CN116254611A - 一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，利用细胞核原位Tn5酶切反应构建单细胞转录组文库，简化了转录组文库构建中cDNA扩增步骤，不需要第二链的合成，缩短了实验流程；通过第一轮标签序列添加，实现多样本混样单批次建库；通过两轮标签序列的添加，实现单芯片多倍过载上样，提高了单次反应可检测的样品数量和细胞数量，大大降低了单细胞文库的制备成本。本发明还提高了反应效率和测序数据质量，单次反应可检测的细胞数量大大增加，单细胞可检出基因数显著提高。本发明还提供一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建体系，使用自主研发的反应试剂体系，降低了单细胞文库的制备成本，具有较高的普遍适用性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法。
背景技术
单细胞转录组测序技术对阐明组织中复杂多样的细胞个体在发育和功能等方面的异质性具有重要作用。目前领域内有多种单细胞转录组方法，其中使用最为广泛的是SMART-Seq2(Switching mechanism at 5'end of the RNA transcript)技术和10×Genomics公司的相关试剂盒。
SMART-seq2在分选得到单细胞后，以oligo(dT)VN为引物进行逆转录，生成cDNA第一链；当逆转录酶到达mRNA 5'末端时，会在末端添加几个连续的胞嘧啶(C)残基；然后通过模板转换引物TSO结合cDNA，合成第二条链；cDNA双链经过PCR扩增纯化后用于测序。其操作繁琐，实验周期长。10×Genomics公司依赖于自有商业平台，开发了一系列单细胞转录组测序试剂盒，但价格昂贵。
因此，现有技术还有待改进，需要开发一种高通量、低成本、流程简洁的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建技术，来满足目前对单细胞转录组测序的广泛需求。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，旨在解决现有单细胞转录组测序技术存在的通量有限、操作繁琐，或者费用高昂的问题。
本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其中，所述方法包括步骤：
对待测细胞进行固定，之后进行细胞膜透化；
利用带有第一轮样本标签序列的特异性逆转录引物1，在透化后的待测细胞的细胞核中原位逆转录合成mRNA-cDNA杂合双链；
提供Tn5转座子，在所述mRNA-cDNA杂合双链上添加接头；
提供含有核酸外切酶和逆转录酶的逆转录酶反应体系，将添加接头反应之后多余的引物去除并补齐Tn5酶切产生的双链缺口；
反应完成后，在微流控平台上构建含有过载的待测细胞的高通量微滴；
利用特定预扩增引物对含有过载的待测细胞的高通量微滴进行文库预扩增，得到预文库；
利用针对待测细胞的特异性引物2对所述预文库进行最终扩增并添加第二轮样本标签序列；
将最终扩增产物回收后，得到所述的单细胞转录组测序文库。
所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其中，所述Tn5转座子为Tn5蛋白与修饰后的寡核酸双链的结合体。
所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其中，所述修饰后的寡核酸双链为5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’与Phos-C*T*G*T*C*T*C*T*T*A*T*A*C*A*C*A*T*C*/iInvdT/的退火产物。
所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其中，所述特异性逆转录引物1包含针对待测细胞的384条逆转录引物，用于样本的第一轮标记；所述特异性引物2包含针对待测细胞的4条样本扩增引物，用于最终扩增时样本的第二轮标记。
所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其中，所述逆转录引物的碱基序列中包含8bp的索引序列。
所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其中，所述在微流控平台上构建含有过载的待测细胞的高通量微滴的具体步骤为：对多个样本计数后，按比例混合，在带有Nextera Read1捕捉序列的微流控平台上以过载的形式上机，构建含有过载的待测细胞的高通量微滴。
第二方面，本发明提供一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建体系，其中，所述体系包括细胞固定液A、细胞透化液B、反应混合物C、反应混合物D、反应混合物E以及混合溶液F；所述反应混合物C包含RNA酶抑制剂混合物、样本特异性逆转录引物1以及逆转录酶反应体系；所述反应混合物D包含Tn5转座子以及Tn5酶切反应体系；所述反应混合物E包含核酸外切酶、逆转录酶以及逆转录酶反应体系；所述混合溶液F包含Tris-HCl、氯化钠和氯化镁。
