CN108642134A - 一种dna的文库构建方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开一种DNA的文库构建方法，包括：做处理表单、样本、试剂耗材准备和仪器准备；加末端修复mix，恒温箱孵育进行末端修复；加B1磁珠进行第一步纯化，75％乙醇清洗两遍，TE溶解得到纯化的平头DNA样本；转入相对应标签的分装好的PCR板上，吹打混匀，进行接头连接；加B2磁珠进行纯化，上架时准备75％乙醇；75％乙醇清洗两遍，TE溶解，转移到分装好的PCR板上，吹打混匀进行PCR；加B2磁珠进行纯化，上架8min时准备75％乙醇，用75％乙醇清洗两遍，50TE溶解；科学合理的操作流程使得其连接活性增强，提高接头连接效率，使得更多的修复DNA片段被成功连上接头序列，进而通过与接头序列互补的引物进行扩增，进而得到了目的扩增片段含量更多的测序文库。

Description

一种DNA的文库构建方法
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体是指一种DNA的文库构建方法。
背景技术
生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。第一代测序仪对电泳分离技术的依赖，使其难以进一步提高分析的速度和并行化程度，也难以通过微型化降低测序成本。经过不断的技术开发和改进， 21世纪初，以Roche454技术、illumina公司的GenomeAnalyzer技术和ABI 公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代技术大大降低了测序成本，还大幅度提高了测序速度并保持了高准确性。其中，illumina公司的第一台测序仪于2006年问世，之后开发出来一系列的测序仪，如Hiseq2000、Hiseq2500、Miseq、HiseqX等，在准确性、通量、成本和速度方面表现更优秀，而使其成为全球使用量最大的第二代测序仪。在第二代测序平台不断完善的同时，以对单分子DNA进行非PCR测序为主要特征的第三代测序技术也初显端倪。但由于其关键技术问题尚待解决，目前还未得到广泛应用。
近几年来，包括人、拟南芥以及水稻等越来越多的基因组被测序，全基因组测序为重要基因的克隆、基因的系统进化和基因组学研究提供了坚实的平台。但依然有部分珍贵物种由于样本较少获取难度大，或者个体较小获得的基因组浓度较低等原因，得到的基因组DNA少(低于50ng)，按照目前现有的建库流程和方法，建库难度非常大。
目前针对低起始量DNA的建库方法主要有转座酶建库和普通流程建库，转座酶建库主要是利用转座酶随机切割基因组DNA，并在片段两端加上接头，然后进行扩增建库，该方法是一种高效的低起始量建库方法。但这种建库方法有一个较为明显的缺点，就是其使用转座酶随机切割打断过程中易受到样本中杂质的干扰，导致打断建库失败。而普通流程建库无法进行低于 20ng的建库，在起始量为50ng时，在后期扩增时扩增循环数较高，需要达到18-25个循环，文库库容较低，质量较差，且建库成功率只有30％左右。
如上所述，现有技术中切割打断建库的方法易受到样本质量的影响，导致切割打断失败，基因组无法正常片段化，在后续扩增中无法得到有效扩增。而普通流程建库无法进行低于20ng的建库，在起始量为50ng时，建库成功率为30％，且文库质量较差，库容低，信息分析结果显示片段重复较高。
按照目前现有的建库流程和方法，建库难度大、各环节成功率低。
因此，如何研发一种DNA的文库构建方法，能够解决上述问题，便成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本申请解决的主要问题是提供一种DNA的文库构建方法，操作简单、流程科学，标准明确，实践操作效果好，使得其连接活性增强，提高接头连接效率，使得更多的修复DNA片段被成功连上接头序列，进而通过与接头序列互补的引物进行扩增，进而得到了目的扩增片段含量更多的测序文库，以解决一种DNA的文库构建方法成本高、流程不科学，标准不明确，实践操作效果不佳、操作难度高、难以复制操作的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种DNA的文库构建方法，其特征在于，包括：
步骤一：做处理表单、样本、试剂耗材准备和仪器准备；
步骤二：加末端修复mix，恒温箱孵育进行末端修复；加B1磁珠进行第一步纯化，保留上清液，加B2磁珠进行第二步纯化，上架10min时准备75％乙醇；75％乙醇清洗两遍，TE溶解得到纯化的平头DNA样本；
