一种接头组合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地,涉及一种接头组合物及其应用,尤其涉及一种接头组合物,使用该接头组合物构建测序文库的方法,所构建的测序文库及其应用。
背景技术
外周血游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)是指存在于外周血中的循环DNA,在健康人外周血中含量较低,在肿瘤患者外周血中含量升高,这些cfDNA主要来自于肿瘤原发灶、转移灶、循环肿瘤细胞以及正常组织。目前学者们普遍认为,在肿瘤发生发展的早期阶段即有核酸释放入血,这种循环在血液中的肿瘤细胞DNA称为ctDNA(circulating tumor DNA),ctDNA被认为携带有肿瘤组织遗传学和表观遗传学的变异信息。近年来,随着科学的发展和技术的进步,ctDNA作为生物标志物受到越来越广泛的关注和报道。有研究证实,基于新一代高通量测序技术,癌症患者ctDNA在肿瘤个体化治疗、肿瘤早期诊断和预后监测等方面具有巨大的潜力和应用前景。
研究表明,早期肿瘤患者血浆内ctDNA的含量最低仅0.01%,而新一代高通量测序技术只能够检测完整的双链DNA,并且为了去除接头二聚体的污染,需要用磁珠进行片段纯化,误差率约0.1-1%,虽然这个错误率对于大部分研究是可以接受的,但是对于携带有极微量突变信息的ctDNA、小片段痕量DNA、受损DNA或单链DNA来说,0.1-1%的错误率会导致无法及时和准确地获得突变位点信息,阻碍肿瘤个体化治疗的进程。
为了提高测序准确度,一系列改进的生物技术和数据处理方法不断涌现。M.W.Schmitt等提出一种双重测序技术(M.W.Schmitt,Detection of ultra-raremutations by next-generation sequencing,PNAS,109,14508-14513(2012)),该技术在Illumina Y状接头的一条链末端添加随机碱基,接头退火后形成双链Y接头,利用限制性内切酶酶切Y接头产生T粘性末端后,连接于具有A粘性末端的DNA双链上,使得DNA的正反义链分别标记随机且互补的标记,分别对DNA的双链进行测序,基于正反双链纠错策略分析测序结果。该方法几乎可以矫正所有类型的测序错误,检测到的突变频率可以达到10-7,但是该技术需要相对常规测序更高的测序通量和更高的样本量,此外,繁琐的接头制作过程和较低的接头连接效率也是制约其发展的重要因素。
为了克服双重测序技术的制约因素,CN 105861710A公开了测序接头、其制备方法及其在超低频变异检测中的应用,其中,测序接头包括依次相连的文库扩增引物序列、目的片段扩增引物序列以及错误提示序列,错误提示序列位于靠近目的片段的一侧,文库扩增引物序列位于远离目的片段的一侧,错误提示序列为已知碱基顺序的序列。该发明采用化学合成法制备含有随机序列的Y状接头,简化了接头制作过程,但是仍然没有改善测序通量高、样本需求大、连接效率低等问题。
CN 106987585 A公开了一种针对cfDNA的单链DNA二代测序文库构建方法,该方法首先对提取的cfDNA去磷酸化和变性为单链,随后在单链cfDNA的3’端添加单链接头,并以单链产物为模板、采用单链接头的引物延伸得到双链DNA,在双链DNA的5’端添加双链接头后PCR构建文库。然而该方法无法去除PCR扩增或测序导致的假阳性。
因此,构建一种新的针对小片段痕量DNA、受损伤DNA和单链DNA的接头,用于构建测序文库,同时降低新一代高通量测序技术的误差率,在肿瘤个体化治疗具有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种接头组合物及其应用,本发明通过直接引入合成的带有UID序列的第一接头,后经延伸将UID序列引入到双链文库中,免去了现有UID接头建库技术中繁琐的接头制作过程,提高了实验效率,降低了实验难度,节约了实验成本。
