JP4962899B2

JP4962899B2 - 環状１本鎖ｄｎａの製造方法

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Publication number: JP4962899B2
Application number: JP2006235838A
Authority: JP
Inventors: 将史遠山
Original assignee: Toyo Seikan Kaisha Ltd
Current assignee: Toyo Seikan Kaisha Ltd
Priority date: 2006-08-31
Filing date: 2006-08-31
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2026-08-31
Also published as: CN101535478B; JP2008054589A; CN101535478A

Description

本発明は、１本鎖ＤＮＡ断片から高収率で環状１本鎖ＤＮＡを製造する方法に関する。

人体や環境中の微生物（アレルゲン、ウィルス、病原菌等）の迅速な検出は、医療現場における感染症の検査、また、食品や医薬品の製造、プール等における微生物検査など、多くの場面において実施されている。
微生物を検出する方法としては、細菌の検出であれば栄養培地上で生細胞を増殖させて検出する方法、その他、抗原抗体反応等によって微生物のタンパク質を検出する方法や核酸を増幅して検出する方法などが行われている。
上記の検出方法の中でも、微生物の持つ核酸を検出する方法は、菌体の培養工程が不要であり、かつ、短時間で高感度に検出が可能であるという利点を有する。即ち、核酸検出においては、少量のサンプルから迅速に検出することが可能であり、また、数多くの検体を扱うことも可能である。
ここで、核酸検出の際に核酸を増幅するための手法としてＰＣＲ法やＬＡＭＰ法などが知られる。しかし、ＰＣＲ法は機器が高価であり、またＬＡＭＰ法は長鎖のプライマーを用いているため非特異的な反応が起こり易いなどの問題点がある。そこで、環状１本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸を増幅する方法が提案されている（ＷＯ２００２−０４４３３９号公報）。

鋳型となる環状１本鎖ＤＮＡは、１本鎖ＤＮＡ断片を環状化させて作製することができるが、これを効率的に行うための方法として、結合させるＤＮＡ断片の両末端配列に相補的なポリヌクレオチドを結合させて１本鎖ＤＮＡ断片を環状に配置させてから、５’および３’末端部にリガーゼを作用させて結合する方法が報告されている（特開２００５−２７８４６５号公報）。しかしながら、この方法においては環状化効率を高めるために予め直鎖状１本鎖ＤＮＡの自由エネルギーの計算を必要とする。また、前記の文献は、高収率の環状化１本鎖ＤＮＡを得るために耐熱性ＤＮＡリガーゼを用いて連続的にライゲーション反応を行うことは示唆していない。
１本鎖環状ＤＮＡを鋳型としてその相補鎖をタンデムに配列した鎖状１本鎖ＤＮＡ(ssDNA)を迅速に合成するRCA(Rolling Circle Amplification)反応が、一塩基変異多型検出やシークエンス反応用鋳型ＤＮＡの簡便な増幅法などのバイオツールとして利用されつつある。また、ＲＮＡポリメラーゼを用いて環状１本鎖ＤＮＡから連続的に相補鎖ＲＮＡを合成してタンパク質の大量合成に応用されるようになっている。
このように、環状１本鎖ＤＮＡの用途が広がっており、従って、環状１本鎖ＤＮＡを簡便に、かつ高収率で製造する方法が重要となる。

ＷＯ２００２−０４４３３９号公報特開２００５−２７８４６５号公報

本発明は、１本鎖ＤＮＡ断片から、環状１本鎖ＤＮＡを簡便に、かつ高収率で製造する方法を提供するものである。

本発明は、環状１本鎖ＤＮＡの製造方法であって、
a)直鎖状１本鎖ＤＮＡと、前記直鎖状１本鎖ＤＮＡの５’末端領域および３’末端領域の相補配列を隣接して有するアダプターポリヌクレオチドと、耐熱性リガーゼとを含む反応混合物を調製する工程、
b)直鎖状１本鎖ＤＮＡとアダプターポリヌクレオチドの相補配列を結合させることにより、前記直鎖状１本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端とを隣接させる工程、
c)前記直鎖状１本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端とを連結する工程、
d)環状化された１本鎖ＤＮＡとアダプターポリヌクレオチドを解離させる工程、
を含む、前記製造方法に関する。

