CN112458544B - 一种用于均衡文库浓度的文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于均衡文库浓度的文库构建方法，包括核酸片段化及加接头；通过文库扩增达到均衡各样本文库的浓度；主要通过文库扩增环节达到均衡各样本文库的浓度。本发明还公开了所述用于均衡文库浓度的文库构建方法的应用，包括扩增文库纯化及回收和上机测序。本发明公开的用于均衡文库浓度的文库构建方法简单快捷，输出文库质量高，浓度水平一致，简化了后续文库定量流程和混样流程，适用于各平台测序领域。
Description
技术领域
本发明涉及高通量测序技术领域，特别是一种用于均衡文库浓度的文库构建方法。
背景技术
自从DNA双螺旋结构被发现，核酸检测技术在研究健康和疾病相关的基因组的复杂性和多样性方面取得了长足进展。随着测序技术的不断发展，其性能不断完善，尤其是高通量测序技术出现以来，其在准确性、通量上不断完善，且成本也在不断下降，使得其在多方面得到了成功应用，包括肿瘤筛查、基因检测、病原体筛查等领域都得到了广泛应用。
虽然高通量测序技术取得了巨大的进步，但这些进步仍存在着新的不足和挑战。新技术的出现并不意味着已存在的问题将得到很好的解决，甚至会更加突出而且有可能出现新的问题。高通量测序平台能够提供海量的测序数据，但得到这些数据的质量是由前期的样本制备及文库构建质量决定的。不同的样本类型以及不同的样本制备方法得到的核酸样本差异巨大。由于在常规测序流程中，通常受到最小上样量的限制，使得某些样本类型或样本制备方法制备的核酸浓度难以满足上样量需求，而导致测序结果质量不佳，甚至数据不可用，尤其是多个样本在一个Run中进行检测的时候。样本输入量的巨大差异，不仅使得文库混样成为一个巨大挑战，还导致样本产出数据也差异巨大，难以达到数据分析需求。
发明内容
本发明的目的是要提供一种用于均衡文库浓度的文库构建方法，该方法能用于不同浓度样本通过文库构建最终得到相似浓度文库，用以解决现有方法中低质量或低浓度核酸建库质量不佳的问题、操作难度高、难以复制操作的技术问题。
为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
一种用于均衡文库浓度的文库构建方法，包括以下步骤：
S1、核酸片段化及加接头；
S2、通过文库扩增达到均衡各样本文库的浓度。
进一步地，所述步骤S1的具体步骤为：根据不同测序平台的要求进行核酸片段化和加接头，其中片段化采用常规的片段化方法，包括机械打断法和酶法打断法；初始核酸浓度可为0.1pg/μL～100ng/μL；加完接头的核酸需用1.8×磁珠进行纯化。
进一步地，所述步骤S2的具体步骤为：
扩增体系为50μL反应体系，按要求依次加入无核酸酶水、20μL加接头的产物、10μL5×Fidelity Buffer、10mM的1.5μL dNTPs、10μM的1.5μL上游引物，5μL下游引物磁珠、1μLKAPA HiFi Hotstar DNA聚合酶，混合均匀，置于PCR仪中进行反应；
反应的反应程序为：95℃3min；98℃20s→60℃15s→72℃20s，循环25-30次，72℃1min；所述下游引物磁珠为链霉亲和素磁珠，其浓度为10mg/mL；磁珠表面结合有下游引物，所述下游引物通过生物素与磁珠表面的链霉亲和素结合；结合在磁珠上的引物浓度为0.2pmol/μL。
进一步地，所述下游引物磁珠的制备过程，包括如下步骤：
步骤S1：取100μL混合均匀的链霉亲和素磁珠，加入1mL的1×B&W缓冲液，混合均匀；
步骤S2：将反应管置于磁力架上2min，弃上清；
步骤S3：将反应管从磁力架上取下，加入100μL的1×B&W缓冲液，重悬磁珠；
步骤S4：重复步骤2-3两次，共重复3次；
步骤S5：将放应管置于磁力架上2min，弃上清；
步骤S6：加入200μL 2×B&W缓冲液，加入等体积的10μM的下游引物，室温孵育10min；
步骤S7：将反应管置于磁力架上，静置5min至溶液变澄清，弃上清；
步骤S8：用1×B&W缓冲液洗2次；
步骤S9：用1000μL无核酸酶水重悬磁珠，即得下游引物磁珠。
