CN112779315A - 一种基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒及其应用 - Google Patents

一种基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒及其应用 Download PDF

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CN112779315A CN202110002457.6A CN202110002457A CN112779315A CN 112779315 A CN112779315 A CN 112779315A CN 202110002457 A CN202110002457 A CN 202110002457A CN 112779315 A CN112779315 A CN 112779315A
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张晓妮
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周书雄
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Abstract

本发明提供了一种基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒及其应用，属于基因测序技术领域。基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒，包括末端修复和加A用酶组合物、末端修复和加A的缓冲液、连接酶、连接酶缓冲液、接头、PCR扩增反应混合液和引物。所述试剂盒采用国产原材料试剂自行配制反应组分，缩短了货期，降低了缺货风险和建库成本，简化了反应程序，同时将末端修复反应体系和加A反应体系合并在一个体系中，缩减了反应时间，提高了出库率。因此，本发明提供了试剂盒在DNA文库构建或高通量测序中的应用。

Description

一种基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒及 其应用
技术领域
本发明属于基因测序技术领域，具体涉及一种基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒及其应用。
背景技术
二代测序(NGS)系统因其可同时进行大量平行测序反应而受到关注。虽然不同的二代测序平台在技术细节上有许多不同，但在测序前都需要建立DNA文库。所以获得合格的DNA文库是影响最终检测结果的重要因素。
目前，适用Illumina二代测序平台的建库试剂盒主要由Illumina、Roche、NEB等进口厂商提供。上述试剂盒构建文库的主要流程包括：对游离DNA末端补平、加A反应；连接接头；磁珠捕获片段；PCR富集，磁珠纯化PCR产物即可出库。但是这些构建文库试剂盒存在缺陷，例如货期长，缺货风险大和建库成本高等，导致测序时间受限制和成本大幅上升。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新的、成本低、国产的用于基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒及其应用，可以降低建库成本的同时保证测序时间。
本发明提供了一种基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒，包括末端修复和加A用酶组合物、末端修复和加A的缓冲液、连接酶、连接酶缓冲液、接头、PCR扩增反应混合液和引物。
优选的，所述末端修复和加A用酶组合物包括T4多聚核苷酸激酶、T4DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和Klenow片段；所述T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为0.1～0.5U/μL；
所述T4 DNA聚合酶的工作浓度为0.04～0.1U/μL；
所述Taq DNA聚合酶的工作浓度为0.025～0.075U/μL；
所述Klenow片段的工作浓度为0.005～0.02U/μL。
优选的，所述末端修复和加A的缓冲液包括Tris-HCl、MgCl2、DTT(二硫苏糖醇)、ATP、dNTP、dATP、PEG8000和水；
优选的，所述Tris-HCl的工作浓度为50～100mM；
所述MgCl2的工作浓度为10～20mM；
所述DTT的工作浓度为5～10mM；
所述ATP的工作浓度为2～5mM；
