CN112662738B - 一种用于核酸原位杂交信号放大的单链dna制备方法及二级放大的单链dna制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法,属于分子生物学技术领域。所述制备方法包括:以基因识别引物、第一磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料,进行连接反应;连接反应完成后加入Bst DNA聚合酶和dNTP,进行滚环扩增反应,反应温度为45‑55℃,反应时间为1‑3h,获得用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA;其中,所述第一磷酸化环化引物包含片段C,所述C的局部片段与第一荧光探针的核酸片段序列相同;或者,所述C的局部片段与二级放大单链DNA的局部片段核苷酸序列相同。该方法具有经济实用、步骤简单和灵敏度高的优点。本发明还提供一种用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA制备方法。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,特别涉及一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法及二级放大的单链DNA制备方法。
背景技术
荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)是一种基于DNA或DNA/RNA双链互补性质的核酸分子识别技术。荧光原位杂交可应用于细胞中RNA分子的定位与表达丰度的检测,是生物学实验与临床的疾病检测中常用的检测与分析方法。尽管之前的研究已经报道了关于FISH相关的检测技术,也表现出了良好的稳定性与检出率。但从综合性能方面来说,以前的FISH不论在成本、步骤复杂性和信号强度方面都表现出或多或少的缺点。
现有的几种FISH放大技术,如分支DNA,HCR,ClampFISH,SABER等,均存在一定局限性,具体如下:
1)分支DNA也叫bDNA(branch DNA),是一种通过DNA合成仪合成的一种支链DNA,在DNA化学合成过程中在已经合成的一个臂(茎)连接在5′末端的分支点上引入支链单体修饰来合成多个其他臂(枝)连接在3′末端继续合成。虽然这种方法被广泛应用,但从费用方面考虑,由于需要合成分支状的DNA寡聚核苷酸,成本较高。
2)HCR(Hybridization Chain Reaction)杂交链式反应,是利用互补配对的发卡结构的荧光探针分子进行杂交反应来放大荧光信号;但要设计相互不干扰的多重发卡结构的荧光探针具有一定的难度,而且由于放大的信号有限。
3)CIampFISH技术利用一种click化学反应形成环形DNA后,通过多轮处理后逐级放大的一种方法[3];但ClampFISH合成在DNA的两端都合成有click修饰的引物,合成费用也非常高。
4)SABER是一种通过PER扩增的来实现信号放大的方法,在体外扩增单链DNA,对荧光结合序列进行重复延伸,使其在拷贝数量上得到放大。但这种方法在编码能力上具有一定的限制,而且也需要合成一种iso-dG或so-dC修饰和3′端修饰的发卡状DNA。
以上方法在性能上都各自存在着一些局限性。要实现灵敏、低成本地实现RNA信号检测,对FISH检测提出了新的挑战。
发明内容
为了解决现有FISH放大技术成本高、步骤复杂、信号强度弱的技术问题,本发明提供了一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法,该方法具有经济实用、步骤简单、稳定和灵敏度高的优点。
本发明还提供了一种用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA制备方法。
本发明通过以下技术方案实现:
本发明实施例提供一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法,所述制备方法包括:
以基因识别引物、第一磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料,进行连接反应;
连接反应完成后加入Bst DNA聚合酶和dNTP,进行滚环扩增反应,反应温度为45-55℃,反应时间为1-3h,获得用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA;
其中,所述第一磷酸化环化引物包含片段C,所述C的局部片段与第一荧光探针的核酸片段核苷酸序列相同;
或者,所述C的局部片段与二级放大单链DNA的局部片段核苷酸序列相同。
可选的,所述以基因识别引物、第一磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料,进行连接反应,具体包括:
将基因识别引物、第一磷酸化环化引物、DNA连接酶缓冲液和退火缓冲液混合,90-95℃热处理3-5min,以0.1-0.4℃/min的冷却速度冷却至25-37℃,后加入DNA连接酶进行连接反应,反应温度为25-37℃,反应时间为4-12h。
可选的,所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶。
可选的,所述基因识别引物的一端包含片段A,另一端包含片段B1和B2,所述A与待测DNA或待测RNA的局部片段碱基互补;
所述第一磷酸化环化引物的两端分别为片段B1′和B2′,所述B1′和所述B2′之间的序列包含所述C,所述B1与所述B1′碱基互补,所述B2与所述B2′碱基互补。
可选的,所述基因识别引物中:
所述A具有如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:10中任意一项所示的核苷酸序列;
所述B1具有如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列;
所述B2具有如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列;
所述第一磷酸化环化引物中:
所述B1′具有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列;
所述B2′具有如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列;
