KR101191305B1 - 핵산증폭방법을 이용한 세포치료제 오염 세균 또는 진균의 검출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포치료제 제조시 쉽게 오염될 수 있는 세균 및 진균을 검출할 수 있는 핵산증폭 방법, 이 방법에 사용되는 프라이머쌍, 및 이를 포함하는 미생물 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 새롭게 제작된 핵산증폭용 프라이머쌍을 이용하면 세포치료제 제조, 보관 및 투여시 쉽게 오염될 수 있는 미생물을 신속하고 정확하며 재현성 있게 검출할 수 있다. 본 발명에서 제안되는 핵산증폭 방법에 의하면 기존의 세포치료제의 무균시험법을 대체하여 경제적이면서 신속하고 정확한 무균시험법을 제공할 수 있는 효과가 있다.

핵산 증폭방법, 중합효소연쇄반응(PCR), PCR 프라이머, 세포치료제, 오염미생물, 병원성미생물, 세균, 진균, 무균시험법, 다중 PCR(multiplex PCR)

Description

핵산증폭방법을 이용한 세포치료제 오염 세균 또는 진균의 검출방법{Method for Detecting Bacteria or Fungi Contaminated in Therapeutic Cells by Using PCR}

본 발명은 세포치료제 제조시 쉽게 오염될 수 있는 세균 및 진균을 검출할 수 있는 핵산증폭 방법의 프라이머쌍, 이를 이용한 세균 및 진균의 검출 방법 및 검출 키트에 관한 것이다.

현재 세포치료제로는 자가, 동종 또는 이종의 세포 또는 조직에서 유래한 것을 체외 조작과정을 거쳐 여러 질병의 치료 및 예방에 이용되고 있다. 생체 세포를 이용한 세포치료제는 줄기세포를 이용한 난치성 질병 예를 들어 치매, 뇌손상, 척추신경 손상, 관절염, 심장병, 당뇨병 등의 치료, 면역세포 예를 들어 수지상세포(dendritic cell), 자연살해세포(natural killer cell), 세포독성 T 세포 및 사이토카인 유도-살해세포(cytokine-induced killer cell)를 이용한 암치료 등의 분야에서 집중적으로 개발되고 있으며, 국내에서도 임상시험 연구가 진행되고 있다. 또한, 연골세포를 이용한 관절염 치료제 및 항암 면역세포치료제와 같은 몇몇의 제품은 이미 식약청의 허가를 획득하였고, 허가를 신청 중인 제품도 이미 10여종 이상인 것으로 알려지고 있다.

세포치료제는 각종 신체 장기 및 세포의 기능을 대치하기 위한 신개념의 맞춤의약품으로 각광 받고 있으나, 실용화를 위해서는 몇몇 개발단계에서의 기술적, 제도적 및 윤리적 제약요소들이 해결되어야 할 것이다. 특히, 치료용 세포의 순도, 유효성 및 유전적 안정성의 검증은 물론 제조와 조작과정에서 미생물학적 안전성이 확보가 우선적으로 요구되고 있다(Microbial Limit Tests, USP 24, USPC, Inc., Rockville, MD, 2000, p.1814; Sterility Tests, USP 24, USPC, Inc., Rockville, MD, 2000, p.1818).

세포치료제는 생체재료, 생화학물질 및 합성물질 등의 기질과 체외 조작과정에서 다양한 미생물의 오염이 가능하며 이를 전파할 수 있다. 따라서 세포치료제의 생산과 투여의 전 과정에서 다양한 항목의 안전성 평가가 이루어져야 하며 특히 미생물학적 안전성은 환자의 건강권 확보에 필수적이다. 세포치료제에 오염 가능한 바이러스, 세균, 진균류, 기생충 등의 미생물을 검출하는데 이용될 수 있는 시험법은 직접배양법, 형광항체 염색법, 효소면역반응, 적혈구응집반응, 전자 현미경법 등을 원용할 수 있으나 이들은 감도, 경제성, 시간, 시료의 양 및 재현성 등에서 단점을 지니며 현재 표준 무균시험법으로 자리 잡고 있는 직접 배양법도 세포치료제의 무균시험법으로 적합하지 않다(Direct estimate fo active bacteria: CTC use and limitation. J Microbiol Methods. 52:19-28. 2003; PNA for rapid microbiology. J Microbiol Methods48:1-17. 2002; Khuu HM, Stock F, McGann M, Carter CS, Atkins JW, Murray PR, Read EJ. Comparison of automated culture systems with a CFR/USP-compliant method for sterility testing of cell-therapy products. Cytotherapy. 2004 6(3):183-95; Cell therapy using human embryonic stem cells. Transpl. Immunol. 2004 12:203-209: Adult neural stem cells: attempting to solve the identity crisis. Dev Neurosci.26:93-100. 2004).

