CN110791814A - 一种快速型的单链建库方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因测序文库技术领域，尤其涉及一种快速型的单链建库方法，包括如下步骤：提供样本DNA，将所述样本DNA进行磷酸化处理，得到单链DNA模板；将所述单链DNA模板的3’端连上第一接头，然后用第一磁珠进行纯化，得到含有第一磁珠的第一连接产物；将所述第一连接产物的5’端连上第二接头，然后用第二磁珠进行纯化，得到含有第一磁珠和第二磁珠的第二连接产物；用通用引物对所述第二连接产物进行PCR扩增，得到文库；其中，所述第一接头和第二接头为双链接头。本发明提供一种快速单链建库方法，该方法提高建库效率以及节省建库时间，通过该方法可以对单链DNA进行建库，以符合二代测序甚至三代测序平台要求。
Description
技术领域
本发明属于基因测序文库技术领域，尤其涉及一种快速型的单链建库方法。
背景技术
目前的二代及三代基因测序技术需要对模板DNA链进行建库(libraryconstruction)。建库是将一段固定序列加入到模板DNA链的两端，两端的固定序列称之为接头(adaptor)，含有接头和模板链的DNA称之为文库(library)。由于含有接头部分，文库可以被测序仪捕获，识别并测序。因此，加入接头部分是文库构建的必要且核心操作。
常见的文库构建通常是对双链DNA进行的。通常包括以下步骤：1.末端修复加A，2.连接接头的一部分或者接头全长，3.PCR扩增引入标签序列(Barcode/Index)并增大模板数量。接头一般也是双链，通过T4 DNA连接酶即可与双链模板DNA连接。但双链建库的局限在于无法针对单链DNA建库，且对于低起始量(<5ng)的DNA建库效果不佳。而目前单链DNA建库需求越来越大，主要是集中于研究甲基化DNA测序。由于常用DNA甲基化测序技术需要对DNA进行重亚硫酸盐处理，一方面导致DNA模板链断裂，另一方面导致双链DNA形成单链，其常用建库模式即先建库再对DNA进行重亚硫酸盐处理就会导致原本的文库有较大损失。而单链建库可以允许先对DNA进行重亚硫酸盐处理，无论是断裂的DNA还是单链DNA都能被有效建库。因此单链建库是目前针对甲基化测序最有效的措施。同时在对循环肿瘤DNA(ctDNA)的研究中也发现，部分ctDNA是单链，双链建库方法会将这部分单链DNA损失掉。而单链建库方法则可对单链DNA，也可以对双链DNA进行有效建库。
常规的单链建库技术主要有以下几种技术路径实现。一种是以Swift的Accel-NGSMethyl-seq技术为代表，即先通过单链连接酶将一段含有illumina通用序列连接到单链DNA的3’端，之后通过通用序列的互补引物进行扩增形成双链，再通过常规加入双链接头形成完整的可供测序的产物进而进行测序。该技术在3’端连接时引入的接头会有6-8bp的随机引物，通常为6C，导致生信分析时需要特殊处理，在测序时需要加入大量的phix以加大文库多样性从而避免测序仪爆屏的问题，而且测序的对象不是DNA模板链本身，而是模板链的互补产物链，引入了更多不确定性。还有一种商业化的试剂是Qiagen的QIAseq MethylLibrary Kit。该试剂盒的原理是设计8bp的随机序列作为引物并扩增形成双链，再使用双链接头进行连接，该技术会导致分析时需要剪切掉部分序列，造成数据浪费，而且具有一定的偏向性，进一步导致文库构建效率低下。SPALT(Splinted adaptor tagging)技术则是通过低浓度的连接酶先在3’端加入双链接头，双链接头含有一段随机碱基用于与单链DNA互补结合，之后进行纯化。纯化完的产物再加入带有含有随机碱基的双链接头连接到单链模板DNA的5’端。经过纯化后再进行扩增。SPALT技术采用的连接酶单位浓度低(5U/μL)，酶的最大反应量为30U，导致每次连接时间长达1小时，由于要分别进行3’端及5’端接头连接，连接时间长达2小时。同时在反应过程中需要进行纯化，也需要耗费一段时间，并且纯化磁珠丢弃也造成了部分损失。2.所需模板量较多，模板需要100ng，对于低起始量的DNA进行建库存在一定困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速型的单链建库方法，旨在解决现有单链建库技术过程繁琐，效率低下的技术问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种快速型的单链建库方法，包括如下步骤：
提供样本DNA，将所述样本DNA进行磷酸化处理，得到单链DNA模板；
将所述单链DNA模板的3’端连上第一接头，然后用第一磁珠进行纯化，得到含有第一磁珠的第一连接产物；
将所述第一连接产物的5’端连上第二接头，然后用第二磁珠进行纯化，得到含有第一磁珠和第二磁珠的第二连接产物；