所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建体系，其中，所述Tn5转座子为Tn5蛋白与修饰后的寡核酸双链的结合体，所述修饰后的寡核酸双链为5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’与Phos-C*T*G*T*C*T*C*T*T*A*T*A*C*A*C*A*T*C*/iInvdT/的退火产物。
第三方面，本发明提供一种用于多样本超高通量单细胞转录组测序文库构建的试剂盒，其中，所述试剂盒包括如上任一所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建体系。
第四方面，本发明提供一种基于如上所述试剂盒的多样本超高通量单细胞转录组测序的方法，其中，包括步骤：
将待测细胞样本制备为单细胞悬液，以细胞固定液A固定细胞、细胞透化液B裂解细胞后，转移细胞核至含有样本特异性逆转录引物1的反应混合物C中，进行细胞核原位逆转录，合成mRNA-cDNA杂合双链；
使用混合溶液F洗去残余的反应混合物C，转移细胞核至反应混合物D中，标记转录组mRNA-cDNA杂合双链序列并添加测序接头；
使用混合溶液F洗去残余的反应混合物D，转移细胞核至反应混合物E中，利用外切酶和逆转录酶去除反应体系中残留的单链DNA分子，并补齐Tn5酶切后留下的缺口；
使用混合溶液F洗去残余的反应混合物D，重悬细胞核并计数；
对细胞进行捕获，使每个液滴里有一个或特定数目的细胞核；
使用特定预扩增引物进行文库预扩增；
使用针对待测细胞的特异性引物2和illumina P5引物进行文库的最终扩增和第二轮样本index标记。
有益效果：本发明提供了一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法。本发明提供的方法，简化了转录组文库构建中cDNA扩增步骤，不需要第二链的合成，缩短了实验流程；在mRNA-cDNA杂合双链上添加接头，避免使用连接反应添加测序接头，提高了反应效率；通过两轮标签序列的添加，实现了单芯片多倍过载上样，提高了单次反应检测的样品数量和细胞数量，降低了单细胞文库的制备成本。此外，本发明还缩短了实验流程，提高了反应效率和测序数据质量，单细胞可检出基因数有了显著提高，具有较高的普遍适用性。
附图说明
图1为本发明实施例中一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法的流程示意图。
具体实施方式
本发明提供一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例首先提供一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建体系，所述体系包括细胞固定液A、细胞透化液B、反应混合物C、反应混合物D、反应混合物E以及混合溶液F。
在一些实施方式中，细胞固定液A的主要成分为乙二醛和乙酸，用于细胞固定。
在一些实施方式中，细胞透化液B的主要成分为吐温-20、CA630、digitonin和RNA酶抑制剂。
细胞固定液A和细胞透化液B主要用于细胞的预处理，除上述成分之外，也可采用其他具有固定、透化功能的溶液。
在一些实施方式中，所述反应混合物C包含RNA酶抑制剂混合物、样本特异性逆转录引物1以及逆转录酶反应体系。
反应混合物C用于实现细胞核的原位逆转录并添加第一轮样本标签和测序接头。所述反应混合物C含有RNA酶抑制剂混合物，可以有效防止细胞核内RNA在逆转录过程中的降解；含有样本特异的逆转录引物，用于结合成熟mRNA的polyA尾，引导合成cDNA-mRNA杂合链，并提供第一轮样本标签和测序所需接头。
具体的，RNA酶抑制剂混合物包括0.8U/μl Ribolock RNase inhibitor,0.2U/μlSUPERaseIn Rnase抑制剂，0.4U/μl RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor。上述RNA酶抑制剂混合物可有效防止RNA降解，同时成本较低。
可选的，RNA酶抑制剂混合物包括1.4U/μl Protector Rnase抑制剂或其他有效的Rnase抑制剂。
在一些实施方式中，所述特异性逆转录引物1包含针对待测细胞的384条逆转录引物，用于样本的第一轮标记。
在一些具体的实施方式中，所述逆转录引物的碱基序列中包含8bp的索引序列。
具体的，所述逆转录引物为5’-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT[8bpsample_idx1]NNNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’。