최근에는 FISH (Fluorescent In Situ Hybridization), PNA(Peptide Nucleic Acid)-FISH, DNA 형광염색법 (Acridine Orange, 4,6-diamino-2-phenylindole, Propidium iodide 등), 산화 환원력 시험법(5-cyano-2,3-ditoyl tetrazolium chloride) 등이 개발되어 왔으나, 많은 양의 세균수를 필요로 함은 물론 별도의 고가 장비(형광현미경, 흡광기)를 요구하고 감도와 경제성 면에서 단점이 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 세포치료제의 제조 및 투여까지의 전과정에서 오염 가능한 다 양한 미생물군의 오염 여부를 적은 시료의 양으로 신속 및 정확하게 판별할 수 있는 무균시험법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과 세포치료제 제조 시 고빈도로 오염될 수 있는 미생물군을 검출할 수 있는 핵산증폭용 프라이머를 개발하였고, 이를 세포치료제의 무균시험법으로 활용 가능함을 증명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 세포치료제의 오염 미생물군을 검출하기 위한 용도의 핵산증폭용 프라이머쌍을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머쌍을 포함하는 세포치료제의 오염 미생물 검출용 키트를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머쌍을 이용한 핵산증폭방법을 통해 세포치료제 오염 미생물을 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 핵산증폭방법을 이용한 하기의 미생물군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 미생물 검출 방법으로서, (a) 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 시료의 DNA와 프라이머쌍을 이용하여 핵산 증폭반응을 행하는 단계; 및 (c) 상기 증폭된 핵산 산물을 검출 하는 단계를 포함하고, 상기 프라이머쌍은 i) 서열목록 제1서열을 갖는 전방향 프라이머 및 서열목록 제2 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍; ⅱ) 서열목록 제3서열을 갖는 전방향 프라이머 및 서열목록 제4서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍; 또는 ⅲ) 상기 프라이머쌍들의 조합이고, 상기 미생물군은 다음의 미생물들로 이루어지는 것을 특징으로 하는 검출 방법을 제공한다: 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis), 살모넬라 티피뮤리엄 (Salmonella typhimurium), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 플루오레슨스 (Pseudomonas fluorescens), 엔테로박터 아로게네스 (Enterobacter aerogenes), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 대장균 (Escherichia coli), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 캐피티스 (Staphylococcus capitis), 화농성연쇄상구균 (Streptococcus pyogenes), 폐렴연쇄상구균 (Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스 (Streptococcus mitis), 코리네박테리움 디프테리에 (Corynebacterium diptheriae), 코리네박테리움 아코렌스 (Corynebacterium accolens), 박테리오데스 불가투스 (Bacteroides vulgatus), 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes), 엔테로코커스 피칼리스 (Entrococcus faecalis), 마이코박테리움 아비움 (Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 포투이튬 (Mycobacterium fortuitum), 마이코박테리움 고르도니에 (Mycobacterium gordonae), 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 츨가이 (Mycobacterium szulgai), 마이코박테리움 테라에 (Mycobacterium terrae), 아스퍼질러스 나이거 (Asperigillus niger), 칸다디아 알피칸스 (Candida albicans), 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 말라세씨아 푸르푸르 (Malasazia furfur).

이하에서 본 발명의 방법을 단계별로 나누어 상세히 설명한다.

단계 (a): 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계

본 발명의 검출 방법은 세균(bacteria) 또는 진균(fungi)이 오염되었을 것으로 예상되는 시료(sample)에 적용할 수 있다. 본 발명의 시료는 예를 들어 배양된 세포(cultured cell), 단백질 또는 핵산, 또는 이를 포함하는 생물학적 의약제 및 세포치료제를 포함한다.

검출 대상인 세균(bacteria) 또는 진균(fungi)의 세포로부터의 DNA의 분리는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있고, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다. 예컨대, 본 발명에서 세균 또는 진균 세포의 genomic DNA는 페놀-클로로포름 추출 방법으로 얻을 수 있다(Neumann B, et al., Rapid isolation of genomic DNA from Gram-negative bacteria., Trends Genet. 8:332-333(1992)).