第一方面,本发明提供了一种接头组合物,所述接头组合物包括第一接头和第二接头,所述第一接头为单链接头,包含有UID序列和一段单链核苷酸,所述第一接头的3’端具有封闭修饰;
所述第二接头为由一条核酸长链与一条核酸短链互补配对而成的双链接头,所述第二接头的核酸长链5’端具有磷酸修饰,所述第二接头的核酸短链5’端不进行磷酸化修饰。
本发明中,发明人经过分析,发现在第一接头中的单链核苷酸的5’端引入UID序列,通过带有UID序列的第一接头后经延伸可将UID序列引入到双链文库中,免去了现有UID接头建库技术中繁琐的接头制作过程,提高了实验效率,降低了实验难度,节约了实验成本,不仅如此,所述第一接头进行3’端封闭,可防止延伸过程中非特异性延伸,提高了文库的特异性。
此外,所述第二接头的核酸短链的5’端是不进行磷酸化修饰处理的,可以有效防止接头间的非特异连接,达到提高接头利用率和降低文库非特异性。
根据本发明,所述UID序列指的是一段随机的碱基序列,其长度为3-8nt,例如可以是3nt、4nt、5nt、6nt、7nt或8nt,优选为4-6nt,更优选为5nt,其碱基序列为NNNNN,其中N可以独立选自A\T\G\C中的任意一个碱基。
根据本发明,发明人意外发现第一接头的长度对连接效率有较大的影响,为了实现更高效的连接效率,经过筛选和优化,所述第一接头的长度为15-45nt,例如可以是15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt、27nt、28nt、29nt、30nt、31nt、32nt、33nt、34nt、35nt、36nt、37nt、38nt、39nt、40nt、41nt、42nt、43nt、44nt或45nt,优选为34bp,发明人发现第一接头的长度在34bp时,其连接效率最高,可达93%以上,且经过筛选第一接头的长度发现可以提高模板的利用率,能够实现超微量高效建库。
根据本发明,所述第一接头的3’端的封闭修饰为双脱氧封闭修饰,通过双脱氧封闭修饰巧妙的避免的接头自连和非特异扩增,极大的提高了建库中模板的利用率。
根据本发明,所述第一接头的5’端具有磷酸化修饰,能够更好的和目的片段相连。
根据本发明,所述单链核苷酸与测序接头的3’端的部分序列互补,由于延伸反应中的延伸引物包含测序接头,使得后续能够与延伸引物互补进行延伸反应。
在一个优选的实施例中,所述第一接头中的单核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示,具体SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列如下:AGTCGGAGGCCAAG,所述单链核苷酸的5’端引入UID序列,得到SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列如下:/phoS/NNNNNAGTCGGAGGCCAAG/ddc/,其中“//”中为末端修饰基团,“Phos”表示磷酸化,“dd”表示双脱氧。
根据本发明,所述测序接头为BGI测序平台的测序接头。
在一个优选的实施例中,所述第二接头中的核酸长链的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示,所述SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列如下:/phoS/AGTCGGATCGTAGCCATGTCGTTC;所述第二接头中的核酸短链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,所述SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列如下:GCTACGATCCGACTT.