可选的，所述逆转录引物可适当增减碱基个数，但需要符合[TruseqR2]+[sample_idx]+[UMI]+[ployT]的模式。
在另一些实施方式中，384条逆转录引物序列所含的8bp索引序列为自主设计的碱基序列，满足每个位置的A、C、G和T频率相等，每两个索引序列差异碱基距离大于3。
具体的，384条逆转录引物中8bp的索引序列参考了文献：Xu W,Yang W,Zhang Y,Chen Y,Hong N,Zhang Q,Wang X,Hu Y,Song K,Jin W,Chen X.ISSAAC-seq enablessensitive and flexible multimodal profiling of chromatin accessibility andgene expression in single cells.Nat Methods.2022Oct；19(10):1243-1249.doi:10.1038/s41592-022-01601-4。
在一些实施方式中，所述反应混合物C还含有增加分子作用频率的添加剂，用于提高分子间挤压力。
具体的，所述添加剂为PEG8000水溶液，浓度为10-15％，主要功能是增加RNA逆转录效率并且背景反应较低。可选的，所述添加剂还可以为其他分子质量的PEG的水溶液，浓度可根据分子量进行调节。
在一些具体的实施方式中，除RNA酶抑制剂混合物和样本特异性逆转录引物1外，所述反应混合物C其他成分为无核酸酶水和逆转录酶反应体系。
具体的，所述逆转录酶反应体系中逆转录酶为maxiama H minus reversetranscriptase，浓度为4U/μl，可以有较好的扩增效率。
可选的，所述逆转录酶还可以为其他种类RNase H酶活性缺失的逆转录酶，可有效完成文库逆转录。
在一些实施方式中，所述反应混合物D包含Tn5转座子以及Tn5酶切反应体系。
本发明实施例提供的反应混合物D，用于标记转录组序列并添加测序接头。所述反应混合物D含有特定组装的Tn5转座子，结合cDNA-mRNA杂合链并插入测序接头。本发明在mRNA-cDNA杂合双链上添加接头，避免使用连接反应添加测序接头，提高了反应效率。
在一些实施方式中，所述Tn5转座子为纯化后的Tn5蛋白与修饰后的寡核酸双链的结合体。
在一些具体的实施方式中，所述修饰后的寡核酸双链核酸序列为5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’与Phos-C*T*G*T*C*T*C*T*T*A*T*A*C*A*C*A*T*C*/iInvdT/的退火产物。其中，碱基之间添加磷酸化修饰可防止寡核酸双链自身被Tn5切割。
在另一些具体的实施方式中，所述修饰后的寡核酸双链核酸序列为5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’与Phos-CTGTCTCTTATACACATC/iInvdT/的退火产物。
在一些具体的实施方式中，所述Tn5转座子为Tn5蛋白与所述核酸片段在转座子组装缓冲液中结合生成，具体结合方法参照已公开发表的文献(Picelli S,
AK,Reinius B,Sagasser S,Winberg G,Sandberg R.Tn5 transposase and tagmentationprocedures for massively scaled sequencing projects.Genome Res.2014；24(12):2033-2040.doi:10.1101/gr.177881.114)。
在一些具体的实施方式中，除Tn5转座子以及Tn5酶切反应体系外，所述反应混合物D的其他成分还包括无核酸酶水。
在一些实施方式中，所述反应混合物E包含核酸外切酶、逆转录酶以及逆转录酶反应体系。
本发明实施例提供的反应混合物E，用于同时去除多余引物和补齐Tn5酶切产生的DNA双链缺口。所述反应混合物E含有核酸外切酶用来去除反应体系中可能残留的单链DNA分子；含有逆转录酶，用以补齐Tn5酶切后留下的缺口。
在一些具体的实施方式中，所述核酸外切酶为可热灭活的exo1，浓度为1-2U/μl。
在另一些具体的实施方式中，所述核酸外切酶还可以为其他种类可热灭活的降解DNA单链的核酸外切酶类。
在一些具体的实施方式中，所述逆转录酶为Maxiama H minus reversetranscriptase，浓度为4U/μl，上述浓度下有较好的扩增效率。
在另一些具体的实施方式中，所述逆转录酶还可以为其他种类逆转录酶，可有效完成mRNA-cDNA缺口补齐的功能。
在一些具体的实施方式中，所述反应混合物E还包括无核酸酶水和逆转录酶反应体系中除逆转录酶之外的的其他组份。
在一些实施方式中，所述混合溶液F包含Tris-HCl、氯化钠和氯化镁。
本发明实施例提供的混合溶液F，用于清洗各个反应过程中残留的上一轮反应物，并维持细胞核的形态。