단계 (b): 상기 추출된 시료의 DNA 와 프라이머쌍을 이용하여 핵산 증폭반응을 행하는 단계

본 명세서에 기술된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구연쇄반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)(21, 22) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)(23)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 증폭 반응은 중합효소연쇄반응 (PCR; polymerase chain reaction)에 따라 실시된다. 상기 중합효소연쇄반응(PCR)은 특정 DNA 단편을 선별적으로 증폭하는 방법으로서 이에 대한 내용은 Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822))에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

중합효소연쇄반응(PCR)은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 명세서에서 용어 "프라이머(primer)"는 핵산의 증폭반응시에 증폭 되는 타깃 핵산 부위의 5' 말단 서열 및 3' 말단 서열에 각각 상보적이며 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)하에서 주형-지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

본 발명의 프라이머는 세균(bacteria) 또는 진균(fungi) 게놈서열 중에서 종(species) 보존적인 세균의 16S rDNA 또는 진균의 18S rDNA 영역을 표적으로 하였기 때문에 다양한 종류의 세균 및 진균을 특이적으로 검출할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 프라이머는 세포치료제의 제조과정에서 고빈도로 오염될 수 있는 총 31 종의 미생물군에서 보존된 16S 또는 18S rDNA의 뉴클레오타이드 서열의 상동성을 조사하고, 이 조사결과에 기초하여 상기 미생물들을 검출할 수 있도록 디자인된 프라이머쌍이다.

본 발명의 핵산 증폭 반응에 포함되는 프라이머쌍은 (ⅰ) 세균(bacteria) 16S rDNA에 특이적인 서열목록 제1서열의 전방향 프라이머와 서열목록 제2서열의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍 (ⅱ) 진균(fungi) 18S rDNA에 특이적인 서열목록 제3서열의 전방향 프라이머와 서열목록 제4서열의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍 및 iii) 상기 프라이머쌍의 조합으로 이루어진다.

본 발명의 프라이머쌍은 상기 열거한 미생물들의 보존된 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합할 수 있으므로, 상기 미생물들 각각의 검출 뿐만 아니라 둘 이상의 미생물을 동시에 검출하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 프라이머쌍 중에서 서열목록 제1서열을 갖는 전방향 프라이머 및 서열목록 제2서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍은 다음의 세균(bacteria)들을 검출하는데 사용된다: 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis), 살모넬라 티피뮤리엄 (Salmonella typhimurium), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 플루오레슨스 (Pseudomonas fluorescens), 엔테로박터 아로게네스 (Enterobacter aerogenes), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 대장균 (Escherichia coli), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 캐피티스 (Staphylococcus capitis), 화농성연쇄상구균 (Streptococcus pyogenes), 폐렴연쇄상구균 (Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스 (Streptococcus mitis), 코리네박테리움 디프 테리에 (Corynebacterium diptheriae), 코리네박테리움 아코렌스 (Corynebacterium accolens), 박테리오데스 불가투스 (Bacteroides vulgatus), 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes), 엔테로코커스 피칼리스 (Entrococcus faecalis), 마이코박테리움 아비움 (Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 포투이튬 (Mycobacterium fortuitum), 마이코박테리움 고르도니에 (Mycobacterium gordonae), 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 츨가이 (Mycobacterium szulgai), 마이코박테리움 테라에 (Mycobacterium terrae).

본 발명의 프라이머쌍 중에서 서열목록 제 3 서열을 갖는 전방향 프라미어 및 서열목록 제 4서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍은 다음의 진균(fungi)들을 검출하는데 사용된다: 아스퍼질러스 나이거 (Asperigillus niger), 칸다디아 알피칸스 (Candida albicans), 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 말라세씨아 푸르푸르 (Malasazia furfur).

본 발명에서 핵산 증폭반응에서 상기 단계 (a)에서 시료로부터 추출한 DNA가 반응의 주형 DNA로서 사용된다.

다양한 DNA 중합효소가 증폭 반응에 이용될 수 있으며, 예컨대 E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow) 단편", 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다.

바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

본 발명에서 증폭 반응액에는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합 효소 조인자 를 포함할 수 있다.

유전자 증폭 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg^{2 +}와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 타겟 주형 DNA의 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 서열 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격 조건하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 본 발명에서의 상기 중합효소증폭 반응은 (ⅰ) 95℃에서 20초간의 변성(denaturation) 과정 (ⅱ) 57℃에서 30초간의 어닐링(annealing) 과정 및 (ⅲ) 72℃에서 90초간의 신장(elongation) 과정으로 이 루어지는 1 사이클을 40회 반복 수행하는 단계를 포함한다.

단계 (c): 증폭된 핵산 산물을 검출하는 단계

본 발명의 프라이머쌍을 이용하여 증폭된 rDNA 폴리뉴클레오타이드 서열의 산물은 적합한 방법으로 분석된다. 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석함으로써 증폭된 rDNA 산물을 분석한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 증폭된 rDNA 폴리뉴클레오타이드 서열 산물을 RFLP (Restriction Polymorphism Length Polymorphism) 분석을 통해 세균 및 진균의 종류를 보다 상세하게 분석할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 서열목록 제1서열을 갖는 전방향 프라이머 및 서열목록 제2서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용하여 증폭한 rDNA 폴리뉴클레오타이드 산물을 제한효소 Sau3AI 또는 HhaI 처리한 후 RFLP 타이핑(typing) 분석을 행한다.

