CN109295500A

CN109295500A - 一种单细胞甲基化测序技术及其应用

Info

Publication number: CN109295500A
Application number: CN201811123559.8A
Authority: CN
Inventors: 王辉; 郭弘妍; 邓莉莉; 邢婉丽; 程京
Original assignee: CapitalBio Corp
Current assignee: Tsinghua University; CapitalBio Corp
Priority date: 2018-09-26
Filing date: 2018-09-26
Publication date: 2019-02-01
Anticipated expiration: 2038-09-26
Also published as: CN109295500B

Abstract

本发明公开了一种单细胞甲基化测序技术及其应用。本发明具有如下优点：(1)操作简单，手工操作时间短，不易污染。(2)针对重硫酸盐处理后基因组序列特点，设计预扩增引物。预扩增引物3’端为H碱基。H碱基不与C互补结合，不影响预扩增引物与重亚硫酸盐转化后的序列结合，但可降低随机引物和接头序列结合的几率；(3)具有更高的Mapping率，有效的提高了测序数据的使用率，比目前的scRRBS(平均25％)和scBS(平均10‑30％)左右，提高20％‑30％。本发明对于单细胞DNA甲基化研究具有重要意义。

Description

一种单细胞甲基化测序技术及其应用

技术领域

本发明涉及一种单细胞甲基化测序技术及其应用。

背景技术

近年来的研究显示，DNA甲基化在许多生物过程中都起着关键的调控作用，例如基因表达的调控、转座子的活性、X染色体失活以及基因组印记维持等。基因组DNA甲基化存在组织特异性，且与发育、衰老密切相关，异常的DNA甲基化通常发生在许多疾病甚至癌症细胞的基因组中。目前，在单细胞水平研究全基因组范围内的甲基化已成为研究热点，对高异质性细胞表观遗传信息的发掘有重大意义，大规模单细胞表观遗传学分析，在胚胎发育，复杂疾病如癌症发生的调控机制、细胞异质性，癌症的早期发现和预后效果评估及进行癌症的研究治疗提供了可能。

对于单细胞DNA甲基化，目前主要有2种常用的方法。第一种是单细胞简化甲基化测序技术(scRRBS)，这种方法不但操作复杂，而且由于RRBS技术法的限制，只能够检测到全基因组上5％左右的CpG位点的甲基化信息，且这些位点主要集中在CpG相对密集的区域，如CpG岛、启动子区等，无法得到基因组其他区域的DNA甲基化，限制了scRRBS方法在研究单细胞甲基化方面的应用。第二种是单细胞全基因组甲基化测序技术(Single Cell WholeGenome Bisulfite Sequencing)，可检测单个细胞的全基因组甲基化水平，可检测更多的全基因组上的CpG位点的甲基化信息。但这种方法极其复杂，主要步骤包括细胞裂解、BS转化、带有biotin标记的预扩增引物的预扩增、预扩增一链的磁珠捕获回收、ExoI引物消化、Oligo2引物预扩增以及后续的PCR扩增和indexing。此过程非常耗时和繁复，扩增过程中每个循环都需要新加入Klenow酶，步骤繁复，耗时耗力。反应多次开盖操作，极易造成污染，给后续分析带来极大困难，并造成数据量浪费，测序数据Mapping率低，文献报道的Mapping率仅有10-30％左右，造成大量的数据浪费。

发明内容

本发明的目的是提供一种单细胞甲基化测序技术及其应用。

本发明提供了一种单细胞甲基化测序文库的的构建方法，包括如下步骤：

(1)将单细胞裂解并进行重亚硫酸盐转化；

(2)以步骤(1)处理得到的DNA样本为模板，利用BstDNA聚合酶和引物甲进行第一链的合成；所述引物甲包括测序接头甲和随机引物甲；所述随机引物甲包括5-9个N和1-2个H；所述碱基H位于引物甲的3’末端；

(3)以步骤(2)的产物为模板，利用引物乙进行第二链的合成；所述引物乙包括测序接头乙和随机引物乙；所述随机引物乙包括5-9个N和0-2个H；所述碱基H位于引物乙的3’末端；