所述C具有如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
基于同一发明构思,本发明实施例还提供一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA,所述单链DNA一端包含片段A,另一端包含若干个片段C′,所述C′与DNA片段C碱基互补,所述A具有如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:10中任意一项所示的核苷酸序列,所述C具有如SEQID NO:15所示的核苷酸序列。
基于同一发明构思,本发明实施例还提供一种用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA制备方法,所述方法包括:
以二级放大识别引物、第二磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料,进行二级放大连接反应;
二级放大连接反应完成后加入Bst DNA聚合酶和dNTP,进行二级放大滚环扩增反应,反应温度为45-55℃,反应时间为1-3h,获得用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA。
可选的,所述以二级放大识别引物、第二磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料,进行二级放大连接反应,具体包括:
以二级放大识别引物、第二磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料,90-95℃热处理3-5min,以0.1-0.4℃/min的冷却速度冷却至25-37℃,后加入DNA连接酶进行二级放大连接反应,反应温度为25-37℃,反应时间为4-12h。
可选的,所述用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA包含若干个片段D,所述D与第二荧光探针的核酸片段碱基互补。
可选的,所述二级放大识别引物的一端为片段E,所述E与用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA中的片段C的局部片段核苷酸序列相同,所述用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA通过上述一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法制得,所述二级放大识别引物的另一端包含片段F1和F2;
所述第二磷酸化环化引物的两端分别为片段F1′和F2′,所述F1′和所述F2′之间的序列包含片段D,所述D与第二荧光探针的核酸片段核苷酸序列相同,所述F1与所述F1′碱基互补,所述F2与所述F2′碱基互补。
可选的,所述第二磷酸化环化引物中:
所述D具有如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列;
所述F1′具有如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列;
所述F2′具有如SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;
所述二级放大识别引物中:
所述E具有如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列;
所述F1具有如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列;
所述F2具有如SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列。
基于同一发明构思,本发明实施例还提供一种用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA,所述单链DNA一端包含片段E,另一端包含若干个片段D′,所述D′与DNA片段D碱基互补,所述E具有如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列,所述D具有如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。
本发明实施例中的一个或多个技术方案,至少具有如下技术效果或优点:
1.本发明一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法,将基因识别引物和第一磷酸化环化引物混合,在DNA连接酶作用下,第一磷酸化环化引物闭合形成首尾相接的单链环,连接反应完成后,加入DNA聚合酶和dNTP,进行滚环扩增反应,以单链环为模板对基因识别引物进行延伸,形成的用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA上包含若干个重复的片段C′,片段C′与片段C碱基互补,片段C′可结合探针或结合用于二次放大的DNA,可用于核酸原位杂交的信号放大,相比现有信号放大方式而言,本发明的方法步骤简单,具有经济实用和灵敏度高的优点。
2.本发明一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法,滚环扩增反应采用Bst DNA聚合酶,Bst DNA聚合酶的延伸能力较弱,有利于对反应产物长度的控制,避免过长的产物导致其杂交的穿透能力过低,并结合对滚环扩增反应的时间与温度控制,得到一种较为匀一的带型,长度为750bp,可用于扩增产物的回收,由于采用重复的荧光结合位点,因此只需要一种荧光来实现一种基因的标记,而传统的方法通常需要合成几十种或上百种的荧光探针,因而本发明极大地减少了荧光探针的合成成本。
3.本发明一种用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA制备方法,在后期杂交阶段与用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA的局部片段结合,每条用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA上连接若干条用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA,每条用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA上可结合若干第二荧光探针,达到荧光信号进一步放大,具有更高的灵敏度。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,而可依照说明书的内容予以实施,并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂,以下特举本发明的具体实施方式。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法示意图;
