CN106283202A - 一种基于illumina二代测序平台的超快速DNA文库构建试剂盒 - Google Patents
一种基于illumina二代测序平台的超快速DNA文库构建试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于illumina二代测序平台的DNA文库构建试剂盒，属于体外核酸检测领域。所述试剂盒末端补平与加dA尾一步完成，无中间纯化步骤可直接进行Adapter连接，且只需20分钟完成末端补平及加A反应。与一般建库方法相比，文库构建时间短、产量高且后期磁珠消耗少。另外采用高保真DNA聚合酶进行文库富集，无偏好的PCR扩增，扩大了序列的覆盖区域，可高效制备用于illumina二代测序平台的DNA文库。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，是一种基于illumina二代测序平台的DNA文库构建试剂盒。
背景技术
Sanger法测序是一种利用利用DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，通过掺入一种链终止核苷酸来完成测序。但由于其存在成本高、速度慢、通量低等不足，并不是最理想的测序方法。
高通量测序技术(High-throughput Sequencing)是对传统Sanger测序(称为一代测序技术)革命性的改变，由于该种方法能够一次同时对几十万到几百万核酸分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为二代测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)。
测序技术在生命科学研究中一直发挥着重要作用。随着以于HiSeq X-10、MiSeq和Nextseq500为代表的第二代测序技术的快速发展，越来越多的生物学问题通过二代测序技术得以解决。如通过基因组重测序、De novo测序、外显子测序、转录组测序以及宏基因组测序等测序技术并结合生物信息学技术，使其在疾病检测、分子育种、物种分析等方面发挥重要作用。
本发明旨在提供一种操作简单、快捷、使用成本低、序列覆盖区域大，可高效制备用于illumina二代测序平台的DNA文库构建试剂盒。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于illumina二代测序平台的DNA文库构建试剂盒。
本发明的第二个目的是，提供一种基于illumina二代测序平台的超快速DNA文库构建方法。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种基于illumina二代测序平台的DNA文库构建试剂盒，在打断DNA样品末端修复反应中采用3-4酶的修饰酶系统进行末端快速修复。
进一步，所述DNA样品末端修复反应结束后不经过纯化，直接加入链接buffer及T4DNA链接酶进行接头链接。
进一步，所述修饰酶为T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq DNA聚合酶的组合；或者是T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Klenow片段(3′→5′exo-)的组合；或者是T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq DNA聚合酶、Klenow片段(3′→5′exo-)的组合。
进一步，所述修饰酶各组分浓度分别是2U-5U T4DNA聚合酶、5U-15U T4多聚核苷酸激酶、1U-5U Taq DNA聚合酶、1U-5U Klenow片段(3′→5′exo-)。
进一步，修饰温度第一阶段为20℃-25℃，第二阶段为65℃-75℃。
进一步，修饰时间第一阶段为5分钟-40分钟，第二阶段为5分钟-40分钟。
进一步，所述DNA样品末端修复反应所用的修饰bufer含有2％-8％的PEG6000。
进一步，所述链接bufer含有2％-8％的PEG6000。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种基于illumina二代测序平台的超快速DNA文库构建方法，包括如下步骤：
(1)采用Covaris超声打断系统将样品基因组DNA打断，样本要求：1ng-1μg打断的双链DNA，溶于EB(10mM Tris-HCl pH 8.0)或去离子水中；DNA纯度要求：OD260/OD280＝1.8～2.0。
(2)将步骤1打断的DNA片段用多重DNA末端修复试剂进行DNA末端修复；
(3)向步骤2修复试剂的修复反应液中加入文库接头及链接试剂进行接头链接；
(4)DNA片段的选择性回收：采用PCR产物分离和纯化试剂，包括在PCR反应液条件下AMPure XP磁珠与PCR产物的结合，分离出DNA产物，然后分别经过80％乙醇漂洗、EB或去离子水洗脱得到纯化的DNA片段；
(5)PCR扩增：采用多重PCR引物和多重PCR扩增反应试剂进行PCR扩增。
(6)PCR产物的纯化：采用PCR产物分离和纯化试剂，包括在PCR反应液条件下AMPure XP磁珠与PCR产物的结合，而分离出DNA产物，然后分别经过80％乙醇漂洗、EB或去离子水洗脱得到纯化的DNA样本；
(7)文库质量检测：通过Real-time PCR方法或使用荧光染料法对DNA文库进行定量。用琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100Bioanalyzer或Fragment Analyzer全自动毛细管电泳系统检测DNA文库中的片段分布范围。
