CN101535478B - 核酸扩增方法 - Google Patents
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Abstract
目的在于提供一种基于新原理的核酸扩增方法，该方法能够简便地且在短时间内高效扩增具有特定碱基序列的核酸。提供了一种核酸扩增方法，其特征在于，(a)以含有作为扩增对象的碱基序列的DNA作为模板，使用具有与前述碱基序列互补的碱基序列的引物对进行DNA聚合酶延伸反应，获得直链状DNA片段；以及(b)以含有与前述引物对中的至少一者相同的碱基序列的环状单链DNA作为模板，以由(a)获得的直链状DNA片段的3’端作为复制起点，连锁地进行链取代型DNA聚合酶延伸反应。
Description
技术领域
本发明涉及核酸扩增方法，尤其是使用特定引物和环状单链DNA的组合的核酸扩增方法、利用前述方法检测是否存在目标基因的方法以及在前述方法中使用的检测用试剂盒。
背景技术
现在，在研究机构、医疗机构、检查机构及其它各种现场，基于目标基因的特异性碱基序列的分析方法和检测方法被广泛使用。例如，在分析和检测人和动物等生物体来源的试样(体液或细胞片)或来源于环境的试样中所含的病原菌、霉菌、螨等过敏原等病原性的微生物和微小动物、病毒和花粉等的存在时，可以采用检测这些检测对象所具有的目标基因的特异性碱基序列的方法。检测这些核酸(DNA、RNA)的方法与检测蛋白质的方法相比，能够在短时间内以高敏感度进行。而且，即使试样中原本所含的核酸量在检测界限之下，也可以使用无细胞系较为简单且特异性地扩增。由于这些优点，利用扩增核酸的方法或与扩增核酸的方法组合来检测目标基因中的特异性碱基序列的方法被广泛开发。
目前，作为最常用的核酸扩增方法，可以列举利用温度循环进行数十次的模板的变性、引物与模板的退火、DNA聚合酶延伸反应的循环，从而扩增夹在引物对之间区域的核酸的PCR法。但是，利用温度循环扩增核酸的方法中，用于控制温度循环的机器(热循环仪等)价格高，而且对于核酸扩增而言最佳的温度循环的研究和设定等是必需的。
因此，近年来，开始考虑不利用温度循环而在一定温度条件下进行DNA聚合酶延伸反应的核酸扩增方法。其代表性的方法为LAMP(环介导等温扩增，Loop-Me diated IsothermalAmplification)法(专利文献1)。在LAMP法中，对于目标基因的6个区域设计并使用4条引物，以使合成的DNA链的3’端时常形成环，并成为之后的DNA扩增反应的复制起点，来扩增目标基因的核酸分子。
另外，在专利文献2中，记载了以下方法：设计一种探针，其为在5’端和3’端具有与目标基因中的2处不连续的邻接区域互补的碱基序列且具有与目标基因不互补的连接子区域的直链DNA分子，使前述探针与目标基因杂交而形成环状，将相互靠近的5’端和3’端之间用连结酶连结而环化，用与前述连接子区域互补的引物扩增环化后的前述探针的碱基序列的方法。
但是，这些已知的方法在成本、检测方法的设计和操作、检测灵敏度等方面还存在问题，因此需要充分满足这些问题的新的核酸扩增方法和检测方法。
专利文献1：国际公开WO2000/28082号小册子
专利文献2：日本特表2005-508599号公报
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种基于新原理的核酸扩增方法，该方法能够简便地且在短时间内高效扩增具有特定碱基序列的核酸。
而且，本发明的目的在于提供一种高灵敏度的检测方法，该方法利用前述扩增方法能够迅速且明确地检测试样中是否存在目标基因。
而且，本发明的另一个目的在于提供一种核酸扩增用试剂盒和检测用试剂盒，其含有在这些方法中有用的特定的引物和环状单链DNA的组合。
而且，本发明的另一个目的是提供由单链DNA片段简便且高产率地制造前述环状单链DNA的方法。
用于解决问题的方案
本发明人发现，对具有特异性碱基序列的模板核酸分子，通过使用具有与前述碱基序列互补的碱基序列的引物和含有与前述引物相同的碱基序列的环状单链DNA的组合，连锁地进行DNA聚合酶延伸反应，则不需要周期性的温度控制，通过简便的且短时间的操作就能够高效扩增前述特异性碱基序列的核酸。
而且本发明人还发现，利用上述核酸扩增方法，能够迅速且高灵敏度地检测试样中有无目标基因，尤其是来源于生物体或环境的试样中有无过敏原、病毒、病原菌等微生物。
这些方法以及在这些方法中有用的试剂盒具体如下。
本发明的核酸扩增方法的特征在于，含有：
(a)以含有作为扩增对象的碱基序列的DNA作为模板，使用具有与前述碱基序列互补的碱基序列的引物对进行DNA聚合酶延伸反应，获得直链状DNA片段；和
(b)以含有与前述引物对中的至少一者相同的碱基序列的环状单链DNA作为模板，以由(a)获得的直链状DNA片段的3’端作为复制起点，连锁地进行链取代型DNA聚合酶延伸反应。
(a)和(b)在所使用的链取代型DNA聚合酶具有活性的温度下进行，优选(a)和(b)在同一温度条件下进行。
而且，优选含有作为扩增对象的碱基序列的DNA中，包括以RNA作为模板通过逆转录获得的DNA链。
在本发明的核酸扩增方法中有用的试剂盒是如下的核酸扩增用试剂盒，其含有：
(i)具有与作为扩增对象的碱基序列互补的碱基序列的引物对；
(ii)含有与前述引物对中的至少一者相同的碱基序列的环状单链DNA；
(iii)链取代型DNA聚合酶；
(iv)dNTP。
本发明的检测双链的目标核酸分子的方法包括：
(a)在作为检测对象的试样中添加具有与目标核酸分子的目标碱基序列互补的碱基序列的引物对、含有与前述引物对中的至少一者相同的碱基序列的环状单链DNA、链取代型DNA聚合酶和dNTP，在前述链取代型DNA聚合酶具有活性的温度下进行酶反应；