(4)对步骤(3)的产物进行PCR扩增，得到测序文库；PCR扩增时向样本引入index标签；

所述测序接头甲和测序接头乙为根据不同测序平台选择对应的测序接头。

所述随机引物甲具体可包括5个N和2个H；

所述随机引物乙具体可包括6个N和1个H。

所述测序平台具体可为illumina测序平台；当测序平台为illumina测序平台是，所述测序接头甲具体可为P5测序接头；所述测序接头乙具体可为P7测序接头。

所述测序平台具体可为illumina测序平台；所述引物甲具体可为序列表的序列1所示的单链DNA分子；所述引物乙具体可为序列表的序列2所示的单链DNA分子。

所述步骤(2)的反应体系中含有DNA样本、10×Blue Buffer(NEB公司)、dNTP200-400μM、引物甲100-400nM、Bst DNA聚合酶4U-16U和无核酸酶水。

所述步骤(2)的反应体系具体可为：DNA样本9μL，10×Blue Buffer(NEB公司)4μL，dNTP1.6μL，引物甲1.6μL，BstDNA聚合酶2μL，无核酸酶水21.8μL。所述dNTP以溶液方式加至反应体系，dNTP在溶液中的浓度为5-10mM。所述引物甲以引物溶液的形式加至反应体系，引物甲在引物溶液中的浓度为5-10μM。所述Bst酶以酶溶液的形式加至反应体系，Bst酶在酶溶液中的浓度为6-8U/μL。

以上任一所述所述BstDNA聚合酶为Bst DNA聚合酶大片段、Bst2.0DNA聚合酶或Bst3.0DNA聚合酶。

所述步骤(2)的反应程序具体可如表2所示。

所述步骤(2)后还包括采用Exonuclease I消化随机引物的步骤和采用0.8XAgencourtAMPure XP Beads纯化产物的步骤。

所述步骤(3)的反应体系中含有Klenow酶。

所述步骤(3)的反应体系中含有步骤(2)的产物、10×Blue Buffer(NEB公司)、dNTP 200-500μM、引物乙100-500nM、Klenow酶(NEB公司)：6-8U/μL和无核酸酶水。

所述步骤(3)的反应体系具体可为：步骤(2)的产物10-21μL，终浓度为1×的BlueBuffer(NEB公司)，dNTP 200-400μM，引物乙100-400nM，Klenow酶6-8U/μL，无核酸酶水20μL。所述dNTP以溶液方式加至反应体系，dNTP在溶液中的浓度为10mM。所述引物乙以引物溶液的形式加至反应体系。

所述步骤(3)的反应程序具体可如表5所示。

所述步骤(3)后还包括采用0.8XAgencourt AMPure XP Beads纯化产物的步骤。

所述步骤(4)中PCR采用的引物对由上游引物和下游引物组成；所述下游引物中包括index标签序列。所述上游引物和下游引物为测序平台对应的接头序列。所述上游引物具体可如序列表的序列3所示。所述下游引物自5’端依次为区段甲、index标签序列和区段乙。所述区段甲如序列表的序列4所示，所述区段乙如序列表的序列5所示。

本发明还保护以上任一所述的方法制备得到的单细胞甲基化测序文库。

本发明还保护一种用于构建单细胞甲基化测序文库的试剂盒，包括以上任一所述的Bst DNA聚合酶、引物甲和引物乙。所述试剂盒还包括含有index标签的扩增引物。所述试剂盒还包括其他文库构建所需的试剂。