进一步，所述步骤2中所用的修复试剂为：T4DNA聚合酶，T4多聚核苷酸激酶，TaqDNA聚合酶，Klenow片段(3′→5′exo-)，ATP，dATP，dCTP，dTTP，dGTP，Enhancer，10x T4DNA连接酶反应缓冲液，修饰条件为22℃10分钟，72度10分钟；所述步骤3中文库接头Adapter浓度为15μM，若起始DNA样本量少于100ng，Adapter浓度为1.5μM，所述链接试剂为ATP，Enhancer，10x T4DNA连接酶反应缓冲液，链接温度为20℃温浴15min；所述步骤5中PCR扩增反应试剂为ExHiFi Reaction Buffer，ExHiFi Hot Start DNA Pol，DMSO，Enhancer，dATP，dCTP，dTTP，dGTP；引物为Index primer，Univesial primer。
进一步，所述的DNA片段回收是可选步骤，若起始样本量低于50ng，不建议进行DNA片段选择性回收，可直接进行DNA片段全纯化。另外构建不同大小片段的DNA文库时，DNA片段选择性回收的磁珠使用量不同。
进一步，所述PCR扩增过程中，若样本起始量为1μg时PCR循环数为6个循环，50ng时10个循环，5ng时14-15个循环，PCR循环数也可根据实验需要进行优化。
本发明优点在于：
本发明的试剂盒不但具有普通二代测序试剂盒的功能，而且末端补平，磷酸化，加dA尾一步完成，整个修饰过程只需要20分钟完成，且不需要纯化，直接加接头。与一般建库方法相比，该试剂盒操作简单、方便，极大的缩短了文库构建时间。另外试剂盒所述的DNA片段分选法与一般建库试剂盒相比，节约1/3的磁珠用量，减低了使用成本。再者所述PCR扩增时，采用了高保真DNA聚合酶进行文库富集，无偏好的PCR扩增，扩大了序列的覆盖区域，可高效制备用于illumina二代测序平台的DNA文库。
附图说明
附图1是本发明的原理与操作简示图。
附图2是实施例1中AMPure XP beads文库分选纯化反应条件。
附图3是实施例1中文库浓度换算方法。
附图4是实施例1中Agilent 2100Bioanalyzer检测DNA文库中片段长度分布图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明技术方案的总体思路为：制备片段化DNA，片段化DNA的末端修复以及Adapter接头的连接，连接Adapter后的DNA片段的选择性回收，采用ExHiFi酶进行快速扩增DNA片段(15sec/1kb)，最大限度地保持扩增质量的保真性，缩短反应时间。经过多个PCR循环反应后，回收DNA片段，用于文库构建测序(图1)。
实施例1
一、试剂准备
1、End Prep Enzyme Mix的配制：
| 试剂 | 体积ul |
| T4DNA聚合酶 | 90 |
| T4多聚核苷酸激酶 | 120 |
| Taq DNA聚合酶 | 50 |
| Klenow片段(3′→5′exo-) | 40 |
| 合计： | 300 |
根据以上表格加入相应试剂，混合后-20度保存备用。
2、5×End Repair Reaction Buffer的配制：
| 试剂 | 体积ul |
| dATP(100mM) | 2000 |
| dCTP(100mM) | 500 |
| dTTP(100mM) | 500 |
| dGTP(100mM) | 500 |
| 10X T4DNA连接酶反应缓冲液 | 13000 |
| 50％Enhancer | 7800 |
| ddH2O | 1700 |
| 合计： | 26000 |
根据以上表格加入相应试剂，混合后-20度保存备用。
3、igase Buffer的配制：
根据以上表格加入相应试剂，混合后-20度保存备用(0.55×筛选150bp插入片段)。
4、2×ExHiFi PCR Master Mix的配制：
| 试剂 | 体积ul |
| ExHiFi Reaction Buffer | 20000 |
| ExHiFi Hot Start DNA Pol | 1000 |
| ddH2O | 23800 |
| DMSO | 2000 |
| Enhancer | 2000 |
| dATP(100mM) | 300 |
| dCTP(100mM) | 300 |
| dTTP(100mM) | 300 |
| dGTP(100mM) | 300 |
| 合计： | 50000 |
根据以上表格加入相应试剂，混合后-20度保存备用。
5、PCR引物及Adapter准备：
根据以上序列进行合成序列，并配制Primer 1/2的终浓度为12.5uM,IndexAdapter终浓度为25uM，混合后-20度保存备用。
二、实验材料
1)5ng-1μg打断的双链DNA；
2)DNA纯度要求：OD260/OD280＝1.8～2.0
三、DNA末端修复、磷酸化并加dA尾反应
1)向PCR反应管中依次加入以下试剂：
2)用枪头将上述溶液轻轻吹吸混匀，短暂离心,使所有组分收集到管底；
3)将上述PCR管置于PCR仪中，热盖打开，反应程序如下：
22℃ 10min
65℃ 10min
hold on 4℃
在修饰bufer含有2％-8％的PEG6000。
四、Adapter连接
1)向上述已完成DNA修复的反应液中直接加入以下试剂：
Ligase Buffer 14μl
T4DNA Ligase 2μl
Index Adapter 2.5μl
此时管中溶液总体积为83.5μl；
