CN111378632B - cfDNA末端修复的酶组合物、缓冲液试剂和测序文库的构建方法 - Google Patents

cfDNA末端修复的酶组合物、缓冲液试剂和测序文库的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了cfDNA末端修复酶组合物，包括如下几种酶：使cfDNA在dNTP存在下进行DNA双链修复及3’端加A的酶Ⅰ，所述的酶Ⅰ为Taq DNA聚合酶及Klenow Fragment，Exo‑；使cfDNA 5’端发生磷酸化修饰的酶Ⅱ，所述的酶Ⅱ为T4多聚核苷酸激酶（T4 Polynucleotide Kinase，简称T4 PNK）。本发明还提供了一种cfDNA末端修复缓冲液试剂。本发明还提供了使用上述的试剂进行cfDNA末端修复和构建cfDNA测序文库的方法。本发明具有如下技术效果：本发明的试剂酶用量少，成本低，且具有意想不到的更高的修复效率，适用于样本量较低的cfDNA进行末端修复。

Description

cfDNA末端修复的酶组合物、缓冲液试剂和测序文库的构建 方法
技术领域
本发明涉及一种cfDNA末端修复的酶组合物、缓冲液试剂和测序文库的构 建方法，属于生物技术领域。
背景技术
血浆游离DNA(circulating cell free DNA,cfDNA)是一种细胞外游离于体 液中的DNA，cfDNA片段大小在150-400bp之间。cfDNA测序广泛应用于肿瘤 疾病的诊断，产前筛查。鉴于血液中cfDNA含量较少，而且片段较短，限制了 高通量测序的测序深度。
因此，有必要通过提高cfDNA的末端修复及加A效率，保证建库效率，高 通量测序数据能够覆盖到所有cfDNA，提高测序数据的真实性及可靠性。
中国专利CN201480062608.5提供了一种用于DNA末端修复、腺苷酸化、 磷酸化的酶组合物，所述组合物包含缺乏5'-3'和3'-5'外切核酸酶活性的经修饰 的Taq DNA聚合酶，其与T4 DNA聚合酶、Klenow片段和T4多核苷酸激酶和 所有其它必要的组分包括反应缓冲液和三磷酸核苷预混，其为在一个管内并经两 个步骤进行DNA钝化、磷酸化和单核苷酸延伸反应所需。
中国专利CN201610040334.0公开了一种采用一步法进行DNA末端修复/加 dA的方法及应用，具体涉及一种采用一步法进行DNA末端修复/加dA的方法 及其应用，所述方法采用T4DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶 的混合酶系。
国际申请PCT/CN2016/106609(国际公布号：WO 2018/090373 A1)公开 了一种DNA末端修复与加A的方法，该方法包括：在同一反应体系中，在dNT P存在下，利用聚合酶将片段化DNA的末端补平或切平，利用多聚核苷酸激酶 将5’羟基转变成5’磷酸基团且将3’磷酸基团转变成3’羟基；在过量dATP存在下， 利用不具有3’-5’外切活性的聚合酶在双链DNA3’末端加上dATP。
上述专利都存在着一些不足，如酶用量较多，成本较高，或者不适用于样本 量较低的cfDNA进行末端修复。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题：提供一种新的 cfDNA末端修复的酶组合物以及缓冲液试剂，来提高cfDNA末端平齐化及双链 DNA 3’端加A效率。
本发明的技术构思如下：
现有技术中DNA片段的末端修复可以使用klenow fragment、T4 DNA Polymerase、Taq DNA polymerase、T4 Polynucleotide Kinase、Klenow Fragment， Exo-。其中KlenowFragment保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性和3'→5' 外切酶活性，但缺少完整的Klenow酶的5'→3'外切酶活性。T4 DNA Polymerase 具有3'→5'外切酶活性，但不具有5'→3'外切酶活性，用于末端平齐化。由于 Klenow Fragment，Exo-没有外切酶活性，其在末端补平时经常会在3'末端额外加 上1个或多个核苷酸，用于加A。Taq DNA polymerase具有5'→3'聚合酶活性， 形成3’端带A的产物。cfDNA完整性较物理打断的基因组DNA高，末端修复 酶混合液可在此基础上进行缩减。