本发明还保护单细胞甲基化测序方法，包括如下步骤：利用以上任一所述单细胞甲基化测序文库构建方法构建单细胞甲基化测序文库，然后对所述单细胞甲基化测序文库进行测序。

本发明还保护以上任一所述单细胞甲基化测序文库构建方法在单细胞DNA甲基化研究中的应用。

本发明还保护所述单细胞甲基化测序文库或所述试剂盒在单细胞DNA甲基化研究中的应用。

本发明还保护所述单细胞甲基化测序方法在单细胞DNA甲基化研究中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)操作简单，手工操作时间短，不易污染。采用一步预扩增方法，采用耐热Bst酶进行预扩增，60-65℃高温退火，促进预扩增引物和模板结合，Bst酶具有链置换活性，具有更好的预扩增效果。单次循环中不需要新加聚合酶，不需要模板变性后再加入酶反应液，减少4次开盖操作，减少污染，具体更好的抗污染能力，非目标细胞污染基因组序列降低20％左右。手工操作时间减少2小时。(2)针对重硫酸盐处理后基因组序列特点，设计预扩增引物。预扩增引物3’端为H碱基。H碱基不与C互补结合，不影响预扩增引物与重亚硫酸盐转化后的序列结合，但可降低随机引物和接头序列结合的几率；(3)具有更高的Mapping率，有效的提高了测序数据的使用率，比目前的scRRBS(平均25％)和scBS(平均10-30％)左右，提高20％-30％。本发明对于单细胞DNA甲基化研究具有重要意义。

附图说明

图1为建库流程图。

图2为文库构建2100检测结果。A：文献方法构建文库2100结果；B：本发明方法构建文库2100结果。

图3为文献方法测序数据目标细胞(人源细胞A549)基因组所占比例。

图4为本发明方法测序数据目标细胞(人源细胞A549)基因组所占比例。

图5为不同方法Mapping率和每M reads可检测CpG位点数比较。A：不同方法Mapping率比较；B：不同方法每M reads可检测CpG位点数比较。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

A549细胞：国家实验细胞资源共享服务平台，资源号：3111C0001CCC000002。

实施例1、单细胞甲基化测序方法的建立

建库流程见图1。本实施例中以A549细胞为例进行操作。

一、单细胞挑取

1、取2.5μL单细胞裂解液Buffer(BufferRLT Plus，QIAGEN，货号：1053393)，置于0.2mL的离心管中，瞬时离心(≤600g，～5sec)，备用。

2、挑取单个A549细胞，置于步骤1的裂解液中，室温下裂解10min。

二、重亚硫酸盐转化

重亚硫酸盐转化可采用任何一款重亚硫酸盐转化试剂盒。

本实施例中采用的是EZ DNAMethylation-Lightning试剂盒(ZYMO research)进行重亚硫酸盐转化，参照试剂盒说明书操作，具体步骤如下：

(1)每个细胞掺入一定量Lambda DNA，添加H₂O至终体积为10μL。

(2)取600μL M-Binding Buffer加入到Zymo-Spin^TM IC Column，并将步骤(1)的样品加入到Zymo-Spin^TM IC Column中，颠倒混匀几次，离心弃穿流液。

(3)加入100μL的M-Wash Buffer洗涤Zymo-Spin^TM IC Column一次。

(4)加入200μL的L-Desulphonation Buffer到Zymo-Spin^TM IC Column洗涤一次。

(5)200μLM-Wash Buffer洗涤Zymo-Spin^TM IC Column 2次。

(6)加入200μL的M-Wash Buffer到Zymo-Spin^TM IC Column中，14,000rpm离心30s。弃穿流液。

(7)柱子放在一个新的1.5mL的离心管上，在Zymo-Spin^TM IC Column中加入10μL的Elution Buffer，室温静置1min，14,000rpm离心30s，收集DNA，约9μL。

重亚硫酸盐转化可以将未甲基化的C转化为T，而甲基化的C则不受影响。

三、Oligo1预扩增

预扩增引物序列为meth_P5NH。

meth P5NH：5’-TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNHH-3’(序列1)。

meth_P5NH引物包括2部分，下划线部分为P5端测序接头，可与测序扩增引物结合，3’端为5-9个N和1-2个H。H碱基不与C互补结合，不影响预扩增引物与重亚硫酸盐转化后的基因组序列结合，但可降低随机引物和接头序列结合的几率。