2)用枪头将上述试剂吹吸混匀混匀，短暂离心，使溶液收集到管底；
3)20℃温浴15min
在链接bufer含有2％-8％的PEG6000。
五、连接产物的纯化
A.片段长度不分选方案：
1)漩涡震荡混匀AMPure XP beads；
2)向连接反应液中加入16.5μl去离子水，使连接反应缓冲液体积至100μl；
3)吸取100μl(1×)AMPure XP beads至100μl连接产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀；
4)室温孵育5min；
5)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清(约5min)，小心移除上清，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠；
6)保持EP管始终处于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠(具体磁珠用量如附图2所示)。室温孵育30秒，小心移除上清：
7)重复步骤6；
8)保持EP管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠10min；
9)将EP管从磁力架中取出，加入28μl灭菌超纯水进行DNA洗脱。漩涡震荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀。将反应管短暂离心置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5min)，小心吸取23μl上清至灭菌PCR管中；
10)进行文库扩增。
B.片段大小分选
1)涡旋震荡混匀AMPure XP beads；
2)向连接反应液中加入16.5μl双蒸水，使连接反应缓冲液体积至100μl；
3)吸取55μl(0.55×)AMPure XP beads至100μl连接产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀；
4)室温孵育5min；
5)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(大约5min)，小心转移上清至干净EP管中；
6)吸取25μl(0.25×)AMPure XP beads至上清中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀；
7)室温孵育5min；
8)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(大约5min)，小心移除上清；
9)保持EP管始终处于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵育30秒，小心移除上清；
10)重复步骤9；
11)保持EP管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠10min；
12)将EP管从磁力架中取出，加入28μl灭菌超纯水进行DNA洗脱。漩涡震荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀。将反应管短暂离心置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5min)，小心吸取23μl上清至灭菌PCR管中；
13)进行文库扩增。
除此之外，接头连接产物也可使用柱纯化或胶回收试剂盒进行纯化，最终使用同样体积的灭菌超纯水或者洗脱缓冲液洗脱。
六、PCR产物扩增
1)在PCR管中加入以下试剂并混匀
2)PCR反应条件
注意：建议1μg样本起始量时PCR循环数为6个循环，50ng时10个循环，5ng时15个循环，PCR循环数也可根据实验需要进行优化。
七、PCR产物的纯化
1)涡旋震荡混匀AMPure XP beads；
2)吸取45μl(0.9×)AMPure XP beads至PCR产物(50μl)中，使用移液器轻轻吹打混匀；
3)室温孵育5min；
4)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清(约5min)，小心移除上清，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠；
5)保持EP管始终处于磁力架中，加入200μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵育30秒，小心移除上清；
6)重复步骤5；
7)保持EP管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠10min；
8)将EP管从磁力架中取出，加入30μl灭菌超纯水进行DNA洗脱。漩涡震荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀。将反应管短暂离心置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5min)，小心吸取25μl上清至灭菌PCR管中；
9)将制备好的DNA文库置于-20℃保持。
除此之外，接头连接产物也可使用柱纯化或胶回收试剂盒进行纯化，最终使用同样体积的灭菌超纯水或者洗脱缓冲液洗脱。
八、文库浓度
