CN116515977B - 基于单端接头转座酶的单细胞基因组测序试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于单端接头转座酶的单细胞基因组测序试剂盒和方法，属于单细胞测序技术领域。所述试剂盒包括：连接有特殊定制序列的转座酶，所述特殊定制序列为双链序列，分别为第一链序列和第二链序列，其中第一链序列依次包括连接序列1、细胞标签1序列和包埋序列，其中第二链序列为包埋序列的互补序列；第一杂交引物，依次包括连接序列2、细胞标签2序列和测序接头1序列；桥连引物，用于将连接序列1和连接序列2进行连接；第二杂交引物，依次包括所述包埋序列的互补序列、分子标签序列、至少一部分所述连接序列1的互补序列和测序接头2。本发明的试剂盒生方法能够实现上亿种分子标记来标记单个细胞，达到超高通量，并且建库时间大幅缩短，属于快速单细胞基因组测序方法。
Description
技术领域
本发明涉及单细胞测序技术领域，具体地，涉及一种基于单端接头转座酶的单细胞基因组测序试剂盒和方法。
背景技术
由于人类大多数的基因突变出现在非编码基因组原件上，因此研究者意识到理解基因型-表型轴需要一个全面的功能性非编码基因组元件目录。自2013年染色质转座酶可及性分析（ATAC）（Buenrostro, J.D.et al. (2013) ‘Transposition of nativechromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position’,Nature Methods, 10(12), pp. 1213–1218）被提出以来，这种方法已被认为是染色质开放区域的全基因组分析最容易获得和最具成本效益的策略。单细胞ATAC-seq（scATAC-seq）技术也已被开发用于研究含有异质细胞群的组织样本中细胞类型特异性染色质的可及性。
ATAC-Seq测序预先将转座酶与细胞标签序列结合，再利用转座酶识别染色质开放区域，对其进行切割产生特定长度范围的片段并将细胞标签插入至待测DNA上。但是单靠转座酶上的细胞标签往往无法达到超高通量单细胞水平，研究者为提高细胞标签的复杂性选择组合索引的方式来扩大测序通量。例如sci-ATAC-seq（Cusanovich, D.A.et al.(2018)‘A Single-Cell Atlas of In Vivo Mammalian Chromatin Accessibility’,Cell, 174(5), pp. 1309-1324.e18）与sci3-ATAC-seq（Domcke, S.et al. (2020) ‘A human cellatlas of fetal chromatin accessibility’,Science, 370(6518), p. eaba7612），分别提供了上万和几十万细胞通量的单细胞ATAC研究，但其通量、灵敏度、细胞间污染率仍未达到理想效果。
发明内容
为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明旨在一种基于单端接头转座酶的单细胞基因组测序技术，能够一次性获得上亿个单细胞的染色体开放区域基因组信息，并且有超高灵敏度和超低物种间转录组交叉污染率。为此，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供一种基于单端接头转座酶的单细胞基因组测序试剂盒，包括：
连接有特殊定制序列的转座酶，用于在切割基因组的同时将所述特殊定制序列连接在基因片段上，所述特殊定制序列为双链序列，分别为第一链序列和第二链序列，其中第一链序列依次包括连接序列1、细胞标签1序列和包埋序列，其中第二链序列为所述包埋序列的互补序列；
第一杂交引物，依次包括连接序列2、细胞标签2序列和测序接头1序列；
桥连引物，依次包括至少一部分所述连接序列1的互补序列和至少一部分所述连接序列2的互补序列，用于将所述连接序列1和所述连接序列2进行连接；
第二杂交引物，依次包括所述包埋序列的互补序列、分子标签序列、至少一部分所述连接序列1的互补序列和测序接头2序列。