图2是采用不同DNA聚合酶的滚环扩增产物电泳图谱;
图3是在不同温度梯度与不同时间梯度条件下的滚环扩增产物电泳图谱;
图4是EYFP基因探针在转染EYFP的Hela细胞中的FISH实验荧光成像图;
图5是EYFP基因探针在Thy1-YFP小鼠脑组织中FISH实验荧光成像图;
图6是小鼠脑组织中针对Gad1基因FISH成像检测图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例,具体阐述本发明,本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解,这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明,而非限制本发明。
在整个说明书中,除非另有特别说明,本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此,除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾,本说明书优先。
除非另有特别说明,本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等,均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题,总体思路如下:
根据本发明一种典型的实施方式,提供一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法,所述制备方法包括:
以基因识别引物、第一磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料,进行连接反应;
连接反应完成后加入Bst DNA聚合酶和dNTP,进行滚环扩增反应,反应温度为45-55℃,反应时间为1-3h,获得用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA;
其中,所述第一磷酸化环化引物包含片段C,所述C的局部片段与第一荧光探针的核酸片段核苷酸序列相同;
或者,所述C的局部片段与二级放大单链DNA的局部片段核苷酸序列相同。
优选的,所述滚环扩增反应的反应温度为50℃,反应时间为2h。
本发明中,发明人通过大量试验,对DNA聚合酶及反应温度和时间进行选择,得出:当聚合酶采用Bst DNA聚合酶,滚环扩增的反应温度为45-55℃,反应时间为1-3h时,可得到长度为750bp的单一带型,750bp的单链DNA制备成探针后具有显著的原位杂交信号放大效果及穿透能力,并且易于回收。
本发明将基因识别引物和第一磷酸化环化引物混合,在DNA连接酶作用下,第一磷酸化环化引物闭合形成首尾相接的单链环,连接反应完成后,加入DNA聚合酶和dNTP,进行滚环扩增反应,以单链环为模板对基因识别引物进行延伸,形成的用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA上包含若干个重复的片段C′,片段C′与片段C碱基互补,片段C′可结合探针或结合用于二次放大的DNA,可用于核酸原位杂交的信号放大,相比现有信号放大方式而言,本发明的方法步骤简单,具有经济实用和灵敏度高的优点。
本发明滚环扩增反应采用Bst DNA聚合酶,Bst DNA聚合酶的延伸能力较弱,有利于对反应产物长度的控制,避免过长的产物导致其杂交的穿透能力过低,并结合对滚环扩增反应的时间与温度控制,得到一种较为匀一的带型,长度为750bp,可用于扩增产物的回收,由于采用重复的荧光结合位点,因此只需要一种荧光来实现一种基因的标记,而传统的方法通常需要合成几十种或上百种的荧光探针,因而本发明极大地减少了荧光探针的合成成本。
作为一种可选的实施方式,所述以基因识别引物、第一磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料,进行连接反应,具体包括:
将基因识别引物、第一磷酸化环化引物、DNA连接酶缓冲液和退火缓冲液混合,90-95℃热处理3-5min,以0.1-0.4℃/min的冷却速度冷却至25-37℃,后加入DNA连接酶进行连接反应,反应温度为25-37℃,反应时间为4-12h。
作为一种可选的实施方式,所述DNA连接酶为T4 DNA连接酶。
本发明实施例中,DNA连接酶也可用其它类型的DNA连接酶,如T3 DNA连接酶。
本发明实施例中,连接反应温度为25-37℃,这是依据T4连接酶的最适反应条件来确定的,而BNA聚合酶最造反应温度是65℃,但实际上采用45-55℃是依据实验结果优化出来的,好处是可以有效控制单链DNA的扩增长度,如果低于或高于上述范围值会带来过慢或过快酶反应速度,从而导致难以控制延伸长度。
作为一种可选的实施方式,所述基因识别引物的5′端包含片段A,3′端包含片段B1和B2,所述A与待测DNA或待测RNA的局部片段碱基互补;
所述第一磷酸化环化引物的两端分别为片段B1′和B2′,所述B1′和所述B2′之间的序列包含所述C,所述B1与所述B1′碱基互补,所述B2与所述B2′碱基互补。
第一磷酸化环化引物的两端分别与基因识别引物中的片段B1和B2碱基互补,将基因识别引物和第一磷酸化环化引物混合后,第一磷酸化环化引物在基因识别引物作用下形成环状单链DNA结构,在DNA连接酶作用下,环状单链DNA结构的B1′和B2′端连接闭合形成首尾相接的单链环,连接反应完成后,加入DNA聚合酶和dNTP,进行滚环扩增反应,以单链环为模板对基因识别引物进行延伸,形成的用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA上包含若干个重复的片段C′,片段C′与片段C碱基互补,片段C′可结合探针或结合用于二次放大的DNA,达到核酸原位杂交信号放大的效果,相比现有信号放大方式而言,本发明的方法步骤简单,具有经济实用和灵敏度高的优点。
作为一种可选的实施方式,所述基因识别引物中:
所述A具有如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:10中任意一项所示的核苷酸序列;
所述B1具有如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列;
所述B2具有如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列;
所述第一磷酸化环化引物中:
所述B1′具有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列;
所述B2′具有如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列;
所述C具有如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
根据本发明另一种典型的实施方式,提供一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA,所述单链DNA一端包含片段A,另一端包含若干个片段C′,所述C′与DNA片段C碱基互补,所述A具有如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:10中任意一项所示的核苷酸序列,所述C具有如SEQID NO:15所示的核苷酸序列。
根据本发明另一种典型的实施方式,提供一种用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA制备方法,所述方法包括:
以二级放大识别引物、第二磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料,进行二级放大连接反应;
二级放大连接反应完成后加入Bst DNA聚合酶和dNTP,进行二级放大滚环扩增反应,反应温度为45-55℃,反应时间为1-3h,获得用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA。
本发明中,用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA可直接与第一荧光探针结合,也可在后期杂交阶段与用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA的局部片段结合,每条用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA上连接若干条用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA,每条用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA上可结合若干第二荧光探针,达到荧光信号进一步放大,具有更高的灵敏度。
可选的,所述以二级放大识别引物、第二磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料,进行二级放大连接反应,具体包括:
以二级放大识别引物、第二磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料,90-95℃热处理3-5min,以0.1-0.4℃/min的冷却速度冷却至25-37℃,后加入DNA连接酶进行二级放大连接反应,反应温度为25-37℃,反应时间为4-12h。
可选的,所述用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA包含若干个片段D,所述D与第二荧光探针的核酸片段碱基互补。
可选的,所述二级放大识别引物的5′端为片段E,所述E与用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA中的片段C的局部片段核苷酸序列相同,所述用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA通过上述一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法制得,所述二级放大识别引物的3′端包含片段F1和F2;
所述第二磷酸化环化引物的两端分别为片段F1′和F2′,所述F1′和所述F2′之间的序列包含片段D,所述D与第二荧光探针的核酸片段核苷酸序列相同,所述F1与所述F1′碱基互补,所述F2与所述F2′碱基互补。作为一种可选的实施方式,所述第二磷酸化环化引物中:
所述D具有如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列;
所述F1′具有如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列;
所述F2′具有如SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;
所述二级放大识别引物中:
所述E具有如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列;
所述F1具有如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列;
所述F2具有如SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列。
根据本发明另一种典型的实施方式,提供一种用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA,所述单链DNA一端包含片段E,另一端包含若干个片段D′,所述D′与DNA片段D碱基互补,所述E具有如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列,所述D具有如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。
本发明涉及的DNA的核苷酸序列如下表所示:
上表中,基因识别引物EYFP-1~5的片段A分别与EYFP基因的5个片段碱基互补,基因识别引物Gad1-1~5的片段A分别与小鼠Gad1基因的5个片段碱基互补。需要注意的是:本发明用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法及二级放大方法还可适用于其他种类基因的杂交探针制备,并不仅限于EYFP基因和小鼠Gad1基因,EYFP基因和小鼠Gad1基因的一级放大和二级放大探针仅作为验证本发明技术效果的案例呈现。
