CN117255857A - 接头、接头连接试剂及试剂盒和文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
一种接头，至少一个第一子接头，每个第一子接头包括：第一核苷酸单链和第二核苷酸单链，所述第一核苷酸单链与所述第二核苷酸单链互补配对；第一核苷酸单链区段，所述第一核苷酸单链区段连接于所述第一核苷酸单链或所述第二核苷酸单链的末端，所述第一核苷酸单链区段包括至少一个随机碱基和至少一个A碱基，每一个所述随机碱基均选自A、C、G和T碱基中的任意一个。
Description
本公开涉及生物技术领域，尤其涉及一种接头、接头连接试剂及试剂盒和文库构建方法。
高通量测序，又称大规模平行测序，或者二代测序。高通量测序能一次对一个样本的多个目标区域或者多个样本进行测序，其在临床，包括药物基因组学、遗传病研究和筛查、肿瘤突变基因检测以及临床微生物检测上的应用也逐渐得到重视。二代测序技术是目前应用最广的测序技术，具有测序深度高、通量大、准确率高、灵敏度好等优势。
发明内容
一方面，提供一种接头，包括至少一个第一子接头和第一核苷酸单链区段。每个第一子接头包括第一核苷酸单链和第二核苷酸单链。所述第一核苷酸单链与所述第二核苷酸单链互补配对。所述第一核苷酸单链区段连接于所述第一核苷酸单链或所述第二核苷酸单链的末端。所述第一核苷酸单链区段包括至少一个随机碱基和至少一个A碱基，每一个所述随机碱基均选自A、C、G和T碱基中的任意一个。
在一些实施例中，所述第一核苷酸单链区段包括多个随机碱基和至少一个A碱基，且所述多个随机碱基连续排列，和/或，所述第一核苷酸单链区段包括多个A碱基和至少一个随机碱基，且所述多个A碱基连续排列。
在一些实施例中，所述第一核苷酸单链区段包括多个随机碱基和至少一个A碱基。所述至少一个A碱基中至少存在一个A碱基排列于所述多个随机碱基中的两个随机碱基之间；和/或，所述第一核苷酸单链区段包括多个A碱基和至少一个随机碱基。所述至少一个随机碱基中至少存在一个随机碱基排列于所述多个A碱基中的两个A碱基之间。
在一些实施例中，所述第一核苷酸单链区段包括3个随机碱基和一个A碱基。
在一些实施例中，接头包括多个第一子接头。所述多个第一子接头中，至少两个第一子接头的第一核苷酸单链区段的随机碱基和A碱基的排列顺序不同。
在一些实施例中，接头包括4个第一子接头。所述4个第一子接头的第一核苷酸单链区段的随机碱基和A碱基的排列顺序各不相同。
在一些实施例中，所述接头还包括至少一个第二子接头和第二核苷酸单链区段。每个第二子接头包括第三核苷酸单链和第四核苷酸单链，所述第三核苷酸单链与所述第四核苷酸单链互补配对。所述第二核苷酸单链区段连接于所述第三核苷酸单链或所述第四核苷酸单链的末端。所述第二核苷酸单链区段包括至少一个随机碱基，每一个所述随机碱基均选自A、C、G和T碱基中的任意一个。
在一些实施例中，所述第二核苷酸单链区段包括4个随机碱基。
另一方面，提供一种接头连接试剂，包括如上所述的接头。
另一方面，提供一种试剂盒，包括如上所述的接头连接试剂。
在一些实施例中，接头连接试剂还包括第三子接头。所述第三子接头包括第五核苷酸单链、第六核苷酸单链和至少一个UMI分子标签。所述第五核苷酸单链与所述第六核苷酸单链互补配对。每个所述UMI分子标签位于所述第五核苷酸单链或第六核苷酸单链上。
在一些实施例中，所述UMI分子标签，包括至少一个随机碱基，每一个所述随机碱基均选自A、C、G和T碱基中的任意一个。
在一些实施例中，所述随机碱基为至少6个。
在一些实施例中，所述UMI分子标签为1个，所述UMI分子标签位于所述第五核苷酸单链上。
在一些实施例中，所述第五核苷酸单链为正向链。所述第六核苷酸单链为反向链。所述第五核苷酸单链包括测序引物序列和扩增引物序列，位于所述第五核苷酸单链上的UMI分子标签位于所述测序引物序列与所述扩增引物序列之间，所述测序引物序列与所述第六核苷酸单链上的碱基通过碱基互补配对而结合。
另一方面，提供一种DNA的文库构建方法，包括获取降解的DNA。对DNA进行解链形成单链DNA。采用如上所述的接头连接试剂进行处理，使所述接头连接试剂中的接头与单链DNA发生反应，得到接头连接产物。对接头连接产物进行钝化、富集，得到DNA文库。
又一方面，提供一种基因测序检测方法，包括使用如上所述的DNA的文库构建方法所获得的DNA文库对DNA进行基因测序。
为了更清楚地说明本公开中的技术方案，下面将对本公开一些实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例的附图，对于本领域普通技术人员来讲，还 可以根据这些附图获得其他的附图。此外，以下描述中的附图可以视作示意图，并非对本公开实施例所涉及的产品的实际尺寸、方法的实际流程、信号的实际时序等的限制。
图1为根据一些实施例的一种第一接头的结构图；
图2A～图2D为根据一些实施例的另一种第一接头的结构图；
图3A～图3B为根据一些实施例的又一种第一接头的结构图；
图4A～图4B为根据一些实施例的第二接头的结构图；
图5为根据一些实施例的一种测序方法的流程图；
图6为根据一些实施例的一种文库构建的流程图；
图7为根据一些实施例的另一种文库构建的流程图。
下面将结合附图，对本公开一些实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本公开一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本公开所提供的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。