本発明の方法は、耐熱性ＤＮＡリガーゼを使用して環状１本鎖ＤＮＡを製造するものであり、同一酵素反応混合物内で反復してライゲーション反応を行うことにより、直鎖状１本鎖ＤＮＡから環状１本鎖ＤＮＡを高収率で合成することが可能である。

本発明の環状１本鎖ＤＮＡの製造方法では、工程a)において、直鎖状１本鎖ＤＮＡおよび前記直鎖状１本鎖ＤＮＡと相補的な配列を有するアダプターポリヌクレオチドおよび耐熱性リガーゼを含む反応混合物が調製される。
環状化に用いられる直鎖状１本鎖ＤＮＡの塩基の種類や数には特に制限はなく、実際の細胞から単離されたゲノム配列でも、人工的に合成されたポリヌクレオチド配列であってもよく、一般に環状化し得るに十分な数の塩基があればよく、例えば少なくとも２０塩基以上、好ましくは２０〜２００塩基、より好ましくは３０〜８０塩基である。
用いる耐熱性DNAリガーゼに依存するが、環状化に用いられる直鎖状１本鎖ＤＮＡが人工的に合成されたポリヌクレオチドの場合、５’末端をリン酸化している方が望ましいが、リン酸化しなくても良い。また、その他の修飾はしない方が望ましい。

また、アダプターポリヌクレオチドは、前記直鎖状１本鎖ＤＮＡの５’末端領域および３’末端領域の相補配列を有し、具体的には、前記直鎖状１本鎖ＤＮＡの５’末端領域および３’末端領域の各相補配列を隣接して有する。本発明において、「５’末端領域」、「３’末端領域」とは、それぞれ直鎖状１本鎖ＤＮＡの５’末端、３’末端の最末端塩基を含む領域を意味し、その領域の長さは一般にポリヌクレオチドのアニーリングを行うために必要な値で当業者が設定することができる。例えば５〜２０塩基が適当であり、アダプターポリヌクレオチドの合成を考慮すると、５’末端領域と３’末端領域の合計で１５〜３０塩基程度であることが好ましい。

本発明において、「（５’末端領域および３’末端領域の）相補配列」は、直鎖状１本鎖ＤＮＡの５’末端および３’末端の各領域の配列と完全に相補的な配列であることが好ましいが、前記直鎖状１本鎖ＤＮＡとのアニーリングが可能な限りにおいてミスマッチの塩基対を有していてもよい。そのような塩基対の数は反応条件や全体の領域の長さに依存するが、例えば各領域に１個、２個、３個等、または各領域の全塩基の１％〜５０％程度であり得る。ただし、当業者に理解されるように、ライゲーションを効率的に行うためには、環状化の際に実際にリガーゼによる連結反応が行われる５’末端と３’末端の塩基は、それぞれアダプターの塩基と塩基対を形成していることが好ましい。
本発明のアダプターポリヌクレオチドは、上に説明した５’末端領域に相補的な配列と３’末端領域に相補的な配列を隣接して有する。ここで、「隣接する」とは、５’側から前記５’末端相補配列、次いで３’末端相補配列が、間に塩基を挟むことなく連続していることを意味する。このようなアダプターポリヌクレオチドは、図１に示すように、直鎖状１本鎖ＤＮＡとアニーリングすることにより前記直鎖状１本鎖ＤＮＡを環状に配置させることが可能となる。