用通用引物对所述第二连接产物进行PCR扩增，得到文库；
其中，所述第一接头和第二接头为双链接头。
本发明提供一种快速型的单链建库方法，该方法中在单链DNA模板的3’端连上第一接头后用第一磁珠进行纯化，并在5’端连上第二接头后用第二磁珠进行纯化，纯化过程中保留的磁珠无需经过纯化去除直接进入下一轮反应，从而保留大部分的产物DNA，而且不会影响连接效率和扩增效率；由于保留了磁珠，可以进一步减少反应时间并且减少模板损失，从而提高了建库效率。
附图说明
图1是本发明实施例中单链建库方法的流程示意图；
图2是本发明实施例中0.5ng cfDNA标准品建库后的数据结果图；
图3是本发明实施例中0.5ng cfDNA标准品建库后的Agilent 2100结果图；
图4本发明实施例中1ng转化的λDNA建库后的数据结果图；
图5是发明实施例中1ng转化的λDNA建库后的Agilent 2100结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征
本发明实施例提供一种快速型的单链建库方法，包括如下步骤：
S01：提供样本DNA，将所述样本DNA进行磷酸化处理，得到单链DNA模板；
S02：将所述单链DNA模板的3’端连上第一接头，然后用第一磁珠进行纯化，得到含有第一磁珠的第一连接产物；
S03：将所述第一连接产物的5’端连上第二接头，然后用第二磁珠进行纯化，得到含有第一磁珠和第二磁珠的第二连接产物；
S04：用通用引物对所述第二连接产物进行PCR扩增，得到文库；
其中，所述第一接头和第二接头为双链接头。
本发明实施例提供一种快速型的单链建库方法，该方法中在单链DNA模板的3’端连上第一接头后用第一磁珠进行纯化，并在5’端连上第二接头后用第二磁珠进行纯化，纯化过程中保留的磁珠无需经过溶解直接进入下一轮反应，从而保留大部分的产物DNA，而且不会影响连接效率和扩增效率；由于保留了磁珠，可以进一步减少反应时间并且减少模板损失，从而提高了建库效率。
单链建库技术应用广泛，特别是针对低起始量DNA测序，甲基化DNA测序以及游离DNA(cfDNA)中的单链DNA测序技术特别有效。本发明实施例提供一种快速单链建库方法。该方法通过磁珠纯化方法提高建库效率以及节省建库时间。通过该方法可以对单链DNA进行建库，以符合二代测序甚至三代测序平台要求。在一个实施例中，所述样本DNA包括cfDNA，无需打断处理；或者是基因组DNA(gDNA)，则经打断至300-400bp。
若需要甲基化测序则需经重亚硫酸盐处理，在一实施例中，所述单链建库方法得到的文库用于甲基化测序，在将所述样本DNA进行磷酸化处理的步骤之前，先用重亚硫酸盐处理。
在一个实施例中，所述磷酸化处理包括多聚核苷酸激酶PNK处理，该多聚核苷酸激酶PNK的浓度为5U/μL-10U/μL。
在一个实施例中，将所述单链DNA模板的3’端连上第一接头的步骤中使用的是T4DNA连接酶；将所述第一连接产物的5’端连上第二接头的步骤中使用的是T4 DNA连接酶。所述T4 DNA连接酶的浓度为40U/μL～600U/μL。高浓度(>＝40U/μL)的T4 DNA连接酶可以节约反应时间，每次连接接头只需要10-15min，两次连接总耗时总共为20-30min.，相对目前方法，特别是SPLAT,节约了110-120分钟的实验时间，从而提高连接效率，同时通过在磁珠纯化环节保留磁珠节约时间(约节省30min)相结合，可以进一步提高单链建库的效率。
本发明实施例中的PNK浓度大于5U/μL即可，本发明实施例中的T4 DNA酶的浓度为40U/μL以上，也可使用600U/μL。本发明实施例的纯化磁珠不局限XP磁珠。
在一个实施例中，所述第一磁珠包括AMPure XP磁珠；所述第二磁珠包括AMPureXP磁珠。用通用引物对所述第二连接产物进行PCR扩增的步骤之前，也可以先去除所述第一磁珠和第二磁珠。即连接反应完成后，含磁珠的第二连接产物(含DNA混合物)可直接进行PCR扩增或进一步纯化去除磁珠后进行PCR扩增。
本发明实施例大幅度缩短了建库时间并且进一步提高了建库效率，可以有效针对低起始量的DNA进行单链建库。本发明实施例是基于illumina平台设计，但不限于illumina平台，其余测序平台，方法通用。
以illumina平台为例，所述第一接头由互补配对的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2组成，所述第二接头由互补配对的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4组成，所述通用引物为SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6。即第一接头和第二接头为双链接头。具体建库步骤如下：
合成以下碱基序列：