본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에 의하면, 서열목록 제3서열을 갖는 전방향 프라이머 및 서열목록 제4서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용하여 PCR 증폭한 rDNA 폴리뉴클레오타이드 산물을 제한효소 SauA3AI으로 처리하여 RFLP 타이핑 분석을 행한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 ⅰ) 서열목록 제1서열을 갖는 전방향 프라이머 및 서열목록 제2서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍 ⅱ) 서열목록 제3서열을 갖는 전방향 프라이머 및 서열목록 제4서열을 갖는 역 방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍 또는 ⅲ) 상기 프라이머쌍의 조합으로서, 하기의 미생물로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 미생물을 검출하기 위한 핵산 증폭용 프라이머쌍을 제공한다: 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis), 살모넬라 티피뮤리엄 (Salmonella typhimurium), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 플루오레슨스 (Pseudomonas fluorescens), 엔테로박터 아로게네스 (Enterobacter aerogenes), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 대장균 (Escherichia coli), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 캐피티스 (Staphylococcus capitis), 화농성연쇄상구균 (Streptococcus pyogenes), 폐렴연쇄상구균 (Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스 (Streptococcus mitis), 코리네박테리움 디프테리에 (Corynebacterium diptheriae), 코리네박테리움 아코렌스 (Corynebacterium accolens), 박테리오데스 불가투스 (Bacteroides vulgatus), 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes), 엔테로코커스 피칼리스 (Entrococcus faecalis), 마이코박테리움 아비움 (Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 포투이튬 (Mycobacterium fortuitum), 마이코박테리움 고르도니에 (Mycobacterium gordonae), 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 츨가이 (Mycobacterium szulgai), 마이코박테리움 테라에 (Mycobacterium terrae), 아스퍼질러스 나이거 (Asperigillus niger), 칸다디아 알피칸스 (Candida albicans), 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 말라세씨아 푸르푸르 (Malasazia furfur).

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머쌍을 포함하며, 상기 미생물로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 미생물을 검출하기 위한 핵산 증폭용 검출 키트를 제공한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 본 발명의 상기 서열목록 제1서열을 갖는 전방향 프라이머 및 서열목록 제2서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 세균(bacteria) 검출을 위한 프라이머쌍과 서열목록 제3서열을 갖는 전방향 프라이머 및 서열목록 제4서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 진균(fungi) 검출을 위한 프라이머쌍을 혼합하여 수행하는 핵산 증폭방법은 상기 미생물로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 둘 이상의 미생물을 동시에 검출한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 키트는 (a) dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP); (b) DNA 중합효소 및 (c) 완충(buffer)용액을 더욱 포함한다.

본 발명의 검출 키트는 선택적으로, 핵산 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

이상에서 상세하게 설명된 바와 같이, 본 발명은 세포치료제 제조시 쉽게 오염될 수 있는 세균 및 진균을 검출할 수 있는 핵산증폭 방법, 이 방법에 사용되는 프라이머쌍, 및 이를 포함하는 미생물 검출용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 새롭게 제작된 핵산증폭용 프라이머쌍을 이용하면 세포치료제 제조, 보관 및 투여시 쉽게 오염될 수 있는 미생물을 신속하고 정확하며 재현성 있게 검출할 수 있다. 본 발명에서 제안되는 핵산증폭 방법에 의하면 기존의 세포치료제의 무균시험법을 대체하여 경제적이면서 신속하고 정확한 무균시험법을 제공할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1 : 본 발명 실험에 사용한 세균 및 진균 균주

하기 표 1 및 표 2에 세포치료제 제조시 고빈도로 오염되는 미생물로서, 본 발명의 실험에 사용한 세균 및 진균 균주를 표시하여 나타내었다.

Strain	ATCC number	구입처
Staphylococcus epidermidis	12228	KCTC 1917
Salmonella typhimurium	13311	KCTC 2514
Pseudomonas aeruginosa	9027	KCTC 2513
Pseudomonas fluorescens	49642	KCTC 12028
Enterobacter aerogenes	13048	KCTC 2190
Bacillus subtilis	6633	KCTC 1021
Bacillus cereus	14579	KCTC 3624
Escherichia coli	-	MG1655 lab stock strain
Corynebacterium glutamicum	13032	KCTC 1445
Corynebacterium ammoniagenes	6871	KCTC 1018
Staphylococcus aureus	6538	KCTC 3881
Staphylococcus capitis	35661	KCCM 41466
Streptococcus pyogenes	19615	KCTC 3208
Streptococcus pneumoniae	33400	KCTC 5412
Streptococcus mitis	49456	KCTC 13047
Corynebacterium diptheriae	11913	KCTC 3075
Corynebacterium accolens	49725	KCTC 3431
Bacteroides vulgatus	8482	ATCC 8482
Propionibacterium acnes	6919	KCTC 3314
Entrococcus faecalis	19433	KCTC 3206
Mycobacterium avium	BAA-968	ATCC BAA-968D
Mycobacterium bovis (BCG)	ATCC BAA-968D	ATCC 19015D
Mycobacterium fortuitum	11440	-
Mycobacterium gordonae	35760	ATCC 35760D
Mycobacterium kansasii	12478	-
Mycobacterium szulgai	29717	-
Mycobacterium terrae	15755	-