(b)确认在进行了酶反应的试样中核酸是否被扩增；和
(c)在核酸被扩增时，确定作为检测对象的试样中存在双链的目标核酸分子。
本发明的检测单链的目标核酸分子的方法包括：
(a)在作为检测对象的试样中添加具有与目标核酸分子的目标碱基序列互补的碱基序列的引物、具有与目标核酸分子的前述目标碱基序列的区域不同区域的目标碱基序列的引物、含有与这些引物中的至少一者相同的碱基序列的环状单链DNA、逆转录酶、链取代型DNA聚合酶和dNTP，在前述链取代型DNA聚合酶具有活性的温度下进行酶反应；
(b)确认在进行了酶反应的试样中核酸是否被扩增；和
(d)在核酸被扩增时，确定作为检测对象的试样中存在单链的目标核酸分子。
在本发明的检测双链的目标核酸分子的方法中有用的试剂盒，其为双链的目标核酸分子的检测用试剂盒，其含有：
(i)具有与双链的目标核酸分子的目标碱基序列互补的碱基序列的引物对；
(ii)含有与前述引物对中的至少一者相同的碱基序列的环状单链DNA；
(iii)链取代型DNA聚合酶；和
(iv)dNTP。
在本发明的检测单链的目标核酸分子的方法中有用的试剂盒，其为单链的目标核酸分子的检测用试剂盒，其含有：
(i)具有与单链的目标核酸分子的目标碱基序列互补的碱基序列的引物；
(ii)具有与目标核酸分子的前述目标碱基序列的区域不同区域的目标碱基序列的引物；
(iii)含有与(i)和(ii)的引物中的至少一者相同的碱基序列的环状单链DNA；
(iv)链取代型DNA聚合酶；和
(v)dNTP。
优选的是，前述检测用试剂盒还含有(vi)逆转录酶。
本发明还提供一种环状单链DNA的制造方法，其包括：
a)制备反应混合物的工序，所述反应混合物含有直链状单链DNA、具有前述直链状单链DNA的5’端区域的互补序列和3’端区域的互补序列且二者邻接的衔接头多核苷酸、和耐热性连接酶；
b)通过使直链状单链DNA与衔接头多核苷酸的互补序列结合，使前述直链状单链DNA的5’端和3’端邻接的工序；
c)连接前述直链状单链DNA的5’端和3’端的工序；
d)使环化的单链DNA与衔接头多核苷酸解离的工序。
发明的效果
本发明提供一种新的高效的核酸扩增方法。
而且，本发明提供一种简便且迅速的检测方法，该方法利用前述核酸扩增方法检测目标基因的有无。通过使用这种检测方法，能够以简便的操作迅速且明确地检测病原性微生物和病毒等中的特异性目标基因。
而且，本发明还提供一种对于这些方法有用的、引物和环状单链DNA的组合。
另外，本发明提供一种使用耐热性DNA连接酶制造环状单链DNA的方法，通过在同一酶反应混合物内反复进行连接反应，能高产率地由直链状单链DNA合成环状单链DNA。
附图说明
图1示出本发明的核酸扩增方法的原理(第一阶段)。
图2示出本发明的核酸扩增方法的原理(第二阶段)。
图3示出表3的实验结果(实验1～实验3)。
图4示出表3的实验结果(实验4～实验6)。
图5示出表3的实验1～实验3的试样的电泳结果。
图6示出通过本发明的方法制造环化单链DNA的概要。
图7示出使用SYBR Green I检测环状单链的照片。A为不添加引物进行聚合酶反应的对照试样，B表示进行通常的合成反应的试样。
图8示出通过电泳检测环状单链的凝胶照片。
图9示出对进行1次连接反应和重复进行25次连接反应时的环状单链的合成浓度进行比较的图。
具体实施方式
在本发明的核酸扩增方法中，通过DNA聚合酶延伸反应，可获得含有一个作为扩增对象的碱基序列或含有作为扩增对象的碱基序列多次重复而成的多种链长的扩增产物，连锁进行这些扩增产物发挥模板或复制起点作用的DNA聚合酶延伸反应，能够高效扩增作为扩增对象的碱基序列。
本发明的含有作为扩增对象的碱基序列(本说明书中也称为“目标碱基序列”)的模板DNA为单链或双链的直链状或环状的DNA，包含于该模板DNA中的作为扩增对象的碱基序列是模板DNA中特异性区域中的碱基序列。而且，本发明的方法还可以使用cDNA作为模板DNA而进行，所述cDNA是采用逆转录酶合成的与RNA分子互补的碱基序列。此时，本发明的作为扩增对象的碱基序列是RNA分子中的尿嘧啶(U)碱基换成胸腺嘧啶(T)的碱基序列。
在本发明的扩增方法中使用的引物对具有与模板DNA中的作为扩增对象的目标碱基序列互补的碱基序列，只要是能够基于模板DNA获得作为直链状DNA片段的夹在引物对之间的区域(包括引物对的碱基序列)即可。因此，模板DNA为双链DNA时，引物对的各引物具有各个链上的目标碱基序列。模板DNA为单链DNA时，引物对中的一条引物具有与存在于模板DNA链上的作为扩增对象的碱基序列不同区域的目标碱基序列。
本发明的方法可以使用至少一个引物对进行，使用多个引物对时，其数目并没有上限，例如还可以设计为嵌套式来使用。例如为1～5对，优选为1～3对，更优选为2～3对，特别优选为2对。
各引物与配对的引物和其它引物对的引物间优选不具有相同的序列或互补序列。
配对的引物所结合的区域之间的相对距离(碱基数)只要能够进行本发明的反应即可，没有特别限制，但优选最内侧引物对的引物所结合的区域间的相对距离更小者，并且优选其外侧的引物对与邻接的内侧引物对所结合的区域间的相对距离更小者。上述相对距离(碱基数)优选为0b～1kb，更优选为0～100b。
作为本发明中使用的引物，只要能够与模板DNA形成互补的双链即可，没有特别限制，优选8～40mer的引物，更优选16～25mer的引物。而且，模板DNA(目标碱基序列)或引物的GC含量、二级结构形成的容易程度以及其它在引物设计中一般考虑的性质也都包含在本领域技术人员的技术常识范围之内。这种引物的设计和合成可以使用本技术领域中通常使用的设计程序等手法来进行。