本发明中,所述第二接头采用核酸长链和核酸短链碱基互补配对的结合方式,能够使长链短链进行错位,从而能够避免接头本身自连。
第二方面,本发明提供一种接头连接方法,采用如第一方面所述的接头组合物。
根据本发明,所述的接头连接方法包括如下步骤:
(1)将所述第一接头连接在待测单链样本DNA上;
(2)加入延伸引物,以步骤(1)所得单链产物为模板进行延伸,获得双链产物,其中所述延伸引物包含测序接头;
(3)将步骤(2)所得双链产物与第二接头进行连接,得到连接产物。
根据本发明,步骤(1)中的连接是利用环化连接酶,优选为Circligase II。
根据本发明,所述延伸引物包含BGI测序平台的测序接头,所述延伸引物能够与单链核苷酸互补,所述延伸引物包括测序引物和标签序列。
本发明中,由于标签序列的存在,在后续步骤中可以将标签不同的不同样品混合后放入同一反应体系进行反应,进一步节约操作步骤与成本,具体标签的选择可以选择现有技术中的常规标签,在此不作特殊限定,本领域技术人员可以根据需要选择不同的标签,后续测序完成后可以根据分子标签和插入片段将来源于同一单链模板的测序片段聚到一起,相互矫正,去除建库和测序过程中引入的各种错误,从而精确还原原始模板序列,提高比对精度和突变检出精度,降低信息分析产生的假阳性和假阴性。
在一个优选的实施例中,所述的测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,所述SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列如下:TGTGAGCCAAGGAGTTG;所述与第一接头中单链核苷酸互补的序列的核苷酸序列会根据第一接头的不同而不同,如第一接头具有不同的长度,使得单链核苷酸互补的序列也会根据接头的长度进行调整,使其具有更多的互补区域。
在一个优选的实施例中,所述延伸引物根据标签的不同,可以有不同的选择,为了测序时碱基平衡,一般一个样本建库时,会用含有不同标签序列的接头进行建库,部分延伸引物的列举如下表1所示:
表1
根据本发明,在步骤(1)的连接前,还分别包括将待测单链样本的DNA进行5’端去磷酸化的步骤,所述去磷酸化是利用碱性磷酸酶,优选虾碱性磷酸酶进行。
根据本发明,所述去磷酸化的步骤之后还包括变性解链处理步骤,所述变性解链具体包括:将5’端去磷酸化的产物在温度90-98℃,例如可以是90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃或98℃,优选为93-96℃下处理1-3min,冰上处理1-3min,灭活去磷酸化酶。
任选地,在步骤(1)的连接前还包括DNA修复的步骤,所述DNA修复是利用修复无碱基位点的酶系,优选为核酸内切酶VIII。
第三方面,本发明提供一种测序文库的构建方法,其使用如第一方面所述的接头组合物或使用如第二方面所述的接头连接方法进行。
根据本发明,所述的构建方法包括以下步骤:根据连接产物设计引物,以连接产物为模板进行扩增,得到所述扩增测序文库。
在一个优选的实施例中,所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14-15所示,所述SEQ ID NO.14-15所示的核苷酸序列如下:
上游引物(SEQ ID NO.14):GAACGACATGGCTACGA;
下游引物(SEQ ID NO.15):TGTGAGCCAAGGAGTTG.
作为优选技术方案,所述构建方法包括如下步骤:
1)将待测DNA进行5’端去磷酸化和变性解链;
2)使用如第一方面所述的接头组合物或通过如第二方面所述的接头连接方法进行接头连接,得到连接产物;
3)DNA片段扩增:根据连接产物设计引物,以步骤2)构建的连接产物为模板进行扩增,得到所述扩增测序文库;
任选地,步骤1)之前根据需要还包括DNA修复的步骤。
根据本发明,步骤1)中,所述待测DNA为基因组DNA、cfDNA、古DNA或福尔马林固定石蜡包埋样本中的任意一种或至少两种的组合,其中,低质量DNA也是可行的,所述低质量DNA为DNA出现严重的降解、片段化程度严重、片段中间损伤频繁(无碱基位点、缺磷酸骨架)等,由于本申请采用的是单链连接,能更好的利用低质量DNA的短片段,并且因为是单链连接,即使DNA中间损伤了,经过变性处理,损伤部分则直接变成了单链,而不影响后续扩增的进行。
根据本发明,所述待测DNA为基因组DNA,在5’端去磷酸化和变性解链前还包括对所述基因组DNA进行片段化处理的步骤,所述片段化处理为利用物理方法或化学方法,对待测DNA进行随机打断,优选利用物理超声法或酶反应法进行待测DNA片段化,所述DNA片段的长度可以根据测序仪读长进行调整,本申请能够利用更短的DNA片段,从而进一步保留更多的插入片段,提升利用效率,提高建库产量。
根据本发明,步骤1)中,所述去磷酸化利用碱性磷酸酶、优选虾碱性磷酸酶进行。
根据本发明,所述DNA修复包括如下步骤:利用核酸内切酶VIII进行第一次修复,再利用碱性磷酸酶进行第二次修复。
第四方面,本发明提供一种测序文库,由第三方面所述构建方法制得。