所述dNTP的工作浓度为0.1～1mM；
所述dATP的工作浓度为1～10mM；
所述PEG8000的工作质量浓度为1％～10％。
优选的，所述连接酶为T4 DNA连接酶；
所述T4 DNA连接酶的工作浓度为15～60U/μL。
优选的，所述连接酶缓冲液包括Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP和PEG 8000；
优选的，所述Tris-HCl的工作浓度为30～100mM；
所述MgCl2的工作浓度为5～20mM；
所述DTT的工作浓度为0.5～2mM；
所述ATP的工作浓度为0.5～2mM；
所述PEG 8000的工作质量浓度为5％～15％。
优选的，所述PCR扩增反应混合液为VAHTS HiFi Amplification Mix；
所述引物优选为UDI Primer Mix。
本发明提供了所述试剂盒在DNA文库构建或高通量测序中的应用。
本发明提供了一种基于所述试剂盒的DNA文库构建方法，包括以下步骤：
1)将血液样本提取的游离DNA与所述末端修复和加A用酶组合物、末端修复和加A的缓冲液混合进行末端修复和加A反应，得到末端修复和加A产物；
2)将所述末端修复和加A产物、接头、连接酶和连接酶缓冲液混合进行连接接头，得到带接头产物；
3)将所述带接头产物经纯化后，与PCR扩增反应混合液混合，用引物进行扩增，得到扩增产物，再次纯化，得到DNA文库。
优选的，步骤1)中末端修复和加A反应的反应条件为先20～37℃保持10～20min，再70～75℃保持10～30min，4℃保存；
所述末端修复和加A反应的反应体系优选为50μL，包含1～100ng游离DNA、工作浓度的末端修复和加A用酶组合物和末端修复和加A的缓冲液。
优选的，步骤2)中连接接头的反应条件先在20～25℃保持10～30min后再在4℃条件保存或16℃过夜；
步骤3)中所述扩增的反应条件优选为95～98℃保持45s～180s；95～98℃保持10～30s，55～60℃保持10～30s，70～75℃保持30～50s，4～12个循环；70～75℃保持5～10min；4℃保存。
本发明提供的基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒，包括末端修复和加A用酶组合物、末端修复和加A的缓冲液、连接酶、连接酶缓冲液、接头、PCR扩增反应混合液和引物。本发明所述试剂盒中试剂为采用国产药品自行人工配制，大大降低了试剂盒的生产成本以及后续文库构建成本，且所述试剂的制备容易，试剂盒的生产周期短，避免了货期长和缺货的风险。
进一步的，本发明提供的所述试剂盒具体限定了各试剂的成分和含量。本发明将末端修复反应用试剂和加A反应用试剂合并在一个体系中，缩减了反应时间，提高了出库率。
具体实施方式
本发明提供了一种基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒，包括末端修复和加A用酶组合物、末端修复和加A的缓冲液、连接酶、连接酶缓冲液、接头、PCR扩增反应混合液和引物。
本发明提供的试剂盒包括末端修复和加A用酶组合物。所述末端修复和加A用酶组合物优选包括T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和Klenow片段。本发明对所述末端修复和加A用酶组合物中各种酶的酶活力没有特殊限制，优选高于各种酶的工作浓度，以便后续使用时进行稀释使用。所述T4多聚核苷酸激酶的工作浓度优选为0.1～0.5U/μL，更优选为0.2～0.4U/μL，最优选为0.3U/μL。所述T4 DNA聚合酶的工作浓度优选为0.04～0.1U/μL，更优选为0.06～0.08U/μL，最优选为0.07U/μL。所述Taq DNA聚合酶的工作浓度优选为0.025～0.075U/μL，更优选为0.04～0.06U/μL，最优选为0.05U/μL。所述Klenow片段的工作浓度优选为0.005～0.02U/μL，更优选为0.01～0.015U/μL，最优选为0.012U/μL。本发明对所述T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和Klenow片段的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的上述酶和Klenow片段的来源即可。