在一些具体的实施方式中，所述混合溶液F成分为50mM Tris-HCl(pH＝8.0)、10mM氯化钠、3mM氯化镁以及无核酸酶水。
优选的，所述混合溶液E中氯化镁浓度可在3-6mM范围内进行调整，以适应不同组织来源的细胞核。
本发明实施例还提供一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，所述方法包括步骤：
S10、对待测细胞进行固定，之后进行细胞膜透化；
S20、利用带有第一轮样本标签序列的特异性逆转录引物1，在透化后的待测细胞的细胞核中原位逆转录合成mRNA-cDNA杂合双链；
S30、提供Tn5转座子，在所述mRNA-cDNA杂合双链上添加接头；
S40、提供含有核酸外切酶和逆转录酶的逆转录酶反应体系，将添加接头反应之后多余的引物去除并补齐Tn5酶切产生的双链缺口；
S50、反应完成后，在微流控平台上构建含有过载的待测细胞的高通量微滴；
S60、利用特定预扩增引物对含有过载的待测细胞的高通量微滴进行文库预扩增，得到预文库；
S70、利用针对待测细胞的特异性引物2对所述预文库进行最终扩增并添加第二轮样本标签序列；
S80、将最终扩增产物回收后，得到所述的单细胞转录组测序文库。
图1所示即为本发明实施例一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法的流程示意图。
在一些实施方式中，所述Tn5转座子为Tn5蛋白与修饰后的寡核酸双链的结合体。其功能是结合cDNA-mRNA杂合链并插入测序接头。在mRNA-cDNA杂合双链上添加接头，避免使用连接反应添加测序接头，提高了反应效率。
在一些具体的实施方式中，所述修饰后的寡核酸双链核酸序列为5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’与Phos-C*T*G*T*C*T*C*T*T*A*T*A*C*A*C*A*T*C*/iInvdT/的退火产物。其中，碱基之间添加磷酸化修饰可防止寡核酸双链自身被Tn5切割。
在另一些具体的实施方式中，所述修饰后的寡核酸双链核酸序列为5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’与Phos-CTGTCTCTTATACACATC/iInvdT/的退火产物。
在一些具体的实施方式中，所述Tn5转座子为Tn5蛋白与所述核酸片段在转座子组装缓冲液中结合生成，具体结合方法参照已公开发表的文献(Picelli S,
AK,Reinius B,Sagasser S,Winberg G,Sandberg R.Tn5 transposase and tagmentationprocedures for massively scaled sequencing projects.Genome Res.2014；24(12):2033-2040.doi:10.1101/gr.177881.114)。
在一些实施方式中，所述特异性逆转录引物1包含针对待测细胞的384条逆转录引物，用于样本的第一轮标记。
在一些具体的实施方式中，所述逆转录引物的碱基序列中包含8bp的索引序列。
具体的，所述逆转录引物为5’-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT[8bpsample_idx1]NNNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’。
可选的，所述逆转录引物可适当增减碱基个数，但需要符合[TruseqR2]+[sample_idx]+[UMI]+[ployT]的模式。
在一些实施方式中，所述特异性引物2包含针对待测细胞的4条样本扩增引物，用于最终扩增时样本的第二轮标记。
具体的，4条特异性引物2序列如SEQ.ID.NO 1-SEQ.ID.NO 4所示：
SEQ.ID.NO 1：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAACGGCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
SEQ.ID.NO 2：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCTACCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
SEQ.ID.NO 3：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCGTTTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
SEQ.ID.NO 4：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGTAAGAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