除非上下文另有要求，否则，在整个说明书和权利要求书中，术语“包括(comprise)”及其其他形式例如第三人称单数形式“包括(comprises)”和现在分词形式“包括(comprising)”被解释为开放、包含的意思，即为“包含，但不限于”。在说明书的描述中，术语“一个实施例(one embodiment)”、“一些实施例(some embodiments)”、“示例性实施例(exemplary embodiments)”、“示例(example)”、“特定示例(specific example)”或“一些示例(some examples)”等旨在表明与该实施例或示例相关的特定特征、结构、材料或特性包括在本公开的至少一个实施例或示例中。上述术语的示意性表示不一定是指同一实施例或示例。此外，所述的特定特征、结构、材料或特点可以以任何适当方式包括在任何一个或多个实施例或示例中。
以下，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本公开实施例的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
“A、B和C中的至少一个”与“A、B或C中的至少一个”具有相同含义，均包括以下A、B和C的组合：仅A，仅B，仅C，A和B的组合，A和C的组合，B和C的组合，及A、B和C的组合。
“A和/或B”，包括以下三种组合：仅A，仅B，及A和B的组合。
本文中“适用于”或“被配置为”的使用意味着开放和包容性的语言，其不排除适用于或被配置为执行额外任务或步骤的设备。
另外，“基于”的使用意味着开放和包容性，因为“基于”一个或多个所述条件或值的过程、步骤、计算或其他动作在实践中可以基于额外条件或超出所述的值。
如本文所使用的那样，“约”、“大致”或“近似”包括所阐述的值以及处于特定值的可接受偏差范围内的平均值，其中所述可接受偏差范围如由本领域普通技术人员考虑到正在讨论的测量以及与特定量的测量相关的误差(即，测量系统的局限性)所确定。
如本文所使用的那样，术语“DNA”是脱氧核糖核酸(DeoxyriboNucleic Acid)的简称。DNA是存在于生物细胞的遗传信息载体，在体内的作用主要是引导RNA和蛋白质的合成。DNA是由脱氧核苷酸组成的大分子聚合物，脱氧核苷酸由磷酸、脱氧核糖和碱基构成；其中，碱基主要有4种，即A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、C(胞嘧啶)和T(胸腺嘧啶)。
如本文所使用的那样，术语“RNA”是核糖核酸(Ribonucleic Acid)的简称。RNA是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体，在体内的作用主要是引导蛋白质的合成。RNA是由核糖核苷酸组成的大分子聚合物，核糖核苷酸由磷酸、核糖和碱基构成；其中，碱基主要有4种，即A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、C(胞嘧啶)和U(尿嘧啶)。
传统的DNA文库制备通常是对双链DNA进行的。包括以下步骤：1、DNA片段化。2、末端修复加“A”。3、双链接头连接。4、连接产物扩增富集形成文库。其中双链接头只适用于双链DNA。在一些严重降解的DNA样本中，DNA常以单链和双链混合形式存在，并且部分双链DNA还存在一条链断裂，间断性缺失等问题。如细胞外循环DNA样本，或者如福尔马林固定和石蜡包埋的生物组织样本、法医样本和古生物化石提取的DNA样本等。对于单链DNA或者断裂间断性缺失的双链DNA，若采用传统双链建库的策略，均会造成单链DNA的丢失，导致后续检测假阴性、灵敏度降低等问题。尤其像DNA甲基化测序领域，DNA经亚硫酸处理后，导致DNA模板断裂，并且会形成大量的单链DNA，若采用传统双链建库的方法，则大量的单链DNA丢失会严重影响后续CpG位点的检测灵敏度。单链建库方法，其接头完全适用于单链DNA，可完全保证单链DNA有效的形成文库进行后续的测序等实验，保证了样本不丢失的问题。所以单链DNA建库非常适用于ctDNA甲基化测序领域。
目前市场上的单链建库技术主要有以下2种技术途径。一是以Swift的Accel-NGS Methyl-seq技术为代表，即先通过及其昂贵的单链连接酶(如环连接酶II)将一段含有illumina通用序列连接到单链DNA的3’端，之后通过通用序列的互补引物进行扩增形成双链，再通过常规加入双链接头形成完整的可供测序的产物进而进行测序。该技术由于使用单链连接酶成本极高，在DNA投入量较多的情况会导致连接效率低下，而且在亚硫酸盐处理的DNA样本中，存在严重的连接偏向性问题；二是Qiagen的QIAseq Methyl Library Kit。该试剂盒的原理是设计8bp的随机序列作为引物并扩增形成双链，再使用双链接头进行连接，该方法PCR扩增具有一定的偏向性，导致文库构建效率低下。以上两种建库方案还存在的问题是都不带有分子标签，无法进行去冗余，纠正PCR扩增和测序引入的错误。