进一步地，所述连接有特殊定制序列的转座酶的制备过程如下：
（1）准备或获得包括所述第一链序列的第一链引物和包括所述第二链序列的第二链引物，按等比例混合后从95℃降至25℃获得转座酶引物工作液，所述第一链引物带有不同的细胞标签1，将同种细胞标签1的第一链引物与第二链引物混合，得到多种不同的转座酶引物工作液；
（2）将转座酶分别与不同种转座酶引物工作液于30℃孵育30~60min。
进一步地，所述试剂盒还包括PCR扩增引物对，上下游引物其中一条包括所述测序接头1序列的互补序列，另外一条包括所述测序接头2序列的互补序列。
进一步地，所述细胞标签1序列、所述细胞标签2序列和分子标签序列分别包括6~15个随机合成的碱基。
进一步地，所述试剂盒还包括酶切反应液、杂交缓冲液、连接缓冲液、PCR缓冲液、核酸纯化试剂、DNA聚合酶和/或DNA连接酶。
本发明第二方面提供一种利用本发明第一方面任一所述的基于单端接头转座酶的单细胞基因组测序试剂盒进行测序的方法，包括以下步骤：
S1，获得待测序细胞的细胞核，并均匀地分装至多孔板中；
S2，利用所述连接有特殊定制序列的转座酶切割基因序列，加入每个孔中的转座酶的所述细胞标签1序列均不同；
S3，将细胞核收集并混合，再次均匀地分装至多孔板中，向每个孔中加入所述第一杂交引物，加入每个孔中的所述第一杂交引物的所述细胞标签2序列均不同，在所述桥连引物存在的情况下使所述连接序列1和所述连接序列2连接；
S4，将细胞核收集并混合，再次均匀地分装至多孔板中，向每个孔中加入所述第二杂交引物，加入每个孔中的所述第二杂交引物的所述分子标签序列均不同，使得所述的包埋序列的互补序列与所述包埋序列进行杂交，并且所述连接序列1的互补序列与所述连接序列1进行杂交。
进一步地，步骤S1中，利用细胞核制备液制备细胞核，所述细胞核制备液包括0.1~0.3% IGEPAL CA-630、0.01~0.05%洋地黄皂苷和1×蛋白酶抑制剂。
进一步地，步骤S2中，在酶切反应液存在的情况下切割基因序列，所述酶切反应液包括：20mM pH7.5 Tris-HCl，10mM MgCl2，10~20%二甲基甲酰胺。
进一步地，在步骤S3中，先将所述第一杂交引物与所述桥连引物退火杂交再与细胞核混合。
进一步地，所述测序方法还包括：
S5，利用PCR扩增引物对进行扩增，
所述PCR扩增引物对上下游引物其中一条包括所述测序接头1序列的互补序列，另外一条包括所述测序接头2序列的互补序列。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明的试剂盒利用多种不同的细胞标签1序列的单端接头转座酶包埋复合物对细胞核进行转座反应，使得不同的细胞带上第一轮分子标记；再利用两轮杂交反应和一轮PCR反应，使得细胞带上共四轮分子标签，能够获得上亿种分子标记，本发明能够实现上亿种分子标记来标记单个细胞，达到超高通量。
本发明的测序方法对大规模高通量单细胞染色质开放程度有较高的灵敏度和细胞亚型高分辨能力。在具有较高转录起始位点富集分数的同时，相较其他已发表技术能够更好地特异性捕获有效reads从而获得更多有效片段，说明本发明的测序方法具有更高的灵敏度。
本发明的测序方法相比常见的单细胞转座酶染色体可及性测序来说，建库时间大幅缩短，属于快速单细胞基因组测序方法。
附图说明
图1示出了本发明公开的染色质开放可及性测序的实验流程示意图。
图2示出了本发明实施例3中人鼠混合细胞基因组开放区域捕获片段read读数（UM）的物种间交叉污染率。
图3示出了本发明实施例3中人鼠混合细胞基因组开放区域在转录起始位点（TSS）上下游富集程度（左：人类细胞数据；右：小鼠细胞数据）。
图4示出了本发明实施例3中人鼠混合细胞基因组插入片段分布长度。
图5示出了本发明实施例4中成体C57/6J小鼠全脑组织单细胞染色质开放区域分群示意图。
图6示出了本发明实施例4中成体C57/6J小鼠全脑细胞基因组开放区域在转录起始位点（TSS）上下游富集程度。
