CN114686563B - 一种核酸单链环化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种核酸单链环化的方法。所述方法包括：(1)提供针对待环化单链序列设计的第一环化序列和第二环化序列，其中所述第一环化序列和第二环化序列分别在所述待环化单链序列的一端形成部分双链，且所形成的两个部分双链的末端为互补的粘性末端；(2)将所述第一环化序列和第二环化序列与所述待环化单链序列退火，在所述待环化单链序列的两端形成两个部分双链；(3)将所述两个部分双链通过粘性末端连接，将所述待环化单链序列环化。本发明的方法利用两条单链环化序列与单链序列进行结合，使得单链序列两端形成双链结构，并且在单链序列的两端形成粘性末端，对所述粘性末端进行连接反应使得单链序列成环。

Description

一种核酸单链环化的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体而言，本发明涉及一种核酸单链环化的方法。
背景技术
核酸单链环化技术分为RNA单链环化和DNA单链环化。目前比较常用的单链环化技术是使用一条单链核苷酸序列作为桥梁。该序列的两端分别与目标单链的核酸的3’端和5’端的序列互补，将单链拉成单链环。对于单链RNA的环化，可以使用RNA连接酶直接进行连接。
现有的核酸单链环化技术包括利用单链桥连接和直接连接两种方法。DNB-seq平台使用的是利用单链桥的方法进行核酸单链环化。利用单链桥的方法进行核酸单链环化，会导致部分模板单链环形成多模板成一个环的情况，而且对于片段过小的模板或者片段过大的模板，该方法的成环效率较低。RNA连接酶只能应用于RNA模板成环。且RNA连接酶在连接片段大于200bp的模板时效率较低。
因此，本领域需要一种改进的核酸单链环化的方法。
发明内容
本发明旨在提供一种核酸单链环化的方法，提高核酸单链环化的效率，减少多模板成环的比例。
因此，本发明提供了一种核酸单链环化的方法，所述方法包括：
(1)提供针对待环化单链序列设计的第一环化序列和第二环化序列，其中所述第一环化序列和第二环化序列分别在所述待环化单链序列的一端形成部分双链，且所形成的两个部分双链的末端为互补的粘性末端；
(2)将所述第一环化序列和第二环化序列与所述待环化单链序列退火，在所述待环化单链序列的两端形成两个部分双链；
(3)将所述两个部分双链通过粘性末端连接，将所述待环化单链序列环化。
在一个实施方案中，所述方法还包括：(4)去除未环化的序列，并将所述环化的序列纯化。
在一个实施方案中，所述待环化单链序列的长度为200nt-700nt。
在一个实施方案中，所述待环化单链序列、所述第一环化序列和第二环化序列为DNA序列或RNA序列。
在一个实施方案中，所述待环化单链序列的两端包括接头序列。
在一个实施方案中，所述接头序列的长度为17nt-22nt。
在一个实施方案中，所述方法包括在所述待环化单链序列的两端分别连接接头序列。
在一个实施方案中，所述接头序列为：
接头-1：5’-ACACTCGGTTCCTCAAC-3’(SEQ ID NO.1)；
接头-2：5’Phos-GAGACGTTCTCGACTCAGCAGA-3’(SEQ ID NO.2)。
在一个实施方案中，所述粘性末端的长度为2或2个以上碱基，例如3、4、5至10个碱基。
在一个实施方案中，在所述待环化单链序列的5’或3’端有粘性末端。
在一个实施方案中，所述第一环化序列和第二环化序列的长度为18-28个碱基。
在一个实施方案中，所述环化序列为：
环化序列-1：5’-TCTGCTGAGTCGAGAACGTC-3’(SEQ ID NO.3)；
环化序列-2：5’-TCTGTGAGCCAAGGAGTTG-3’(SEQ ID NO.4)；
环化序列-3：5’-TCTGCTGAGTCGAGAACG-3’(SEQ ID NO.5)；
环化序列-4：5’-TCTCTGTGAGCCAAGGAGTTG-3’(SEQ ID NO.6)；
环化序列-5：5’-TCTGCTGAGTCGAGAA-3’(SEQ ID NO.7)；
环化序列-6：5’-CGTCTCTGTGAGCCAAGGAGTTG-3’(SEQ ID NO.8)；
其中所述环化序列按如下两两配对使用：环化序列-1和环化序列-2、环化序列-3和环化序列-4、环化序列-5和环化序列-6。
在一个实施方案中，通过核酸外切酶去除未环化的序列。
本发明利用两条单链环化序列与单链序列进行结合，使得单链序列两端形成双链结构，并且在单链序列的两端形成粘性末端，对所述粘性末端进行连接反应使得单链序列成环。
附图说明
从下面结合附图对本发明的具体实施方式的描述中可以更好地理解本发明。