进一步地，所述2×B&W缓冲液组成为：10mM、pH为7.5的Tris-HCl，1mM EDTA；2MNaCl；所述1×B&W缓冲液为2×B&W缓冲液稀释到原浓度的一半得到；所述下游引物的5'修饰有生物素。
进一步地，所述上游引物和下游引物磁珠的建库平台为Illumina测序平台或IonTorrent测序平台。
进一步地，采用Illumina测序平台时，所述上游引物序列为S1：AATGATACGGCGACCACCGAGATCT；所述下游引物磁珠序列为A1-B：Biotin-TTTTT(C3 spacer)TUCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT。
进一步地，采用Ion Torrent测序平台时，所述上游引物序列为S2:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC；下游引物磁珠序列为A2-B：Biotin-TTTTT(C3 spacer)TUCCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTC；其中：Biotin表示生物素标记，C3 spcaer为C3修饰，用于终止扩增反应；所述下游引物中的U碱基，用于被USER酶作用，进行切除，使合成的双链核酸与链霉亲和素磁珠分离，用于回收构建的文库。
与现有技术相比，本发明具有下列优点：
(1)本发明的一种用于均衡文库浓度的文库构建方法，采用该发明的方法可将建库输入核酸浓度(≥0.0001ng/μL)差异在10000倍的核酸，最终输出的文库浓度保持在一个浓度水平，便于后续文库混样均匀。
(2)本发明的一种用于均衡文库浓度的文库构建方法，方法简单快捷，输出文库质量高，浓度水平一致，简化了后续文库定量流程和混样流程，适用于各平台测序领域。
(3)本发明的一种用于均衡文库浓度的文库构建方法，提供了一种用于不同浓度样本通过文库构建最终得到相似浓度文库的技术，可用以解决现有方法中低质量或低浓度核酸建库质量不佳、操作难度高、难以复制操作的技术问题。
(4)本发明的一种用于均衡文库浓度的文库构建方法，采用该技术，可将不同浓度的样本，通过文库构建的过程，最终输出相同浓度的文库。后期只需将所构建的文库进行等体积混样，即可使得各样本最终产出数据量均衡在统一水平，使得其差异在5％以内。
(5)本发明的一种用于均衡文库浓度的文库构建方法，这种建库技术尤其适用于病原体测序检测领域，该领域检测样本类型多种多样，各样本类型组成差异较大，且样本制备方法多样，最终制备的核酸浓度差异较大，要想将多个样本类型的样本用一个Run进行检测，均衡各样本的文库量必不可少，通过该均衡文库的文库构建技术即可满足需求。该技术为病原体的高通测序检测提供新的研究思路，使得高通量测序技术能更好的应用于病原体测序检测。
(6)本发明的一种用于均衡文库浓度的文库构建方法，通过该发明的方法可将不同输入量的核酸最终输出浓度相当的文库。简化了文库构建流程，不再需要计算各样本文库输入量，且由于输出文库浓度相当，简化了后续文库流程流程，只需将文库按等体积混合即可。为病原体测序检测不同样本类型的检测提供了新的建库方法。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例涉及的仪器包括：超净工作台、离心机、Qubit4.0，PCR仪、移液器、磁力架等；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
下游引物磁珠的制备
一、物料准备
链霉亲和素M-270磁珠(厂家：Thermo Fisher货号：65001)；下游引物由上海生工生物合成，溶解浓度为50μM，用时无核酸酶水稀释至1μM；引物序列为，Illumina测序平台A1-B：Biotin-TTTTT(C3spacer)TUCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT；Ion Torrent测序平台：A2-B：Biotin-TTTTT(C3spacer)TUCCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTC。
二、下游引物磁珠的制备
(1)取出链霉亲和素C1磁珠，室温平衡30min，并混合均匀，使磁珠完全重悬；