以采用逆转录酶合成RNA分子中的碱基序列而得的cDNA作为模板DNA时，同样，可以根据该RNA分子是双链还是单链如上述那样设计引物对。
在本发明的方法中使用的环状单链DNA至少含有一段与引物对中的至少一条引物相同的碱基序列，所谓与至少一条引物相同的碱基序列是指具有与作为扩增对象的碱基序列互补的碱基序列。
环状单链DNA可以设计为以一定间隔反复含有多个与1条引物相同的碱基序列，而且还可以含有一个或反复含有多个与多个不同的引物相同的碱基序列。使用多个引物对时，包含于环状单链DNA中的碱基序列优选与在最内侧使用的引物对的碱基序列中的至少一者相同。
环状单链DNA中，与引物相同的碱基序列以外区域的碱基序列，只要是本发明特异性反应即可，没有特别限定，但优选较小者。而且，使用不具有3’→5’核酸外切酶活性的链取代型聚合酶时，优选在与引物相同的碱基序列的5’侧上添加1个胸腺嘧啶(T)。
环状单链DNA的链长，只要本发明特异性反应即可，没有特别限定，但优选为16b～10kb，更优选为20～100b。这种环状单链DNA的设计和合成可以使用本技术领域中通常使用的设计程序等手法而进行。而且，环状单链DNA还可以通过后述的环状单链DNA的制造方法来制备。
本发明的方法中使用的DNA聚合酶优选具有链取代型5’→3’DNA聚合酶活性，正确合成碱基对的互补链。而且，所述DNA聚合酶可以具有3’→5’核酸外切酶活性，但优选不具有此活性，而且也优选不具有5’→3’核酸外切酶活性。DNA聚合酶的最适温度优选为50～90℃，更优选为60～72℃。作为这种DNA聚合酶，例如可以单独或以试剂盒的形式获得嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)来源的Bst DNA聚合酶大片段、火球菌(Pyrococcus)属细菌来源的Deep VentR (R)(exo-)DNA聚合酶(New England Biolabs Incorporation制)、Herculase(R)II Fusion DNA聚合酶(STRATAGENE公司制)、嗜热球菌(Thermococcus)属来源的VentR (R)(exo-)DNA聚合酶、TherminatorTMDNA聚合酶、TherminatorTMII DNA聚合酶(NewEngland Biolabs Incorporation制)、KOD Dash DNA聚合酶(东洋纺公司制)。只要相互之间不抑制酶活性，还可以同时使用两种以上DNA聚合酶。
利用DNA聚合酶进行的延伸反应还可以使用在一般的核酸扩增中使用的缓冲液(含有Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4等盐类)，例如所使用的DNA聚合酶附带的优化组成的缓冲液。
在上述这种合适的缓冲液中添加模板DNA、本发明的引物对、本发明的环状单链DNA、链取代型DNA聚合酶和作为底物的4种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，将该反应溶液保持在链取代型DNA聚合酶具有该酶活性的温度例如50～90℃、优选60～72℃，则不用进行温度循环控制即可在同一容器中通过1次操作来高效扩增核酸。而且，使用多个引物对时，能够将本发明的反应温度条件进一步设定在更低的条件，例如30～50℃。DNA聚合酶延伸反应的温度条件依赖于使用的链取代型DNA聚合酶具有活性的温度。只要在使用的链取代型DNA聚合酶具有酶活性的温度范围内即可，扩增反应整个过程不必都保持在相同温度(等温)亦可，但优选扩增反应整个过程保持在相同温度(等温)(同一温度条件下)。
核酸的扩增可以通过DNA聚合酶延伸反应中核酸被扩增时反应溶液中生成的焦磷酸镁的沉淀来确认(国际公开第2001/083817号小册子)。而且，还可以使用本技术领域中通常使用的核酸染色荧光染料等例如溴化乙锭、SYBR Green I(CAMBREX公司制)等，按照常规方法根据荧光的有无和强度来确认核酸扩增。
然后，用附图具体说明本发明的核酸扩增方法的方式。
首先，在第一阶段，通过含有作为扩增对象的特异性碱基序列的模板DNA与引物对的DNA聚合酶延伸反应，获得直链状DNA片段(图1)。
以双链的模板DNA中的两个特异性碱基序列区域A、B作为扩增对象时，将各区域在其中一条链上的序列设定为A1和B1，另一条链上的序列设定为A2和B2。引物对中，将一条引物设计为具有与A1互补的碱基序列，即具有A2的碱基序列，另一条引物设计为具有与B2互补的碱基序列，即具有B1(图1，(i))。
通过该引物对与前述模板DNA的DNA聚合酶延伸反应，获得了在5’端上具有与A2相同的碱基序列且在3’端上具有与B2相同的碱基序列的直链状DNA片段，以及在5’端上具有与B 1相同的碱基序列且在3’端上具有与A1相同的碱基序列的直链状DNA片段的组合。所获得的该直链状DNA片段成为第二阶段开始时的复制起点(图1，(ii))。
在第二阶段作为模板的环状单链DNA被设计为含有与引物对中的至少一者相同的碱基序列(A2和/或B1)(图2，(i))。图2中示出了含有与A2和B1分别相同的碱基序列的环状单链DNA。如上所述，由于获得的直链状DNA片段在3’端各自具有与引物对互补的碱基序列(A1或B2)，因此该直链状DNA片段的3’端区域(A1、B2)和环状单链DNA中的与引物对相同的碱基序列(A2、B1)区域退火，成为复制起点，以环状单链DNA作为模板发生DNA聚合酶延伸反应(图2，(i))。合成的DNA链通过链取代型DNA聚合酶而剥离，与此同时呈滚环式延伸(图2，(ii))。存在于反应溶液中的引物与该剥离的延伸DNA链发生退火，从而成为复制起点，发生DNA聚合酶延伸反应(图2，(iii))，以前述引物作为复制起点进行合成并剥离的DNA链与存在于反应溶液中的引物或环状单链DNA发生退火，从而发生DNA聚合酶延伸反应(图2，(iv))。