针对上述存在的技术问题，如图1所示，本公开的一些实施例提供一种接头，该接头可以命名为第一接头，该第一接头包括至少一个第一子接头100。每个第一子接头100包括第一核苷酸单链11、第二核苷酸单链12和第一核苷酸单链区段13。第一核苷酸单链11与第二核苷酸单链12互补配对。第一核苷酸单链区段13连接于第一核苷酸单链11或第二核苷酸单链12的末端。如图2A～图2D所示，第一核苷酸单链区段13包括至少一个随机碱基和至少一个A碱基。每一个随机碱基均选自A、C、G和T碱基中的任意一个，该随件碱基可以用N来表示。
由于人体基因组DNA的C碱基占比大约22.5％，其中未甲基化的C碱基占比大约16.5％。DNA在亚硫酸盐处理后，未甲基化的C碱基会转化成U碱基，导致序列序列碱基组成比例会发生变化。预计碱基C占比6％，碱基U/T占比44％，G碱基与A碱基保持不变。因此亚硫酸盐处理后的序列存在碱基不均衡性，U/T碱基含量较高。而现有技术的单链连接接头采用末端4～8个N碱基进行连接反应。但是N碱基的组成成分A、G、C、T四种碱基占比均为25％，因此常规N碱基接头与亚硫酸盐处理的DNA互补配对成功率会降低。间接引起双链局部双链DNA量减少，最终导致在T4DNA连接酶作用下的连接产物量降低，即连接效率低。通过采用本公开的接头，通过在第一核苷酸单链区段13上增加A碱基的占比，该占比为40％～50％，提升与亚硫酸盐处理后单链DNA的互补配对成功率，以此解决连接效率低的问题。
在一些实施例中，如图1所示，第一核苷酸单链区段13连接于第二核苷酸单链12的末端。
需要说明的是，第一核苷酸单链区段13也可以连接于第一核苷酸单链11 的末端，本公开以第一核苷酸单链区段13连接于第二核苷酸单链12的末端进行解释说明，示例性地，如图2A～图2D所示，第一核苷酸单链区段13连接于第二核苷酸单链12的3’端。
在一些实施例中，第一核苷酸单链区段13包括多个随机碱基和至少一个A碱基，且多个随机碱基连续排列。
示例性地，随机碱基为多个，A碱基为一个，在此情形下，多个随机碱基连续排列。此时，A碱基可以位于多个随机碱基的一侧(如将第二核苷酸单链12的5’端到3’端的方向称为第一方向X，将从第二核苷酸单链12的3’端到5’端的方向称为第二方向Y，A碱基可以位于多个随机碱基的第一方向或第二方向的一侧)。
例如，第一核苷酸单链区段13包括3个随机碱基和一个A碱基，该A碱基位于3个随机碱基的一侧。如图2A所示，A碱基位于3个随机碱基的第一方向X的一侧。如图2D所示，其A碱基位于3个随机碱基的第二方向Y的一侧。
在另一些实施例中，所述第一核苷酸单链区段包括多个A碱基和至少一个随机碱基，且所述多个A碱基连续排列。
示例性地，A碱基为多个，随机碱基为一个，在此情形下，随机碱基可以位于多个A碱基的一侧(如将从第二核苷酸单链12的5’端到3’端的方向称为第一方向X，将从第二核苷酸单链12的3’端到5’端的方向称为第二方向Y，随机碱基可以位于多个A碱基的第一方向X或第二方向Y的一侧)，随机碱基也可以位于任意两个A碱基之间，并连续排列。
在又一些实施例中，第一核苷酸单链区段13包括多个随机碱基和至少一个A碱基，至少一个A碱基中至少存在一个A碱基排列于多个随机碱基中的两个随机碱基之间。
示例性地，随机碱基和A碱基均为多个，在此情形下，多个随机碱基和多个A碱基均连续排列，此时，多个A碱基可以位于多个随机碱基的一侧(如将从第二核苷酸单链12的5’端到3’端的方向称为第一方向X，将从第二核苷酸单链12的3’端到5’端的方向称为第二方向Y，多个A碱基可以位于多个随机碱基的第一方向X或第二方向Y的一侧)，此外多个A碱基位于任意至少一个间隔的随机碱基之间，例如，多个A碱基位于任意两个间隔的随机碱基之间，多个A碱基位于任意三个间隔的随机碱基之间。此外，多个随机碱基和多个A碱基均至少有两个碱基间隔排列，且两个间隔的随机碱基之间可以间隔一个或多个A碱基，两个间隔排列的A碱基之间也可以间隔一个或多个 随机碱基，本公开不限于此。
例如，如图2B与图2C所示，所述第一核苷酸单链区段包括3个随机碱基和一个A碱基。该A碱基位于任意两个随机碱基之间，并连续排列。如图2B所示，在第一方向X上，A碱基位于第2号N碱基与第4号N碱基之间。
如图2C所示，在第一方向X上，A碱基位于第1号N碱基与第3号N碱基之间。
在又一些实施例中，第一核苷酸单链区段13包括多个A碱基和至少一个随机碱基，至少一个随机碱基中至少存在一个随机碱基排列于多个A碱基中的两个随机碱基之间。
示例性地，第一核苷酸单链区段13包括1个随机碱基和3个A碱基，在此情形下，1个随机碱基位于任意2个A碱基之间。
由上述可知，如图2A～图2D所示的第一子接头100，随机碱基为3个，A碱基为1个。其第一子接头100存在两种情形。第一种情形，如图2A与图2D所示，A碱基可以位于3个随机碱基的一侧(如将第二核苷酸单链12的5’端到3’端的方向称为第一方向X，将从第二核苷酸单链12的3’端到5’端的方向称为第二方向Y，A碱基可以位于3个随机碱基的第一方向或第二方向的一侧)。第二种情形，如图2B与图2C所示，A碱基位于任意两个随机碱基之间，由此提升A碱基在第一核苷酸单链区段13中的占比，并提升单链DNA的互补配对成功率，以此提升连接效率。
在一些实施例中，接头包括多个第一子接头100，多个第一子接头100中，至少两个第一子接头100的第一核苷酸单链区段13的随机碱基和A碱基的排列顺序不同。示例性地，至少两个第一子接头100的第一核苷酸单链区段13的随机碱基和A碱基的排列顺序可以如图2A～图2D所示中的任意两种。