本研究选择Klenow Fragment，Exo-、Taq DNA Polymerase、T4 PolynucleotideKinase进行末端修复、5’端磷酸化修饰及3’端加A。经过末端平齐化的cfDNA 3’ 端添加碱基A，以获得具有粘性末端A的cfDNA片段。末端平齐化所需的四种 脱氧核糖核苷三磷酸很少，末端平齐化后通过Klenow Fragment，Exo-为DNA 双链的3’端添加碱基A，所以反应体系中dATP浓度对于cfDNA 3’端加A效率 影响较大。
另外，发明人在研究上述问题时，在调整cfDNA末端修复缓冲液的过程中 发现，改变缓冲液中三磷酸核苷dATP、dTTP、dCTP和dGTP比例时，末端修 复效率会发生改变，dATP浓度会影响双链DNA 5’端加A效率。基于上述发现， 发明人提高末端修复缓冲液中dATP在其他三种脱氧核糖核苷三磷酸的占比，而 不是同时加入四种等量的脱氧核糖核苷三磷酸，从而完成本发明。
本发明的技术方案如下：
cfDNA末端修复酶组合物，其特征在于，包括如下几种酶：
使cfDNA在dNTP存在下进行DNA双链修复及3’端加A的酶Ⅰ，所述的 酶Ⅰ为Taq DNA聚合酶及Klenow Fragment，Exo-；
使cfDNA 5’端发生磷酸化修饰的酶Ⅱ，所述的酶Ⅱ为T4多聚核苷酸激酶 (T4Polynucleotide Kinase，简称T4 PNK)。
优选地，
每50μL反应体系中含有：T4多聚核苷酸激酶2.5U；Klenow Fragment， Exo-1U；TaqDNA聚合酶3U。
本发明的cfDNA末端修复缓冲液试剂，包括Tris-Hcl、MgCl2、DTT、ATP、 dATP、dGTP、dCTP和dTTP，其中的dATP浓度是dGTP、dCTP和dTTP各成 分的浓度的5-10倍。
优选地，每50微升反应体系中，末端修复缓冲液试剂的组分和含量如下：1 00-105mM Tris-Hcl，18-20mM MgCl2，15-20mM DTT、18-20mM KCl、0.05-1％ NP40、0.05-1％Tween 20、1.5-2.5mM ATP、0.2-0.5mM dGTP、0.2-0.5mM dCTP和0.2-0.5mM dTTP。
更优选地，末端修复时，每50ul反应体系中加入5ul的10×末端修复缓冲液， 所述的10×末端修复缓冲液试剂的组分和含量如下：
组分 含量
Tris-Hcl(pH8.3) 1M
MgCl<sub>2</sub> 0.2M
DTT 0.2M
KCl 0.2M
ATP 20mM
dATP 20mM
dTTP 2mM
dCTP 2mM
dGTP 2mM
NP40 0.7％v/v
Tween-20 0.7％v/v
本发明还提供了含有上述酶组合物以及上述缓冲液试剂的cfDNA末端修复 试剂。
本发明还提供了含有上述cfDNA末端修复试剂的cfDNA末端修复试剂盒。
本发明还提供了含有上述cfDNA末端修复试剂的cfDNA建库试剂盒。
使用上述cfDNA末端修复试剂进行cfDNA末端修复的方法，具体方法如下： 在末端修复缓冲液试剂中用末端修复酶组合物处理cfDNA以产生末端平齐化且 3’端加A的cfDNA；
所述的末端修复反应体系的pH值为8.0～8.3左右；
所述的反应条件为先在35～40℃反应10～15min；然后在60～70℃反应10～15min。
优选地，所述的反应条件为先在37℃反应10min，然后在65℃反应15min。
使用上述cfDNA末端修复试剂进行适用于MGI测序平台的cfDNA测序文 库的构建方法，包括如下步骤：
1)在末端修复缓冲液试剂中用末端修复酶组合物处理cfDNA以产生5’端 磷酸化且3’端加A的cfDNA；
2)末端修复产物接头连接反应，在末端修复体系中直接加入MGI接头、T 4连接酶及T4连接Buffer，进行接头连接；
3)接头连接产物进行磁珠纯化，去除反应体系中的酶、盐离子及残余接头；
4)使用高保真DNA聚合酶，对连接产物进行富集，反应结束后磁珠纯化。
所述的步骤1)中，
末端修复反应体系的pH值为8.0-8.3左右；