Strain	ATCC number	구입처
Aspergillus niger	16404	KCTC 6317
Candida albicans	10231	KCTC 7965
Saccharomyces cerevisiae	-	W303 lab stock strain
Malassezia furfur	14521	KCTC 7545

또한, 도 1a 및 도 1b에 본 실험에 사용한 세균 및 진균 균주의 형태를 보여주는 사진을 나타내었다.

실시예 2 : 세균 또는 진균 검출용 프라이머의 설계

상기 실시예 1에 나타낸 세균 또는 진균은 세포치료제 제조 과정에서 고빈도로 오염되는 미생물이다. 상기 다수의 세균 또는 진균을 동시에 특이적으로 검출할 수 있도록 프라이머쌍을 디자인하였다.

세균과 같은 원핵생물(prokaryote)의 16S rDNA 염기서열이 매우 잘 보존되어 있다. 따라서, 상기 세균들의 16S rDNA 염기서열을 증폭 표적으로 선택하였다. 1994년 Julie D. Thompson 등에 의해 개발된 다중 서열 정렬 프로그램인 Clustal W (http://www.ccbb.re.kr/clustalW.php)를 이용하여 27종 세균들의 16S rDNA 유전자 염기서열의 유사성을 비교 분석하였고, 분석한 결과로부터 27종 세균의 공통적인 염기서열 부분을 선택하였다. 이 때 27종 세균의 염기서열이 공통적인 부분이지만 일부 염기가 100％ 일치하지 않은 경우, 다종의 세균의 타겟 DNA 염기 서열과 결합될 수 있도록 일치되지 않는 일부 염기를 혼합염기(mixed base; C/T -> Y, T/A -> W)로 대체하여 설계하였다. 상기의 방법으로 디자인한 프라이머는 아래 표 3에 나타내었다.

특이성	명칭	서열	길이(mer)	Tm(℃)
전방향	MB-F1 서열목록 제1서열	GCYTA AYACA TGCAA GT	17	46
역방향	MB-R2 서열목록 제2서열	TGAYT TGACG TCATC CCCAC CTTCC	25	76

상기 세균에서 설명된 방법과 동일한 방법으로 상기 진균의 18S rDNA 염기서열을 증폭 표적으로 선택하고, 다중 서열 정렬 프로그램인 Clustal W를 이용하여 종의 진균들의 18S rDNA 유전자 염기서열의 유사성을 비교 분석하였다. 분석 결과로부터 4종 진균의 공통적인 염기서열 부분을 선택하였다. 이 때 4종의 진균 염기서열이 공통적인 부분이지만 일부 염기가 100％ 일치하지 않은 경우, 다종의 진균의 타겟 DNA 염기서열과 결합될 수 있도록 일치되지 않는 일부 염기를 혼합염기(mixed base C/T -> Y, T/A -> W)로 대체하여 설계하였다. 상기의 방법으로 디자인한 프라이머는 아래 표 4에 나타내었다.

특이성	명칭	서열	길이(mer)	Tm(℃)
전방향	YE-F 서열목록 제3서열	TTCAT TCAAA TWTCT GCCCT ATCAA C	26	70
역방향	YE-R2 서열목록 제4서열	ACTTT GATTT CTCGT AAGGT GCCG	24	70

실시예 3 : 본 발명의 각 프라이머쌍의 세균 검출 특이도 검사

상기 실시예 2에서 설명된 방법으로 제조된 세균 검출용 프라이머쌍 MB-F1(서열목록 제1서열) 및 MB-R2(서열목록 제2서열)을 사용한 세균에 대한 검출 특이도를 측정하였다. 우선, 세포치료제 제조시 고빈도로 오염되는 세균 중 하나인 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)에 대한 검출 특이도를 검사하였다.

스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)를 250g에서 3분간 원심분리하여 상층액을 취한 후, 새 마이크로 튜브에 넣고 95℃에서 5분간 가열하고, 살짝 원심분리하여 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 PCR 반응에 주형으로 사용하기 전까지는 -20℃ 에서 보관하였다.