在一些实施例中，接头包括4个第一子接头100，4个第一子接头100的第一核苷酸单链区段13的随机碱基和A碱基的排列顺序各不相同。示例性地，4个第一子接头100的第一核苷酸单链区段13的随机碱基和A碱基的排列顺序可以分别如图2A～图2D所示。
在一些实施例中，如图3A所示，该第一接头还包括至少一个第二子接头110，每个第二子接头110包括第三核苷酸单链14、第四核苷酸单链15和第二核苷酸单链区段16。第三核苷酸单链14与第四核苷酸单链15互补配对。第二核苷酸单链区段16连接于第三核苷酸单链14或第四核苷酸单链15的末端。第二核苷酸单链区段16包括至少一个随机碱基。每一个随机碱基均选自A、C、G和T碱基中的任意一个，该随机碱基可以用N来表示。
在一些实施例中，如图3A所示，第二核苷酸单链区段16连接于第四核苷酸单链15的末端。如图3B所示，第二核苷酸单链区段16连接于第四核苷酸单链15的3’端。
需要说明的是，第二核苷酸单链区段16也可以连接于第三核苷酸单链14的末端，本公开以第二核苷酸单链区段16连接于第三核苷酸单链14的末端进行解释说明。
在一些实施例中，图3B所示，随机碱基为4个，以每个随机碱基选取A、C、G和T碱基中的任意一个，该随件碱基可以用N来表示，此时第二核苷酸单链区段16存在4
4种情况的区段。由此可见随着随件碱基的个数以及具体的碱基选择越多，第二核苷酸单链区段16的种类也就越多。
如图4A所示，本公开还提供一种接头，该接头可以命名为第二接头，该第二接头包括第三子接头200，第三子接头200包括第五核苷酸单链21、第六核苷酸单链22和至少一个UMI分子标签23。第五核苷酸单链21与第六核苷酸单链22互补配对。每个UMI分子标签23位于第五核苷酸单链21或第六核苷酸单链22上。
在一些实施例中，UMI分子标签23包括至少一个随机碱基。每一个随机碱基均选自A、C、G和T碱基中的任意一个，该随机碱基可以用N来表示。随机碱基选自不同的碱基，可以用于标记不同的DNA分子。
示例性地，以一个UMI分子标签23中，随机碱基为一个为例，该UMI分子标签23中的N可以选自4个碱基中的任一个，这时，根据UMI分子标签23中的N不同，可以得到4种UMI分子标签23，这4种UMI分子标签23可以做成4
2个(也即16个)接头(一个DNA分子连接两个接头)，从而可以对4
2个(也即16个)不同的DNA分子进行标记，进而完成对4
2个(也即16个)不同的DNA分子的检测。
以一个UMI分子标签23中，随机碱基为3个为例，该UMI分子标签23中的每个N均可以选自4个碱基中的任一个，这时，根据UMI分子标签23中的3个N分别有4
3种(也即64种)组合，可以得到4
3种(也即64种)UMI分子标签23，这64种UMI分子标签23可以做成64
2个(也即4096个)接头(一个DNA分子连接两个接头)，从而可以对64
2个(也即4096个)不同的DNA分子进行标记，进而完成对64
2个(也即4096个)不同的DNA分子的检测。
以一个UMI分子标签23中，随机碱基为6个为例，该UMI分子标签23中的每个N均可以选自4个碱基中的任一个，这时，根据UMI分子标签中的 4个N分别有4
6种(也即4096种)组合，可以得到4
6种(也即4096种)UMI分子标签，这4096种UMI分子标签23可以做成4096
2个(也即16777216个)接头(一个DNA分子连接两个接头)，从而可以对4096
2个(也即16777216个)不同的DNA分子进行标记，进而完成对4096
2个(也即16777216个)不同的DNA分子的检测。
由此可见，随着随机碱基的个数越多，UMI分子标签23的种类就越多，其所能够标记的DNA分子的数量也就越多。
第三子接头200中含有UMI分子标签23，用于在PCR扩增和测序发生错误时，对其进行纠正，以避免导致噪音突变。
具体的，如图5所示，以起始终止位置相同100条原始DNA片段(即来自不同细胞的序列相同)，分别记为原始DNA序列1、原始DNA序列2、原始DNA序列3、…、原始DNA序列99和原始DNA序列100，其中，原始DNA序列98是发生了突变的序列，由A碱基突变成了C碱基，真实的突变频率为1％为例，原始的DNA片段分别连上一个不同的UMI接头，得到对应原始DNA序列1～原始DNA序列100的序列，仍然记为原始DNA序列1、原始DNA序列2、原始DNA序列3、…、原始DNA序列99和原始DNA序列100，对这100个连接有UMI接头的原始DNA序列进行PCR扩增富集，得到DNA文库，该DNA文库包括100条连接有UMI接头的原始DNA序列1。
其中，文库构建过程中，此处的PCR扩增富集，意思是指以原始DNA序列为模板，进行PCR扩增，复制出完全相同的原始DNA序列，但扩增过程中，由于酶活性等因素会导致扩增出现错误，如图5中的第一种情况所示，每一条原始DNA序列未连接UMI接头，此种情况下，这种扩增错误无法排除，会误以为是真实突变，造成检测结果的假阳性，而在原始DNA序列连上UMI后进行扩增与复制时，若也出现了扩增错误，如图5的第二种情况所示，每一条原始DNA序列连接UMI接头，则通过UMI接头序列完全一致则可判断是扩增错误，而不是真实的突变。
由此可见，在第三子接头200中采用UMI分子标签23可以对不同的原始DNA片段进行标记，而且还排除PCR扩增或测序引入的噪音突变，从而可以提高检测的准确性。
在一些实施例中，随机碱基为至少6个。