反应条件为先在35～40℃反应10～15min；然后在60～70℃反应10～15 min。
优选地，
所述的步骤1)中，反应条件为先在37℃反应10min，然后在65℃反应15 min。
本发明的技术方案提供了多个技术贡献：
与中国专利CN201480062608.5相比，现有专利的末端修复酶体是由4种酶 组合物，分别是T4多核苷酸激酶，T4 DNA聚合酶，klenow fragment及mod-Tbr DNA聚合酶。而本发明使用的末端修复酶混合物由三种酶组成，分别是1)T4 PNK，2)Klenow Fragment，Exo及3)Taq DNA聚合酶。cfDNA浓度较低，针 对该类样本建库时所需末端修复酶量较少，本发明在减少混合酶组分的同时，减 少酶的用量，大大降低反应成本。
与中国专利CN201610040334.0相比，由于血浆中cfDNA浓度较低，基因组 DNA样本量相对较高，这两类样本在进行末端修复时所需的酶量不同，同时物 理打断的基因组DNA，缺刻及断裂区域较多，对具有5’-3’聚合酶活性的这类酶 需求度较高，dNTP底物消耗率较高。本发明中，cfDNA基因组序列较为完整， 对5’端磷酸化修饰及3’端加A这些酶的需求度较高。同时本发明设计的末端修 复程序为37℃10min，65℃15min，末端修复时间为25min，较基因组DNA的末 端修复时间更短。
与国际申请PCT/CN2016/106609(国际公布号：WO 2018/090373 A1)相 比，现有专利提及的方案用于完整基因组建库，末端修复体系中包含片段化试剂， 现有专利的方案不适用于样本量较低的cfDNA进行末端修复。本发明中，cfD NA片段大小在150-400bp之间，无需片段化处理，提取的cfDNA只需使用末端 修复酶反应混合液的作用下，进行末端平齐化及3’端加A反应。本发明将cfDN A在同一反应管中进行在末端修复，完成cfDNA片段的末端平齐化，5’端磷酸 化修饰以及3’端加A反应，反应结束后无需纯化，即可加入含接头的连接反应 体系，cfDNA两端加上接头。
本发明具有如下技术效果：本发明的试剂酶用量少，成本低，且具有意想不 到的更高的修复效率，适用于样本量较低的cfDNA进行末端修复。
附图说明
图1为实施例2中实验一的电泳结果图。图中泳道M为DNA分子量标记 (DNAmarker)。
图2为实施例2中实验二的电泳结果图。图中泳道M为DNA分子量标记 (DNAmarker)。
图3为实施例2中实验三的电泳结果图。图中泳道M为DNA分子量标记(DNAmarker)。
具体实施方式
本发明所用的试剂购自康为世纪。
实施例1 cfDNA建库
cfDNA建库，包括如下步骤：
一、末端修复
每50微升反应体系中，使用末端修复缓冲液试剂为10×End Repair ReactionBuffer，其组分和含量如下：
组分 含量
Tris-Hcl(pH8.3) 1M
MgCl<sub>2</sub> 0.2M
DTT 0.2M
KCl 0.2M
ATP 20mM
dATP 20mM
dTTP 2mM
dCTP 2mM
dGTP 2mM
NP40 0.7％v/v
Tween-20 0.7％v/v
每50微升反应体系中，末端修复酶组合物的组分和含量如下：
组分 含量
T4 Polynucleotide Kinase 2.5U
Klenow exo- 1U
Taq DNA Polymerase 3U
甘油 50％v/v
MgCl<sub>2</sub> 10mM
Tris-Hcl 70mM
末端修复包括如下步骤：
1、取1ng游离DNA于PCR管中，体积应≤42μL，不足42μL用水补平,在 PCR管中配制如下末端修复反应混合液：
Figure BDA0002417256090000061
Figure BDA0002417256090000071
2、震荡混匀5s，瞬时离心将反应液收集至管底；
3.将含有上一步反应混合液的PCR管置于PCR仪上，如下条件反应：
温度 时间
热盖 66℃
37℃ 10min
65℃ 15min
4℃ Hold
二、接头连接，包括如下步骤：
1、向上一步PCR管中加入以下连接反应混合液；
组分 体积
T4 DNA Ligase Buffer 14μL
T4 DNA ligase 4μL
Adaptor 5μL
Nuclease-free Water 7μL