图7示出了本发明实施例4中成体C57/6J小鼠全脑组织单细胞染色质开放区域测序数据（图中标记为UU ATAC）与其他已发表单细胞染色质开放区域测序数据的对比。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的相关术语的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
基于现有技术的不足，发明人开发了一种基于单端接头转座酶的单细胞基因组测序方法，该测序方法能够一次性获得上亿个单细胞的染色体开放区域基因组信息，并且有超高灵敏度和超低物种间转录组交叉污染率。
结合图1，对本发明的测序方法进行详细描述：
S1，获得待测序细胞的细胞核，并均匀地分装至多孔板中。
在本发明中，细胞的类型不受限定，可以是任何有细胞核的细胞，对细胞的活性状态也没有任何限定，可以是新鲜的细胞，也可以是培养的细胞系，还可以是将各种方式保存的包含细胞的组织样本处理后得到的细胞。在本发明的一些实施例中，所述细胞来源于培养的细胞系，用细胞核制备液制备细胞核。
在本发明的一些实施方案中，所述细胞核制备液包括0.1~0.3% IGEPAL CA-630，0.01~0.05%洋地黄皂苷和1×蛋白酶抑制剂；在本发明的一些具体实施方案中，所述细胞核制备液包括0.1% IGEPAL CA-630，0.05%洋地黄皂苷和1×蛋白酶抑制剂。进一步地，所述细胞核制备液利用RSBT洗液配制，现配现用，其中，RSBT洗液包括1% Tween-20，10mM Tris-HCl（pH7.5），10mM NaCl，3mM MgCl2，ddH2O配制，现配现用。
在本发明的一些具体实施方案中，将细胞重悬于所述细胞核制备液中混匀，冰上放置3~10min，再利用RSBT洗液稀释以终止反应。
S2，利用连接有特殊定制序列的转座酶切割基因序列。
在本发明中，所述连接有特殊定制序列的转座酶用于在切割基因组的同时将所述特殊定制序列连接在基因片段上，所述特殊定制序列为双链序列，分别为第一链序列和第二链序列，其中第一链序列依次包括连接序列1、细胞标签1序列和包埋序列，其中第二链序列为包埋序列的互补序列。在本发明的一些实施方案中，所述连接有特殊定制序列的转座酶的制备过程如下：
（1）准备或获得包括所述第一链序列的第一链引物和包括所述第二链序列的第二链引物，按等比例混合后从95℃降至25℃获得转座酶引物工作液；所述第一链引物带有不同的细胞标签1序列，将同种细胞标签1的第一链引物与第二链引物分别混合，得到多种不同的转座酶引物工作液；
（2）将转座酶分别与不同种转座酶引物工作液于30℃孵育30~60min。
在本发明的一些具体实施方案中，
所述第二链序列为：5'-[pho]CTGTCTCTTATACACATCT-3'，[pho]代表磷酸化修饰。
连接有连接序列1、细胞标签1序列和包埋序列的所述第一链序列为：
5'-phos-ACACTCTTTCCCTACACGACGnnnnnnnnnnAGATGTGTATAAGAGACAG-3’，n表示A/T/C/G中的任一种，10n为随机合成的第一细胞标签（细胞标签1）。在本发明中，设计了768种组合。
在本发明中，在本步骤中，可以预先在多孔板的每个孔中加入酶切体系，也可以分装细胞后再加入酶切体系，甚至可以先将酶切体系与细胞核混合后一起分装至多孔板中。在本发明的一些实施方案中，加入至每个孔中的酶切体系包括：连接有特殊定制序列的转座酶工作液1-3μL，1×酶切反应液，0.01%~0.05%洋地黄皂苷，反应完成后加入等体积40mMEDTA终止反应。其中，所述连接有特殊定制序列的转座酶工作液的浓度为1~5μM。2×酶切反应液包括20mM Tris-HCl（pH7.5），10mM MgCl2，10~20%二甲基甲酰胺ddH2O配置，4℃保存。
在本发明的一些实施方案中，酶切反应结束后，进一步包括利用PBST洗液清洗细胞核的步骤。所述PBST洗液为0.05~0.1% Tween-20，DPBS配置，现配现用。