示例性地，随机碱基为6个～8个，随机碱基可以为6个、7个或8个，在可以保证检测的容错率的情况下，防止随机碱基数量过多而造成后续占用 测序数据量。如图4B所示，本公开实施例以随机碱基为6个进行解释说明，由于随机碱基选自A、C、G和T碱基中的任意一个，其存在4
6种，足以满足区分原始DNA拷贝数分子。此外6个～8个随机碱基可以相同或不相同，本公开对此不做具体限定。
在一些实施例中，如图4B所示，UMI分子标签23为1个。UMI分子标签23位于第五核苷酸单链21上。
需要说明的是，UMI分子标签23也可以位于第六核苷酸单链22上。
在一些实施例中，如图4B所示，第五核苷酸单链21为正向链(如图4B中从5’端到3’端排列的链)，第六核苷酸单链22为反向链(如图4B中从3’端到5’端排列的链)。第五核苷酸单链21包括测序引物序列24和扩增引物序列25，位于第五核苷酸单链21上的UMI分子标签23位于测序引物序列24与扩增引物序列25之间。测序引物序列24与第六核苷酸单链33上的碱基通过碱基互补配对而结合。
需要说明的是，如图4B所示，将从第五核苷酸单链21的5’端到3’端的方向称为第一方向X，该UMI分子标签23上的6个随机碱基排列在第27号至32号碱基位置处。其在于使后续扩增时，需要扩增引物在1～16号碱基位置处互补配对。
本公开的一些实施例提供一种接头连接试剂，包括第一子接头100和/或第二子接头110和/或第三子接头200。此外，接头连接试剂还包括T4 DNA连接酶(T4 DNA Ligase)、T4多核苷酸激酶(T4 PNK)、2x Taq DNA Master Mix、10×T4 DNA连接酶缓冲液(10X T4 DNA Ligase Buffer)、聚乙二醇(PEG)等，T4 DNA连接酶与T4多核苷酸激酶其作用是促使多种接头(第一接头10和/或第二接头20)和进行DNA单链连接，2x Taq DNA Master Mix、10×T4 DNA连接酶缓冲液与聚乙二醇为接头连接反应提供稳定的pH环境。此外聚乙二醇可以为聚乙二醇4000、聚乙二醇6000和聚乙二醇8000中的至少一种，本公开对此不做具体限定。其中，聚乙二醇4000是指分子量为4000的聚乙二醇，聚乙二醇6000是指分子量为6000的聚乙二醇，聚乙二醇8000是指分子量为8000的聚乙二醇。
需要说明的是，2x Taq DNA Master Mix是一种PCR预混液，含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、标准Taq酶反应缓冲液、酶稳定剂和溴酚蓝染料，适用于常规的PCR应用。使用时，只需在制品溶液中加入模板和引物可进行PCR反应，大大简化了操作过程，减少了PCR操作过程中的污染。此外其主要组份包括0.1U/μLTaq DNA Poiymerase(Taq DNA聚合酶)、2xPCR反应缓冲液、 3mmol/L氯化镁与0.4mmol/L dNTPs，该组份的浓度可以根据实际需求进行选择，此外该2x Taq DNA Master Mix为现有产品，可以直接商购，本公开不限于此。
本公开的一些实施例还提供一种试剂盒，包括如上的接头连接试剂。
需要说明的是，该试剂盒可以是接头连接试剂盒。试剂盒是指用于盛放检测化学成分、药物残留、病毒种类等化学试剂的盒子，在此则是指盛放有接头连接试剂的盒子。
本公开的实施例提供的试剂盒的有益技术效果和本公开的实施例提供的接头的有益技术效果相同，在此不再赘述。
本公开的一些实施例提供一种UMI分子标签23在基因测序中的应用，该UMI分子标签23包括至少一个随机碱基。每一个随机碱基均选自A、C、G和T碱基中的任意一个。
在一些实施例中，基因包括用于遗传信息表达的DNA分子或RNA分子。UMI分子标签被配置为对不同的DNA或RNA分子进行标记。
示例性地，该基因可以包括ctDNA，该UMI分子标签23可以用于UMI接头中，对不同的ctDNA分子进行标记。
本公开的一些实施例提供一种DNA或RNA的文库构建方法，如图6所示，包括S1～S4。
S1、获取降解的DNA。
示例性地，其DNA通过亚硫酸盐处理过的片段DNA或已经高度降解的DNA，本公开不限于此。
S2、对DNA进行解链形成单链DNA。
示例性地，通过PCR仪进行扩增、孵育从而使DNA解链得到单链DNA，此外，在一些严重降解的DNA样本中，其存在单链的DNA。或者，可以通过商业途径获取单链DNA。此外还可以采用mRNA反转录得到单链DNA。
S3、采用如上的接头连接试剂进行处理，使接头连接试剂中的接头与单链DNA发生反应，得到接头连接产物。
利用上述包括多种接头(第一子接头100、第二子接头110、第三子接头200)与单链DNA进行PCR扩增反应得到接头连接产物。
S4、对接头连接产物进行钝化、富集，得到DNA文库。
示例性地，通过向接头连接产物中加入磁珠进行钝化与富集，从而得到DNA文库。
本公开的一些实施例提供一种基因测序检测方法，包括使用如上所述的 DNA或RNA的文库构建方法所获得的DNA或RNA文库对DNA或RNA进行基因测序。
在本公开的实施例中，通过采用如上所述的DNA或RNA的文库构建方法所获得的DNA或RNA文库对DNA或RNA进行基因测序，由于上述构建的DNA或RNA文库中的DNA分子或RNA分子均连接有接头(第一子接头100、第二子接头110与第三子接头200)，第一子接头100由于提高了A碱基的占比，通过第一子接头100与第二子接头110使文库构建效率提高。而第三子接头200中包含有UMI分子标签23，因此，通过UMI分子标签23即可对DNA分子或RNA分子进行标记，可以在后续测序过程中，对测序或扩增过程中所产生的错误进行纠正，从而可以减少引入假阳性突变，提高检测准确性。