Total 80uL
2、震荡混匀10s，请保证混匀充分，瞬时离心将反应液收集至管底；
3、将含有上一步反应液的PCR管置于PCR仪上，按照下表的条件进行反 应：
温度 时间
热盖 30℃
23℃ 20min
4℃ Hold
三、连接产物纯化
使用康为世纪磁珠法DNA纯化回收试剂盒(CW2508)进行DNA片段的纯 化回收。
包括如下步骤：
1.提前30min取出CMPure磁珠置于室温，使用前充分震荡混匀；
2.吸取80uL CMPure磁珠至80uL连接产物中，用移液器轻轻吹打10次 充分混匀，室温孵育5min；
3.瞬时离心，将不粘管置于磁力架，静置2min至液体澄清，移液器吸取 并弃掉上清；
4.保持不粘管固定于磁力架上，加入250uL新鲜配制的80％乙醇，保持 离心管固定于磁力架上，待悬起的磁珠完全吸附后彻底弃去乙醇(1min左右)。
5.重复步骤4一次，最后一次尽量吸干管底液体，有少量残留在管壁时可 将离心管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器把管底液体吸干。 注意：不要吸取磁珠，以免影响产量。
6.保持不粘管固定于磁力架上，打开不粘管管盖，室温干燥3～5min，直至 磁珠无反光、无开裂；
7.将不粘管从磁力架上取下，加入46uL TE进行DNA洗脱，移液器吹打 混匀并室温下溶解5min；
8.瞬时离心，将不粘管置于磁力架上，静置2min至液体澄清，将44uL上 清液全部转移到新的PCR管中，进行下一步反应或者-20℃保存。
四、PCR扩增，包括如下步骤：
1.向上一步的每个PCR管中单独加入3ul Index primer(index 1-8)，每 个样品中加入一种index，然后再按照下表配制PCR反应混合液；
组分 体积
2×HiFidelity PCR Mix 50uL
PCR-universal primer 3μL
Index primer 3μL
DNA 44uL
Total 100uL
2.震荡混匀5s，瞬时离心将反应液收集至管底；
3.将上述PCR管置于PCR仪上，按照下表的条件进行反应：
Figure BDA0002417256090000081
注意：PCR循环数可根据入库DNA浓度进行调整
五、PCR产物纯化，包括如下步骤：
使用康为世纪磁珠法DNA纯化回收试剂盒(CW2508)进行DNA片段的纯 化回收
1.提前30min取出CMPure磁珠置于室温，使用前充分震荡混匀；
2.吸取100uL CMPure XP磁珠至100uL PCR产物中，使用移液器轻轻吹 打10次充分混匀,室温孵育5min；
3.瞬时离心，将不粘管置于磁力架，静置2min至液体澄清，移液器吸取 并弃掉上清；
4.保持不粘管固定于磁力架上，加入250uL新鲜配制的80％乙醇，保持 离心管固定于磁力架上，待悬起的磁珠完全吸附后彻底弃去乙醇(1min左右)。
5.重复步骤4一次，最后一次尽量吸干管底液体，有少量残留在管壁时可 将离心管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器把管底液体吸干； 注意：不要吸取磁珠，以免影响产量。
6.保持不粘管固定于磁力架上，打开不粘管管盖，室温干燥3～5min，直至 磁珠无反光、无开裂；
7.将不粘管从磁力架上取下，加入32uL TE进行DNA洗脱，移液器吹打 混匀并室温下溶解5min；
8.瞬时离心，将不粘管置于磁力架上，静置2min至液体澄清，将30uL上 清液转移到新的1.5mL不粘管中，进行环化或者-20℃保存。
实施例2对照试验
配方一：末端修复缓冲液试剂中，三磷酸核苷dATP、dTTP、dCTP和dGT P终浓度均分别为0.2mM。(此为作为对照的技术方案)
配方二：末端修复缓冲液试剂中，三磷酸核苷dATP终浓度为2mM；dTTP、 dCTP和dGTP终浓度分别为0.2mM。(此为本发明的技术方案)
配方三：配制末端修复酶混合液，成分如下：T4多聚核苷酸激酶2.5U；Kl enowFragment，Exo-1U；Taq DNA聚合酶3U。以上三种酶混合物用于50ul 的反应体系的组成单位。(此为本发明的技术方案)