在一些实施方式中，提供逆转录酶反应体系，利用外切酶和逆转录酶去除反应体系中可能残留的单链DNA分子，并补齐Tn5酶切后留下的缺口。
在一些实施方式中，步骤S50中，所述在微流控平台上构建含有过载的待测细胞的高通量微滴的具体步骤为：对多个样本计数后，按一定比例混合，在带有Nextera Read1捕捉序列的微流控平台上以过载的形式上机，构建含有过载的待测细胞的高通量微滴。
本发明实施例提供了一种在带有Nextera Read1捕捉序列的微流控平台上构建高通量细胞微滴的策略。对多个样本计数后，按一定比例混合，以过载的形式上机形成多细胞微滴，实现过载的细胞液滴包裹。
具体的，所述带有Nextera Read1捕捉序列的微流控平台为10×GenomicsChromium平台。
可选的，所述带有Nextera Read1捕捉序列的微流控平台为BioRad ddSEQ平台，或者Hydrop平台。
在一些实施方式中，所述特定预扩增引物核酸序列为illumina P5与部分TruseqR2。illumina P5的序列如SEQ.ID.NO 5所示：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3’
TruseqR2的序列如SEQ.ID.NO 6所示：5’-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
在一些实施方式中，可通过磁珠纯化回收步骤S80的扩增产物。
本发明实施例提供的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，所用到的试剂、酶、引物等，与上文所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建体系中一致；所用到的特异性逆转录引物1、特定预扩增引物以及特异性引物2与上文所述一致。
本发明实施例提出了一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，简化了转录组文库构建中cDNA扩增步骤，不需要第二链的合成，缩短了多样本高通量单细胞文库制备的实验流程；通过两轮标签序列的添加，实现了单芯片多倍过载上样，提高了单次反应检测的样品数量和细胞数量，降低了单细胞文库的制备成本。不仅如此，本发明还提出一组反应体系的溶液配制方法和反应程序，用以实现本发明。通过使用自主研发的反应试剂体系，降低了单细胞文库的制备成本，提高了反应效率和测序数据质量，单次反应可检测的细胞数量大大增加，具有较高的普遍适用性。
本发明实施例还提供一种用于多样本超高通量单细胞转录组测序文库构建的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建体系。该试剂盒包括上述的细胞固定液A、细胞透化液B、反应混合物C、反应混合物D、反应混合物E以及混合溶液F，提供了构建文库所需的全部试剂，极其方便，节省了溶液配制的时间，且标准化程度高，最大可能避免了人为因素的干扰，具有极高的普遍适用性。
基于上述试剂盒，本发明实施例还提供一种多样本超高通量单细胞转录组测序的方法，包括步骤：
S100、将待测细胞样本制备为单细胞悬液，以细胞固定液A固定细胞、细胞透化液B裂解细胞后，转移细胞核至含有样本特异性逆转录引物1的反应混合物C中，进行细胞核原位逆转录，合成mRNA-cDNA杂合双链；
S200、使用混合溶液F洗去残余的反应混合物C，转移细胞核至反应混合物D中，标记转录组mRNA-cDNA杂合双链序列并添加测序接头；
S300、使用混合溶液F洗去残余的反应混合物D，转移细胞核至反应混合物E中，利用外切酶和逆转录酶去除反应体系中残留的单链DNA分子，并补齐Tn5酶切后留下的缺口；
S400、使用混合溶液F洗去残余的反应混合物D，重悬细胞核并计数；
S500、对细胞进行捕获，使每个液滴里有一个或特定数目的细胞核；
S600、使用特定预扩增引物进行文库预扩增；
S700、使用针对待测细胞的特异性引物2和illumina P5引物进行文库的最终扩增和第二轮样本index标记。
在一些实施方式中，步骤S400中，以1×DNB溶液重悬细胞核并计数。
在一些实施方式中，步骤S500中，使用10×Genomics scATAC kit进行细胞捕获，使每个液滴里有一个或多个细胞核。
在一些实施方式中，步骤S600中，使用10×Genomics scATAC kit和特定预扩增引物进行文库预扩增。
可选的，10×Genomics scATAC kit可以替换为任何含有Nextera Read1捕获测序列的微流控平台试剂盒。
在一些实施方式中，所述特异性引物2包含针对待测细胞的4条样本扩增引物，用于最终扩增时样本的第二轮标记。4条特异性引物2序列如SEQ.ID.NO 1-SEQ.ID.NO 4所示。
在一些实施方式中，所述illumina P5引物核酸序列如SEQ.ID.NO 5所示：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-3’