为了对本公开的实施例的技术效果进行客观评价，本公开的实施例将通过如下实施例和实验例对本公开进行详细地示例性地描述。
本公开的一些实施例中，以第一核苷酸单链11与第三核苷酸单链14的序列相同进行解释说明，其序列为如下SEQ ID NO：1所示：
5'-Phos-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGA-Spac-3' SEQ ID NO：1。
由于第一核苷酸单链11与第二核苷酸单链12碱基互补配对，第三核苷酸单链14与第四核苷酸单链15碱基互补配对，因此第二核苷酸单链12与第四核苷酸单链15的序列也相同，其序列为如下SEQ ID NO：2所示：
5'-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3' SEQ ID NO：2。
在本公开的一些实施例中为了便于解释说明，其第一核苷酸单链11命名为第一链，第二核苷酸单链区段16(序列为NNNN)连接于第四核苷酸单链15的末端命名为第二链，第二核苷酸单链12与第一核苷酸单链区段13(序列为NNNA)相连命名为第三链，第二核苷酸单链12与第一核苷酸单链区段13(序列为NNAN)相连命名为第四链，第二核苷酸单链12与第一核苷酸单链区段13(序列为NANN)相连命名为第五链，第二核苷酸单链12与第一核苷酸单链区段13(序列为ANNN)相连命名为第六链。
第五核苷酸单链21命令为第七链，第六核苷酸单链33命名为第八链。其第一链至第八链的序列为如下表1所示：
表1
由上表1可知，第一核苷酸单链区段13的序列包括NNNA、NNAN、NANN和ANNN，第二核苷酸单链区段16包括NNNN，其中N表示为随机碱基，N选自选自A、C、G和T碱基中的任意一个。其中*表示代表硫代修饰，保证DNA不降解。Phos表示磷酸基团修饰，s-表示硫代修饰。
1、接头合成
接头合成实施例
步骤1、分别将第一链至第八链重悬至浓度为100μM，体积分别为100μL的溶液；
步骤2、配制缓冲液试剂100μL，试剂组成：
10mM Tris(Tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，三羟甲基氨基甲烷)-HCl)缓冲液，该缓冲液的pH为7.5，2mM EDTA，50mM NaCl。
步骤3、分别取10μL第一链溶液与第二链溶液置于标号为接头1-1的PCR管中，分别取10μL第一链溶液与第三链溶液置于标号为接头1-2的PCR管中，分别取10μL第一链溶液与第四链溶液置于标号为接头1-3的PCR管中，分别取10μL第一链溶液与第五链溶液置于标号为接头1-4的PCR管中，分别取10μL第一链溶液与第六链溶液置于标号为接头1-5的PCR管中，分别取10μL第七链溶液与第八链溶液置于标号为接头2的PCR管中，以上各PCR管中分别加入80μL缓冲液试剂，充分混匀，并离心10s。
步骤4、将上述各PCR管放置于PCR仪中，在95℃变性10min。
步骤5、反应结束后，直接关掉PCR仪，待温度降至室温，取出各PCR管。
步骤6、分别取各PCR管中的产物1μL在全自动核酸片段分析仪(Qsep100)中质检，得到如图2A～图2D、图3B以及图4B所示的接头(第一子接头100、第二子接头110与第三子接头200)。
2、文库构建和测序
实施例1
步骤1、定制菁良基因公司的多突变位点的cfDNA标准品作为样本，突变频率为1％，采用的标准品为cfDNA的样本，可直接进行文库构建。
步骤2、将1ng～200ng(如1ng、5ng、10ng、50ng、200ng)亚硫酸盐处理过的片段化DNA或者高度降解的DNA加入到PCR管中，加入超纯水稀释到总体积为30μL。
步骤3、将步骤2中的PCR管放入PCR仪中，进行95℃孵育5min后，将PCR管在0℃以下冷却，静置2min，使DNA充分解链成单链DNA。
步骤4、将表2中试剂解冻后混匀后，在0℃以下，向步骤3中PCR管中依次加入表2试剂组分，充分混匀，并离心移液器轻轻吹打或振荡混匀，然后瞬时离心使反应液至管底。其中接头为接头合成实施例合成的接头，该接头如图2A～图2D(第一子接头100)与图3B(第二子接头110)所示，其中每个接头数量相等。
表2
步骤5、将步骤4的PCR管置于PCR仪中，在20℃温度条件下反应30min，再在95℃变性2min。
步骤6、在0℃以下，取步骤5中的PCR反应管中产物40μL，并再加入40μL的2x Taq DNA Master Mix以及浓度为10μM、体积为3μL的引物，移液器轻轻吹打或振荡混匀，然后瞬时离心使得反应液至管底。
步骤7、将步骤6的PCR管置于PCR仪，在98℃变心2min，在60℃退火2min，在70℃延伸5min，在4℃保存，得到接头连接产物。
步骤8、连接产物纯化：向接头连接产物中加入1.2倍体积磁珠，充分混匀后室温静置5min，放置于磁力架使磁珠完全吸附且溶液澄清，小心移除上清，加入200μL 80％乙醇进行漂洗，室温孵育30s～60s，小心移除上清，重复一次；待磁珠干燥后，加入31μL超纯水洗脱，室温放置3min后置于磁力架，待溶液澄清吸取30μL上清液待用，得到钝化产物。