一旦作为第二阶段开始的诱因的直链状DNA片段被合成后，以上说明的第一阶段的过程和第二阶段的过程就平行地同时进行。而且，这样进行连锁的扩增反应，其结果是合成了含有1个或反复含有多个作为扩增对象的特异性碱基序列的多种链长的DNA链。
本发明的另一种方式是利用上述核酸扩增方法的原理，检测目标基因的方法。该检测方法可以根据检测目标、检测对象试样的来源、目标基因等，在多种产业中各种情况下进行。
作为检测目标基因的试样，例如可以从人以及动物来源的体液或组织片中制备，也可以从环境来源的土壤、海水、植物中制备，还可以是在工厂制造加工的饮料或食品、药品等。它们直接或根据需要采用适当的操作制备出核酸(DNA、RNA)提取液，这种提取液作为检测对象试样可用于本发明的检测方法中。这种试样的制备可以按照一般的核酸检测方法中使用的常规方法进行。
目标基因可以为微生物(细菌、霉菌等)、过敏原(例如螨、花粉等)、病毒中特异性的遗传物质，而且也可以是人以及动物的基因组中的野生型或突变型基因。
本检测方法中，将上述核酸扩增方法的“模板DNA”和“作为扩增对象的碱基序列”分别替换为本检测方法的“目标核酸分子(即目标基因)”和“目标基因中的目标碱基序列”，该方法利用的是试样中存在目标核酸分子(即目标基因)时，根据与上述核酸扩增方法相同的原理来扩增目标基因中的目标碱基序列的核酸。
在检测双链的目标核酸分子时，可以通过以下工序检测目标核酸分子：
(a)在作为检测对象的试样中添加具有与目标核酸分子的目标碱基序列互补的碱基序列的引物对、含有与前述引物对中的至少一者相同的碱基序列的环状单链DNA、链取代型DNA聚合酶和dNTP，在前述链取代型DNA聚合酶具有活性的温度下进行酶反应；
(b)确认在进行了酶反应的试样中核酸是否被扩增；以及
(c)在核酸被扩增时，确定作为检测对象的试样中存在双链的目标核酸分子。
在检测单链的目标核酸分子时，将检测双链的目标核酸分子时的“具有与目标核酸分子的目标碱基序列互补的碱基序列的引物对”和“含有与前述引物对中的至少一者相同的碱基序列的环状单链DNA”分别替换成“具有与目标核酸分子的目标碱基序列互补的碱基序列的引物和具有与目标核酸分子的前述目标碱基序列的区域不同区域的目标碱基序列的引物的组合”和“含有与这些引物中的至少一者相同的碱基序列的环状单链DNA”，通过与目标核酸分子为双链时相同的操作来检测单链的目标核酸分子。
在目标核酸分子为RNA时，通过在上述(a)的酶反应的工序中，在试样中进一步添加逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)进行酶反应，可与上述核酸扩增方法一样确认是否发生了以基于试样中的RNA分子合成的cDNA链作为模板的核酸扩增，在核酸被扩增时，确定为存在目标RNA分子，由此可以检测目标RNA分子的存在。
核酸扩增可与上述相同地采用焦磷酸镁的沉淀、或本技术领域中通常使用的核酸染色荧光染料等，以沉淀或荧光的有无作为指标进行确认。而且，还可以以焦磷酸镁的生成量或荧光的强度作为指标，来比较作为检测对象的试样中存在的目标基因的核酸量的多少。
这样一来，通过使用本检测方法，即使试样中存在的目标基因的核酸极为微量，也可以在同一反应容器中通过一次操作高效扩增并检测出目标基因中的特异性碱基序列。本检测方法还可以在例如微管、微孔板、微芯片(microchip)等反应容器中进行，而且还可以使用HTS(高通量筛选，High-ThroughputScreening)等技术。
在本发明的环状单链DNA的制造方法中，在工序a)中，制备含有直链状单链DNA、和具有与前述直链状单链DNA互补的序列的衔接头多核苷酸以及耐热性连接酶的反应混合物。
在环化中使用的直链状单链DNA的碱基的种类和数量没有特别限制，可以是从实际的细胞中分离的基因组序列，也可以是人工合成的多核苷酸序列，只要是对一般环化来说足够数目的碱基即可，例如至少在20个碱基以上，优选为20～200个碱基，更优选为30～80个碱基。
尽管5’端磷酸化依赖于所使用的耐热性DNA连接酶，然而在环化中使用的直链状单链DNA为人工合成的多核苷酸时，理想的情况是其5’端被磷酸化，但也可以不被磷酸化。而且，理想的是没有其它修饰。
另外，衔接头多核苷酸具有前述直链状单链DNA的5’端区域的互补序列和3’端区域的互补区域，具体而言，具有前述直链状单链DNA的5’端区域的互补序列和3’端区域的互补区域且二者邻接。在本发明中，所谓“5’端区域”和“3’端区域”分别指含有直链状单链DNA的5’端、3’端的最末端碱基的区域，该区域的长度，可由本领域技术人员设定为一般用于进行多核苷酸的退火所必需的值。例如，适合为5～20个碱基，若考虑衔接头多核苷酸的合成，5’端区域和3’端区域总计优选为15～30个碱基左右。
在本发明的环状单链DNA的制备方法中，“(5’端区域和3’端区域的)互补序列”优选为与直链状单链DNA的5’端区域的序列和3’端区域的序列完全互补的序列，但只要能够与前述直链状单链DNA退火，也可以有错配的碱基对。这种碱基对的数目取决于反应条件和整个区域的长度，例如在各区域中可以是1个、2个、3个等，或者可以是各区域总碱基的1％～50％左右。但是，本领域技术人员可以理解的是，为了高效进行连接，优选的是，在环化时实际通过连接酶进行连接反应的5’端和3’端的碱基各自与衔接头的碱基形成碱基对。