图1示出了根据本发明的一个示例性实施方案的两条环化序列(环化序列-1和环化序列-2)与单链模板的结构示意图。
图2示出了根据本发明的核酸单链环化的过程的示意图。
具体实施方式
下文中，参照附图描述本发明的实施例。下面的详细描述和附图用于示例性地说明本发明的原理，本发明不限于所描述的优选实施例，本申请的范围由权利要求书限定。现参考示例性的实施方式详细描述本发明，一些实施例图示在附图中。以下示例性实施方式中描述的方案不代表本发明的所有方案。相反，这些方案仅是所附权利要求中涉及的本发明的各个方面的方法的示例。
图1示出了根据本发明的核酸单链环化的方法的一个示例性实施方案的两条环化序列(环化序列-1和环化序列-2)与单链模板的结构示意图。如图1所示，两条环化序列(环化序列-1和环化序列-2)分别与单链模板的两端退火。图2示出了根据本发明的核酸单链环化的过程的示意图，包括环化、成环后和消化后三个阶段。如图2所示，环化序列-1与单链模板的一端退火，单链模板的末端多出2个(本发明中不限于2个)未配对碱基。环化序列-2与单链模板的另一端退火，环化序列-2的末端多出2个(本发明中不限于2个)未配对碱基。单链模板末端多出的2个碱基与环化序列-2末端多出的2个碱基可以互补，从而在环化反应时，通过连接酶实现粘性末端连接。
在一个示例性实施方案中，本发明的核酸单链环化的方法包括：
(1)DNA变性获得单链
使用热变性(95℃维持3分钟，然后立刻放置于冰上)，形成DNA单链；或者，通过强碱变性处理双链DNA序列，然后用Tris-HCl进行中和，形成DNA单链。在变性前该DNA样本两端分别已经加上接头序列，所述接头序列例如：
接头-1：5’-acactcggttcctcaac-3’(SEQ ID NO.1)；
接头-2：5’Phos-gagacgttctcgactcagcaga-3’(SEQ ID NO.2)。
添加接头的目的是方便后续环化序列的设计。例如对于多个待环化序列的情形，借助于添加接头序列，方便序列扩增和统一使用一套环化序列进行环化。接头序列的长度通常可以为22nt及以上；接头序列的设计原则是优选包含一段可以与PCR引物退火的区域。
因此，在本发明中，所述待环化序列可以来自双链核酸序列变性，所述双链核酸序列优选包括接头序列。
(2)环化序列退火
向例如如(1)所述已变性含有接头序列的单链DNA样本中加入环化序列-1和环化序列-2的1:1的混合液。将所述混合液混匀后使用梯度降温的方法进行退火，例如95℃维持3分钟，40℃维持3分钟，4℃保持的孵育条件进行退火。
环化序列-1与单链模板的一端退火，退火后在单链模板末端多出数个未配对碱基；环化序列-2与单链模板的另一端退火，环化序列-2末端多出数个未配对碱基，单链模板末端多出的数个未配对碱基与环化序列-2末端多出的数个碱基互补，二者形成粘性末端，方便进行DNA连接酶连接。粘性末端序列可以根据使用的DNA连接酶选择长度及具体的碱基序列。例如，T4 DNA连接酶连接的粘性末端为1个到多个，但优选不超过10个碱基。
示例性环化序列举例如下：
环化序列-1：5’-tctgctgagtcgagaacgtc-3’(seq id no.3)；
环化序列-2：5’-tctgtgagccaaggagttg-3’(seq id no.4)；
环化序列-3：5’-tctgctgagtcgagaacg-3’(seq id no.5)；
环化序列-4：5’-tctctgtgagccaaggagttg-3’(seq id no.6)；
环化序列-5：5’-tctgctgagtcgagaa-3’(seq id no.7)；
环化序列-6：5’-cgtctctgtgagccaaggagttg-3’(seq id no.8)；
其中按如下两两配对使用：环化序列-1和环化序列-2、环化序列-3和环化序列-4、环化序列-5和环化序列-6。
(3)环化反应
将(2)中所得混合液在退火结束后加入连接反应试剂，例如加入T4DNA连接酶和连接反应缓冲液后，在30℃下反应30分钟。
(4)未环化序列的消化
在上述环化反应结束后，在所得混合液中加入消化反应试剂进行消化反应，去除没有被环化的核酸序列，例如使用外切酶3和外切酶1缓冲液，在37℃下反应30分钟，反应结束后加入反应终止缓冲液。
(5)纯化
使用DNA纯化磁珠对消化后的样本进行纯化，获得纯的单链环。