(2)取100μL链霉亲和素C1磁珠于一个新的1.5mL离心管中；
(3)向离心管中加入1mL的1×B&W缓冲液，混合均匀；
(4)将反应管置于磁力架上2min，至溶液变澄清，弃上清；
(5)将反应管从磁力架上取下，加入100μL的1×B&W缓冲液，重悬磁珠；
(6)将反应管置于磁力架上2min，至溶液变澄清，弃上清；
(7)重复步骤5-6两次，共重复3次；
(8)将反应管从磁力架上取下，加入200μL 2×B&W缓冲液重悬磁珠，加入等体积(200μL)的1μM的下游引物，室温孵育10min；
(9)将反应管置于磁力架上，静置5min至溶液变澄清，弃上清；
(10)用1×B&W缓冲液洗2次；
(11)用1000μL无核酸酶水重悬磁珠，即得下游引物磁珠。
实施例2
均衡多个文库浓度的文库构建技术
本实施例以Ion Torrent测序平台的文库构建及上机测序为例进行说明。
一、文库构建
核酸片段化
采用酶法进行核酸片段化，所用片段化酶为KAPA的片段化酶。具体流程如下：
(1)取10个不同浓度的DNA核酸30μL(每个样本重复2次)，加入5μL片段化酶，5μL片段化Buffer，用水补足至50μL；
(2)混合均匀，瞬时离心，将反应管置于PCR仪中进行反应；
(3)反应程序为：4℃，1min；37℃，40min；4℃，Hold；
(4)反应结束后，加入5μL终止缓冲液，旋涡混匀，瞬时离心；
(5)用1.8×AMPure XP磁珠进行纯化，用13μL无核酸酶水洗脱核酸。
加接头及缺壳修复
(6)取12.5μL上述片段化后的核酸
(7)依次加入24.5μL无核酸酶水、5μL连接酶Buffer、1μL dNTP、1μLDNA连接酶、4μL缺壳修复酶、1μL通用接头、1μL含有Barcode X的接头(每个样本采用不同的Barcode)
(8)混合均匀，瞬时离心，将反应管置于PCR仪中
(9)反应程序：25℃，20min；72℃，5min；4℃，hold
(10)反应结束后，用1.5×AMPure XP磁珠进行纯化；用21μL无核酸酶水洗脱核酸。
文库扩增
(11)取20μL上述产物，加入10μL 5×Fidelity Buffer、1.5μL dNTPs(10mM)、1.5μL上游引物(10μM)、5μL下游引物磁珠、1μLKAPA HiFi Hotstar DNA聚合酶，用无核酸酶水补至50μL，混和均匀，瞬时离心，将反应管置于PCR仪中。(12)反应程序为：预变性95℃3min；循环相98℃20s→60℃15s→72℃20s，循环25次，延伸72℃1min；4℃，Hold。
(12)反应结束后，将反应管置于磁力架/板上，静置5～10min至溶液变澄清，弃上清；
(13)向管中加入200μL新鲜配制70％的乙醇，室温放置1min，弃上清；
(14)重复上步一次；
(15)将反应管置于磁力架/板上，开盖放置3-5min至磁珠干燥；
(16)向其中加入18μL的1X CutSmart buffer，2μL USER酶，混匀后，37℃孵育15min；
(17)将反应管置于磁力架上，放置5-10min，至溶液变澄清。
(18)转移上清于一新的离心管中，加入1.5×磁珠进行纯化，用20μL无核酸酶水洗脱。并用Qubit和荧光定量PCR进行定量。
二、上机测序
取上述制备的文库，按初始浓度每10个样本为一组，等体积混合，如各取5μL进行混合。然后定量，根据定量结果，取适当体积进行乳液PCR、模板制备及上机测序。
三、检测结果
检测结果如表1所示，对比了各样本所建文库的浓度及测序产出的数据量。其中文库浓度包括用Qubit定量的结果和用qPCR定量的结果。由表1可以看出采用该方法所构建的文库，当核酸初始输入浓度大于等于0.0001ng/μL时，即便文库浓度差异在10000倍，最后生成的文库浓度差异在5％以内，即生成文库精密度小于5％。最终产出数据量差异也在5％以内。由此可见即便初始输入核酸浓度差异较大，采用该建库方法也能将输出文库浓度控制在一个相似的水平。这为文库构建带来了便捷，开始建库时不用再考虑文库浓度和核酸输入量不够等情况。简化了文库构建流程。
实时例3
本发明在病原体测序检测中的应用