本発明の方法においては、直鎖状１本鎖ＤＮＡを環状化するためのライゲーション反応に耐熱性ＤＮＡリガーゼが使用される。耐熱性ＤＮＡリガーゼとは、隣接したＤＮＡ鎖の５’末端と３’末端をホスホジエステル結合で連結する酵素であって、２本鎖ＤＮＡを１本鎖ＤＮＡに解離させるような高温（ＤＮＡ解離温度）、例えば８０〜１００℃、好ましくは９０〜９５℃でも実質的に活性を失わない酵素を意味する。例えば、一般的に解離温度として使用される９５〜１００℃に３０分〜１時間程度さらしても３０％以上、好ましくは５０％以上の酵素活性を維持するようなリガーゼが挙げられ、一般にＬＣＲ反応への使用に適したものとして市販されるリガーゼであれば「耐熱性ＤＮＡリガーゼ」に含まれると理解される。耐熱性ＤＮＡリガーゼは、一般に高温環境に生息するパイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)やアエロパイラム・ペルニックス(Aeropyrum pernix)、サーモコッカス属（Thermococcus sp.）などの超好熱性菌やサーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）などの高度好熱性菌から単離されるが、耐熱性をさらに高めるために組み換えが行われているものも本発明の方法に使用し得る。具体的には、（Stratagene社製のPfu DNA リガーゼやEpicentre社製のAmpligase DNA リガーゼ、和光純薬工業社製耐熱性DNAリガーゼ、New England Biolabs社製の９°N^th DNA Ligase、Taq DNA Ligase）などが挙げられる。

本発明の方法において、工程a)で調製される反応混合物は、上記の直鎖状１本鎖ＤＮＡ、アダプターポリヌクレオチド、耐熱性ＤＮＡリガーゼを含む。これらの濃度、存在比率は当該分野の技術常識に基づいて適宜決定することができる。直鎖状１本鎖ＤＮＡの濃度は例えば1〜100μmol/l、好ましくは20〜80μmol/l、より好ましくは40〜60μmol/lであり、アダプターポリヌクレオチドの濃度は例えば0.05〜50μmol/l、好ましくは1〜40μmol/l、より好ましくは3〜12μmol/lなどであるが、これらの範囲に限定されるものではない。また、好ましい直鎖状１本鎖ＤＮＡとアダプターポリヌクレオチドとのモル比は後述するライゲーション反応の繰り返し回数などにより変動するが、例えば100:1〜1:5、好ましくは50:1〜1:1、より好ましくは20:1〜4:1である。
なお、本発明の方法では、後述するようにアダプターポリヌクレオチドは環状化した１本鎖ＤＮＡから解離して再利用することができるため、当初の反応混合物中にアダプターポリヌクレオチドが直鎖状１本鎖ＤＮＡよりも低い割合（例えば上に示したようなモル比20:1など）でしか存在しない場合であっても効率的に環状１本鎖ＤＮＡを製造することができる。

耐熱性ＤＮＡリガーゼの添加量は、例えば市販のものを使用する場合は、反応混合物中のＤＮＡの濃度や量に基づいて製造者の指示に従って好ましい値を決定し得る。
また、工程a)で調製される反応混合物はさらに、ライゲーション反応に必要な様々な物質を含んでもよい。一般に、使用するリガーゼの種類に応じて反応バッファーの組成が決定されるが、例えばTris-HCl(pH 7.5)、KCl、MgCl₂、ATP、NAD(P)、DTTなどを適切な濃度で含むことができる。実際には、市販のリガーゼに添付される反応バッファーを製造者の指示に従って使用すれば十分である。

上記工程a)で直鎖状１本鎖ＤＮＡ、アダプターポリヌクレオチドおよび耐熱性DNAリガーゼを含む反応混合物を調製した後、工程b)からd)で、それぞれ直鎖状１本鎖ＤＮＡとアダプターポリヌクレオチドの結合（アニーリング）、ライゲーション反応による環状化、熱変性による環状化一本鎖DNAとアダプターポリヌクレオチドへの分離を行うことにより、環状一本鎖DNAが製造される（図１参照）。