步骤9、将表3中试剂解冻后混匀，置于0℃以下，取步骤8中得到的纯化产物30μL，并依次加入表3试剂组分，移液器轻轻吹打或振荡混匀，然后瞬时离心使得反应液至管底，表3中的接头为图4B所示的接头(第三子接头200)。
表3
步骤10、将步骤9的PCR管置于PCR仪中，在20℃进行连接反应15min，4℃保存。
步骤11、富集产物纯化：向步骤10扩增产物中加入1倍体积磁珠，充分混匀后室温静置5min，放置于磁力架使磁珠完全吸附且溶液澄清，小心移除上清；加入200μL 80％乙醇进行漂洗，室温孵育30s～60s，小心移除上清，重复一次；待磁珠干燥后，加入22μL超纯水洗脱，室温放置3min后置于磁力架，待溶液澄清吸取20μL上清液至新PCR管中。
步骤12、取步骤11中的产物20μL，再加入2×HIFI Uracil PCR Mix 25μL与primer Mix 5μL，移液器轻轻吹打或振荡混匀，然后瞬时离心使得反应液至管底。
其中，primer Mix包含2条引物，在illumina测序平台中通常分为i5 primer与i7 primer，此外在i5 primer中包含i5 Index，i7 primer中包含i7 Index，i5 primer与i7 primer具体序列如下表4所示：
表4
步骤13、将步骤12中的PCR管置于PCR仪中，并在98℃预变性1min，随后5次～10次循环，循环反应包括98℃变性20s，60℃引物退火30s，72℃产物延伸30s。循环完成后再进行72℃终延伸3min，最后4℃暂存。
步骤14、文库浓度测定：使用Qubit 4.0 Fluorometer，取1μL步骤13的产物进行测定。
步骤15、上机测序：使用Novaseq 6000(Illumina)仪器进行上机测序，以及使用FastQC软件对下机数据基本质控进行分析，实际检出位点及突变与理论值基本一致，具体检测结果如下表5与表6所示。
此外，由于一个文库对应一个样本DNA(上述步骤2中的DNA)，在构建文库的过程中，最后一步为Index引物扩增，引物扩增完成后给予每一个样本添加上Index(包含i5Index和i7 Index)，而一组i5 Index和i7 Index决定样本的信息。因此为了便于在测序反应混合多个样本DNA，在每个样本DNA进行文库构建的过程后进行Index引物扩增，即给每个样本DNA进行标记，以便测序识别。而由于测序仪器的不同所对应的Index序列也不同，每个测序仪器对应的Index包含16种序列，其具体如下表7～表9所示：
表7
表8
表9
实施例2
实施例2中的各步骤与实施例1的各步骤基本相同，在此不再赘述，不同的是，在步骤4中，其接头采用接头合成实施例合成的接头进行文库构建，该接头如图2A、图2B、图3B与图4B所示，每个接头个数相等，实际检出位点及突变与理论值基本一致，具体检测结果如下表5与表6所示。
对比例
对比例中的各步骤与实施例1的各步骤基本相同，在此不再赘述，不同的是，在步骤4中，其接头采用接头合成实施例合成的接头进行文库构建，该接头如图3B与图4B所示，每个接头的个数相等，其文库构建过程如图7所示，此外，实施例1与实施例2的文库构建过程同理参照图7所示，本公开不再赘述。实际检出位点及突变与理论值基本一致，但相对实施例1与实施例2欠佳，具体检测结果如下表5与表6所示。
表5
| 实施例 | 样本编号 | DNA加入量(ng) | PCR循环次数 | 文库产量(ng) |
| 实施例1 | 1 | 1 | 14 | 2100 |
| 实施例1 | 2 | 1 | 14 | 2060 |
| 实施例1 | 3 | 5 | 12 | 1980 |
| 实施例1 | 4 | 5 | 12 | 1990 |
| 实施例1 | 5 | 10 | 11 | 2050 |
| 实施例1 | 6 | 10 | 11 | 2030 |
| 实施例1 | 7 | 50 | 9 | 1980 |
| 实施例1 | 8 | 50 | 9 | 1996 |
| 实施例1 | 9 | 200 | 6 | 1890 |
| 实施例1 | 10 | 200 | 6 | 1900 |
| 实施例2 | 1 | 1 | 14 | 1600 |
| 实施例2 | 2 | 1 | 14 | 1580 |
| 实施例2 | 3 | 5 | 12 | 1320 |
| 实施例2 | 4 | 5 | 12 | 1310 |
| 实施例2 | 5 | 10 | 11 | 1360 |
| 实施例2 | 6 | 10 | 11 | 1380 |
| 实施例2 | 7 | 50 | 9 | 1180 |
| 实施例2 | 8 | 50 | 9 | 1205 |
| 实施例2 | 9 | 200 | 6 | 1070 |
| 实施例2 | 10 | 200 | 6 | 1110 |
| 对比例 | 1 | 1 | 14 | 1400 |
| 对比例 | 2 | 1 | 14 | 1350 |
| 对比例 | 3 | 5 | 12 | 1250 |
| 对比例 | 4 | 5 | 12 | 1210 |
| 对比例 | 5 | 10 | 11 | 1200 |
| 对比例 | 6 | 10 | 11 | 1125 |
| 对比例 | 7 | 50 | 9 | 1000 |
| 对比例 | 8 | 50 | 9 | 1050 |
| 对比例 | 9 | 200 | 6 | 950 |
| 对比例 | 10 | 200 | 6 | 980 |