第五方面,本发明提供如第四方面所述的测序文库在基因组测序中的应用。
第六方面,本发明提供如第四方面所述测序文库在目标基因组区域测序中的应用。
第七方面,本发明提供一种测序文库构建试剂盒,包括第一方面所述的接头元件。
根据本发明,所述试剂盒还包括去磷酸化酶,优选碱性磷酸酶,更优选虾碱性磷酸酶。
与现有技术相比,本申请具有如下有益效果
(1)本发明所用UID接头可以通过常规序列合成即可实现,效率高,成本低,本发明通过巧妙的实验设计,可直接引入合成的带有UID序列的单链接头,后经延伸将UID序列引入到双链文库中,免去了现有UID接头建库技术中繁琐的接头制作过程,提高了实验效率,降低了实验难度,节约了实验成本;
(2)本发明兼顾了单链建库和UID建库的优点,实现了快速并高效的UID单链建库,该UID标签位于插入片段末端,测序和分析识别简单;测序完成后根据分子标签和插入片段将来源于同一单链模板的测序片段聚到一起,相互矫正,去除建库和测序过程中引入的各种错误,从而精确还原原始模板序列,提高比对精度和突变检出精度,降低信息分析产生的假阳性和假阴性;
(3)本发明通过摸索与优化接头的长度实现更高效的连接效率,显著提高了模板利用效率,实现超微量高效建库,目前测试使用最低量为1ng以上,在12个cycle即可获得300ng以上产量;
(4)本发明的第一接头进行3’端ddc封闭,可防止延伸过程中非特异性延伸,提高了文库的特异性,巧妙的避免的接头自连和非特异扩增,极大的提高了建库中模板的利用率;
(5)本发明中第二接头的双链接头中的短互补片段的5’端是不进行磷酸化修饰处理的,可以有效防止接头间的非特异连接,达到提高接头利用率和降低文库非特异性。
附图说明
图1为本发明建库的示意图;
图2为本发明cfDNA单链UID建库结果的整体情况,其中,图2(A)、图2(B)、图2(C)、图2(D)和图2(E)表示的是5个不同的样本;
图3为本发明cfDNA单链UID建库结果中图2(B)的放大图;
图4(A)为本申请单链建库和对比例1常规BGI500建库的产量对比直方图;图4(B)为本申请单链建库和对比例1常规BGI500建库的建库结果;
图5为实施例1和对比例1-2的对比结果,其中,图5(A)为本发明方法的建库结果,图5(B)为对比例1的建库结果,图5(C)为对比例2的建库结果;
图6为本发明实施例4FFPE单链UID建库结果的整体情况,其中,图6(A)、图6(B)和图6(C)表示的是3个不同的样本;;
图7为本发明实施例4FFPE单链UID建库结果中图6(C)的放大图;。
具体实施方式
为便于理解本发明,本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
实施例1 BGI-seq500平台cfDNA起始单链UID建库
本实施例基于华大的BGI-seq500平台,提供一种cfDNA起始单链UID建库方法,其中cfDNA来源于混合血浆提取的cfDNA,混合血浆来源于华大基因细胞资源库,包括如下具体步骤:
1)将3ng cfDNA进行5’端去磷酸化、变性解链和DNA修复,具体体系的配制过程如下表2所示:
表2
体系 |
体积/μl |
DNA |
1-100ng(体积X<=16μl) |
环化连接酶缓冲液II |
4 |
MnCl<sub>2</sub> |
2 |
核酸内切酶VIII(10U/μl) |
0.5 |
无核酸酶水 |
16-X |
37℃孵育1h;再加入2μl FastAP(1U/μl),37℃孵育10min,95℃孵育2min,冰上孵育2min;
2)将所述第一接头连接在待测单链样本DNA上,第一接头的核苷酸序列(SEQ IDNO.2)如下:/phoS/NNNNN-AGTCGGAGGCCAAG/ddc/,具体体系的配制过程如下表3所示:
表3
试剂名称 |
体积/μl |
PEG-4000(50%) |
16 |
第一接头(1μM) |
1 |
环化连接酶II(100U/μl) |
0.5 |
60℃孵育1h,磁珠纯化,32μl回溶;
3)加入延伸引物,以步骤2)所得单链产物为模板进行延伸,获得双链产物,其中所述延伸引物包含测序接头具体引物序列如下表4所示,体系的配制过程如下表5所示:
表4
其中下划线的部分为标签序列,为了测序时碱基平衡,一般一个样本建库时,会用含有不同标签序列的接头进行建库,后续测序完成后可以根据分子标签和插入片段将来源于同一单链模板的测序片段聚到一起,相互矫正,去除建库和测序过程中引入的各种错误,从而精确还原原始模板序列,提高比对精度和突变检出精度,降低信息分析产生的假阳性和假阴性;
表5
试剂名称 |
体积/μl |
水 |
10.5 |
等温扩增缓冲液(10×) |
5 |
dNTP mix(25Mm/个) |
0.5 |
步驟2)产物 |
16 |
65℃孵育3min,冰上孵育 |
|
加BST2.0 |
3 |
37℃孵育20min,磁珠纯化,而后22μl ddH<sub>2</sub>O回溶 |
|
4)将步骤3)所得双链产物与第二接头进行连接,得到连接产物,具体第二接头的核苷酸序列如下表6所示,体系的配制过程如下表7所示:
表6
序列名称 |
核苷酸序列 |
核酸长链(SEQ ID NO.3) |
/phoS/AGTCGGATCGTAGCCATGTCGTTC |
核酸短链(SEQ ID NO.4) |
GCTACGATCCGACTT |
表7
23℃孵育1h,磁珠纯化后加入24μl ddH2O回溶;
5)DNA片段扩增:根据连接产物设计引物,以步骤4)的连接产物为模板进行扩增,得到所述扩增测序文库,具体引物序列如下表8所示,体系的配制过程如下表9所示,反应程序如表10所示:
表8
引物名称 |
引物序列 |
上游引物(SEQ ID NO.14) |
GAACGACATGGCTACGA |
下游引物(SEQ ID NO.15) |
TGTGAGCCAAGGAGTTG |
表9
试剂 |
体积/μl |
PCR扩增反应混合液 |
25 |
上游引物(20μM) |
1.5 |
下游引物(20μM) |
1.5 |
步骤4)产物 |
22 |
表10
磁珠纯化后,32μl ddH2O回溶,Qubit定量和安捷伦2100检测,结果如图2(A)-图2(E)和图3所示。
从图2(A)-图2(E)可以看出,文库整体提分布峰型与常规建库一致,单产量更高;从图3可以看出,单链建库峰图分布更完整,较多的小片段都有留下来,构建的文库更完整。
实施例2第一接头长度的梯度优化
由于发现第一接头的长度对连接效率有较大的影响,其中接头的选择是由于第一接头由5bp UID序列+另一段序列组成,这另一段序列是从延伸引物上3’端截取的反向互补序列,并且由于需要对第一接头进行ddc封闭,则要求末端是碱基C,而延伸引物则应该是G,即本实施例采用截取的20bp、24bp和34bp的接头进行建库,以便分析研究采用不同长度的接头对连接效率以及最终建库效果的影响,其中建库方法的具体步骤同实施例1,接头的具体序列和结果如下表11所示:
表11
从表11可以看出,接头长度对连接效率有较大影响,经优化,已探索到最优的接头长度为34bp。
对比例1现有BGI500平台建库方法
采用实施例1相同样本和起始量进行建库,建库方法采用BGI500平台生产线现有的步骤流程,具体如下:
1)末端修复和末端加A
试剂名称 |
体积/μl |
DNA |
X(X≤25) |
2X-Faster Library MIX1 |
25 |
水 |
25-X |
37℃孵育30分钟,75℃孵育30分钟 |
|
2)连接接头
3)扩增
磁珠纯化后,32μl ddH2O回溶,Qubit定量和安捷伦2100检测,结果下图4(A)-图4(B)所示;
从图4(A)可以看出,本申请单链建库得到的文库整体提分布峰型与BGI500平台建库(对比例1)一致,但产量更高;从图4(B)可以看出,本申请单链建库峰图分布更完整,特别是在150~200bp处的片段保留更多,是常规BGI500平台建库(对比例1)方法的两倍,构建的文库更完整。
对比例2cfDNA单链建库的方法
本申请提供的对比例2采用实施例1相同样本和起始量进行建库,具体建库方法参见“CN201710153542A-一种针对cfDNA的单链DNA二代测序文库构建方法”,建库结果如图5(B),从图5(B)可以看出,主峰片段同样在250bp,该方法实现过程繁琐,产量较低,连接效率不佳且存在接头污染。
对比例3损伤DNA单链建库的方法
本申请提供的对比例3采用实施例1相同样本和起始量进行建库,具体建库方法参见“Single-stranded DNA library preparation for the sequencing of ancient ordamaged DNA,Nat Protoc.2013Apr;8(4):737-48.doi:10.1038/nprot.2013.038.Epub2013Mar 14.”,建库结果如图5(C),从图5(C)可以看出,在255bp为主要的片段组成,连接效率不佳且存在接头污染,更重要的是,该对比例所提供的方法需要用到生物素标记和生物素磁珠,经济成本和时间成本也会相应的变高。
建库结果对比:
将实施例1、对比例2和对比例3的对比结果如图5(A)、图5(B)和图5(C),可以看出,现有技术的方法存在连接效率不佳且有接头污染是接头长度和接头、引物浓度导致的,本发明在经过了大量实验验证后,改进的方法构建的cfDNA文库可以保留更多片段类型,获得更完整的文库类型,从而提高后续测序分析的灵敏度。
实施例3 FFPE严重降解样本起始单链UID建库
由于本申请对降解的DNA也能够进行建库,本实施例提供一种FFPE严重降解样本起始单链UID建库方法,包括如下具体步骤:
1)提取FFPE样本DNA;
2)Covaris超声打断富集DNA样本,12个循环;
3)1.5×Agencourt AMPure XP-Medium磁珠纯化;
4)80%酒精洗涤2遍,20μl回溶;
5)Qubit定量;
6)取30ng打断后FFPE基因组DNA,按实施1中建库方法进行建库;
7)Qubit定量和安捷伦2100检测,结果如图6(A)-图6(C)和图7所示。