在一些实施方式中，还可以通过变更逆转录引物序列和Tn5测序接头序列，应用于其他单细胞分选平台。
最终，本发明实施例提出一种细胞核原位Tn5酶切反应构建单细胞转录组文库的方法，以及Tn5测序接头序列和逆转录引物的碱基序列设计方案，用以在现有平台上低价实现多样品高通量单细胞转录组文库检测。不仅如此，本发明实施例还提出一组反应体系的溶液配制方法和反应程序，用以实现本发明。
下面通过具体实施例对本发明一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法做进一步的解释说明：
实施例1待测细胞的预处理
本实施例的目的是制备两个样本的超高通量单细胞转录组测序文库，样本1和样本2，每个样本检测15000个细胞，共计30000个细胞。
(1)制备单细胞核悬液
通过组织消化或流式分选分离单细胞，重悬在冷的PBS中。检测细胞浓度及活率，活率高于90％为宜。
(2)对细胞悬液进行固定和透化处理
a.配制溶液：
按照表1配制细胞固定液A：
表1
按照表2配制细胞透化液B：
表2
按照表3配制混合溶液F，并通过0.22μm滤膜过滤除菌：
表3
| 成分 | 体积(μl) | 终浓度 |
| 30％BSA(w/v) | 83.3μl | 0.5％ |
| 5M NaCl | 10μl | 10mM |
| 1M MgCl2 | 15 μl | 3mM |
| 1M Tris-HCl(pH＝8.0) | 50μl | 10mM |
| Ribolock Rnase inhibitor | 12.5μl | 0.1U/μl |
| 无核酸酶水 | 4.829ml | - |
b.样本1和样本2每个反应各吸取100万个细胞，在800g,4℃下离心3分钟，吸去培养基，加入1ml预冷的PBS-0.5％ BSA重悬；
c.在800g,4℃下离心3分钟收集细胞核，彻底吸去上清；
d.用1ml细胞固定液A重悬细胞核，轻轻吹打混匀，室温孵育7分钟；
e.在800g,4℃下离心3分钟，用200μl预冷的混合溶液F洗涤细胞核两次，彻底吸去上清；
f.用1ml预冷的PBS-0.5％BSA重悬细胞，计数，离心收集10万细胞/管；
e.用50μl细胞透化液B重悬细胞核，轻轻吹打混匀，冰上孵育3分钟；
f.加入1ml混合溶液F，10μl 10％Tween-20，颠倒混匀后1000g,4℃下离心10分钟收集细胞核。
实施例2细胞核原位逆转录反应
(1)配制溶液：
按照表4配制5×NaCl溶液，并通过0.22μm滤膜过滤除菌：
表4
| 成分 | 体积(μl) | 终浓度 |
| 1M Tris-HCl(pH＝8.0) | 1250μl | 250mM |
| 5M NaCl | 375μl | 375mM |
| 1M MgCl2 | 75μl | 15mM |
| 二硫苏糖醇 | 250μl | 50mM |
| 无核酸酶水 | 3.05ml | - |
按照表5配制反应混合物C：
表5
*每个样本应分为若干个反应，反应个数的设置取决于最终预期检测的细胞总数，一般情况下，最终获得的细胞数每增加5000个，则增设一个反应。本实施例中，每个样本分为3个反应。对于样本1和样本2的每一管反应，反应混合物C中应使用特异性逆转录引物1中不同的多个逆转录引物，含有不同的第一轮样本标签序列。
(2)分别以1 ml预冷的混合溶液F重悬样本1和样本2的细胞核；
(3)每个反应计数10万个细胞，将样本1和样本2分别分成3个反应，标记为1-1，1-2，1-3；2-1，2-2，2-3；共计6个反应；
(3)使用含有不同逆转录引物的100μl反应混合物C重悬细胞核，轻轻吹打混匀30次；
(4)将100μl逆转录反应混合物转移到新的PCR管中，在PCR仪中进行如下反应：25℃10 min,50℃10 min,3×[8℃12s,15℃45s,20℃45s,30℃30s,42℃2 min,50℃3 min],50℃5 min；
(5)反应结束后，将100μl逆转录反应混合物转移到新的1.5 ml管中，加入100μl预冷的混合溶液F，轻轻吹打混匀6-8次；
(6)在800g,4℃下离心3分钟，用200μl预冷的混合溶液F洗涤细胞核两次，彻底吸去上清。
实施例3细胞核原位标记转录组序列并添加测序接头
(1)配制溶液：
按照表6配制反应混合物D：
表6
按照表7配制反应终止液，并通过0.22μm滤膜过滤除菌：
表7
| 成分 | 体积(μl) | 终浓度 |
| 30％BSA(w/v) | 66μl | 2％ |
| 0.5 M EDTA | 40μl | 20mM |
| 1M Tris-HCl(pH＝8.0) | 20μl | 20mM |
| 无核酸酶水 | 874μl | - |
(2)对于每个反应，使用50μl反应混合物D重悬细胞核，轻轻吹打混匀30次；
(3)在37℃，800rpm下孵育半小时，进行反应；
(4)反应结束后，加入50μl反应终止液，轻轻吹打混匀6-8次；