A3-1序列如下所示，5’-GACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNN-3’–aminomodifer(SEQ IDNO.1)，其中GACGTGTGCTCTTCCGATCT是illumina接头(adaptor)的部分序列，负责与A3-2互补配对，NNNNNN是随机序列。
A3-2序列如下所示：P-5’-AGATCGGAAGAGCACACGTC-3’(SEQ ID NO.2)，5’端进行磷酸化修饰。AGATCGGAAGAGCACACGTC是illumina接头(adaptor)的部分序列。
A5-1序列如下所示：5’-ACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.3)，ACACGACGCTCTTCCGATCT是illumina adaptor的部分序列，作为P5端。
A5-2序列如下所示：5’-NNNNNNAGATCGGAAGAGCGTCGTGT(SEQ ID NO.4)，AGATCGGAAGAGCGTCGTGT是illumina adaptor的部分序列，负责与A5-1互补配对，NNNNNN是随机序列。
以上A3-1与A3-2退火配对，形成第一接头A3 adaptor。A5-1与A5-2退火配对，形成第二接头A5 adaptor。两种接头浓度均为20μM-100μM，存储于-20℃冰箱。
DNA经过多聚核苷酸激酶PNK(终浓度：0.5-1U/μL)37℃处理15分钟，再加热到95℃反应5分钟，反应完成的DNA混合物立刻插入冰中孵育5分钟。
进行3’端接头连接，在同一反应管的DNA混合物中加入T4 DNA连接酶(终浓度4U/μL～60U/μL)和A3 adaptor接头(终浓度:1-10μM)，并加入快速连接缓冲液(反应终浓度：66mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mM DTT，1-2mM ATP，6-8％PEG 6000)，加水补足后于20-30℃(根据连接酶反应条件设定)反应10-15分钟。
随后在同一反应管中按照1：2比例加入AMPure XP(BeckmanCoulter)磁珠或同等纯化磁珠进行纯化。在80％乙醇洗涤之后晾干直接加入去离子水，95℃反应5分钟。反应完成的含磁珠的DNA混合物立刻插入冰中孵育5分钟。
进行5’端接头连接，在同一反应管的DNA混合物中加入T4 DNA连接酶(终浓度4U/μL～60U/μL)和A5 adaptor接头(终浓度:1-10μM)，并加入快速连接缓冲液(反应终浓度：66mM Tris-HCl,10mM MgCl2,1mM DTT,1-2mM ATP，6-8％PEG 6000)，加水补足后反应20-30℃(根据连接酶反应条件设定)，10-15分钟。
再次进行纯化，在同一反应管中按照1：2比例加入AMPure XP(BeckmanCoulter)磁珠或同等纯化磁珠进行纯化。在80％乙醇洗涤之后晾干直接加入去离子水。反应完成的含磁珠的DNA混合物可直接进行PCR扩增或进一步纯化去除磁珠后进行PCR扩增。
按照PCR反应体系进行扩增，本环节中会引入illumina Index，引物序列如下：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC“X6”ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO.5)；
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT“Y6”GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQID NO.6)。其中，X6/Y6分别为Index。
按照PCR反应说明进行扩增，扩增完成的产物按照1：1-1：1.2比例加入加入AMPureXP(BeckmanCoulter)磁珠或同等纯化磁珠进行纯化。在80％乙醇洗涤之后晾干直接加入去离子水，经进一步纯化后去除磁珠，产物可以进入下一步测序或捕获阶段。建库步骤如图1所示。
本发明实施例不仅适用于illumina平台，也适用于MGI平台。在一个实施例中，所述第一接头由互补配对的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8组成，所述第二接头由互补配对的SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10组成，所述通用引物为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12，Y6为Index。所用序列如下。
MGI-A3-1:5’-GACCGCTTGGCCTCCGACTTNNNNN-3’–aminomodifer(SEQ ID NO.7)；