本发明提供的试剂盒包括末端修复和加A的缓冲液。在本发明中，所述末端修复和加A的缓冲液优选包括Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP、dNTP、dATP、PEG8000和水。本发明对所述Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP、dNTP、dATP、PEG8000的浓度不做具体限定，优选高于各试剂的工作浓度即可，以便后续使用时进行稀释使用。所述Tris-HCl的工作浓度优选为50～100mM，更优选为60～80mM，最优选为70mM。所述MgCl2的工作浓度优选为10～20mM，更优选为12～18mM，最优选为15mM。所述DTT的工作浓度优选为5～10mM，更优选为6～9mM，最优选为8mM。所述ATP的工作浓度优选为2～5mM，更优选为3～4mM，最优选为3.5mM。所述dNTP的工作浓度优选为0.1～1mM，更优选为0.2～0.8mM，最优选为0.5mM。所述dATP的工作浓度优选为1～10mM，更优选为2～8mM，最优选为5mM。所述PEG8000的工作质量浓度优选为1％～10％，更优选为2％～8％，最优选为5％。本发明对所述Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP、dNTP、dATP、PEG8000的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP、dNTP、dATP、PEG8000来源即可。
本发明提供的所述试剂盒包括连接酶。本发明对所述连接酶的种类不做具体限定，采用本领域所熟知的链接酶即可。所述连接酶优选为T4 DNA连接酶。所述T4 DNA连接酶的工作浓度为15～60U/μL。本发明对所述连接酶的来源不做具体限定，采用本领域所熟知的连接酶来源即可。
本发明提供的所述试剂盒包括连接酶缓冲液。所述连接酶缓冲液优选包括Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP和PEG8000。本发明对所述Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP和PEG8000的浓度不做具体限定，优选高于各试剂的工作浓度即可，以便后续使用时进行稀释使用。所述Tris-HCl的工作浓度优选为30～100mM，更优选为40～80mM，最优选为50mM。所述MgCl2的工作浓度优选为5～20mM，更优选为10～15mM，最更优选为12mM。所述DTT的工作浓度优选为0.5～2mM，更优选为1～1.5mM，最优选为1.2mM。所述ATP的工作浓度优选为0.5～2mM，更优选为1～1.5mM，最优选为1.2mM。所述PEG8000的工作质量浓度优选为5％～15％，更优选为8％～12％，更优选为10％。
本发明所述试剂盒包括PCR扩增反应混合液。所述PCR扩增反应混合液优选为VAHTS HiFi Amplification Mix。所述VAHTS HiFi Amplification Mix的工作浓度为1×。
本发明所述试剂盒包括引物。所述引物优选为UDI Primer Mix。
本发明所述试剂盒包括接头。所述接头优选为Unique Dual Index Adapters。
在本发明中，所述试剂盒的制备方法，优选包括将上述各试剂配制后分装。本发明对所述配制的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的配制方法即可。所述分装优选将上述各试剂独立分装，一种试剂分装在一个试剂瓶中。
本发明提供了所述试剂盒在DNA文库构建或高通量测序中的应用。所述DNA文库构建或高通量测序均是针对Illumina测序平台进行的文库构建和高通量测序。
本发明提供了一种基于所述试剂盒的DNA文库构建方法，包括以下步骤：
1)将血液样本提取的游离DNA与所述末端修复和加A用酶组合物、末端修复和加A的缓冲液混合进行末端修复和加A反应，得到末端修复和加A产物；
2)将所述末端修复和加A产物、接头、连接酶和连接酶缓冲液混合进行连接接头，得到带接头产物；
3)将所述带接头产物经纯化后，与PCR扩增反应混合液混合，用引物进行扩增，得到扩增产物，再次纯化，得到DNA文库。
本发明将血液样本提取的游离DNA与所述末端修复和加A用酶组合物、末端修复和加A的缓冲液混合进行末端修复和加A反应，得到末端修复和加A产物。
在本发明中，所述提取的游离DNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取血液中游离DNA的方法即可。所述末端修复和加A反应的反应条件优选为先20～37℃保持10～20min，再70～75℃保持10～30min，4℃保存；更优选为先28℃保持15min，再73℃保持20min，4℃保存。所述末端修复和加A反应的反应体系优选为50μL，包含1～100ng游离DNA、工作浓度的末端修复和加A用酶组合物和末端修复和加A的缓冲液。所述反应体系中游离DNA的质量优选为40～60ng，更优选为50ng。本发明将末端修复和加A步骤合并成一步，有利于减少文库的操作，缩短文库构建的时间。