临床病原体测序检测涉及的临床样本类型多种多样，包括外周血、肺泡灌洗液、痰液、脓液、脑脊液、尿液、胸水、腹水、组织等。不同样本类型所含细胞数量差异很大，提取的核酸浓度差异较大。传统的测序检测技术操作流程复杂，需进行严格的样本定量，检测周期长。
通过本发明可在一次检测中同时检测不同的样本类型的核酸。本发明选取了外周血、脑脊液、肺泡灌洗液、脓液、尿液五种样本类型各2例样本，共10个样本进行一张芯片测序检测，所有样本均来自临床医院。检测流程如下
一、核酸提取
采用常规提取技术进行核酸提取，并进行定量，Qubit定量结果如表2所示，可以看出有些样本类型核酸浓度差异较大，有些样本浓度不能满足常规建库样本核酸输入量。
表1
表2
二、文库构建
采用两种方法进行文库构建
方法一、采用本发明的方法进行文库构建及上机上机测序，操作方法参见实施例2.
方法二、采用Ion Torrent文库构建操作流程进行文库构建，操作方法如下：
片段化
(1)取经过样本制备的DNA核酸50ng(不足10ng的样本取最大体积)，IC，5μL片段化Buffer，10μL片段化酶，用水补足至50μL；
(2)混合均匀，瞬时离心，将反应管置于PCR仪中进行反应；
(3)反应程序为：4℃，1min；37℃，40min；4℃，Hold。
(4)反应结束后，加入5μL终止缓冲液，旋涡混匀，瞬时离心；
(5)用1.8×AMPure XP磁珠进行纯化；用13μL无核酸酶水洗脱核酸；
(6)加接头；
(7)取12.5μL上述片段化后的核酸；
(8)依次加入24.5μL无核酸酶水、5μL连接酶Buffer、1μL dNTP、1μL DNA连接酶、4μL缺壳修复酶、1μL通用接头、1μL含有Barcode X的接头(每个样本采用不同的Barcode)；
(9)混合均匀，瞬时离心，将反应管置于PCR仪中；
(10)反应程序：25℃，20min；72℃，5min；4℃，hold；
(11)反应结束后，用1.5×AMPure XP磁珠进行纯化；用14μL TE洗脱核酸；
(12)文库扩增
(13)取12.5μL加接头的核酸溶液，加入50μL PCR混合液，2.5μL扩增引物；
(14)混合均匀，瞬时离心，将反应管置于PCR仪中；
(15)反应程序：预变性95℃，5min；循环相(7个循环)95℃15s，58℃15s，70℃1min；4℃，Hold；
(16)反应结束后，用1.5×AMPure XP磁珠进行纯化；用20μL无核酸酶，用Qubit和qPCR进行定量，并记录相应浓度。
上机测序
文库混样：根据qPCR定量浓度，按等物质的量浓度进行文库混合，并将文库稀释至100pM。
乳液PCR：取20μL混合的文库，按乳液PCR操作流程进行操作。
上机模板制备：将乳液PCR产物进行富集纯化，并变性为单链；
芯片Loading和上机测序：将制备好的单链文库按芯片Loading操作流程进行操作，并进行上机，启动测序相关程序。
三、两种建库方法测序结果对比
采用两种建库方法进行文库构建及上机测序，测序产出数据量如表3所示。通过对比可以发现，不同类型样本，最终产出数据量分布较均匀，其数据量分布差异在5％以内，而采用传统建库方法，最终个样本产出数据量差异较大，差异接近80％，且数据量最大样本与数据量最小样本差24M的reads数(最大值：25154932、最小值1215646)，相差1个数量级还多。由此可见采用本发明的方法能有效的对所建文库进行平衡。可更好的应用于病原体测序等领域。
表3
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 微岩医学科技（北京）有限公司
<120> 一种用于均衡文库浓度的文库构建方法
<130> 2020.12.16
<150> 202010075819X
<151> 2020-01-22
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatct 25
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
ttttttucaa gcagaagacg gcatacgaga t 31
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 3