S3，将细胞核收集并混合，再次均匀地分装至多孔板中，向每个孔中加入所述第一杂交引物，所述第一杂交引物依次包括连接序列2、细胞标签2序列和测序接头1序列，加入每个孔中的所述第一杂交引物的所述细胞标签2序列均不同，在桥连引物存在的情况下使所述连接序列1和所述连接序列2连接，其中，所述桥连引物依次包括至少一部分所述连接序列1的互补序列和至少一部分所述连接序列2的互补序列，由于桥连引物包括至少一部分所述连接序列1的互补序列和至少一部分所述连接序列2的互补序列。在本发明的一些具体实施方案中，所述桥连引物由所述连接序列1的互补序列和所述连接序列2的互补序列组成。
在本发明的一些实施方案中，先将所述第一杂交引物与所述桥连引物退火杂交再与细胞核混合。在本发明的一些具体实施方案中，先将30μM第一杂交引物和10μM桥连引物1:1混合后，从95℃慢速降至25℃，使得桥连引物与第一杂交引物上的连接序列2杂交，得到第一杂交引物-桥连引物杂合双链。第一杂交引物-桥连引物杂合双链再与连接序列1杂交，从而实现连接序列1和连接序列2的连接。
S4，将细胞核收集并混合，再次均匀地分装至多孔板中，向每个孔中加入所述第二杂交引物，所述第二杂交引物依次包括包埋序列的互补序列、分子标签序列、至少一部分所述连接序列1的互补序列和测序接头2序列，加入每个孔中的所述第二杂交引物的所述分子标签序列均不同。加入第二杂交引物后，第二杂交引物上的包埋序列的互补序列能够与所述包埋序列杂交，并且连接序列1的互补序列与连接序列1进行杂交，从而将分子标签序列和测序接头2序列连接到基因片段上。
在本发明中，加入第二杂交引物后，除所述包埋序列的互补序列能够与所述包埋序列杂交外，所述连接序列1的互补序列还能够与所述连接序列1进行杂交。也就是说，所述第二杂交引物共有两段序列分别与Tn5转座酶的包埋序列和连接序列1结合，从而达到接头转换的效果。与单端结合相比，这种双端结合方式获得的cDNA浓度上就可提升3~5倍，因此所述方法有更高的灵敏度。
在本发明的一些实施方案中，所述测序接头1序列和测序接头2序列不同，可以直接用于测序。如此，通过在杂交接头互换过程中在两端接上测序接头，无需额外的建库过程。另一方面，常见的转座酶染色体可及性测序中往往涉及一种寡核苷酸链细胞标签序列和一种通用引物，共两种转座酶包埋复合物，这种测序方法在转座酶插入标记过程中会产生一部分基因组两端均为相同序列而在后续PCR中无法富集而丢失的情况。而本发明中采用单端接头转座酶和接头转换的联合，能够更为全面的捕获上述测序方案中丢失的基因片段，因此本发明具有更高的灵敏度。
并且，本发明的第二轮杂交反应属于胞外杂交反应，能够大大增加杂交效率，提高测序灵敏度。除此之外第二轮杂交反应与常见的基于寡核苷酸链杂交标记染色体可及性测序相比，无需额外加入封闭寡核苷酸序列进行封闭步骤，同时可控制细胞间污染率处于极低水平，因此整体操作流程更简单快速。
进一步地，本发明的第二轮杂交反应是通过控制退火温度使得包埋序列的互补序列和桥连引物前述步骤产物上脱离释放，并在3'端结合上第二杂交引物。
在本发明的一些实施具体方案中，所述第一杂交引物的序列为：
5'-TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTnnnnnnnnnnGGCAGCGTC-3'；n表示A/T/C/G中的任一种，10n序列为随机合成的细胞标签2，由于每个位点有A/T/C/G 4种选择，所以10n的序列可以有46种选择，
所述桥连引物的序列为：
5'-GGAAAGAGTGTGACGCTGCC-3'，
所述第二杂交引物的序列为：
5'-phos-CTGTCTCTTATACACATCTNNNNNNNNNNCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAAGTCGGATCGTAGCCATGTCGTTCinvT-3'；
N表示A/T/C/G中的任一种，10N序列为随机合成的分子标签；3'端带有invT修饰，用于防止引物降解和非特异性延伸。
进一步地，步骤S1中，利用细胞核制备液制备细胞核，所述细胞核制备液包括0.1~0.3% IGEPAL CA-630、0.01~0.05%洋地黄皂苷和1×蛋白酶抑制剂。
进一步地，步骤S2中，在酶切反应液存在的情况下切割基因序列，所述酶切反应液包括：20mM pH7.5 Tris-HCl，10mM MgCl2，10~20%二甲基甲酰胺。