MGI-A3-2:P-5’-AAGTCGGAGGCCAAGCGGTC-3’(SEQ ID NO.8)；
MGI-A5-1:5’-ACATGGCTACGATCCGACTT-3’(SEQ ID NO.9)；
MGI-A5-2:5’-NNNNNNAAGTCGGATCGTAGCCATGTC-3’(SEQ ID NO.10)；
Ad153_PCR2_1:longΩ:5’-GAACGACATGGCTACGATCCGACT-3’(SEQ ID NO.11)；
Ad153_PCR2_2:5’-TGTGAGCCAAGGAGTTG“Y6”TGTATTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCG-3’(SEQ ID NO.12)。
本发明实施例先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。
实施例一
本实施例针对0.5ng cfDNA进行建库，包括如下步骤：
(1)在PCR反应管中加入0.5ng cfDNA标准品(Horizon HD 780)，经PNK处理，反应15min后加热到95℃，立即插入到冰上，静置3-5min，得到单链模板。
(2)进行3’端接头连接：在同一反应管中加入3μL 600U/μL的T4 DNA ligase，加入T4 DNA ligase缓冲液，加入A3 adaptor接头(终浓度:10μM)补足H2O，20℃℃反应15min。
(3)随后在同一反应管中按照1：2(体积比)比例加入AMPure XP(BeckmanCoulter)磁珠或同等纯化磁珠进行纯化。用80％乙醇洗涤之后晾干直接加入13μL去离子水，95℃反应5分钟。将反应完成后的含磁珠的DNA混合物立刻插入冰中孵育5分钟。
(4)进行5’端接头连接：在同一反应管的DNA混合物中加入T4 DNA连接酶(终浓度60U/μL)和A5 adaptor接头(终浓度:10μM)，并加入快速连接缓冲液，20℃反应15分钟。
(5)再次进行纯化，在同一反应管中按照1：2(体积比)比例加入AMPure XP(BeckmanCoulter)磁珠或同等纯化磁珠进行纯化。用80％乙醇洗涤之后晾干直接加入去离子水。将反应完成后的含磁珠的DNA混合物直接进行PCR扩增。
(6)按照以下条件进行扩增：反应体系如下表1所示，反应条件如下表2所示。
表1
表2
本环节中会引入illumina Index，引物序列如下：
Primer I5：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACX6ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT。
Primer I7：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATY6GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT。
其中，X6/Y6分别为Index。
(7)扩增完成的产物按照1：1.2(体积比)比例加入加入AMPure XP(BeckmanCoulter)磁珠或同等纯化磁珠进行纯化。用80％乙醇洗涤之后晾干直接加入去离子水，经进一步纯化后去除磁珠，产物经Qubit测浓度以及Agilent 2100测片段分布。
如图2所示，本实施例的0.5ng cfDNA标准品15个循环反应出库量达到520ng(文库的浓度和体积分别为：26ng/ul，20ul)；建库后的Agilent 2100分析结果如图3所示。该建库方法与商品双链建库试剂盒KAPA进行对比，结果显示本实施例可以针对低起始量DNA有效建库。
实施例二
本实施例针对1ng lambda DNA进行甲基化建库，包括如下步骤：
(1)10ng lambda DNA(λDNA)经EZ DNA methylation Gold Kit处理后10μLH2O溶解，取1μL用于建库。先经PNK处理，反应15min后加热到95℃，立即插入到冰上，静置3-5min，得到单链模板。
(2)进行3’端接头连接：在同一反应管仲加入3μL 600U/μL的T4 DNA ligase，加入T4 DNA ligase缓冲液，加入A3 adaptor接头(终浓度:10μM)补足H2O，20℃反应15min。
(3)随后在同一反应管中按照1：2(体积比)比例加入AMPure XP(BeckmanCoulter)磁珠或同等纯化磁珠进行纯化。用80％乙醇洗涤之后晾干直接加入13μL去离子水，95℃反应5分钟。将反应完成后的含磁珠的DNA混合物立刻插入冰中孵育5分钟。
(4)进行5’端接头连接：在同一反应管的DNA混合物中加入T4 DNA连接酶(终浓度60U/μL)和A5 adaptor接头(终浓度:10μM)，并加入快速连接缓冲液，20℃反应15分钟。