得到末端修复和加A产物后，本发明将所述末端修复和加A产物、接头、连接酶和连接酶缓冲液混合进行连接接头，得到带接头产物。
在本发明中，在连接接头的体系中接头的工作浓度优选为0.1μM～1μM，更优选为0.2～0.8μM，更优选为0.5μM。在连接接头的体系中，连接酶和连接酶缓冲液的浓度为工作浓度，在此不做赘述。连接接头的反应条件优选先在20～25℃保持10～30min后再在4℃条件保存或16℃过夜；更优选为先在22℃保持20min后再在4℃条件保存。
得到带接头产物后，本发明将所述带接头产物纯化后，与PCR扩增反应混合液混合，用引物进行扩增，得到扩增产物，再次纯化，得到DNA文库。
在本发明中，所述纯化和再次纯化均优选进行磁珠分离纯化。所述磁珠分离用溶剂为磁珠分选液。本发明对所述磁珠分选液的来源不做具体限定，采用本领域常规的纯化DNA片段的磁珠分选液即可。在本发明实施例中，所述磁珠分选液采用申请号CN202010042158.0的专利中记载的磁珠分选液(HP Pure Beads)。
在本发明中，所述扩增的反应条件优选为95～98℃保持45s～180s；95～98℃保持10～30s，55～60℃保持10～30s，70～75℃保持30～50s，4～12个循环；70～75℃保持5～10min；4℃保存；更优选为95℃保持180s；98℃保持20s，60℃保持15s，72℃保持30s，5个循环；72℃保持5min；4℃保存。所述扩增的反应体系优选为50μl，包含5μl引物，PCR扩增反应混合液25μl，带接头产物20μl。
在本发明中，采用本发明提供的试剂盒构建的游离DNA文库产量明显高于常规进口试剂盒，可以完全可以替代进口文库构建试剂盒。
下面结合实施例对本发明提供的一种基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明中涉及的名词解释如下：
NGS，高通量测序技术(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术("Next-generation"sequencing technology)，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。
实施例1
基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒，包括以下试剂：
末端修复和加A用酶组合物：包括T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和Klenow片段；其中T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为0.3U/μL；T4 DNA聚合酶的工作浓度为0.08U/μL；Taq DNA聚合酶的工作浓度为0.05U/μL；Klenow片段的工作浓度为0.01U/μL；
末端修复和加A的缓冲液：包括Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP、dNTP、dATP、PEG8000和水；其中Tris-HCl的工作浓度为50mM；MgCl2的工作浓度为15mM；DTT的工作浓度为8mM；ATP的工作浓度为3mM；dNTP的工作浓度为0.5mM；dATP的工作浓度为5mM；PEG8000的工作质量浓度为5％。
连接酶为T4 DNA连接酶；T4 DNA连接酶的工作浓度为35U/μL；
连接酶缓冲液：包括Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP和PEG8000；Tris-HCl的工作浓度为70mM；MgCl2的工作浓度为13mM；DTT的工作浓度为1.2mM；ATP的工作浓度为1.0mM；PEG8000的工作质量浓度为10％；
接头：IDT接头，工作浓度为0.3μL；
PCR扩增反应混合液：1×VAHTSHiFiAmplificationMix；
引物：UDIPrimerMix，工作浓度为0.4μL。
实施例2
1.本实施例样本为临床样本，临床样本的来源及编号如表1所示，采用Qubit3.0对DNA进行定量，结果见表1。
表1临床样本的DNA定量结果
样本编号 样本姓名 投入量(ng)
01 何某 104.3
02 郑某 116
03 胡某 101
04 王某 108
2.准备工作
取出本发明提供的试剂盒，并确定试剂在有效期内。
从4℃冰箱取出纯化DNA所用的磁珠为HPPureBeads(202010042158.0)，室温平衡至少30min再使用。