PCR 반응은 총 반응물의 양을 25㎕로 수행하였으며, PCR 반응 샘플간의 오차를 줄이기 위하여 주형으로 사용할 DNA 추출물을 제외한 나머지 반응물을 모두 섞어 마스터 혼합물(master mix)을 만들어서 수행하였다. 여러 종의 세균 및 진균 검출을 최적화할 수 있도록 간편하게 PCR 조건을 설정할 수 있도록 고안된 2X Taq premix 2 (SolGent사, STD02-M50h)를 사용하였다.

분석하고자 하는 시료 외에 음성대조군으로서 증류수, human genomic DNA 또는 mouse genomic DNA, 또는 진균 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) genomic DNA를 주형으로 하여 분석시료와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다.

PCR을 종료한 각 반응액 10㎕을 2.5% NuSieve:Seckem 아가로스 겔 상에 로딩하여 150V 전압으로 전기영동 하였다. 전기영동한 아가로스 겔을 EtBr로 염색한 후, UV 광선투사기(trans-illuminator)로 조사하여 PCR 산물의 밴드 유무와 그 크기를 확인하였다.

검출 특이도 검사 결과는 도 2a에 나타내었다. 도 2a의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 세균 검출용 프라이머쌍 MB-F1(서열목록 제1서열) 및 MB-R2(서열목록 제2서열)는 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)에 대해 특이적인 검출능을 나타내었다.

이어서, 상기 프라이머쌍의 세포치료제 고빈도 오염균인 총 27종 세균에 대한 검출 특이도를 검사하였다. 세균 genomic DNA의 분리 및 PCR 반응의 수행은 상기 설명된 방법과 동일하게 수행하였다. 검사결과는 도 2b에 나타내었다. 도 2b의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 세균 검출용 프라이머쌍은 세균 27종에 대해 특이적인 검출능을 보여 주었다.

실시예 4 : 본 발명의 각 프라이머쌍의 진균 검출 특이도 검사

상기 실시예 2에서 설명된 방법으로 제조된 진균 검출용 프라이머쌍 YE-F(서열목록 제3서열) 및 YE-R2(서열목록 제4서열)을 사용한 PCR의 진균에 대한 검출 특이도를 측정하였다.

Genomic DNA의 추출, PCR의 수행 방법 및 PCR산물의 검출은 상기 실시예 3에서 설명된 방법과 동일한 방법으로 행하였다. 이 때, 분석하고자 하는 시료 외에 음성대조군으로서 증류수, human genomic DNA 또는 mouse genomic DNA, 또는 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis) genomic DNA를 주형으로 하여 분석시료와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. 검사결과는 도 2c에 나타내었다.

도 2c에 나타낸 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 진균 검출용 프라이머쌍은 아스퍼질러스 나이거 (Asperigillus niger), 칸다디아 알피칸스 (Candida albicans), 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 말라세씨아 푸르푸르 (Malasazia furfur)의 진균에 대해서 특이적인 검출능을 보였다.

실시예 5: PCR 증폭산물의 RFLP ( restriction fragment length polymorphism ) 분석

5-1. 세균에 대한 PCR 증폭산물 RFLP 분석

상기 실시예 3에서 얻은 세균에 대한 PCR 증폭 산물을 정제한 후 제한효소 Sau3AI 처리 또는 HhaI 처리하여 RFLP 분석을 행하였다. 분석결과는 도 3a 및 도 3b에 나타내었다. 세균의 PCR 증폭 산물에 대한 RFLP 분석을 통해 검출된 세균의 구체적인 종류를 확인할 수 있다.

5-2. 진균에 대한 PCR 증폭산물 RFLP 분석

상기 실시예 4에서 얻은 진균에 대한 PCR 증폭 산물을 정제한 후 제한효소 Sau3AI 처리하여 RFLP 분석을 행하였다. 분석결과는 도 3c에 나타내었다. 진균의 PCR 증폭 산물에 대한 RFLP 분석은 검출된 진균의 구체적인 종류를 확인하는데 사용될 수 있다.

실시예 6 : 본 발명의 PCR 방법에 의한 각 균주의 검출 민감도 검사

6-1. 세균에 대한 본 발명의 PCR 방법의 민감도 검사

상기 실시예 2에서 설명된 방법으로 제조된 세균 검출용 프라이머쌍 MB-F1(서열목록 제1서열) 및 MB-R2(서열목록 제2서열)을 이용한 본 발명의 PCR 방법의 각 세균 균주에 대한 검출 민감도를 측정하였다. 각 균주의 genomic DNA의 농도를 측정하여 10배 계열희석한 후 copy number로 환산하고 약 100,000copy 부터 0.1 copy 에 해당하는 genomic DNA를 주형으로 하여 본 발명의 PCR 방법에 따라 PCR 반응을 수행하였다. 본 발명의 PCR 방법의 각 세균 균주에 대한 검출 민감도 측정결과는 도 4a 및 도 4b에 나타내었다. 도 4a 및 도 4b에 나타낸 결과로부터 본 발명의 방법은 세균 copy number가 1-1000의 수준에서 검출 가능한 방법으로서 매우 높은 검출 민감도를 가짐을 확인하였다.