通常在文库制备过程中，文库连接效率可通过荧光定量PCR对连接产物绝对定量进行评估，由于在连接反应完成后会进行PCR扩增，所以也可能通过文库产量在相同DNA加入量、相同扩增循环数条件下文库产量对比评估，本公开则采用文库产量来进行连接效率高低的量化评估，从上述表5中的实验数据可以看出，实施例1文库产量均值约2000ng，实施例2文库产量均值约1300ng，对比例文库产量均值约1100ng，其实施例1与实施例2的文库产量均优于对比例。以此说明了实施例1与实施例2中的接头提高了与单链DNA的互补配对效率，以此提高连接效率，最终提高文库的产量。
表6
其中，在上述表6中，实验例1对选定基因的不同突变位点的实际检测突变频率基本在0.94％～1.11％之间，与理论突变频率(1％)相比较为准确，实验例2对选定基因的不同突变位点的实际检测突变频率基本在0.90％～1.10％之间，与理论突变频率相比较也均为准确，对比例对选定基因的不同突变位点的实际检测突变频率基本在0.93％～1.15％之间，与理论突变频率相比较也较为准确，但对比例相对实施例1与实施例2波动较大。
综上所述，通过采用本公开实施例的接头与UMI分子标签，既可以保证接头的多样性，标记不同的原始的DNA片段，提高文库产量，以及排除PCR扩增或测序引入的噪音突变，纠正PCR扩增错误，从而可以提高检测准确性。
以上所述，仅为本公开的具体实施方式，但本公开的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内，想到变化或替换，都应涵盖在本公开的保护范围之内。因此，本公开的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (17)
- 一种接头，包括：至少一个第一子接头，每个第一子接头包括：第一核苷酸单链和第二核苷酸单链，所述第一核苷酸单链与所述第二核苷酸单链互补配对；第一核苷酸单链区段，所述第一核苷酸单链区段连接于所述第一核苷酸单链或所述第二核苷酸单链的末端，所述第一核苷酸单链区段包括至少一个随机碱基和至少一个A碱基，每一个所述随机碱基均选自A、C、G和T碱基中的任意一个。
- 根据权利要求1所述的接头，其中，所述第一核苷酸单链区段包括多个随机碱基和至少一个A碱基，且所述多个随机碱基连续排列；和/或，所述第一核苷酸单链区段包括多个A碱基和至少一个随机碱基，且所述多个A碱基连续排列。
- 根据权利要求1所述的接头，其中，所述第一核苷酸单链区段包括多个随机碱基和至少一个A碱基，所述至少一个A碱基中至少存在一个A碱基排列于所述多个随机碱基中的两个随机碱基之间；和/或，所述第一核苷酸单链区段包括多个A碱基和至少一个随机碱基，所述至少一个随机碱基中至少存在一个随机碱基排列于所述多个A碱基中的两个A碱基之间。
- 根据权利要求1～3中任一项所述的接头，其中，所述第一核苷酸单链区段包括3个随机碱基和一个A碱基。
- 根据权利要求1～4中任一项所述的接头，包括多个第一子接头，所述多个第一子接头中，至少两个第一子接头的第一核苷酸单链区段的随机碱基和A碱基的排列顺序不同。
- 根据权利要求5所述的接头，其中，包括4个第一子接头，所述4个第一子接头的第一核苷酸单链区段的随机碱基和A碱基的排列顺序各不相同。
- 根据权利要求1～6中任一项所述的接头，还包括：至少一个第二子接头，每个第二子接头包括：第三核苷酸单链和第四核苷酸单链，所述第三核苷酸单链与所述第四核苷酸单链互补配对；第二核苷酸单链区段，所述第二核苷酸单链区段连接于所述第三核苷酸单链或所述第四核苷酸单链的末端，所述第二核苷酸单链区段包括至少一个随机碱基，每一个所述随机碱基均选自A、C、G和T碱基中的任意一个。
- 根据权利要求6或7所述的接头，其中，所述第二核苷酸单链区段包括4个随机碱基。
- 一种接头连接试剂，包括：如权利要求1～8中任一项所述的接头。
- 一种试剂盒，包括：如权利要求9所述的接头连接试剂。
- 根据权利要求10所述的试剂盒，所述接头连接试剂还包括：第三子接头，所述第三子接头包括：第五核苷酸单链和第六核苷酸单链，所述第五核苷酸单链与所述第六核苷酸单链互补配对；至少一个UMI分子标签，每个所述UMI分子标签位于所述第五核苷酸单链或第六核苷酸单链上。
- 根据权利要求11所述的试剂盒，其中，所述UMI分子标签，包括：至少一个随机碱基，每一个所述随机碱基均选自A、C、G和T碱基中的任意一个。
- 根据权利要求12所述的试剂盒，其中，所述随机碱基为至少6个。
- 根据权利要求11～13中任一项所述的试剂盒，其中，所述UMI分子标签为1个，所述UMI分子标签位于所述第五核苷酸单链上。
- 根据权利要求14所述的试剂盒，其中，所述第五核苷酸单链为正向链，所述第六核苷酸单链为反向链；所述第五核苷酸单链包括测序引物序列和扩增引物序列，位于所述第五核苷酸单链上的UMI分子标签位于所述测序引物序列与所述扩增引物序列之间，所述测序引物序列与所述第六核苷酸单链上的碱基通过碱基互补配对而结合。
- 一种DNA的文库构建方法，包括：获取降解的DNA；对DNA进行解链形成单链DNA；采用如权利要求9所述的接头连接试剂进行处理，使所述接头连接试剂中的接头与单链DNA发生反应，得到接头连接产物；对接头连接产物进行钝化、富集，得到DNA文库。
- 一种基因测序检测方法，包括：使用如权利要求16所述的DNA的文库构建方法所获得的DNA文库对DNA进行基因测序。
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