より詳細には、工程b)では、直鎖状１本鎖ＤＮＡとアダプターポリヌクレオチドの相補配列を結合させることにより、前記直鎖状１本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端とを隣接させる。直鎖状１本鎖ＤＮＡとアダプターポリヌクレオチドとの結合（アニーリング）は、反応混合物を適当な温度に置くことにより行われ、その温度は例えば５５〜６５℃、好ましくは６０℃であるが、当業者の理解するようにアダプターポリヌクレオチドの長さやT_m値によって適切な値は変動するため、適宜調整することが可能である。反応時間も同様にポリヌクレオチドの長さや反応温度との関係で任意に設定することができる。例えば１秒から３分まで、好ましくは５秒から１分まで、より好ましくは１０秒であるが、反応混合物が実質的に設定温度に到達していれば十分であり、より長い時間設定とすることも可能である。
この工程b)において直鎖状１本鎖ＤＮＡとアダプターポリヌクレオチドの相補配列が結合する際に直鎖状１本鎖ＤＮＡが曲がって５’末端と３’末端が隣接・接近した構造となるため、次の工程c)において環状化（ライゲーション反応）を効率的に行うことが可能となる。

工程c)では、前記直鎖状１本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端とを連結させる。すなわち、反応混合物を適切な温度に一定時間置くことにより、反応混合物中に含まれるＤＮＡリガーゼが作用して直鎖状１本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端を連結させる。反応温度は使用する耐熱性ＤＮＡリガーゼの至適温度に設定することが好ましいが、当該リガーゼが活性を有する温度の範囲内で自由に設定することができる。例えば和光純薬工業社製耐熱性ＤＮＡリガーゼを使用する場合、６０〜９０℃、好ましくは７０℃に設定される。適切な反応時間はリガーゼの種類や酵素量などに依存し、例えば５〜３０分、好ましくは１０分である。

工程d)では、環状化された１本鎖ＤＮＡとアダプターポリヌクレオチドを解離させる。即ち、反応混合物のＤＮＡの解離温度（高温）に置くことにより、工程c)が終了した時点で結合している環状１本鎖ＤＮＡとアダプターポリヌクレオチドを解離させる。反応温度は一般に使用されるＤＮＡ解離温度であればよく、例えば９０〜１００℃、好ましくは９３〜９８℃、例えば９５℃に設定される。また、反応時間は例えば１秒〜１分、好ましくは５〜３０秒、より好ましくは１０秒に設定することができる。この工程によってアダプターポリヌクレオチドが当初の１本鎖の状態に戻るため、後述するように再び工程b)に戻って、環状化されずに残っている１本鎖ＤＮＡとの結合に再利用することが可能となる。

好ましくは、本発明においては工程b)からd)の一連の操作（以下、サイクルとも表す）が反復して行われる。工程b)からd)のサイクルを繰り返して、アダプターポリヌクレオチドを繰り返し利用しつつ直鎖状１本鎖ＤＮＡを次々と環状化させることにより、高収率で環状化１本鎖ＤＮＡを製造することが可能となる。
反復回数は例えば少なくとも２回、好ましくは１０回以上、より好ましくは２５回以上であり、直鎖状１本鎖ＤＮＡの枯渇、リガーゼ活性の低下、必要とする環状化１本鎖ＤＮＡの収量などを考慮して当業者が適当な回数を決定することができる。

なお、本発明は、当該技術分野の技術常識に基づいて様々に変更、改良された方法をも包含する。例えば、工程b)からd)を反復して行う場合、最初と最後を除く途中の各サイクルが工程b)、c)、d)を含み、かつこの順で実施されればよく、特に最初と最後のサイクルでは、環状１本鎖ＤＮＡを適切に製造するための手段を取り得ることを当業者は容易に理解する。
例えば、一般に、反応を開始した直後は反応混合物を解離温度に上げて非特異的なアニーリングを防止することが好ましい。本発明においては、例えば９５℃で２分間処理される。また、最後のサイクルでは工程c)で反応混合物をライゲーション温度に置いた後で、反応混合物をそれまでとは異なった解離条件で処理して（例えば９８℃で２分間）環状１本鎖ＤＮＡとアダプターポリヌクレオチドを解離させてもよい。さらに、その後４℃に急冷して反応を終了させてもよい。
その他、サイクル毎に温度や時間の設定の変更や、工程b)とc)を同一条件で一括して行うことなどの変更も可能である。
以下、実施例を参照して本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