从-20℃冰箱内取出建库试剂，置于冰盒上解冻，待用。
3.文库构建方法
3.1片段化末修加A反应
提前设置PCR仪，PCR仪进行如下反应程序(将热盖温度设置至70℃)。
表2片段化末修加A反应的反应程序
步骤 温度 时间
0 4℃ 保持
1 4℃ 1min
2 20℃ 10min
3 72℃ 10min
4 4℃ 保持
配制反应体系，进行PCR反应(整个配制过程需要在冰盒上进行)，按下表3所述各组份单次反应用量，在200μLPCR管中准备反应体系。
表3片段化末修加A反应的反应体系
组份 体积(μL)
末修加A缓冲液 10
末修加A酶组合物 3
1～100ngDNA X
Nuclease-freeH<sub>2</sub>O 35.5～X
总计 50
用移液器轻柔吸打6～8次混匀(注意不要涡旋混匀)。
将离心管瞬时离心后，立即放入预冷至4℃的PCR仪中，进入反应程序。
当PCR仪中反应程序结束，样品温度降至4℃时，将样品取出并立即置于冰上。
3.2接头连接
配制连接反应体系见表4。
表4连接反应体系
成分 1个反应体系(μL)
连接缓冲液 20
T4 DNA连接酶 5
ddH<sub>2</sub>O 20
总计 45
最后向样本管加入45μL接头连接反应体系及5μLIDT接头。用移液器吸打混匀后瞬时离心。置PCR仪中20℃反应15min(注意不要启动热盖)。
3.3接头连接反应结束后，开始DNA纯化，步骤如下：
1)加入80μL充分混匀的磁珠至连接产物中，混匀离心。
2)室温孵育10min后上架吸附，弃去上清。
3)用500μL80％乙醇洗涤磁珠，弃去上清。重复本洗涤步骤一次。
4)将离心管取下磁力架，开盖干燥至磁珠表面不反光。注意过分干燥会导致DNA洗脱效率降低。
每个样本管内加入22μLNuclease-Freewater，重悬浮磁珠，充分混匀后室温静置5min。
准备一批新的0.2mLPCR管，管盖管壁标注对应的样本编号。
将样本管置于磁力架，进行磁珠吸附，直至溶液澄清后，将上清液转移至对应编号的PCR管中，作为PCR实验的模板。
配制QubitBuffer199μL，加入1μLDNA样本，涡旋混匀，避光静置2min，测试浓度，见表5。
表5各样本的DNA浓度
Figure BDA0002882061420000091
Figure BDA0002882061420000101
3.4 Pre-PCR扩增
3.4.1按照表6配制Pre-PCR扩增反应体系。
表6 Pre-PCR扩增反应体系
成分 1个反应体系
VAHTSHiFiAmplificationMix 25μL
UDIPrimerMix 5μL
Totalmastermix 30μL
3.4.2按照表7所示设置PCR扩增过程温度和时间参数。
表7 Pre-PCR扩增过程温度和时间参数
Figure BDA0002882061420000102
3.4.3 Pre-PCR反应结束后，开始进行DNA纯化，具体步骤如下：
1)准备一批新的1.5mL离心管，管盖管壁标注对应的样本编号，加入50μL混合均匀的磁珠，充分涡旋混匀后，室温静置10min。
2)将1.5mL样本管置于磁力架上，进行磁珠吸附，直至溶液澄清(一般等待1～2min)。
3)小心移除上清液(为避免吸入磁珠，可以在管底留存20μL上清液)，再加入500μL80％乙醇，180℃旋转离心管使磁珠穿过溶液吸至另一侧管壁，旋转2～3次，或上下颠倒混匀6～8次，静置15s后弃上清液。(此过程，离心管一直保持在磁力架上。)
4)重复步骤3)一次。
5)将离心管自磁力架上取下，快速离心，然后置于磁力架上再次分离、移除残留的酒精溶液。将离心管自磁力架上取下，打开管盖，常温下干燥磁珠，挥发乙醇，以免过多乙醇影响后续反应体系中酶的效果。(注：磁珠的干燥在室温下进行，一般等到磁珠表面无反光或是裂开一两条缝即可，此过程需等待2～3min；应避免磁珠过干，磁珠过干会导致DNA回收损失极大。)
6)每个1.5mL样本管内加入22μLNuclease-Freewater，充分混匀后室温静置5min。
7)将1.5mL样本管置于磁力架上，进行磁珠吸附，直至溶液澄清后，将上清液转移至对应的新的写有样本信息的1.5mL离心管，并用qubit3.0定量。定量结果见表8。
表8使用本发明试剂盒构建的文库和商品试剂盒构建的文库产量对比
样本编号 文库总量(ng) Roche试剂盒文库产量(ng)
01 1728 1620
02 1824 1672
03 1736 1408
04 1804 1248
对构建的文库中主条带(280～350bp)分布进行统计，结果见表9。
表9使用本发明试剂盒构建的文库和商品试剂盒构建的文库主条带情况