本发明的方法不但适用于DNA，而且适用于RNA。对于RNA而言，在RNA两端可以通过T4 RNA ligase作用加上一段与环化序列互补的DNA接头序列，然后再进行变性、环化序列退火，连接、未环化序列的消化及纯化。由于此时环化连接的位点依然是在含有环化序列的DNA接头上，因此RNA环化的变性、环化序列退火，连接、未环化序列的消化条件和DNA单链环化条件一致，但RNA的纯化需使用RNA纯化磁珠。因此，本发明的待环化单链序列可以为DNA序列或RNA序列，所述第一环化序列和第二环化序列优选为DNA序列。
实施例
本实施例详细步骤如下：
(1)双链DNA样本加接头
在双链DNA样本两端分别加上接头序列。使用T4 DNA连接酶进行反应，反应条件是5μL 20μM接头-1/接头-2退火产物(退火条件是70℃维持3分钟，以0.1℃梯度降温至20℃，20℃维持30分钟)，2μL T4 DNA连接酶(600U/mL)，33.3μL 3×连接缓冲液(6mL 50％PEG-8000，0.75mL 2M Tris-HCl(pH 7.8)，0.3mL 1M MgCl2，0.3mL 0.1M ATP，15μL 1M DTT，75μL 20mg/mL BSA和560mL灭菌超纯水)，然后用灭菌超纯水补体积至100μL。在25℃下反应30分钟，在65℃下反应15分钟。
接头序列如下：
接头-1：5’-ACACTCGGTTCCTCAAC-3’(SEQ ID NO.1)；
接头-2：5’Phos-GAGACGTTCTCGACTCAGCAGA-3’(SEQ ID NO.2)。
(2)DNA变性获得单链
实验组1和2：使用强碱变性(1M NaOH)处理加接头的双链DNA序列和环化序列，此双链DNA序列长度不超过3K bp，不短于200bp。反应体系为：双链DNA 100ng、环化序列-1(SEQ ID NO.3)和环化序列-2(SEQ ID NO.4)混合液，每种环化序列的浓度均为1mM，混合液体积0.5μL，1M NaOH(Sigma氢氧化钠，221465，预先溶解定容至1M)体积4.75μL，用灭菌超纯水补体积到42.72μL；震荡混匀后，在室温下反应5分钟，然后加入4.75μL 1M Tris-HCl进行中和，形成DNA单链，并且环化引物退火到结合位点。
实验组3和4：使用强碱变性(1M NaOH)处理加接头的双链DNA序列和环化序列，此双链DNA序列长度不超过3K bp，不短于200bp。反应体系为：双链DNA 100ng、环化序列-3(SEQ ID NO.5)和环化序列-4(SEQ ID NO.6)混合液，每种环化序列的浓度均为1mM，混合液体积0.5μL，1M NaOH(Sigma氢氧化钠，221465，预先溶解定容至1M)体积4.75μL，用灭菌超纯水补体积到42.72μL；震荡混匀后，在室温下反应5分钟，然后加入4.75μL 1M Tris-HCl进行中和，形成DNA单链，并且环化引物退火到结合位点。
实验组5和6使用强碱变性(1M NaOH)处理加接头的双链DNA序列和环化序列，此双链DNA序列长度不超过3K bp，不短于200bp。反应体系为：双链DNA 100ng、环化序列-5(SEQID NO.7)和环化序列-6(SEQ ID NO.8)混合液，每种环化序列的浓度均为1mM，混合液体积0.5μL，1M NaOH(Sigma氢氧化钠，221465，预先溶解定容至1M)体积4.75μL，用灭菌超纯水补体积到42.72μL；震荡混匀后，在室温下反应5分钟，然后加入4.75μL 1M Tris-HCl进行中和，形成DNA单链，并且环化引物退火到结合位点。
对照组：使用热变性处理双链DNA序列和环化引物-7。反应体系如下：双链DNA100ng，浓度为20μM的环化引物-7 25μL，用TE Buffer(AM9849，Ambion)将反应体积补齐至48μL，95℃维持3分钟，40℃维持3分钟，反应结束后放置于冰上，形成DNA单链，并且环化引物-7退火到结合位点。
环化引物-7：5’-cgagaacgtctctgtgagccaagg-3’(SEQ ID NO.9)。
(3)环化反应
实验组：退火结束后加入连接反应试剂：10×TA缓冲物(330mM Tris-乙酸缓冲液pH 7.8、660mM乙酸钾、100mM乙酸镁、5mM DTT、1mg/mL牛血清白蛋白)6μL、0.1M ATP 1.5μL、T4 DNA连接酶(Enzymatics，600U/μL)1μL、灭菌超纯水4μL，在37℃下反应60分钟。
对照组：10×TA缓冲物6μL、0.1M ATP 0.6μL、T4 DNA连接酶(Enzymatics，600U/μL)0.2μL、灭菌超纯水5.2μL，在37℃下反应30分钟。
(4)未环化序列的消化
实验组/对照组：环化反应结束后，加入消化反应试剂进行消化反应。反应体系为：10×TA缓冲物0.4μL，EXOI(NEB 20U/ul)1.95μL、EXOIII(NEB 100U/ul)0.65μL和灭菌超纯水1μL。在37℃下反应30分钟，反应结束后加入反应终止缓冲液0.5M EDTA(51201，LONZA)3μL。