为了得到高质量的测序结果，需要对DNA文库进行精确定量，首先推荐使用Real-timePCR方法对DNA文库进行绝对定量。此外，还可使用荧光染料法，如Qubit法，此处请勿使用基于吸光度测量的定量方法。最终可使用附图3近似公式换算DNA文库的摩尔浓度。
九、文库长度分布
制备好的DNA文库可用琼脂糖凝胶电泳、Agilent 2100Bioanalyzer或FragmentAnalyzer全自动毛细管电泳系统检测DNA文库中的片段长度分布范围(图4)。
十、文库结构
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT[TargetSequence]TGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
NNNNNNNN：index,8bases
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于illumina二代测序平台的DNA文库构建试剂盒，其特征在于，在打断DNA样品末端修复反应中采用3-4酶的修饰酶系统进行末端快速修复。
2.根据权利要求1所述illumina二代测序平台的DNA文库构建试剂盒，其特征在于，所述DNA样品末端修复反应结束后不经过纯化，直接加入链接buffer及T4DNA链接酶进行接头链接。
3.根据权利要求1所述illumina二代测序平台的DNA文库构建试剂盒，其特征在于，所述修饰酶为T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq DNA聚合酶的组合；或者是T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Klenow片段(3′→5′exo-)的组合；或者是T4DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq DNA聚合酶、Klenow片段(3′→5′exo-)的组合。
4.根据权利要求1所述illumina二代测序平台的DNA文库构建试剂盒，其特征在于，所述修饰酶各组分浓度分别是2U-5U T4DNA聚合酶、5U-15U T4多聚核苷酸激酶、1U-5U TaqDNA聚合酶、1U-5U Klenow片段(3′→5′exo-)。
5.根据权利要求1所述illumina二代测序平台的DNA文库构建试剂盒，其特征在于，修饰温度第一阶段为20℃-25℃，第二阶段为65℃-75℃。
6.根据权利要求1所述illumina二代测序平台的DNA文库构建试剂盒，其特征在于，修饰时间第一阶段为5分钟-40分钟，第二阶段为5分钟-40分钟。
7.根据权利要求1所述illumina二代测序平台的DNA文库构建试剂盒，其特征在于，所述DNA样品末端修复反应所用的修饰bufer含有2％-8％的PEG6000。
8.根据权利要求2所述illumina二代测序平台的DNA文库构建试剂盒，其特征在于，所述链接bufer含有2％-8％的PEG6000。
9.一种基于illumina二代测序平台的超快速DNA文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用Covaris超声打断系统将样品基因组DNA打断，样本要求：1ng-1μg打断的双链DNA，溶于EB(10mM Tris-HCl pH 8.0)或去离子水中；DNA纯度要求：OD260/OD280＝1.8～2.0；
(2)将步骤1打断的DNA片段用多重DNA末端修复试剂进行DNA末端修复；
(3)向步骤2修复试剂的修复反应液中加入文库接头及链接试剂进行接头链接；
(4)DNA片段的选择性回收：采用PCR产物分离和纯化试剂，包括在PCR反应液条件下AMPure XP磁珠与PCR产物的结合，分离出DNA产物，然后分别经过80％乙醇漂洗、EB或去离子水洗脱得到纯化的DNA片段；
(5)PCR扩增：采用多重PCR引物和多重PCR扩增反应试剂进行PCR扩增。
(6)PCR产物的纯化：采用PCR产物分离和纯化试剂，包括在PCR反应液条件下AMPure XP磁珠与PCR产物的结合，而分离出DNA产物，然后分别经过80％乙醇漂洗、EB或去离子水洗脱得到纯化的DNA样本；
(7)文库质量检测：通过Real-time PCR方法或使用荧光染料法对DNA文库进行定量。用琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2100Bioanalyzer或Fragment Analyzer全自动毛细管电泳系统检测DNA文库中的片段分布范围。
10.根据权利要求9所述基于illumina二代测序平台的超快速DNA文库构建方法，其特征在于，所述步骤2中所用的修复试剂为：T4DNA聚合酶，T4多聚核苷酸激酶，Taq DNA聚合酶，Klenow片段(3′→5′exo-)，ATP，dATP，dCTP，dTTP，dGTP，Enhancer，10x T4DNA连接酶反应缓冲液，修饰条件为22℃10分钟，72度10分钟；所述步骤3中文库接头Adapter浓度为15μM，若起始DNA样本量少于100ng，Adapter浓度为1.5μM，所述链接试剂为ATP，Enhancer，10xT4DNA连接酶反应缓冲液，链接温度为20℃温浴15min；所述步骤5中PCR扩增反应试剂为ExHiFi Reaction Buffer，ExHiFi Hot Start DNA Pol，DMSO，Enhancer，dATP，dCTP，dTTP，dGTP；引物为Index primer，Univesial primer。
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