감응성 격막을 포함하는, 이중중합효소연쇄반응용 튜브.
2. 제1항에 있어서,
   상기 온도감응성 격막은 상기 이중중합효소연쇄반응용 튜브의 높이 방향과 수직하는 방향이고, 튜브의 하면으로부터 일정 간격 이격된 높이에 형성되는, 이중중합효소연쇄반응용 튜브.
3. 제1항에 있어서,
   상기 온도감응성 격막은 상기 이중중합효소연쇄반응용 튜브의 높이 방향이고, 튜브의 하면으로부터 튜브의 개구까지 연결되어 형성되는, 이중중합효소연쇄반응용 튜브.
4. 제1항에 있어서,
   상기 온도감응성 격막은 2차 시발체를 둘러싸는 캡슐 형상으로 형성되는, 이중중합효소연쇄반응용 튜브.
5. 제1항에 있어서,
   상기 온도감응성 격막은 녹는점이 87~99℃의 범위 내인 물질로서, 상기 이중중합효소연쇄반응용 튜브 내 온도가 90℃ 이하에서는 고체 상태이고, 90℃ 이상에서는 상변이를 일으켜 용융되는 물질인, 이중중합효소연쇄반응용 튜브.
6. 제5항에 있어서,
   상기 온도감응성 격막은 녹는점이 90~99℃의 범위 내인 물질인, 이중중합효소연쇄반응용 튜브.
7. 제1항에 따른 이중중합효소연쇄반응용 튜브에,
   1차 시발체 및 피검체를 제1챔버에 첨가하고, 2차 시발체를 제2챔버에 첨가하는 단계,
   25℃ 이상 90℃ 이하의 온도 범위에서 1차 PCR 증폭 사이클을 실시하는 단계,
   90℃ 이상으로 상승시켜 온도감응성 격막의 상변이를 일으켜 2차 시발체를 제1챔버로 첨가시키는 단계, 및
   2차 PCR 증폭 사이클을 실시하는 단계를 포함하는, 이중중합효소연쇄반응용 튜브의 사용 방법.
8. 제7항에 있어서,
   제1챔버에 DNA 중합효소 및 완충액을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 이중중합효소연쇄반응용 튜브의 사용 방법.
9. 제7항에 있어서,
   상기 온도감응성 격막은 상기 이중중합효소연쇄반응용 튜브의 높이 방향과 수직하는 방향이고, 튜브의 하면으로부터 일정 간격 이격된 높이에 형성되는, 이중중합효소연쇄반응용 튜브의 사용 방법.
10. 제7항에 있어서,
    상기 온도감응성 격막은 상기 이중중합효소연쇄반응용 튜브의 높이 방향이고, 튜브의 하면으로부터 튜브의 개구까지 연결되어 형성되는, 이중중합효소연쇄반응용 튜브의 사용 방법.
11. 제7항에 있어서,
    상기 온도감응성 격막은 2차 시발체를 둘러싸는 캡슐 형상으로 형성되는, 이중중합효소연쇄반응용 튜브의 사용 방법.
12. 제7항에 있어서,
    상기 온도감응성 격막은 녹는점이 87~99℃의 범위 내인 물질로서, 상기 이중중합효소연쇄반응용 튜브 내 온도가 90℃ 이하에서는 고체 상태이고, 90℃ 이상에서는 상변이를 일으켜 용융되는 물질인, 이중중합효소연쇄반응용 튜브의 사용 방법.
13. 제12항에 있어서,
    상기 온도감응성 격막은 녹는점이 90~99℃의 범위 내인 물질인, 이중중합효소연쇄반응용 튜브의 사용 방법.
14. 내측 공간에 온도감응성 격막을 설치하여, 제1챔버 및 제2챔버를 구분시킨 이중중합효소연쇄반응용 튜브 제조 방법.
15. 제14항에 있어서,
    상기 온도감응성 격막을 내측 공간에 수평방향으로 설치하는 단계를 포함하는 이중중합효소연쇄반응용 튜브 제조 방법.
16. 제14항에 있어서,
    상기 온도감응성 격막을 내측 공간에 수직방향으로 설치하는 단계를 포함하는 이중중합효소연쇄반응용 튜브 제조 방법.
17. 제14항에 있어서,
    상기 온도감응성 격막을 2차 시발체를 둘러싸는 캡슐 형상으로 형성하는 단계를 포함하는 이중중합효소연쇄반응용 튜브 제조 방법.
18. 제14항에 있어서,
    상기 온도감응성 격막은 녹는점이 87~99℃의 범위 내인 물질로서, 상기 이중중합효소연쇄반응용 튜브 내 온도가 90℃ 이하에서는 고체 상태이고, 90℃ 이상에서는 상변이를 일으켜 용융되는 물질인, 이중중합효소연쇄반응용 튜브 제조 방법.
19. 제18항에 있어서,
    상기 온도감응성 격막은 녹는점이 90~99℃의 범위 내인 물질인, 이중중합효소연쇄반응용 튜브 제조 방법.

Images