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgac 26
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 4
ttttttucca ctacgcctcc gctttcctct c 31
Claims (7)
1.一种用于均衡文库浓度的文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、核酸片段化及加接头；S2、通过文库扩增达到均衡各样本文库的浓度；
所述步骤S2的具体步骤为：扩增体系为50μL反应体系，按要求依次加入无核酸酶水、20μL加接头的产物、10μL 5×Fidelity Buffer、10mM的1.5μL dNTPs、10μM的1.5μL上游引物，5μL下游引物磁珠、1μLKAPA HiFiHotstar DNA聚合酶，混合均匀，置于PCR仪中进行反应；反应的反应程序为：95℃3min；98℃20s→60℃15s→72℃20s，循环25-30次，72℃1min；所述下游引物磁珠为链霉亲和素磁珠，其浓度为10mg/mL；磁珠表面结合有下游引物，所述下游引物通过生物素与磁珠表面的链霉亲和素结合；结合在磁珠上的引物浓度为0.2pmol/μL。
2.根据权利要求1所述的用于均衡文库浓度的文库构建方法，其特征在于，所述步骤S1的具体步骤为：根据不同测序平台的要求进行核酸片段化和加接头，其中片段化采用常规的片段化方法，包括机械打断法和酶法打断法；初始核酸浓度可为0.1pg/μL～100ng/μL；加完接头的核酸需用1.8×磁珠进行纯化。
3.根据权利要求1所述的用于均衡文库浓度的文库构建方法，其特征在于，所述下游引物磁珠的制备过程，包括如下步骤：步骤S1：取100μL混合均匀的链霉亲和素磁珠，加入1mL的1×B&W缓冲液，混合均匀；步骤S2：将反应管置于磁力架上2min，弃上清；步骤S3：将反应管从磁力架上取下，加入100μL的1×B&W缓冲液，重悬磁珠；步骤S4：重复步骤2-3两次，共重复3次；步骤S5：将放应管置于磁力架上2min，弃上清；步骤S6：加入200μL 2×B&W缓冲液，加入等体积的10μM的下游引物，室温孵育10min；步骤S7：将反应管置于磁力架上，静置5min至溶液变澄清，弃上清；步骤S8：用1×B&W缓冲液洗2次；步骤S9：用1000μL无核酸酶水重悬磁珠，即得下游引物磁珠。
4.根据权利要求3所述的用于均衡文库浓度的文库构建方法，其特征在于，所述2×B&W缓冲液组成为：10mM、pH为7.5的Tris-HCl，1mM EDTA；2M NaCl；所述1×B&W缓冲液为2×B&W缓冲液稀释到原浓度的一半得到；所述下游引物的5'修饰有生物素。
5.根据权利要求1所述的用于均衡文库浓度的文库构建方法，其特征在于，所述上游引物和下游引物磁珠的建库平台为Illumina测序平台或Ion Torrent测序平台。
6.根据权利要求5所述的用于均衡文库浓度的文库构建方法，其特征在于，采用Illumina测序平台时，所述上游引物序列为S1：AATGATACGGCGACCACCGAGATCT；所述下游引物磁珠序列为A1-B：Biotin-TTTTT(C3 spacer)TUCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT。
7.根据权利要求5所述的用于均衡文库浓度的文库构建方法，其特征在于，采用IonTorrent测序平台时，所述上游引物序列为S2:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC；下游引物磁珠序列为A2-B：Biotin-TTTTT(C3 spacer)TUCCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTC；其中：Biotin表示生物素标记，C3 spcaer为C3修饰，用于终止扩增反应；所述下游引物中的U碱基，用于被USER酶作用，进行切除，使合成的双链核酸与链霉亲和素磁珠分离，用于回收构建的文库。
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