(5)在800g,4℃下离心3分钟，用200μl预冷的混合溶液F洗涤细胞核两次，彻底吸去上清。
实施例4去除多余引物和补齐Tn5酶切产生的DNA缺口
(1)配制溶液：
按照表8配制反应混合物E：
表8
| 成分 | 体积(μl) | 终浓度 |
| dNTP | 2.5μl | 0.5mM |
| Maxima H minus reverse transcriptase | 1μl | 4U/μl |
| 5×NaCl溶液 | 10μl | 1× |
| EXO I | 5μl | 2U/μl |
| 无核酸酶水 | 30.5μl | - |
(2)每个反应使用50μl反应混合物E重悬细胞核，轻轻吹打混匀30次；
(3)在37℃，800rpm下孵育15min，进行反应；
(4)反应结束后，加入50μl预冷的混合溶液F，轻轻吹打混匀6-8次；
(5)在800g,4℃下离心3分钟，用200μl预冷的混合溶液F洗涤细胞核一次，彻底吸去上清。
实施例5构建高通量细胞微滴并进行文库预扩增
(1)使用100μl预冷的1×DNB-BSA溶液重悬细胞核，轻轻吹打混匀；
(2)分别取2μl细胞核悬液，加入8μl台盼蓝染液，显微镜下计数细胞核浓度；
样本1-1，1-2，1-3；2-1，2-2，2-3各取15000个细胞核，混合后吹打均匀。ka
(3)取5万个混合细胞核，做为一个液滴包被反应样本，按照10×Genomics scATACkit使用说明上机，但有一些修改：1)省略了使用10×ATAC酶的转座步骤(步骤1)；2)在样本索引PCR中，使用部分TruseqR2引物和illumina P5引物代替SI-PCR引物B和单个单索引N组A(步骤4.1)，用于生成过载的多细胞GEMs和获得预扩增文库。
实施例6最终文库扩增
(1)配制反应体系如下：
| 5μl | 样本扩增引物*(10μM) |
| 5μl | P5(10μM) |
| 50μl | Amp mix |
| 40μl | 纯化样品 |
*每个液滴包被反应对应一个特定样本扩增引物，含有特异的第二轮样本标签序列。特异性引物2提供4条不同的样本扩增引物。本实施例中，为一个液滴包被反应，故使用单一样本扩增引物。
(2)运行如下程序，72℃5min,98℃30s,6-8cycles of[98℃20s,63℃20s,72℃1min],72℃5min；
(3)使用1.2倍体积的VAHTS DNA Clean Beads纯化，最终溶解在TE溶液中。采用Qubit dsDNA定量试剂测定文库浓度，采用Agilent-2100分析仪检测文库分布。
实施例7测序
采用Illumina测序仪进行测序，模式为PE150加双端index；其中i7为细胞第二轮样本标签，测量8bp；Read1中含有8bp第一轮样本标签和10bp UMI序列；i5作为10x droplet标签测量16bp。测序数据量可根据细胞数及测序深度确定，可选的数据量为每个细胞100,000reads。
实施例8
按照实施例1-7所述的方法、试剂、引物等，对人293T细胞和鼠NIH3T3细胞混合细胞样本进行检测，在测序深度为每个细胞30K raw reads时，检测到有效barcode的reads比例为92.1％，细胞间污染率低于10％，单细胞基因中位数为2441，检测到UMI数为5261。
综上所述，本发明提供了一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，所述方法包括步骤：1)对待测细胞进行固定以及细胞膜透化；2)利用带有第一轮样本标签序列的特异性逆转录引物1在细胞核中原位逆转录合成mRNA-cDNA杂合双链；3)提供Tn5转座子，在所述mRNA-cDNA杂合双链上添加接头；4)提供含有核酸外切酶和逆转录酶的外切酶/逆转录酶反应体系，去除多余引物并补齐Tn5酶切产生的双链缺口；5)反应完成后，在微流控平台上构建高通量细胞微滴；6)利用特定预扩增引物进行文库预扩增；7)利用针对待测细胞的特异性引物2对文库进行最终扩增并添加第二轮样本标签序列；8)将最终扩增产物回收后，即得到所述的单细胞转录组测序文库。本发明提供的方法，简化了转录组文库构建中cDNA扩增步骤，不需要第二链的合成，缩短了实验流程；在mRNA-cDNA杂合双链上添加接头，避免使用连接反应添加测序接头，提高了反应效率；通过两轮标签序列的添加，实现了单芯片多倍过载上样，提高了单次反应检测的样品数量和细胞数量，降低了单细胞文库的制备成本。此外，本发明还缩短了实验流程，提高了反应效率和测序数据质量，单次反应可检测的样品个数和细胞数量大大增加，单细胞可检出基因数有了显著提高。不仅如此，本发明还提供一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建体系，使用自主研发的反应试剂体系，降低了单细胞文库的制备成本，具有较高的普遍适用性。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
对待测细胞进行固定，之后进行细胞膜透化；