本发明的衔接头多核苷酸具有与上述5’端区域互补的序列和与3’端区域互补的序列且二者邻接。其中，所谓“邻接”是指从5’侧起为前述5’端互补序列与其后的3’端互补序列二者之间不夹着碱基而是连续的。这种衔接头多核苷酸，如图6所示，通过与直链状单链DNA退火，可以使前述直链状单链DNA形成环状。
在本发明的环状单链DNA的制造方法中，在用于使直链状单链DNA环化的连接反应中使用耐热性DNA连接酶。所谓耐热性DNA连接酶是指通过磷酸二酯键连结相互邻接的DNA链的5’端和3’端的酶，是指即使在将双链DNA解离成单链DNA的高温(DNA解离温度)例如80～100℃、优选90～95℃下，也基本上不丧失活性的酶。例如，可以列举即使置于作为一般解离温度使用的95～100℃下30分钟～1小时左右，酶活性也能维持30％以上，优选为维持在50％以上的连接酶，一般可以理解为，只要是适于在LCR反应中使用的市售的连接酶都包含于“耐热性DNA连接酶”中。耐热性DNA连接酶一般从生存于高温环境下的强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、嗜热泉生古细菌(Aeropyrum pernix)、嗜热球菌属(Thermococcus sp.)等超嗜热性菌以及栖热水生菌(Thermus aquaticus)等高度好热性菌中分离，但本发明方法中也可以使用进行了重组以进一步提高耐热性的耐热性DNA连接酶。具体而言可以列举(Stratagene公司制造的Pfu DNA连接酶、Epicentre公司制造的AmpligaseDNA连接酶、和光纯药工业公司制造的耐热性DNA连接酶、New England Biolabs公司制造的9°Nth DNA连接酶、Taq DNA连接酶)等。
在本发明的环状单链DNA的制造方法中，工序a)中制备的反应混合物含有上述的直链状单链DNA、衔接头多核苷酸、耐热性DNA连接酶。这些物质的浓度和存在比率可以基于本领域的技术常识适当确定。直链状单链DNA的浓度例如为1～100μmol/l，优选为20～80μmol/l，更优选为40～60μmol/l，衔接头多核苷酸的浓度例如为0.05～50μmol/l，优选为1～40μmol/l，更优选为3～12μmol/l等，但并不限于这些范围。而且，优选的直链状单链DNA和衔接头多核苷酸的摩尔比根据后述的连接反应的重复次数等而变化，例如为100∶1～1∶5，优选50∶1～1∶1，更优选20∶1～4∶1。
另外，本发明的环状单链DNA的制造方法中，如后所述，由于衔接头多核苷酸可以从环化的单链DNA中解离后再利用，因此在最初的反应混合物中衔接头多核苷酸即使仅以比直链状单链DNA低的比例(例如，如上所述的摩尔比20∶1等)存在时，也可以高效制造环状单链DNA。
例如在使用市售的连接酶时，耐热性DNA连接酶的添加量可以根据反应混合物中的DNA浓度和量，按照制造者的指示来确定优选的值。
而且，工序a)中制备的反应混合物还可以进一步含有连接反应所必需的各种物质。一般，可根据所使用的连接酶的种类来确定反应缓冲液的组成，例如，可以以适当浓度含有Tris-HCl(pH7.5)、KCl、MgCl2、ATP、NAD(P)、DTT等。实际上，只要按照制造者的指示使用市售的连接酶所附带的反应缓冲液足以。
在上述工序a)中制备含有直链状单链DNA、衔接头多核苷酸和耐热性DNA连接酶的反应混合物后，从工序b)到d)，通过分别进行直链状单链DNA和衔接头多核苷酸的结合(退火)、通过连接反应进行的环化、通过热变性进行的环化单链DNA和衔接头多核苷酸的分离来制造环状单链DNA(参照图6)。
更具体而言，在工序b)中，使直链状单链DNA与衔接头多核苷酸的互补序列结合，以使前述直链状单链DNA的5’端与3’端邻接。直链状单链DNA与衔接头多核苷酸的结合(退火)通过将反应混合物置于适当的温度下而进行，其温度例如为55～65℃，优选为60℃，但如本领域技术人员理解的那样，由于合适的值根据衔接头多核苷酸的长度和Tm值而变化，因此可以适当调整。反应时间也同样可以根据多核苷酸的长度和与反应温度的关系而任意设定。例如，从1秒到3分钟，优选从5秒到1分钟，更优选为10秒，但基本上只要反应混合物达到设定温度就足以，也可以设定为更长的时间。
由于在该工序b)中，直链状单链DNA和衔接头多核苷酸的互补序列结合时，直链状单链DNA弯曲，形成5’端和3’端邻接/接近的结构，因此，接下来的工序c)中可以高效进行环化(连接反应)。
在工序c)中，使前述直链状单链DNA的5’端和3’端相连接。即，通过将反应混合物在适当的温度下放置一定时间，包含于反应混合物中的DNA连接酶发挥作用而连接直链状单链DNA的5’端和3’端。反应温度优选设定在使用的耐热性DNA连接酶的最适温度，但也可以在该连接酶具有活性的温度范围内进行自由设定。例如，在使用和光纯药工业公司制造的耐热性DNA连接酶时，设定为60～90℃，优选为70℃。适当的反应时间取决于连接酶的种类和酶量等，例如为5～30分钟，优选为10分钟。
在工序d)中，使环化的单链DNA与衔接头多核苷酸解离。即，通过置于反应混合物的DNA解离温度(高温)下，使在工序c)终止时结合在一起的环状单链DNA与衔接头多核苷酸解离。反应温度只要是一般使用的DNA解离温度即可，例如设定在90～100℃，优选为93～98℃，例如优选为95℃。另外，反应时间例如可以设定在1秒～1分钟，优选为5～30秒，更优选为10秒。通过该工序，衔接头多核苷酸返回到最初的单链状态，因此可以如后所述再返回到工序b)，能够与剩余的未环化的单链DNA结合而进行再利用。