本发明涉及的英文或缩写释义如下:
T4 Ligase: T4 DNA连接酶
T4 Ligase Buffer: T4 DNA连接酶缓冲液
Anealing Buffer: 引物退火缓冲液
Bst LF Polymerase: Bst大片段DNA聚合酶
Bst Polymerase Buffer: Bst大片段DNA聚合酶缓冲液
SSCT: 柠檬酸钠-吐温缓冲液
SSC: 柠檬酸钠缓冲液
RVC: 氧钒核糖核苷复合物
PBST0.5: 磷酸缓冲盐溶液与0.5%Triton X-100
PBSTw: 磷酸缓-吐温冲盐溶液
DAPI: 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚
FISH: 荧光原位杂交
CY5: CY5荧光染料
Tamra: Tamra荧光染料。
下面将结合实施例对本申请一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法及二级放大的单链DNA制备方法进行详细说明。
实施例1
本实施例一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法,包括以下步骤:
1.连接反应
将基因识别引物、第一磷酸化环化引物、DNA连接酶缓冲液和退火缓冲液混合,95℃条件下热处理3-5min,自然冷却至室温后加入DNA连接酶进行连接反应,反应温度为37℃,反应时间为4h。
连接反应体系如表2所示:
表2连接反应体系
2.滚环扩增反应
连接反应完成后向反应体系中加入DNA聚合酶和dNTP等,构成滚环扩增反应体系,进行滚环扩增反应,反应温度为45-55℃,反应时间为1-3h,获得用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA。
滚环扩增反应体系如表3所示:
表3滚环扩增反应体系
3.扩增反应产物利用1%琼脂糖凝胶进行电泳,胶回收产物。
上述步骤均可在试管中完成。
本实施例选用两种聚合酶进行滚环扩增,即依照上述步骤,分别利用phi29 DNA聚合酶与Bst DNA聚合酶采用不同的温度与时间进行滚环扩增反应。结果如图2所示:由于phi29 DNA聚合酶产生的链长超过了5kb,但后期的DNA的回收效率过低,也考虑到过长的ssDNA可能会导致杂交的穿透能过低,所以不采用phi29 DNA聚合酶进行相关的后续实验。而Bst DNA聚合酶表现出了较弱的延伸能力,正好有利于实验对反应长度的控制需要。
然后,利用Bst DNA聚合酶在45℃,50℃与55℃条件温度梯度,分别延伸反应0.5小时,1小时,1.5小时,2小时,结果如图3,电泳结果表明随着增加与反应时间的延长,都要助于ssDNA链的增长。50℃,2小时产生了大约750bp的长度,比较适中,因此后期均采用该延伸反应条件。
实施例2
本实施例一种用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA制备方法,本实施例方法与实施例1相同,仅需要将基因识别引物、第一磷酸化环化引物分别替换成二级放大识别引物、第二磷酸化环化引物即可。
实施例3
本实施例进行基因探针在细胞中的FISH实验。
(1)试剂配制
1、PBST0.5:1×PBS,0.5%Triton X-100
2、PBSTw:1×PBS,0.1%Tween-20
3、2×SSCT:2×SSC,PBSTw;
4、杂交探针缓冲液:2×SSC,30%甲酰胺,20mM RVC,10%葡聚糖,1%Triton X-100,0.1mg/ml Samlon Spern DNA,1×PBS,探针(0.5-1μg/ml)
探针加入缓冲液前85-95℃热处理5mim。(若要孵育二级放大信号探针,则甲酰胺浓度为50%)
5、30%甲酰胺溶液:30%甲酰胺,1×PBS
6、15%甲酰胺溶液:15%甲酰胺,1×PBS
7、二级放大信号探针缓冲液:2×SSC,30%甲酰胺,20mM RVC,10%葡聚糖,1%Triton X-100,0.1mg/ml Samlon Spern DNA,1×PBS,探针(0.5-1μg/ml)
探针加入缓冲液前85-95℃热处理5min
8、荧光探针杂交缓冲液:2×SSC,20%甲酰胺,10%葡聚糖,150nM荧光探针,1×PBS
Wash buffer:2×SSC,20%甲酰胺,1×PBS
(1)实验操作步骤:
1)表达EYFP荧光的Hela细胞制备
A)Hela细胞分皿长匀:取12孔板。每孔加细胞培养液1ml,37℃5%CO2培养箱过夜培养至细胞密度为70%
B)制备转染液:均为不含血清和双抗(青霉素/链霉素)的DMEM
A:1.6μg EYFP质粒,终体积为200μl
B:5μl脂质体,终体积为200μl
混匀A、B,室温静置10-15min
A)用PBS润洗细胞2次,用不含血清和双抗的培养液润洗一遍
B)把A/B混合液缓缓加入12孔板内的细胞中,37℃5%CO2培养箱培养4-6小时
C)吸除无血清培养液,换上含10%血清的培养液,过夜培养。
2)细胞上的FISH实验
A)1×PBS润洗细胞
B)4%PFA室温固定10min;
C)1×PBS润洗细胞1min
D)PBST0.5室温透化处理10min
E)PBSTw润洗细胞1min
F)2×SSCT润洗细胞1min
G)探针杂交缓冲液于42℃轻微震荡孵育细胞18-24h;
H)30%甲酰胺溶液润洗切片2次,每次25min;
I)二级放大信号探针杂交缓冲液于37℃轻微震荡孵育细胞4-5h;
J)30%甲酰胺溶液润洗细胞2次,每次25min;
K)15%甲酰胺溶液润洗细胞2次,每次20min;
L)2×SSCT润洗细胞3次,每次15min;
M)DAPI室温孵育细胞10min;
N)2×SSCT润洗细胞3次,每次10min;
0)荧光探针缓冲液室温孵育细胞0.5-1h;
P)Wash buffer润洗细胞3次,每次10min;
Q)Zeiss 710倒置共聚焦显微镜成像。
(3)实验结果
对HeLa细胞转蛋白EYFP的质粒,转染后有部分HeLa细胞会表达EYFP荧光蛋白,在激发光的作用下,能显示出荧光信号。为了检测FISH杂交具有好的准确性,将表达荧光蛋白的HeLa细胞与未转染荧光蛋白的HeLa细胞混合后,分别进行一级放大杂交与二级放大杂交,本实施例用到的一级放大与二级放大的荧光探针的A片段具有5种核苷酸序列,分别为SEQ ID NO:1~5。杂交结果如图4所示,无论是一级放大杂交还是二级放大杂交,FISH信号与EYFP都有很好的共定位。