6-2. 진균에 대한 본 발명의 PCR 방법의 민감도 검사

상기 실시예 2에서 설명된 방법으로 제조된 진균 검출용 프라이머쌍 YE-F(서열목록 제3서열) 및 YE-R2(서열목록 제4서열)을 이용한 본 발명의 PCR방법에 대한 각 진균 균주에 대한 검출 민감도를 측정하였다. 각 균주의 genomic DNA의 농도를 측정하여 10배 계열희석한 후 copy number로 환산하고 약 10,000copy 부터 1 copy 에 해당하는 genomic DNA를 주형으로 하여 본 발명의 PCR 방법에 따라 PCR 반응을 수행하였다. 본 발명의 PCR 방법의 각 진균 균주에 대한 검출 민감도 측정결과는 도 4c에 나타내었다. 도 4c에 나타낸 결과로부터 본 발명의 방법은 진균 copy number가 100-1000의 수준에서 검출 가능한 방법으로서 매우 높은 검출 민감도를 가짐을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1a는 본 발명의 검출방법에 의한 검출 대상인 20 종의 세균의 형태를 보여주는 사진이다. A: 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), B: 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), C: 박테리오데스 불가투스(Bacteroides vulgatus), D: 엔테로박터 아로게네스 (Enterobacter aerogenes), E: 대장균(Escherichia coli), F: 엔테로코커스 피칼리스 (Entrococcus faecalis), G: 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes), H: 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), I: 슈도모나스 플루오레슨스 (Pseudomonas fluorescens), J: 스트렙토코커스 미티스 (Streptococcus mitis), K: 폐렴연쇄상구균 (Streptococcus pneumoniae), L: 화농성연쇄상구균 (Streptococcus pyogenes), M: 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), N: 스타필로코커스 캐피티스 (Staphylococcus capitis), O: 스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis), P: 살모넬라 티피뮤리엄 (Salmonella typhimurium), Q: 코리네박테리움 아코렌스 (Corynebacterium accolens), R: 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), S: 코리네박테리움 디프테리에 (Corynebacterium diptheriae), T: 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum).

도 1b는 본 발명의 검출방법에 의한 검출 대상인 4 종의 진균의 형태를 보여주는 사진이다. A: 아스퍼질러스 나이거 (Asperigillus niger), B: 사카로마이세 스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), C: 칸다디아 알피칸스 (Candida albicans), D: 말라세씨아 푸르푸르 (Malasazia furfur).

도 2a는 서열목록 제1서열의 전방향 프라이머 및 서열목록 제2서열의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용하여 고빈도 오염 세균인 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)에 대한 PCR 증폭반응을 실시하고 증폭산물을 아가로스 젤 상에서 확인한 것을 보여주는 사진이다.

도 2b는 서열목록 제1서열의 전방향 프라이머 및 서열목록 제2서열의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용하여 총 27 종의 세균에 대한 PCR 증폭반응을 실시하고 증폭산물을 아가로스 젤 상에서 확인한 것을 보여주는 사진이다.

도 2c는 서열목록 제3서열의 전방향 프라이머 및 서열목록 제4서열의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용하여 총 4종의 진균에 대한 PCR 증폭반응을 실시하고 증폭산물을 아가로스 젤 상에서 확인한 것을 보여주는 사진이다.

도 3a는 실시예 3에서 얻은 PCR 증폭 산물을 제한효소 Sau3AI 처리하여 RFLP 분석을 수행한 결과를 보여주는 도면이다.

도 3b는 실시예 3에서 얻은 PCR 증폭 산물을 제한효소 HhaI 처리하여 RFLP 분석을 수행한 결과를 보여주는 도면이다.

도 3c는 실시예 4에서 얻은 PCR 증폭 산물을 제한효소 Sau3AI 처리하여 RFLP 분석을 수행한 결과를 보여주는 도면이다.

도 4a 및 도 4b는 본 발명의 서열목록 제1서열의 전방향 프라이머 및 서열목록 제2서열의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용한 PCR 방법의 각 세균 균주에 대한 검출 민감도를 측정한 결과를 보여주는 도면이다.

도 4c는 본 발명의 서열목록 제3서열의 전방향 프라이머 및 서열목록 제4서열의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 이용한 PCR 방법의 각 진균 균주에 대한 검출 민감도를 측정한 결과를 보여주는 도면이다.