(5)纯化
使用DNA纯化磁珠(N411-01，VAHTS DNA Clean Beads)对消化后的样本进行纯化，每个样本加入150μL纯化磁珠，震荡混匀后常温孵育10分钟，上磁力架弃掉上清，用75％乙醇清洗2遍磁珠，去掉上清后室温晾干3-5分钟，然后用TE缓冲物溶解磁珠，室温反应5分钟，上磁力架，回收上清液。
(6)用QubitTM ssDNA Assay Kit(Q10212，thermo)对回收后的上清定量，计算环化效率。
实验结果：
尽管结合实施例对本发明进行了描述，但本领域技术人员应理解，上文的描述和附图仅是示例性而非限制性的，本发明不限于所发明的实施例。在不偏离本发明的主旨的情况下，各种改型和变体是可能的。
序列表
<110> 深圳华大智造科技股份有限公司
<120> 一种核酸单链环化的方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acactcggtt cctcaac 17
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagacgttct cgactcagca ga 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctgctgagt cgagaacgtc 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tctgtgagcc aaggagttg 19
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tctgctgagt cgagaacg 18
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tctctgtgag ccaaggagtt g 21
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tctgctgagt cgagaa 16
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgtctctgtg agccaaggag ttg 23
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgagaacgtc tctgtgagcc aagg 24

Claims (11)

1.一种核酸单链环化的方法，所述方法包括：
(1)提供针对待环化单链序列设计的第一环化序列和第二环化序列，其中所述第一环化序列和第二环化序列分别在所述待环化单链序列的末端形成部分双链，且所形成的两个部分双链的末端为互补的粘性末端；
(2)将所述第一环化序列和第二环化序列与所述待环化单链序列退火，在所述待环化单链序列的两端形成两个部分双链；
(3)将所述两个部分双链通过粘性末端连接，将所述待环化单链序列环化。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：(4)去除未环化的序列，并将所述环化的序列纯化。
3.根据权利要求1或2所述的方法，所述待环化单链序列的长度为200nt-700nt。
4.根据权利要求1或2所述的方法，所述待环化单链序列、所述第一环化序列和第二环化序列为DNA序列或RNA序列。
5.根据权利要求1或2所述的方法，所述待环化单链序列的两端包括接头序列。
6.根据权利要求5所述的方法，所述接头序列的长度为17nt-22nt。
7.根据权利要求6所述的方法，所述接头序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
8.根据权利要求1、2、6或7任一项所述的方法，所述粘性末端的长度为2或2个以上碱基。
9.根据权利要求8所述的方法，所述粘性末端的长度为3至10个碱基。
10.根据权利要求1、2、6、7或9任一项所述的方法，所述第一环化序列和第二环化序列的长度为18-28个碱基。
11.根据权利要求10所述的方法，所述环化序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6；或者SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。
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