利用带有第一轮样本标签序列的特异性逆转录引物1，在透化后的待测细胞的细胞核中原位逆转录合成mRNA-cDNA杂合双链；
提供Tn5转座子，在所述mRNA-cDNA杂合双链上添加接头；
提供含有核酸外切酶和逆转录酶的逆转录酶反应体系，将添加接头反应之后多余的引物去除并补齐Tn5酶切产生的双链缺口；
反应完成后，在微流控平台上构建含有过载的待测细胞的高通量微滴；
利用特定预扩增引物对含有过载的待测细胞的高通量微滴进行文库预扩增，得到预文库；
利用针对待测细胞的特异性引物2对所述预文库进行最终扩增并添加第二轮样本标签序列；
将最终扩增产物回收后，得到所述的单细胞转录组测序文库。
2.根据权利要求1所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述Tn5转座子为Tn5蛋白与修饰后的寡核酸双链的结合体。
3.根据权利要求2所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述修饰后的寡核酸双链为5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’与Phos-C*T*G*T*C*T*C*T*T*A*T*A*C*A*C*A*T*C*/iInvdT/的退火产物。
4.根据权利要求1所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述特异性逆转录引物1包含针对待测细胞的384条逆转录引物，用于样本的第一轮标记；所述特异性引物2包含针对待测细胞的4条样本扩增引物，用于最终扩增时样本的第二轮标记。
5.根据权利要求4所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述逆转录引物的碱基序列中包含8bp的索引序列。
6.根据权利要求1所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述在微流控平台上构建含有过载的待测细胞的高通量微滴的具体步骤为：对多个样本计数后，按比例混合，在带有Nextera Read1捕捉序列的微流控平台上以过载的形式上机，构建含有过载的待测细胞的高通量微滴。
7.一种多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建体系，其特征在于，所述体系包括细胞固定液A、细胞透化液B、反应混合物C、反应混合物D、反应混合物E以及混合溶液F；所述反应混合物C包含RNA酶抑制剂混合物、样本特异性逆转录引物1以及逆转录酶反应体系；所述反应混合物D包含Tn5转座子以及Tn5酶切反应体系；所述反应混合物E包含核酸外切酶、逆转录酶以及逆转录酶反应体系；所述混合溶液F包含Tris-HCl、氯化钠和氯化镁。
8.根据权利要求7所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建体系，其特征在于，所述Tn5转座子为Tn5蛋白与修饰后的寡核酸双链的结合体，所述修饰后的寡核酸双链为5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’与Phos-C*T*G*T*C*T*C*T*T*A*T*A*C*A*C*A*T*C*/iInvdT/的退火产物。
9.一种用于多样本超高通量单细胞转录组测序文库构建的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求7-8任一所述的多样本超高通量单细胞转录组测序文库的构建体系。
10.一种基于权利要求9所述试剂盒的多样本超高通量单细胞转录组测序的方法，其特征在于，包括步骤：
将待测细胞样本制备为单细胞悬液，以细胞固定液A固定细胞、细胞透化液B裂解细胞后，转移细胞核至含有样本特异性逆转录引物1的反应混合物C中，进行细胞核原位逆转录，合成mRNA-cDNA杂合双链；
使用混合溶液F洗去残余的反应混合物C，转移细胞核至反应混合物D中，标记转录组mRNA-cDNA杂合双链序列并添加测序接头；
使用混合溶液F洗去残余的反应混合物D，转移细胞核至反应混合物E中，利用外切酶和逆转录酶去除反应体系中残留的单链DNA分子，并补齐Tn5酶切后留下的缺口；
使用混合溶液F洗去残余的反应混合物D，重悬细胞核并计数；
对细胞进行捕获，使每个液滴里有一个或特定数目的细胞核；
使用特定预扩增引物进行文库预扩增；
使用针对待测细胞的特异性引物2和illumina P5引物进行文库的最终扩增和第二轮样本index标记。
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| CN117051481A (zh) * | 2023-10-13 | 2023-11-14 | 北京寻因生物科技有限公司 | 一种空间条形码芯片的制备方法及其应用 |
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