步骤三：纯化的平头DNA样本转入相对应标签的分装好的PCR板上，吹打混匀，进行接头连接；连接完成的DNA加B2磁珠进行纯化，上架时准备75％乙醇；75％乙醇清洗两遍，TE溶解得到纯化的加好接头的DNA样本；
步骤四：转移纯化的加好接头的DNA样本到分装好的PCR板上，吹打混匀进行PCR；准备出库用单管，写号并核对，加B2磁珠进行纯化，上架 8min时准备75％乙醇，用75％乙醇清洗两遍，50TE溶解，转出的样本按顺序放置在待定量盒子，并-20℃保存，完成文库构建。
进一步的，所述步骤二中还包括：在末端修复的20min空闲时间可以准备第二步接头连接的试剂和标签在4℃融化，酶需放置-20℃使用时取出洗脱和上架的15min配制接头连接的试剂并分装。
进一步的，所述步骤三还包括：反应的30min时间可以准备第三步PCR 用的试剂，放置在4℃融化；洗脱和上架的15mn配制扩增PCR的试剂并分装，开PCR仪预热。
进一步的，还包括：转管需一一核对编号，特别是注意转入浅孔板的位置，防止混淆样本；接头连接时需核对样本和标签号，再三确认，防止转错；接头连接时特别注意低温操作；清洗用的75％乙醇按照表格配置，防止配错； B1磁珠纯化时待液体澄清后在吸取上清，如果发现未澄清需延长上架时间，注意转板时不要误弃。
进一步的，所述步骤一具体包括：表单处理：制作建库表并打印；样本、试剂耗材准备：DNA样本室温融化，融化的单管保存的DNA转移至浅孔板，配制末端修复试剂，B1和B2磁珠室温平衡；在末端修复的20min空闲时间可以准备第二步接头连接的试剂和标签在4℃融化，酶需放置-20℃使用时取出；仪器准备：打开25C恒温箱和生物安全柜，开风机15分钟自净后关闭，建库过程中不开风机，开PCR仪预热。
本申请提供的DNA的文库构建方法操作简单便利并且灵活、降低测序成本，减少测序流程，提高劳动效率，流程科学，标准明确，实践操作效果好。
科学合理的操作流程使得其连接活性增强，提高接头连接效率，使得更多的修复DNA片段被成功连上接头序列，进而通过与接头序列互补的引物进行扩增，进而得到了目的扩增片段含量更多的测序文库。
具体实施方式
如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
实施例一：
一种DNA的文库构建方法，其特征在于，包括：
步骤一：做处理表单、样本、试剂耗材准备和仪器准备；
步骤二：加末端修复mix，恒温箱20min孵育进行末端修复；加B1磁珠进行第一步纯化，保留上清液，加B2磁珠进行第二步纯化，上架10min 时准备75％乙醇；75％乙醇清洗两遍，26uLTE溶解得到纯化的平头DNA样本；在末端修复的20min空闲时间可以准备第二步接头连接的试剂和标签在 4℃融化，酶需放置-20℃使用时取出洗脱和上架的15min配制接头连接的试剂并分装；
步骤三：纯化的平头DNA样本转入相对应标签的分装好的PCR板上，在冰板上操作，吹打混匀，进行接头连接，需核对PCR程序，选择25C，30min 条件；连接完成的DNA加B2磁珠进行纯化，上架8min时准备75％乙醇； 75％乙醇清洗两遍，19uLTE溶解得到纯化的加好接头的DNA样本，反应的 30min时间可以准备第三步PCR用的试剂，放置在4℃融化；洗脱和上架的 15mn配制扩增PCR的试剂并分装，开PCR仪预热；
步骤四：转移纯化的加好接头的DNA样本到分装好的PCR板上，在冰板上操作，吹打混匀进行PCR；准备出库用单管，写号即贴标签并核对，加 B2磁珠进行纯化，上架8min时准备75％乙醇，用75％乙醇清洗两遍，50TE 溶解，转出的样本按顺序放置在待定量盒子，并-20℃保存，完成文库构建。
转管需一一核对编号，特别是注意转入浅孔板的位置，防止混淆样本；接头连接时需核对样本和标签号，再三确认，防止转错；接头连接时特别注意低温操作；清洗用的75％乙醇按照表格配置，防止配错；B1磁珠纯化时待液体澄清后在吸取上清，如果发现未澄清需延长上架时间，注意转板时不要误弃。
所述步骤一具体包括：表单处理：制作建库表并打印；样本、试剂耗材准备：DNA样本室温融化，融化的单管保存的DNA转移至浅孔板，配制末端修复试剂，B1和B2磁珠室温平衡；在末端修复的20min空闲时间可以准备第二步接头连接的试剂和标签在4℃融化，酶需放置-20℃使用时取出；仪器准备：打开25C恒温箱和生物安全柜，开风机15分钟自净后关闭，建库过程中不开风机，开PCR仪预热。
上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。