从图6(A)-图6(C)可以看出,文库片段分布集中,能够实现建库,从图7可以看出,主带为235左右,负荷文库构建目标,而且片段分布更集中,效果更好。
综上所述,本发明能够提高连接效率,兼顾了单链建库和UID建库的优点,实现了快速并高效的UID单链建库,提高了实验效率,降低了实验难度,节约了实验成本;测序完成后根据分子标签和插入片段将来源于同一单链模板的测序片段聚到一起,相互矫正,去除建库和测序过程中引入的各种错误,从而精确还原原始模板序列,提高比对精度和突变检出精度,降低信息分析产生的假阳性和假阴性。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程,但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程,即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大智造科技有限公司
<120> 一种接头组合物及其应用
<130> 2018年
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
agtcggaggc caag 14
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 2
nnnnnagtcg gaggccaag 19
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
agtcggatcg tagccatgtc gttc 24
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gctacgatcc gactt 15
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
tgtgagccaa ggagttg 17
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
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<210> 7
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
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<210> 8
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
tgtgagccaa ggagttgtca gtgagtcttg tcttcctaag accgcttggc ctccgact 58
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
tgtgagccaa ggagttgact gccttatttg tcttcctaag accgcttggc ctccgact 58
<210> 10
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
tgtgagccaa ggagttgaat ctatcaattg tcttcctaag accgcttggc ctccgact 58
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
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<210> 12
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
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<210> 13
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
tgtgagccaa ggagttgggg aaacatgttg tcttcctaag accgcttggc ctccgact 58
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
gaacgacatg gctacga 17
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
tgtgagccaa ggagttg 17
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 16
nnnnnagtcg gaggccaag 19
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 17
nnnnnagtcg gaggccaagc ggt 23
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 18
nnnnnagtcg gaggccaagc ggtcttagga aga 33