进一步地，每次将细胞核分装至多孔板中时，通过标记细胞标签1、细胞标签2和分子标签的组合，可以达到单细胞的分辨率。
进一步地，所述测序方法还包括：
S5，利用PCR扩增引物对进行扩增，
所述PCR扩增引物对上下游引物其中一条包括所述测序接头1序列的互补序列，另外一条包括所述测序接头2序列的互补序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述PCR扩增引物对包括P5-ATAC引物和i7-ATAC引物，其中，
P5-ATAC序列：
5'-[phos]-GAACGACATGGCTACGATCCGAC-3'，
[pho]代表磷酸化修饰；
i7-ATAC序列：
5'-TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCG-3'，
N表示A/T/C/G中的任一种，为随机合成的index，用来区分上机样品。
针对该测序方法，相应的试剂可以包装成基于单端接头转座酶的单细胞基因组测序试剂盒，详细描述如下：
基于单端接头转座酶的单细胞基因组测序试剂盒，包括：
连接有特殊定制序列的转座酶，用于在切割基因组的同时将所述特殊定制序列连接在基因片段上，所述特殊定制序列为双链序列，分别为第一链序列和第二链序列，其中第一链序列依次包括连接序列1、细胞标签1序列和包埋序列，其中第二链序列为所述包埋序列的互补序列；
第一杂交引物，依次包括连接序列2、细胞标签2序列和测序接头1序列；
桥连引物，依次包括至少一部分所述连接序列1的互补序列和至少一部分所述连接序列2的互补序列，用于将所述连接序列1和所述连接序列2进行连接；
第二杂交引物，依次包括所述包埋序列的互补序列、分子标签、至少一部分所述连接序列1的互补序列和测序接头2序列。
进一步地，所述连接有特殊定制序列的转座酶的制备过程如下：
1）准备或获得包括所述第一链序列的第一链引物和包括所述第二链序列的第二链引物，按等比例混合后从95℃降至25℃获得转座酶引物工作液，所述第一链引物带有不同的细胞标签1，将同种细胞标签1的第一链引物与第二链引物混合，得到多种不同的转座酶引物工作液；
（2）将转座酶分别与所述不同种转座酶引物工作液于30℃孵育30~60min。
在本发明中，所述第二杂交引物除所述包埋序列的互补序列能够与所述包埋序列杂交外，所述连接序列1的互补序列还能够与所述连接序列1进行杂交。
在本发明的一些实施方案中，所述细胞标签1、所述细胞标签2和所述分子标签包括6~15个随机合成的碱基。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括PCR扩增引物对，上下游引物其中一条包括所述测序接头1序列的互补序列，另外一条包括所述测序接头2序列的互补序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述PCR扩增引物对包括P5-ATAC引物和i7-ATAC引物，其中，
P5-ATAC序列：
5'-[phos]-GAACGACATGGCTACGATCCGAC-3'，
[pho]代表磷酸化修饰；
i7-ATAC序列：
5'-TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCG-3'，
N表示A/T/C/G中的任一种，为随机合成的index，用来区分上机样品。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括酶切反应液、杂交缓冲液、连接缓冲液、PCR缓冲液、核酸纯化试剂、DNA聚合酶和/或DNA连接酶。
在本发明的一些具体实施方案中，2×酶切反应液包括20mM Tris-HCl（pH7.5），10mM MgCl2，10~20%二甲基甲酰胺ddH2O配置，4℃保存。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1 带寡核苷酸细胞标签序列的转座酶的配制
（1）转座酶包埋接头序列保存液：配制浓度为5μMTn5引物工作液，保存于-80℃冰箱。其序列和配制方法如下：