优选的是，本发明的环状单链DNA的制造方法中反复进行工序b)到d)一系列的操作(以下也表示为循环)。通过重复进行工序b)到d)的循环，重复利用衔接头多核苷酸，同时依次使直链状单链DNA环化，可以以高产率制造环化单链DNA。
重复次数例如为至少两次，优选为10次以上，更优选为25次以上，本领域技术人员可以考虑直链状单链DNA耗尽、连接酶活性的降低、所需的环化单链DNA的产量等而确定合适的次数。
此外，本发明的环状单链DNA的制造方法也包括基于本技术领域的技术常识进行各种变化、改良后的方法。例如，在重复进行工序b)至d)时，在除了最初和最后的中间的各循环中包括工序b)、c)、d)并按照这个顺序实施即可，对于本领域技术人员容易理解的是，在最初和最后的循环中可适当采用能制造环状单链DNA的其它方法。
例如，一般优选在反应开始后立即将反应混合物上升到解离温度以防止非特异性退火。在本发明中，例如在95℃下处理2分钟。而且，在最后的循环中，可以在工序c)中将反应混合物置于连接温度后，在与之前不同的解离条件下处理反应混合物(例如在98℃下2分钟)，使环状单链DNA与衔接头多核苷酸解离。此外，还可以在这之后通过迅速冷却到4℃来结束反应。
此外，每个循环中，可以进行温度和时间设定的变化，也可以变化为在同一条件下将工序b)和c)总括在一起进行。
以下通过实施例对本发明进行更具体的说明。
实施例
药品名称后没有注明公司名的物质均为和光纯药工业公司制造。而且，只要没有特别的说明，溶剂为水。
(TE缓冲液组成)
4mmol/l Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷)盐酸
1mmol/l 乙二胺四乙酸二钠二水合物(EDTA)
调整到pH8.0
(1.2％TAE电泳用胶)
1.2％琼脂糖
4mmol/l Tris-HCl
1mmol/l EDTA
1mmol/l 醋酸
(2.0％TAE电泳用胶)
2.0％琼脂糖
4mmol/l Tris-HCl
1mmol/l EDTA
1mmol/l 醋酸
例1
[目标的制备方法]
以下示出的酶制品、试剂盒制品只要没有特别说明均按照使用说明书。
对pUC 19(Takara Bio Inc.)进行限制性酶DraI(Takara BioInc.)处理后，使用1.2％TAE电泳用胶，使用电泳槽Mupid-ex(Advance公司)进行电泳(100V，50分钟)。
然后，用核酸染色试剂SYBR GreenI(CAMBREX公司制)染色，从胶中切出目标DNA片段(约2kb)，用DNA提取试剂盒NucleoS pin Extract试剂盒(MACHEREY-NAGEL公司)回收，形成目标制备液(10mmol/l)。
[环状单链DNA的合成]
环状单链DNA合成中使用的引物记载于表1。43C是在5’端进行磷酸化修饰的引物，Bind是进行cartridge纯化(cartridgepurification)的引物(Invitrogen Co.制)。
表1：环状单链DNA的合成中使用的引物序列
| 名称 | 序列(5’～3’) |
| 43C | ACAGCTATGACTCGACGTTGTAAAACGACGGCTCACACAGGAA |
| Bind | GTCATAGCTGTTTCCTGTGTG |
将表1的两条引物(43C：75nmol/l，Bind：1.6nmol/l)和耐热性的DNA连接酶(耐热性连接酶)混合，在以下所示的温度下进行酶反应。
95℃，2分钟 -工序1
95℃，10秒 -工序2
60℃，10秒 -工序3 进行25个循环的2～4工序
70℃，10秒 -工序4
98℃，2分钟 -工序5
4℃，∞ -工序6
反应结束后，添加Gen Toru Kun(Takara Bio Inc.)，进行乙醇沉淀。然后，对获得的DNA颗粒用75％乙醇清洗2次，用99.5％乙醇清洗1次，于65℃干燥后，用超纯水溶解至30μl。
在该溶解液中添加核酸外切酶I(Takara Bio Inc.)，于37℃使之反应60分钟后，进行乙醇沉淀。对获得的DNA的颗粒用75％乙醇清洗2次，用99.5％乙醇清洗1次，于65℃干燥后，用TE缓冲液溶解至30μl，制成环状单链DNA制备液。
[特异性基因扩增]
基因检测时使用的引物示于表2。均进行HPLC纯化(Invitrogen公司制)。
表2：基因检测时使用的引物序列
| 名称 | 序列(5’～3’) |
| Forward-in | CGACGTTGTAAAACGACGGC |
| Reverse-in | CACACAGGAAACAGCTATGAC |
在基因检测反应时使用下述材料。
酶：Bst DNA聚合酶(New England Biolabs Incorporation制)4U/25μl
目标：目标制备液0.5μl/25μl
λ基因组：λ基因组(Takara Bio Inc.)0.5ng/μl
(反应缓冲液组成)
1/10量 Bst DNA聚合酶所附带的缓冲液
1μmol/l 表2的引物(Forward-in，Reverse-in)
dNTP 每种0.5mmol/l
0.02μg/ml 环状单链DNA制备液
按表3的条件混合各试剂，于95℃保温5分钟后，骤冷到4℃，添加酶后，于63℃保温60分钟。
[DNA扩增的确认方法]
将核酸染色试剂SYBR GreenI稀释到1/10，在25μl试样中加入1μl，在302nm的波长处用高敏感度滤镜观察。结果示于表3和图3～5。
表3：DNA的扩增结果
| 酶 | 目标 | λ基因组 | 反应缓冲液 | 核酸的扩增 | |