实施例4
本实施例进行基因探针在鼠脑组织中的FISH实验。
(1)试剂配制
1、PBST:1×PBS.0.1%Triton X-100;
2、4×SSCT:4×SSC,PBST;
3、杂交探针缓冲液:2×SSC,40%甲酰胺,20Mm RVC,10%葡聚糖,1%Triton X-100,0.1mg/ml Samlon Spern DNA,1×PBS,探针(0.5-1μg/ml)
探针加入缓冲液前85-95℃热处理5min
4、30%-40%甲酰胺溶液:30%-40%甲酰胺.1×PBS
5、20%-25%甲酰胺溶液:20%-25%甲酰胺,1×PBS
6、二级放大信号探针缓冲液:2×SSC,25%甲酰胺,20Mm RVC,10%葡聚糖,1%Triton X-100,0.1mg/ml Samlon Spern DNA,1×PBS,探针(0.5-1μg/ml)
探针加入缓冲液前85-95℃热处理5min
7、2×SSCT:2×SSC.PBST
8、荧光探针杂交缓冲液:2×SSC,20%甲酰胺,10%葡聚糖,150nM荧光探针,1×PBS
9、Wash buffer:2×SSC,20%甲酰胺,1×PBS
(2)实验操作步骤
1、PBS对Thy1-YFP小鼠进行心脏灌流,4%PFA再灌流小鼠,剥离小鼠脑组织,或者是PBS对C57小鼠进行心脏灌流,剥离小鼠脑组织
2、脑组织处理方式:脑组织利用4%PFA于4℃下后固定2h,PBS润洗脑组织2次,加入30%蔗糖溶液过夜脱水处理,OCT进行组织包埋,-80℃异戊烷速冻
3、脑组织冷冻切片,切片厚度为16-20μm;
4、4%PFA室温固定切片10min;
5、PBS润洗切片2次;
6、切片甲醇梯度脱水(50%-75%-95%-100%)处理,每个梯度处理3min,-20℃100%甲醇透化处理过夜;
7、-80℃通透处理15min,室温平衡;
8、PBST洗3次,每次5min;
9、杂交探针缓冲液于37-43℃轻微震荡孵育切片过夜;
10、30%-40%甲酰胺/PBS洗涤切片,2次,每次30min,室温;
11、20%-25%甲酰胺/PBS洗涤切片,2次,每次45min,室温;
12、二级放大探针杂交缓冲液于37℃轻微震荡孵育切片4-5h;
13、20%甲酰胺/PBS洗涤切片,3次,每次20min,室温;
14、2×SCCT洗涤切片3次,每次5min,室温;
15、DAPI孵育切片,20min,室温;
16、2×SCCT洗涤切片3次,每次10min;
17、荧光探针缓冲液于室温孵育切片30min;
18、Wash buffer润洗切片3次,每次10min;
19、Zeiss 710倒置共聚焦显微镜成像。
(3)实验结果
为了检测FISH杂交能针对组织有效准确性地检测mRNA的表达,利用Thy1-EYFP转基因鼠(在部分神经元细胞中表达有EYFP的信号),通过对10um的冰冻包埋的脑切片杂交,结果如图5所示,通过二级放大杂交后的FISH信号与EYFP也都有很好的共定位,FISH荧光与荧光蛋白的细胞水平上的共定位率达100%。
图6为针对小鼠脑片上的抑制性神经元的标志基因Gad1进行检测,一级放大表现出了较高的背景信号,但经过二级放大后,背景信号明显降低。
本实施例针对EYFP基因的检测,用到的二级放大的荧光探针的A片段具有5种核苷酸序列,分别为SEQ ID NO:1~5;针对Gad1基因的检测,用到的一级放大和二级放大的荧光探针的A片段具有5种核苷酸序列,分别为SEQ ID NO:6~10。
附图4-6的详细说明:
如图4所示,A对应的四个图a1、a2、a3和a4分别表示:a1)HeLa细胞DAPI染色后的成像图;a2)表达外源转染EYFP基因的EYFP蛋白荧光成像图;a3)针对EYFP基因的一级放大FISH荧光成像图;a4)a1-a3的叠加图
B对应的四个图b1、b2、b3和b4分别表示:b1)HeLa细胞DAPI染色后的成像图;b2)表达外源转染EYFP基因的EYFP蛋白荧光成像图;b3)针对EYFP基因的二级放大FISH荧光成像图;b4)b1-b3的叠加图。
如图5所示,图5中左、中和右侧图分别表示:左)Thy1-EYFP转基因小鼠脑片的DAPI染色的成像图;中)EYFP荧光蛋白成像图;右)EYFP基因的二级放大FISH荧光成像图,荧光染料为Tamra
如图6所示,左图为一级放大荧光探针Gad1基因FISH成像检测图,右图为二级放大荧光探针Gad1基因FISH成像检测图。
本发明实施例中的一个或多个技术方案,至少具有如下技术效果或优点:
(1)本发明实施例一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法,将基因识别引物和第一磷酸化环化引物混合,在DNA连接酶作用下,第一磷酸化环化引物闭合形成首尾相接的单链环,连接反应完成后,加入DNA聚合酶和dNTP,进行滚环扩增反应,以单链环为模板对基因识别引物进行延伸,形成的用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA上包含若干个重复的片段C′,片段C′与片段C碱基互补,片段C′可结合探针或结合用于二次放大的DNA,可用于核酸原位杂交的信号放大,相比现有信号放大方式而言,本发明的方法步骤简单,具有经济实用和灵敏度高的优点。
(2)本发明实施例一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法,滚环扩增反应采用Bst DNA聚合酶,Bst DNA聚合酶的延伸能力较弱,有利于对反应产物长度的控制,避免过长的产物导致其杂交的穿透能力过低,并结合对滚环扩增反应的时间与温度控制,得到一种较为匀一的带型,长度为750bp,可用于扩增产物的回收,100ul的反应体系回收可以得到2-3ug的单链DNA,可实现4-5张脑片的杂交反应,由于采用重复的荧光结合位点,因此只需要一种荧光来实现一种基因的标记,而传统的方法通常需要合成几十种或上百种的荧光探针,因而本发明极大地减少了荧光探针的合成成本。
(3)本发明实施例一种用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA制备方法,用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA可直接与第一荧光探针结合,也可在后期杂交阶段与用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA的局部片段结合,每条用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA上连接若干条用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA,每条用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA上可结合若干第二荧光探针,达到荧光信号进一步放大,具有更高的灵敏度。