以下の実施例において、薬品名後に会社名を記していないものは和光純薬工業社製である。また、特別に記さない限り、溶媒は水である。
なお、使用した溶媒とゲルの組成は以下の通りである。

ＴＥバッファー
４ｍmol/l Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス-ヒドロキシメチル-アミノメタン）塩酸
１ｍmol/l エチレンジアミン四酢酸２ナトリウム２水和物（ＥＤＴＡ）
ｐＨ８．０に調整

２．０％ＴＡＥ電気泳動用ゲル
２．０％アガロース
４ｍmol/l Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
１ｍmol/l ＥＤＴＡ
１ｍmol/l 酢酸

（１、環状１本鎖ＤＮＡの合成）
環状１本鎖ＤＮＡの合成に用いたポリヌクレオチドを表１に記す。共にカートリッジ精製を行った。

表１：環状１本鎖ＤＮＡの合成に用いたポリヌクレオチド配列

上記の表において４３C（配列番号１）が直鎖状１本鎖ＤＮＡに、Bind（配列番号２）がアダプターポリヌクレオチドに相当する。

表１の２種類のポリヌクレオチド（４３C：６０μmol/l、Bind：３μmol/l）と和光純薬工業社製耐熱性ＤＮＡリガーゼ組換え体（１．２５ul）を合計２５ulに混合し、下記に示した条件で反応を行った。その他、前記耐熱性ＤＮＡリガーゼに添付の反応バッファーを使用した。混合液中における最終的な組成は、耐熱性リガーゼ（１．２５ul/２５ul）添付バッファー（２．５ul/２５ul）、表１の２種類のポリヌクレオチド（４３C：６０μmol/l、Bind：３μmol/l）である。

９５℃、２分間 −(1)
９５℃、１０秒間 −(2)
６０℃、１０秒間 −(3)
７０℃、１０分間 −(4)
９８℃、２分間 −(5)
４℃、∞ −(6)
（(2)〜(4)を２５サイクル）

反応終了後、Genとるくん（タカラバイオ社）を添加し、エタノール沈殿を行った。その後、７５％エタノールで２回、９９．５％エタノールで１回洗浄し、６５℃で乾燥させた後に、超純水で３０μlに溶解した。
溶解後、ExonucleaseＩ（タカラバイオ社）を添加し、３７℃、６０分反応させた後、Genとるくんを添加し、エタノール沈殿を行った。その後、７５％エタノールで２回、９９．５％エタノールで１回洗浄し、６５℃で乾燥させた後に、TEバッファーで３０μlに溶解し、環状１本鎖ＤＮＡ調製液とした。

（２、環状１本鎖ＤＮＡの合成の確認）
環状１本鎖ＤＮＡの合成の確認に用いたプライマーを表２に記す。共にHPLC精製を行っている。

表２：環状１本鎖ＤＮＡの合成確認に用いたプライマー配列
（F：配列番号３、R：配列番号４）

環状１本鎖ＤＮＡの合成をポリメラーゼ反応により確認した。
反応混合物組成
０．０２μg/ml 環状１本鎖ＤＮＡ調製液
１．６nmol/l 表２のプライマー（FとR）
４U/２５μl Bst DNA ポリメラーゼ（New England Biolabs Incorporation）
１．６nmol/l 表１のプライマー（Bind）
（反応バッファーは、Bst DNA ポリメラーゼの製造者の指示に従った。）

上記の反応混合物を調製した後、６３℃・６０分インキュベートした。また、Bindのプライマーを含まない対照混合物を調製し、同様にインキュベートした。
この反応は、環状１本鎖ＤＮＡに対してアニーリングしたBindポリヌクレオチドがプライマーとなって３’方向にＤＮＡを複製し、その複製されたＤＮＡをさらに鋳型としてFとRのプライマーによりＤＮＡを増幅するものである。