Tn5 primerA：
5'-[pho]CTGTCTCTTATACACATCT-3'，
[pho]代表磷酸化修饰，该序列为转座酶包埋识别固定序列。
Tn5 primerB：
5'-phos-ACACTCTTTCCCTACACGACGnnnnnnnnnnAGATGTGTATAAGAGACAG-3’，
n表示A/T/C/G中的任一种，10n为随机合成的细胞标签1，有1~768种组合。
将Tn5 primerA（100μM），Tn5 primerB（100μM）等体积混合，置于PCR仪中从95℃慢速降至25℃获得Tn5引物工作液。
（2）将Tn5裸酶与Tn5引物工作液30℃孵育30~60min后于-20℃冰箱保存。
实施例2 单细胞基因组测序相关工作液和洗液的配制
RSB缓冲液：10mM Tris-HCl（pH7.4），10mM NaCl，3mM MgCl2，ddH2O配置，4℃保存。
10% Tween-20：ddH2O配置，4℃保存。
50% PEG8000：ddH2O配置，4℃保存。
10% IGEPAL CA-630：ddH2O配制，4℃保存。
1%洋地黄皂苷储存液（Promega G9441）：DMSO配制，-20℃保存。
40mM EDTA：10mM Tris-HCl（pH8.0）配置，4℃保存。
50×蛋白酶抑制剂储液（Roche，04693132001）：ddH2O配制，-20℃保存12周，4℃保存2周。
2×酶切反应液：20mM Tris-HCl（pH7.5），10mM MgCl2，20%二甲基甲酰胺ddH2O配置，4℃保存。
RSBT洗液：0.1% Tween-20，10mM Tris-HCl（pH7.5），10mM NaCl，3mM MgCl2，ddH2O配制，现配现用。
细胞核制备液：0.1% IGEPAL CA-630，0.05%洋地黄皂苷，1×蛋白酶抑制剂，RSBT洗液配制，现配现用。
PBST洗液：0.05% Tween-20，DPBS配置，现配现用。
核裂解液：1% SDS，0.1mg/mL蛋白酶K，10mM Tris-HCl配制，现配现用。
实施例3 人293T、鼠3T3混合细胞测试
（1）细胞核制备：小鼠胚胎成纤维细胞3T3和人胚肾细胞（293T）重悬于细胞核制备液中混匀，冰上放置6min，再利用RSBT洗液稀释以终止反应。
（2）Tn5酶切反应：取人293T细胞核与鼠3T3细胞核进行1:1混合，并以每孔1万的细胞数加入到预先加有酶切体系的多孔板中，55℃反应30min。
其中酶切体系：Tn5引物工作液2μL，1×酶切反应液，0.05%洋地黄皂苷。
反应完成后加入等体积40mM EDTA。
（3）细胞核清洗：用PBST洗液清洗收集细胞核到离心管中。
（4）杂交-连接反应：
预先将30μM第一杂交引物和10μM桥连引物1:1混合后，从95℃慢速降至25℃，使得桥连引物与第一杂交引物形成双链，得到第一杂交引物-桥连引物杂合双链。配制杂交-连接体系：6μM第一杂交引物-桥连引物杂合双链、1×E.colibuffer，15% PEG，2UE.coliligase。
用杂交-连接体系重悬细胞，每孔5000个细胞核分孔至多孔板中，16℃连接1-2h。
第一杂交引物的序列为：
5‘-TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTnnnnnnnnnnGGCAGCGTC-3’；
n表示A/T/C/G中的任一种，10n序列为随机合成的细胞标签2。由于每个位点有A/T/C/G 4种选择，所以10n的序列可以有410种选择。
桥连引物的序列为：
5’-GGAAAGAGTGTGACGCTGCC-3’。
反应结束后，每孔加入等体积40mM EDTA。用PBST润洗细胞核并收集所有细胞核于离心管中。
（5）杂交-裂解反应：以每孔200个细胞核，分孔至提前预备有每孔3μL杂交-裂解体系的多孔板中并置于PCR仪中发生反应。
其中，杂交-裂解体系为：细胞核裂解液1μL，10μM第二杂交引物2μL。
杂交引物2序列为：