最后,还需要说明的是,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 华中科技大学
<120> 一种用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA制备方法及二级放大的单链DNA制备方法
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(1)
<400> 1
tcccggcggc ggtcacgaac tccagcagga 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(2)
<400> 2
agcgggcgaa gcactgcagg ccgtagccga 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(3)
<400> 3
gctcgatgcg gttcaccagg gtgtcgccct 30
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(4)
<400> 4
acctcggcgc gggtcttgta gttgccgt 28
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(5)
<400> 5
cctggacgta gccttcgggc atggcggact 30
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(6)
<400> 6
ctcggcgggg ggaatcacga ggccgttgc 29
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(7)
<400> 7
tgcttgcacg atccctggtc cggcacggg 29
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(8)
<400> 8
cgctcccgcg ttcgaggagg ttgcaggcga 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(9)
<400> 9
tctggtgcat ccatgggcta cgccacacca 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(10)
<400> 10
aggagtggaa gatgccatca gctcggtggt 30
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(11)
<400> 11
ttagttggga tgtatt 16
<210> 12
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(12)
<400> 12
gaaggaggat 10
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(13)
<400> 13
aatacatccc aactaa 16
<210> 14
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(14)
<400> 14
atcctccttc 10
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(15)
<400> 15
accctctaac ttccatcaca acagta 26
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(16)
<400> 16
accctctaac ttccatca 18
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(17)
<400> 17
acactaccac catttcctat 20
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(18)
<400> 18
taccaccatt tcctataaaa cactaccacc attt 34
<210> 19
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(19)
<400> 19
actctcacac 10
<210> 20
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(20)
<400> 20
cctatacacc a 11
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(21)
<400> 21
accctctaac ttccatca 18
<210> 22
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(22)
<400> 22
gtgtgagagt 10
<210> 23
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(23)
<400> 23
tggtgtatag g 11
Claims (7)
1.一种用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:
以基因识别引物、第一磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料,进行连接反应;
连接反应完成后加入Bst DNA聚合酶和dNTP,进行滚环扩增反应,反应温度为45-55℃,反应时间为1-3h,获得用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA;