Claims (5)

1.一种DNA的文库构建方法，其特征在于，包括：
步骤一：做处理表单、样本、试剂耗材准备和仪器准备；
步骤二：加末端修复mix，恒温箱孵育进行末端修复；加B1磁珠进行第一步纯化，保留上清液，加B2磁珠进行第二步纯化，上架10min时准备75％乙醇；75％乙醇清洗两遍，TE溶解得到纯化的平头DNA样本；
步骤三：纯化的平头DNA样本转入相对应标签的分装好的PCR板上，吹打混匀，进行接头连接；连接完成的DNA加B2磁珠进行纯化，上架时准备75％乙醇；75％乙醇清洗两遍，TE溶解得到纯化的加好接头的DNA样本；
步骤四：转移纯化的加好接头的DNA样本到分装好的PCR板上，吹打混匀进行PCR；准备出库用单管，写号并核对，加B2磁珠进行纯化，上架8min时准备75％乙醇，用75％乙醇清洗两遍，50TE溶解，转出的样本按顺序放置在待定量盒子，并-20℃保存，完成文库构建。
2.根据权利要求1所述的DNA的文库构建方法，其特征在于，所述步骤二中还包括：在末端修复的20min空闲时间可以准备第二步接头连接的试剂和标签在4℃融化，酶需放置-20℃使用时取出洗脱和上架的15min配制接头连接的试剂并分装。
3.根据权利要求2所述的DNA的文库构建方法，其特征在于，所述步骤三还包括：反应的30min时间可以准备第三步PCR用的试剂，放置在4℃融化；洗脱和上架的15mn配制扩增PCR的试剂并分装，开PCR仪预热。
4.根据权利要求3所述的DNA的文库构建方法，其特征在于，还包括：转管需一一核对编号，特别是注意转入浅孔板的位置，防止混淆样本；接头连接时需核对样本和标签号，再三确认，防止转错；接头连接时特别注意低温操作；清洗用的75％乙醇按照表格配置，防止配错；B1磁珠纯化时待液体澄清后在吸取上清，如果发现未澄清需延长上架时间，注意转板时不要误弃。
5.根据权利要求1所述的DNA的文库构建方法，其特征在于，所述步骤一具体包括：表单处理：制作建库表并打印；样本、试剂耗材准备：DNA样本室温融化，融化的单管保存的DNA转移至浅孔板，配制末端修复试剂，B1和B2磁珠室温平衡；在末端修复的20min空闲时间可以准备第二步接头连接的试剂和标签在4℃融化，酶需放置-20℃使用时取出；仪器准备：打开25C恒温箱和生物安全柜，开风机15分钟自净后关闭，建库过程中不开风机，开PCR仪预热。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104099666A (zh) * 2013-04-15 2014-10-15 江苏基谱生物科技发展有限公司 二代测序文库构建方法
CN105624798A (zh) * 2016-02-19 2016-06-01 北京乐普基因科技股份有限公司 一种胎儿染色体文库构建的试剂盒、方法及其应用
CN106283202A (zh) * 2016-09-23 2017-01-04 依科赛生物科技（太仓）有限公司 一种基于illumina二代测序平台的超快速DNA文库构建试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104099666A (zh) * 2013-04-15 2014-10-15 江苏基谱生物科技发展有限公司 二代测序文库构建方法
CN105624798A (zh) * 2016-02-19 2016-06-01 北京乐普基因科技股份有限公司 一种胎儿染色体文库构建的试剂盒、方法及其应用
CN106283202A (zh) * 2016-09-23 2017-01-04 依科赛生物科技（太仓）有限公司 一种基于illumina二代测序平台的超快速DNA文库构建试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘冲DENG: "新疆一枝蒿cDNA文库构建方法研究", 《中国药房》 *

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