5'-phos-CTGTCTCTTATACACATCTNNNNNNNNNNCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAAGTCGGATCGTAGCCATGTCGTTCinvT-3’;
N表示A/T/C/G中的任一种，10N序列为随机合成的分子标签1；3’端带有invT修饰，用于防止引物降解和非特异性延伸。
PCR仪程序如下：55℃ 10~20min；60~70℃ 5~10min；40~55℃ 30~60min；10℃ ∞。
（6）延伸-连接反应：在杂交-裂解反应结束的体系中每孔依次加入等体积10%Tween-20和延伸-连接体系，37℃反应30min。
其中，延伸-连接体系为：1×DNA 聚合酶缓冲液，2.5U DNA连接酶，1U DNA聚合酶和0.5mM dNTP。
反应结束后加入EDTA终止反应，收集反应液，加入1.2×VAHTS DNA Clean Beads（诺唯赞）纯化磁珠进行纯化，具体纯化步骤详见说明书。
（7）测序文库扩增
在纯化获得的产物中加入PCR体系进行扩增反应。
其中，PCR体系为：1×KAPA HiFi HotStart ReadyMix，0.1μM P5-ATAC，0.1μL 10μM i7-ATAC。
P5-ATAC序列：
5'-[phos]-GAACGACATGGCTACGATCCGAC-3'，
[pho]代表磷酸化修饰。
i7-ATAC序列：
5'-TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCG-3'，
N表示A/T/C/G中的任一种，为随机合成的index，用来区分上机样品。
PCR程序如下：
95℃ 5min；98℃ 20s；60~65℃ 20~60s；72℃ 60s，5~15循环；72℃ 5min；10℃∞。
反应结束，加入两轮磁珠分选纯化200~500bp文库片段。
（10）环化测序文库
使用诺唯赞公司VAHTS Circularization Kit for MGI环化试剂盒，按照说明书方法进行操作进行文库环化，环化产物-20℃保存。使用Qubit 3.0荧光剂测定文库浓度，取1μL文库使用Agilent 2100 Bioanalyzer进行长度分布检测，剩余文库利用DNBSEQ-T7测序平台进行DNB的制作。
（11）上机测序以及数据分析
测序文库使用DNBSEQ-T7测序平台，PE150模式，返回原始fastq数据进行质控过滤、单细胞barcodes标记及固有序列裁剪后，将Read 2中大于20bp的序列比对到人（hg19）和小鼠（mm10）的参考基因组上。若一个细胞唯一比对到人或小鼠参考基因组的片段数不足90%，则被认为是交叉污染的细胞。图2显示物种间的污染率为0.3%，与其他建库平台相比处于极低水平。
通过将人和鼠的细胞的reads做转录起始位点（TSS）富集分析，如图3所示，说明检测到的片段在转录开放起始区域富集程度高（左图为人细胞的TSS富集分析；右图为鼠细胞的TSS富集分析）。同时将获取的片段数据根据大小进行分布统计如图4所示，该数据说明本方法获得的数据大小符合染色质开放区域的大小分布。
实施例4
取野生型C57BL/6J全脑组织通过液氮研磨获得冰冻组织粉，重悬于细胞核制备液以获得单细胞核悬液，其余步骤同实施例2操作，经过实验操作离心耗损，最后回收得到约20万细胞用于文库构建。文库送DNBSEQ-T7测序平台进行质量检测与测序，使用PE150测序策略，返回原始数据进行筛分比对得到基因组开放性区域富集图谱，使用R分析开放基因组与亚群得到数据质控与细胞所属亚群可视化UMAP，根据实际测序深度过滤得到高质量数据细胞，筛选得到前1.5万单细胞核数据。
将reads做转录起始位点（TSS）富集分析，如图5所示，说明检测到的片段在转录开放起始区域富集程度高。
单细胞水平分群如图6所示，该数据说明该方法对大规模高通量单细胞染色质开放程度有较高的灵敏度和细胞亚型高分辨能力。