以二级放大识别引物、第二磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料,进行二级放大连接反应;
二级放大连接反应完成后加入Bst DNA聚合酶和dNTP,进行二级放大滚环扩增反应,反应温度为45-55℃,反应时间为1-3h,获得用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA;
其中,所述第一磷酸化环化引物包含片段C,所述片段C的局部片段与二级放大单链DNA的局部片段核苷酸序列相同;
所述用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA和用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA长度为750bp;
所述基因识别引物的5'端包含片段A,3'端包含片段B1和B2,所述片段A与待测DNA或待测RNA的局部片段碱基互补;
所述第一磷酸化环化引物的两端分别为片段B1'和B2',所述片段B1'和所述片段B2'之间的序列包含片段C,所述片段B1与所述片段B1'碱基互补,所述片段B2与所述片段B2'碱基互补;
所述二级放大识别引物的5'端为片段E,所述片段E与用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA中的片段C的局部片段核苷酸序列相同,所述二级放大识别引物的3'端包含片段F1和F2;
所述第二磷酸化环化引物的两端分别为片段F1'和F2',所述片段F1'和所述片段F2'之间的序列包含片段D,所述片段D与第二荧光探针的核酸片段核苷酸序列相同,所述片段F1与所述片段F1'碱基互补,所述片段F2与所述片段F2'碱基互补。
2.根据权利要求1所述的一种用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA制备方法,其特征在于,所述以基因识别引物、第一磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料,进行连接反应,具体包括:
将基因识别引物、第一磷酸化环化引物、DNA连接酶缓冲液和退火缓冲液混合,90-95℃热处理3-5min,以0.1-0.4℃/min的冷却速度冷却至25-37℃,后加入DNA连接酶进行连接反应,反应温度为25-37℃,反应时间为4-12h。
3.根据权利要求1所述的一种用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA制备方法,其特征在于,所述基因识别引物中:
所述片段A为如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:10中任意一项所示的核苷酸序列;
所述片段B1为如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列;
所述片段B2为如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列;
所述第一磷酸化环化引物中:
所述片段B1'为如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列;
所述片段B2'为如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列;
所述片段C为如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的一种用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA制备方法,其特征在于,所述用于核酸原位杂交信号放大的单链DNA,一端包含片段A,另一端包含若干个片段C',所述片段C'与DNA片段C碱基互补,所述片段A为如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:10中任意一项所示的核苷酸序列,所述片段C为如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的一种用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA制备方法,其特征在于,所述以二级放大识别引物、第二磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料,进行二级放大连接反应,具体包括:
以二级放大识别引物、第二磷酸化环化引物和DNA连接酶为原料,90-95℃热处理3-5min,以0.1-0.4℃/min的冷却速度冷却至25-37℃,后加入DNA连接酶进行二级放大连接反应,反应温度为25-37℃,反应时间为4-12h。
6.根据权利要求1所述的一种用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA制备方法,其特征在于,所述第二磷酸化环化引物中:
所述片段D为如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列;
所述片段F1'为如SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列;
所述片段F2'为如SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列;
所述二级放大识别引物中:
所述片段E为如SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列;
所述片段F1为如SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列;
所述片段F2为如SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列。
7.一种用于核酸原位杂交信号二级放大的单链DNA,其特征在于,所述单链DNA的5'端包含片段E,3'端包含若干个片段D',所述片段D'与DNA片段D碱基互补,所述片段E为如SEQIDNO:21所示的核苷酸序列,所述片段D为如SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。
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