样本编号 主条带(bp) Roche试剂盒文库主条带bp
01 311 309
02 313 310
03 313 314
04 309 310
由表9可知，本发明提供的试剂盒制备的文库与商品试剂盒构建的文库主片段较为一致，说明构建的文库符合测序要求。同时由表8和可知，本发明提供的试剂盒文库产量明显高于常规进口试剂盒，可以替代进口商品试剂盒。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于Illumina测序平台的游离DNA文库构建用试剂盒，其特征在于，包括末端修复和加A用酶组合物、末端修复和加A的缓冲液、连接酶、连接酶缓冲液、接头、PCR扩增反应混合液和引物。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述末端修复和加A用酶组合物包括T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和Klenow片段；所述T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为0.1～0.5U/μL；
所述T4 DNA聚合酶的工作浓度为0.04～0.1U/μL；
所述Taq DNA聚合酶的工作浓度为0.025～0.075U/μL；
所述Klenow片段的工作浓度为0.005～0.02U/μL。
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述末端修复和加A的缓冲液包括Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP、dNTP、dATP、PEG 8000和水；
优选的，所述Tris-HCl的工作浓度为50～100mM；
所述MgCl2的工作浓度为10～20mM；
所述DTT的工作浓度为5～10mM；
所述ATP的工作浓度为2～5mM；
所述dNTP的工作浓度为0.1～1mM；
所述dATP的工作浓度为1～10mM；
所述PEG 8000的工作质量浓度为1％～10％。
4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述连接酶为T4 DNA连接酶；
所述T4 DNA连接酶的工作浓度为15～60U/μL。
5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述连接酶缓冲液包括Tris-HCl、MgCl2、DTT、ATP和PEG 8000；
优选的，所述Tris-HCl的工作浓度为30～100mM；
所述MgCl2的工作浓度为5～20mM；
所述DTT的工作浓度为0.5～2mM；
所述ATP的工作浓度为0.5～2mM；
所述PEG 8000的工作质量浓度为5％～15％。
6.根据权利要求1～5任意一项所述试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增反应混合液为VAHTS HiFiAmplificationMix；
所述引物优选为UDI PrimerMix。
7.权利要求1～6任意一项所述试剂盒在DNA文库构建或高通量测序中的应用。
8.一种基于权利要求1～6任意一项所述试剂盒的DNA文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将血液样本提取的游离DNA与所述末端修复和加A用酶组合物、末端修复和加A的缓冲液混合进行末端修复和加A反应，得到末端修复和加A产物；
2)将所述末端修复和加A产物、接头、连接酶和连接酶缓冲液合进行连接接头，得到带接头产物；
3)将所述带接头产物纯化后，与PCR扩增反应混合液混合，用引物进行扩增，得到扩增产物，再次纯化，得到DNA文库。
9.根据权利要求8所述DNA文库构建方法，其特征在于，步骤1)中末端修复和加A反应的反应条件为先20～37℃保持10～20min，再70～75℃保持10～30min，4℃保存；
所述末端修复和加A反应的反应体系优选为50μL，包含1～100ng游离DNA、工作浓度的末端修复和加A用酶组合物和末端修复和加A的缓冲液。
10.根据权利要求8所述DNA文库构建方法，其特征在于，步骤2)中连接接头的反应条件先在20～25℃保持10～30min后再在4℃条件保存或16℃过夜；
步骤3)中所述扩增的反应条件优选为95～98℃保持45s～180s；95～98℃保持10～30s，55～60℃保持10～30s，70～75℃保持30～50s，4～12个循环；70～75℃保持5～10min；4℃保存。
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