本发明与其他已发表的单细胞染色质可及性测序数据（Lareau, Caleb A et al.“Droplet-based combinatorial indexing for massive-scale single-cell chromatinaccessibility.” Nature biotechnology vol. 37,8 (2019): 916-924.；Zheng, GraceX Y et al. “Massively parallel digital transcriptional profiling of singlecells.” Nature communications vol. 8 14049. 16 Jan. 2017）质控比较如图7所示，该数据说明本发明在仍具有较高转录起始位点富集分数的同时，相较其他已发表技术能够更好地特异性捕获有效reads从而获得更多有效片段，这说明该方法具有更高的灵敏度。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (5)
1.一种基于单端接头转座酶进行单细胞基因组测序方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，获得待测序细胞的细胞核，并均匀地分装至多孔板中；
S2，利用连接有特殊定制序列的Tn5转座酶切割基因序列，加入每个孔中的转座酶的细胞标签1序列均不同，其中，所述连接有特殊定制序列的Tn5转座酶用于在切割基因组的同时将所述特殊定制序列连接在基因片段上，所述特殊定制序列为双链序列，分别为第一链序列和第二链序列，其中第一链序列依次包括连接序列1、细胞标签1序列和包埋序列，其中第二链序列为包埋序列的互补序列；
S3，将细胞核收集并混合，再次均匀地分装至多孔板中，向每个孔中加入第一杂交引物，所述第一杂交引物依次包括连接序列2、细胞标签2序列和测序接头1序列，加入每个孔中的所述第一杂交引物的所述细胞标签2序列均不同，在桥连引物存在的情况下使所述连接序列1和所述连接序列2连接，其中，所述桥连引物依次包括至少一部分所述连接序列1的互补序列和至少一部分所述连接序列2的互补序列；
S4，将细胞核收集并混合，再次均匀地分装至含有杂交-裂解体系的多孔板中，所述杂交-裂解体系由细胞核裂解液和第二杂交引物组成，所述第二杂交引物依次包括包埋序列的互补序列、分子标签序列、至少一部分所述连接序列1的互补序列和测序接头2序列，加入每个孔中的所述第二杂交引物的所述分子标签序列均不同，杂交-裂解反应程序如下：55℃10~20min；60~70℃ 5~10min；40~55℃ 30~60min；10℃ ∞，使得所述的包埋序列的互补序列与所述包埋序列进行杂交，并且所述连接序列1的互补序列与所述连接序列1进行杂交，
在杂交-裂解反应结束的体系中每孔依次加入等体积10% Tween-20和延伸-连接体系，37℃反应30min，
其中，延伸-连接体系为：1×DNA 聚合酶缓冲液，2.5U DNA连接酶，1U DNA聚合酶和0.5mM dNTP，
进一步包括测序文库扩增和上机测序的步骤。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，利用细胞核制备液制备细胞核，所述细胞核制备液包括0.1~0.3% IGEPAL CA-630、0.01~0.05%洋地黄皂苷和1×蛋白酶抑制剂。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，在酶切反应液存在的情况下切割基因序列，所述酶切反应液包括：20mM pH7.5 Tris-HCl，10mM MgCl2，10~20%二甲基甲酰胺。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，先将所述第一杂交引物与所述桥连引物退火杂交再与细胞核混合。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序文库扩增为利用PCR扩增引物对进行扩增，
所述PCR扩增引物对上下游引物其中一条包括所述测序接头1序列的互补序列，另外一条包括所述测序接头2序列的互补序列。
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