配方四：配制末端修复酶混合液，成分如下：T4多聚核苷酸激酶4U；Kle nowFragment 1U；Taq DNA聚合酶1U，T4 DNA聚合酶1.2U。以上四种酶 混合物用于50ul的反应体系的组成单位。(国际申请PCT/CN2016/106609(国 际公布号：WO 2018/090373A1)的技术方案)
不同配方的末端修复缓冲液与末端修复酶组合，分别用于不同浓度的cfDN A建库。cfDNA建库方法参考实施例1。
实验一：将配方一及配方二的末端修复缓冲液分别与配方三末端修复酶组 合，用于1ng的cfDNA样本建库，每个样本做2个重复，PCR扩增循环数12。
实验结果如下：
Figure BDA0002417256090000101
结果见图1。
实验二：将配方一及配方二的末端修复缓冲液分别与配方三末端修复酶组 合，用于cfDNA样本建库，投入量分别为1ng、2ng及3ng，PCR扩增循环数1 2。
实验结果如下：
Figure BDA0002417256090000102
结果见图2。
实验三：将配方一及配方二的末端修复缓冲液分别与配方三及配方四末端修 复酶组合，用于1ng的cfDNA样本建库，PCR扩增循环数12。
实验结果如下：
Figure BDA0002417256090000111
结果见图3。
结论：
从图1、图2和图3以及上表，可以看出，提高末端修复缓冲液中dATP浓 度，同时优化末端修复酶混合液组分，可提高cfDNA片段3’端加A效率，接头 5’含有游离的碱基T，与经修复的3’末端含有游离碱基A的DNA片段连接，因 此DNA片段加A效率越高，接头连接效率越高。
通过接头引入的特异性序列进行PCR扩增，引入Barcode序列，获取完整 DNA文库。末端修复效率影响文库产量，提高cfDNA末端修复效率以及3’端加 A效率，可有效提高建库效率。

Claims (5)

1.含有cfDNA末端修复酶组合物和cfDNA末端修复缓冲液试剂的cfDNA末端修复试剂，其特征在于，
所述的cfDNA末端修复酶组合物，由如下几种酶组成：
使cfDNA在dNTP存在下进行DNA双链修复及3’端加A的酶Ⅰ，所述的酶Ⅰ为Taq DNA聚合酶及Klenow Fragment，Exo-；
使cfDNA 5’端发生磷酸化修饰的酶Ⅱ，所述的酶Ⅱ为T4多聚核苷酸激酶（T4Polynucleotide Kinase，简称T4 PNK）；
每50μL 反应体系中含有：T4多聚核苷酸激酶 2.5U；Klenow Fragment，Exo- 1U；TaqDNA聚合酶 3U；
所述的cfDNA末端修复缓冲液试剂，在末端修复时，每50ul反应体系中加入5ul的10×末端修复缓冲液，所述的10×末端修复缓冲液试剂的组分和含量如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
所述的Tris-Hcl的pH为8.3。
2.含有如权利要求1所述的cfDNA末端修复试剂的cfDNA末端修复试剂盒。
3.含有如权利要求1所述的cfDNA末端修复试剂的cfDNA建库试剂盒。
4.使用如权利要求1所述的cfDNA末端修复试剂进行cfDNA末端修复的方法，其特征在于，具体方法如下：在末端修复缓冲液试剂中用末端修复酶组合物处理cfDNA以产生末端平齐化且3'端加A的cfDNA；
所述的末端修复反应体系的pH值为8.0～8.3；
所述的反应条件为先在35～40℃反应10～15min；然后在60～70℃反应10～15min。
5.使用如权利要求1所述的cfDNA末端修复试剂进行cfDNA测序文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）在末端修复缓冲液试剂中用末端修复酶组合物处理cfDNA以产生5’端磷酸化且3’端加A的cfDNA；
2）末端修复产物接头连接反应，在末端修复体系中直接加入MGI接头、T4连接酶及T4连接Buffer，进行接头连接；
3）接头连接产物进行磁珠纯化，去除反应体系中的酶、盐离子及残余接头；
4）使用高保真DNA聚合酶，对连接产物进行富集，反应结束后磁珠纯化；
所述的步骤1）中，
末端修复反应体系的pH值为8.0-8.3；
反应条件为先在35～40℃反应10～15min；然后在60～70℃反应10～15min。
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