| 实验1 | × | ○ | × | ○ | - |
| 实验2 | ○ | × | × | ○ | - |
| 实验3 | ○ | ○ | × | ○ | + |
| 实验4 | × | ○ | ○ | ○ | - |
| 实验5 | ○ | × | ○ | ○ | - |
| 实验6 | ○ | ○ | ○ | ○ | + |
根据以上的实验1～6的结果，确认了在含有酶和目标的实验(实验3和实验6)中核酸被迅速扩增。另一方面，在存在酶而不含目标的实验(实验2和实验5)中没有发现核酸扩增。而且，即使含有目的序列以外的DNA，也没有发现核酸扩增(实验5)，由此确认了能特异性地识别序列。另外，不含酶的实验(实验1和实验4)未发生核酸扩增。
例2
[特异性基因扩增]
使用与例1一样制备的环状单链DNA制备液进行特异性基因扩增。
在基因检测中使用的引物示于表4。均进行HPLC纯化(Invitrogen公司制)。
表4：基因检测时使用的引物序列
| 名称 | 序列(5’～3’) |
| Forward-in | CGACGTTGTAAAACGACG GC |
| Forward-out | ACGCCAGGGTTTTCCCAGTC |
| Reverse-in | CACACAGGAAACAGCTATGAC |
| Reverse-out | TGGAATTGTGAGCGGATAAC |
基因检测反应中使用下述物质：
酶：Bst DNA聚合酶(New England Biolabs Incorporation制)4U/25μl
目标：目标制备液0.5μl/25μl
λ基因组：λ基因组(Takara Bio Inc.)0.5ng/μl
(反应缓冲液组成)
1/10量 Bst DNA聚合酶所附带的缓冲液
1μmol/l 表4的引物(Forward-in，Reverse-in)
0.2μmol/l 表4的引物(Forward-out，Reverse-out)
dNTP 每种0.5mmol/l
1μmol/ml 环状单链DNA制备液
5％ 二甲基亚砜
按表5的条件混合各试剂，于95℃保温5分钟后，骤冷到4℃，添加酶后，于63℃保温60分钟。
[DNA扩增的确认方法]
将核酸染色试剂SYBR GreenI稀释到1/10，在25μl试样中加入1μl，在302nm的波长处用高敏感度滤镜观察。结果示于表5。
表5：DNA的扩增结果
| 酶 | 目标 | λ基因组 | 反应缓冲液 | 荧光的有无 | |
| 实验7 | × | ○ | × | ○ | - |
| 实验8 | ○ | × | × | ○ | - |
| 实验9 | ○ | ○ | × | ○ | + |
| 实验10 | × | ○ | ○ | ○ | - |
| 实验11 | ○ | × | ○ | ○ | - |
| 实验12 | ○ | ○ | ○ | ○ | + |
根据以上实验7～12的结果，确认了在含有酶和目标的实验(实验9和实验12)中核酸迅速被扩增。另一方面，在存在酶而不含目标的实验(实验8和实验11)中没有发现核酸扩增。而且，即使含有目标序列以外的DNA，也没有发现核酸扩增(实验11)，由此确认了能特异性地识别序列。另外，不含酶的实验(实验7和实验10)未发生核酸扩增。
如上述实施例所示，通过本发明能够特异性地识别核酸序列且迅速扩增核酸。
例3
[环状单链DNA的合成]
将表1的2种多核苷酸(43C：60μmol/l，Bind：3μmol/l)和和光纯药工业公司制造的耐热性DNA连接酶重组体(1.25μl)混合，总计25μl，在下述条件下进行反应。此外，使用前述耐热性DNA连接酶所附带的反应缓冲液。混合液中的最终组成为添加有耐热性连接酶(1.25μl/25μl)的缓冲液(2.5μl/25μl)、表1的2种多核苷酸(43C：60μmol/l，Bind：3μmol/l)。
对该混合物，在与例1的[环状单链DNA的合成]相同的温度条件下进行酶反应，同样进行乙醇沉淀，用TE缓冲液溶解至30μl，获得了环状单链DNA制备液。
[环状单链DNA合成的确认]
通过聚合酶反应确认了环状单链DNA的合成。
反应混合物组成
0.02μg/ml 环状单链DNA制备液
1.6nmol/l 表2的引物(Forward-in和Reverse-in)
4U/25μl Bst DNA聚合酶(New England BiolabsIncorporation)
1.6nmol/l 表1的引物(Bind)
(反应缓冲液按照Bst DNA聚合酶的制造者的指示。)
在制备上述反应混合物后，于63℃保温60分钟。另外，制备不含Bind引物的对照混合物，同样进行保温。
该反应中，与环状单链DNA退火的Bind多核苷酸成为引物，在3’方向复制DNA，再以该复制的DNA作为模板，通过F引物和R引物扩增DNA。
[检测]
将核酸染色试剂SYBR GreenI(Takara Bio Inc.)稀释到1/10，在25μl试样中加入1μl并混合，在302nm的波长处用高敏感度滤镜观察。
另外，使用2.0％TAE电泳用胶，使用电泳槽Mupid-ex(Advance公司)进行电泳(100V，60分钟)，然后用核酸染色试剂SYBR GreenI染色，在254nm的波长处用高敏感度滤镜观察。
结果示于表6和图7、8。
表6：环状单链合成确认的结果
| 引物(Bind) | 反应缓冲液 | 核酸的扩增 | |
| A | - | ○ | × |
| B | + | ○ | ○ |
根据图7、图8确认了合成了长链的DNA，由此能够确认合成了环状单链DNA。而且，同时也能够确认经核酸外切酶I处理能够分解环状单链外的核酸。