(5)再次进行纯化，在同一反应管中按照1：2(体积比)比例加入AMPure XP(BeckmanCoulter)磁珠或同等纯化磁珠进行纯化。用80％乙醇洗涤之后晾干直接加入去离子水。将反应完成后的含磁珠的DNA混合物直接进行PCR扩增。
(6)按照以下条件进行扩增：反应体系如下表3所示，反应条件如下表4表示。
表3
表4
本环节中会引入illumina Index，引物序列如下：
Primer I5：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACX6ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；
Primer I7:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATY6GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT。
其中，X6/Y6分别为Index。
(7)扩增完成的产物按照1：1.2(体积比)比例加入加入AMPure XP(BeckmanCoulter)磁珠或同等纯化磁珠进行纯化。用80％乙醇洗涤之后晾干直接加入去离子水，经进一步纯化后去除磁珠，产物经Qubit测浓度以及Agilent 2100测片段分布。
如图4所示，本实施例的1ng转化的lambda DNA 15个循环反应出库量达到370ng(文库的浓度和体积分别为：18.5ng/ul，20ul)；建库后的Agilent 2100分析结果如图5所示，结果显示本实施例可以有效建库。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种快速型的单链建库方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供样本DNA，将所述样本DNA进行磷酸化处理，得到单链DNA模板；
将所述单链DNA模板的3’端连上第一接头，然后用第一磁珠进行纯化，得到含有第一磁珠的第一连接产物；
将所述第一连接产物的5’端连上第二接头，然后用第二磁珠进行纯化，得到含有第一磁珠和第二磁珠的第二连接产物；
用通用引物对所述第二连接产物进行PCR扩增，得到文库；
其中，所述第一接头和第二接头为双链接头。
2.如权利要求1所述的快速型的单链建库方法，其特征在于，所述样本DNA包括cfDNA，或打断至300-400bp的gDNA。
3.如权利要求1所述的快速型的单链建库方法，其特征在于，所述单链建库方法得到的文库用于甲基化测序，在将所述样本DNA进行磷酸化处理的步骤之前，先用重亚硫酸盐处理；和/或，
用通用引物对所述第二连接产物进行PCR扩增的步骤之前，先去除所述第一磁珠和第二磁珠。
4.如权利要求1所述的快速型的单链建库方法，其特征在于，所述磷酸化处理包括多聚核苷酸激酶PNK处理。
5.如权利要求4所述的快速型的单链建库方法，其特征在于，多聚核苷酸激酶PNK的浓度为5U/μL-10U/μL。
6.如权利要求1所述的快速型的单链建库方法，其特征在于，将所述单链DNA模板的3’端连上第一接头的步骤中使用的是T4 DNA连接酶；和/或，
将所述第一连接产物的5’端连上第二接头的步骤中使用的是T4 DNA连接酶。
7.如权利要求6所述的快速型的单链建库方法，其特征在于，所述T4 DNA连接酶的浓度为40U/μL～600U/μL。
8.如权利要求1所述的快速型的单链建库方法，其特征在于，所述第一磁珠包括AMPureXP磁珠；和/或，所述第二磁珠包括AMPure XP磁珠。
9.如权利要求1-8任一项所述的快速型的单链建库方法，其特征在于，所述第一接头由互补配对的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2组成，所述第二接头由互补配对的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4组成，所述通用引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。
10.如权利要求1-8任一项所述的快速型的单链建库方法，其特征在于，所述第一接头由互补配对的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8组成，所述第二接头由互补配对的SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10组成，所述通用引物为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。
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