<110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation Korea Food and Drug Administration <120> Method for Detecting Bacteria or Fungi Contaminated in Therapeutic Cells by Using PCR <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 gcytaayaca tgcaagt 17 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 tgayttgacg tcatccccac cttcc 25 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 ttcattcaaa twtctgccct atcaac 26 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 actttgattt ctcgtaaggt gccg 24

Claims (6)

1. 핵산증폭방법을 이용한 하기의 세포치료제 오염 미생물군의 동시 검출방법으로서,

   (a) 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계;

   (b) 상기 추출된 시료의 DNA와 프라이머쌍을 이용하여 핵산 증폭반응을 행하는 단계;

   (c) 상기 증폭된 핵산 산물을 검출하는 단계; 및

   (d) 상기 증폭된 핵산 산물을 검출한 후 제한효소 Sau3AI 또는 HhaI으로 처리하여 RFLP(restriction fragment length polymorphism) 분석을 행하는 단계를 포함하고,

   상기 프라이머쌍은

   (i) 서열목록 제 1 서열을 갖는 전방향 프라이머 및 서열목록 제 2 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍; 및

   (ⅱ) 서열목록 제 3 서열을 갖는 전방향 프라이머 및 서열목록 제 4 서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 포함하고,

   상기 미생물군은 다음의 미생물들로 이루어지는 검출방법:

   스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis), 살모넬라 티피뮤리엄 (Salmonella typhimurium), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 플루오레슨스 (Pseudomonas fluorescens), 엔테로박터 아로게네스 (Enterobacter aerogenes), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 대장균 (Escherichia coli), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 캐피티스 (Staphylococcus capitis), 화농성연쇄상구균 (Streptococcus pyogenes), 폐렴연쇄상구균 (Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스 (Streptococcus mitis), 코리네박테리움 디프테리에 (Corynebacterium diptheriae), 코리네박테리움 아코렌스 (Corynebacterium accolens), 박테리오데스 불가투스 (Bacteroides vulgatus), 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes), 엔테로코커스 피칼리스 (Entrococcus faecalis), 마이코박테리움 아비움 (Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 포투이튬 (Mycobacterium fortuitum), 마이코박테리움 고르도니에 (Mycobacterium gordonae), 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 츨가이 (Mycobacterium szulgai), 마이코박테리움 테라에 (Mycobacterium terrae), 아스퍼질러스 나이거 (Asperigillus niger), 칸다디아 알피칸스 (Candida albicans), 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 말라세씨아 푸르푸르 (Malasazia furfur).
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 핵산 증폭반응은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 세포치료제 오염 미생물의 동시 검출을 위한 핵산 증폭용 프라이머쌍으로서,

   (i) 서열목록 제1서열을 갖는 전방향 프라이머 및 서열목록 제2서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍; 및

   (ⅱ) 서열목록 제3서열을 갖는 전방향 프라이머 및 서열목록 제4서열을 갖는 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머쌍을 포함하고,

   상기 세포치료제 오염 미생물은 다음의 미생물로 이루어지는 군인 것을 특징으로 하는 핵산 증폭용 프라이머쌍:

   스타필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis), 살모넬라 티피뮤리엄 (Salmonella typhimurium), 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 플루오레슨스 (Pseudomonas fluorescens), 엔테로박터 아로게네스 (Enterobacter aerogenes), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 대장균 (Escherichia coli), 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 황색포도상구균 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 캐피티스 (Staphylococcus capitis), 화농성연쇄상구균 (Streptococcus pyogenes), 폐렴연쇄상구균 (Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 미티스 (Streptococcus mitis), 코리네박테리움 디프테리에 (Corynebacterium diptheriae), 코리네박테리움 아코렌스 (Corynebacterium accolens), 박테리오데스 불가투스 (Bacteroides vulgatus), 프로피오니박테리움 아크네스 (Propionibacterium acnes), 엔테로코커스 피칼리스 (Entrococcus faecalis), 마이코박테리움 아비움 (Mycobacterium avium), 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 포투이튬 (Mycobacterium fortuitum), 마이코박테리움 고르도니에 (Mycobacterium gordonae), 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii), 마이코박테리움 츨가이 (Mycobacterium szulgai), 마이코박테리움 테라에 (Mycobacterium terrae), 아스퍼질러스 나이거 (Asperigillus niger), 칸다디아 알피칸스 (Candida albicans), 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae), 말라세씨아 푸르푸르 (Malasazia furfur).
5. 제 4 항에 있어서, 상기 핵산 증폭은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의한 것임을 특징으로 하는 프라이머쌍.
6. 제 4 항에 기재된 핵산 증폭용 프라이머쌍을 포함하는 세포치료제 오염 미생물 검출용 키트.

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