[连接反应的重复反应导致的环状单链DNA的浓度比较]
用与上述“环状单链DNA的合成”中所示方法同样的方法，重复进行连接反应，比较制备的环状单链DNA的浓度。
加入于反应混合物的直链状单链DNA和衔接头多核苷酸的浓度方面，43C为60μmol/l，Bind为3μmol/l。
C：没有连接酶
D：(2)～(4)的循环1次
E：(2)～(4)的循环25次
反应后，添加Gen Toru Kun(Takara Bio Inc.)进行乙醇沉淀。然后，用75％乙醇清洗2次，用99.5％乙醇清洗1次，于65℃干燥后，用超纯水溶解至30μl。
溶解后，添加核酸外切酶I(Takara Bio Inc.)，于37℃反应60分钟后，添加Gen Toru Kun，进行乙醇沉淀。然后，用75％乙醇清洗2次，用99.5％乙醇清洗1次，于65℃干燥后，用TE缓冲液溶解至25μl，根据吸光度(260nm)检测各浓度。以不添加连接酶进行的C作为零点。
根据图9可知，通过使用本发明的方法重复进行连接循环，以高产率制造了环状单链DNA。
序列表
<110>东洋制罐株式会社(TOYO SEIKAN KAISHA，Ltd)
<120>核酸扩增方法
<130>X1O-0625
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的多核苷酸
<400>1
acagctatga ctcgacgttg taaaacgacg gctcacacag gaa 43
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的多核苷酸
<400>2
gtcatagctg tttcctgtgt g 21
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的多核苷酸
<400>3
cgacgttgta aaacgacggc 20
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的多核苷酸
<400>4
cacacaggaa acagctatga c 21
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的多核苷酸
<400>5
acgccagggt tttcccagtc 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的多核苷酸
<400>6
tggaattgtg agcggataac 20
Claims (9)
1.一种核酸扩增方法，其特征在于，其包括：
(a)使用含有作为扩增对象的碱基序列的模板DNA、和具有与前述碱基序列互补的碱基序列的引物对进行DNA聚合酶延伸反应，获得直链状DNA片段；和
(b)以含有与前述引物对中的至少一者相同的碱基序列的环状单链DNA作为模板，以由(a)获得的直链状DNA片段的3’端作为复制起点，进行链取代型DNA聚合酶延伸反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，(a)和(b)在同一温度条件下进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，含有作为扩增对象的碱基序列的模板DNA包括以RNA作为模板通过逆转录获得的DNA链。
4.一种核酸扩增用试剂盒，其含有：
(i)具有与作为扩增对象的碱基序列互补的碱基序列的引物对；
(ii)在同一分子上含有与前述引物对相同的碱基序列的环状单链DNA；
(iii)链取代型DNA聚合酶；
(iv)dNTP。
5.一种检测双链的目标核酸分子的方法，其包括：
(a)在作为检测对象的试样中添加具有与目标核酸分子的目标碱基序列互补的碱基序列的引物对、含有与前述引物对中的至少一者相同的碱基序列的环状单链DNA、链取代型DNA聚合酶和dNTP，在前述链取代型DNA聚合酶具有活性的温度下进行酶反应；
(b)确认在进行了酶反应的试样中核酸是否被扩增；和
(c)在核酸被扩增时，确定作为检测对象的试样中存在双链的目标核酸分子。
6.一种检测单链的目标核酸分子的方法，其包括：
(a)在作为检测对象的试样中添加具有与目标核酸分子的目标碱基序列互补的碱基序列的引物、具有与目标核酸分子的前述目标碱基序列的区域不同区域的目标碱基序列的引物、含有与前述引物中的至少一者相同的碱基序列的环状单链DNA、链取代型DNA聚合酶和dNTP，在前述链取代型DNA聚合酶具有活性的温度下进行酶反应；
(b)确认在进行了酶反应的试样中核酸是否被扩增；和
(d)在核酸被扩增时，确定作为检测对象的试样中存在单链的目标核酸分子。
7.一种双链的目标核酸分子的检测用试剂盒，其含有：
(i)具有与双链的目标核酸分子的目标碱基序列互补的碱基序列的引物对；
(ii)含有与前述引物对中的至少一者相同的碱基序列的环状单链DNA；
(iii)链取代型DNA聚合酶；和
(iv)dNTP。
8.一种单链的目标核酸分子的检测用试剂盒，其含有：
(i)具有与单链的目标核酸分子的目标碱基序列互补的碱基序列的引物；
(ii)具有与目标核酸分子的前述目标碱基序列的区域不同区域的目标碱基序列的引物；
(iii)含有与(i)和(ii)的引物中的至少一者相同的碱基序列的环状单链DNA；
(iv)链取代型DNA聚合酶；和
(v)dNTP。
9.根据权利要求8所述的检测用试剂盒，其中，还含有(vi)逆转录酶。
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