（３、検出）
核酸染色試薬SYBR GreenＩ（タカラバイオ社）を１/１０に希釈し、サンプル２５μlに対して１μlを混合し、３０２nmの波長を当て高感度フィルターで観察した。
また、２．０％ＴＡＥ電気泳動用ゲルを使用し、電気泳動漕であるMupid-ex（アドバンス社）を用いて電気泳動（１００Ｖ、６０分）を行い、その後、核酸染色試薬SYBR GreenＩで染色し２５４nmの波長を当て高感度フィルターで観察した。
結果を表３、および図２、図３に示す。

表３：環状１本鎖合成確認の結果

図２、図３より長鎖のＤＮＡが合成されていることが確認されたことから、環状１本鎖ＤＮＡが合成されていることを確認した。また、ExonucleaseＩの処理で環状１本鎖以外を分解し得ることも同時に確認できた。

（４、ライゲーション反応の繰り返し反応による環状１本鎖ＤＮＡの濃度比較）
上記１の環状１本鎖ＤＮＡの合成に示したのと同様の方法で、ライゲーション反応を繰り返し行って、作製された環状１本鎖ＤＮＡの濃度の比較を行った。
反応混合物に加える直鎖状１本鎖ＤＮＡとアダプターポリヌクレオチドの濃度は、４３Cが６０μmol/l、Bindが３μmol/lとなるように調製した。

C：リガーゼなし
D：(2)〜(4)のサイクル１回
E：(2)〜(4)のサイクル２５回

反応後、Genとるくん（タカラバイオ社）を添加し、エタノール沈殿を行った。その後、７５％エタノールで２回、９９．５％エタノールで１回洗浄し、６５℃で乾燥させた後に、超純水で３０μlに溶解した。
溶解後、ExonucleaseＩ（タカラバイオ社）を添加し、３７℃、６０分反応させた後、Genとるくんを添加し、エタノール沈殿を行った。その後、７５％エタノールで２回、９９．５％エタノールで１回洗浄し、６５℃で乾燥させた後に、TEバッファーで２５μlに溶解し、各濃度を吸光度（２６０ｎｍ）により検出した（図４）。リガーゼを加えずに行ったCをゼロ点とした。
図４より、本発明の方法を用いてライゲーションのサイクルを繰り返して行うことにより、環状１本鎖ＤＮＡが高収率で製造されていることが分かった。

本発明の方法による、環状化１本鎖ＤＮＡの製造の概略を示す。 SYBR GreenＩを用いて環状１本鎖を検出した写真を示す。Ａはプライマーを加えずにポリメラーゼ反応を行った対照サンプルであり、Ｂは通常の合成反応を行ったサンプルを示す。電気泳動により環状１本鎖を検出したゲル写真を示す。ライゲーション反応を１回、および２５回反復して行った場合の、環状１本鎖合成の濃度を比較したグラフを示す。

Claims

環状１本鎖ＤＮＡの製造方法であって、
a)直鎖状１本鎖ＤＮＡと、前記直鎖状１本鎖ＤＮＡの５’末端領域および３’末端領域の相補配列を隣接して有するアダプターポリヌクレオチドと、耐熱性リガーゼとを含む反応混合物を調製する工程、
b)直鎖状１本鎖ＤＮＡとアダプターポリヌクレオチドの相補配列を結合させることにより、前記直鎖状１本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端とを隣接させる工程、
c)前記直鎖状１本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端とを連結する工程、
d)環状化された１本鎖ＤＮＡとアダプターポリヌクレオチドを解離させる工程、
を含み、
工程b)からd)の一連の操作を同一反応混合物内で少なくとも２回反復して行い、かつ、
工程a)で調製した反応混合物中における、直鎖状１本鎖ＤＮＡに対するアダプターポリヌクレオチドのモル比が１未満である、前記製造方法。