1、使用1.5mL的低吸附性PCR离心管按照表1配制预扩增反应体系，混合后吹吸5次混匀，瞬时离心(≤600g，～5sec)收集上清液，运行表2程序。

表1预扩增反应体系

表2预扩增反应程序

2、完成步骤1后，向体系中加入2μL Exonuclease I(20U/μL)(NEB，货号：M0293S)，37℃孵育1h。

3、完成步骤2后，采用0.8XAgencourtAMPure XP Beads进行纯化，最后加入23μL洗脱液洗脱核酸，回收21μL。

四、Oligo2标记

Oligo2标记采用的引物为meth_P7NH。

meth_P7NH：5’-CCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNH-3’(序列2)。

meth_P7NH包括2部分，下划H线部分为P7端测序接头，3’端为5-9个N和0-2个HH。

1、使用1.5mL的低吸附性PCR离心管按照表4配制标记反应体系，混合后吹吸5次混匀，瞬时离心(≤600g，～5sec)收集上清液。

表4标记反应体系

成分	体积
		10×BlueBuffer	5μL
10mMdNTP	2μL
		meth_p7NH(10μM)	2μL
Nuclease-freewater	20μL
		总计	29μL

2、将29μL步骤1得到的上清液加入到步骤三得到的21μL样品管中，瞬时离心(≤600g，～5sec)收集上清液。

3、将步骤2得到的上清液95℃变性1min，然后立即将样品置于冰上2min，然后室温离心(500g，10sec)收集上清液。

4、完成步骤3后，向上清液中加入1μL的Klenow fragment(3’-5’exo-)，50U/μL。涡旋5sec(不可直接振混)，瞬时离心(≤600g，～5sec)收集上清液。

5、完成步骤4后，设置热盖温度为42℃，运行表5程序。程序结束后，瞬时离心(≤600g，～5sec)收集上清液。

表5标记反应程序

阶段	温度	时间
			Hold	4℃	5min
165个循环(0.2℃/个循环)	4℃-37℃	6sec(0.2℃)
			Hold	37℃	90min
Hold	4℃	Hold

6、完成步骤5后，采用0.8XAgencourtAMPure XP Beads进行纯化，最后加入23μL洗脱液洗脱核酸，回收上清21μL。

五、index-PCR扩增

1、使用1.5mL的离心管按照表6配制index-PCR扩增反应体系，混合后吹吸5次混匀，瞬时离心(≤600g，～5sec)收集上清液。

表6 index-PCR扩增反应体系

i5_Primer：5’-CAAGCAGAAGACGGCATATAGCCTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’(序列3)；

p7_index primer:5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(序列4)XXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(序列5)-3’。

2、将29μL步骤1得到的上清液加入到步骤四得到的21μL样品管中，瞬时离心(≤600g，～5sec)收集上清液。

3、完成步骤2后，使用200μL移液器吹打混匀5次，瞬时离心(≤600g，～5sec)收集上清液放入PCR仪中。设置热盖温度为103℃，运行表7的程序。程序结束后，瞬时离心(≤600g，～5sec)收集上清液。

表7 index-PCR扩增反应程序

4、完成步骤3后，采用0.8XAgencourtAMPure XP Beads进行纯化，最后加入15μL洗脱液洗脱核酸。-20℃保存备用。

六、上机测序

利用Qubit2.0DNA检测试剂盒对步骤五得到的反应产物进行精确定量，利用Agilent High Sensitivity DNA Kit对反应产物进行质控。不同样品等质量文库产物pooling后，进行illumina 2×150bp测序。

七、结果分析

1、分别采用本发明方法与对比文献(Smallwood S A,Lee H J,Angermueller C,et al.Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigeneticheterogeneity.[J].Nature Methods,2014,11(8):817.)的方法构建单细胞甲基化文库，使用Aglient2100核酸分析仪分析文库DNA片段大小范围。

结果见图2。结果表明，文献方法所建文库2100结果在200bp-1000bp，主峰在300bp左右。本发明中所建文库2100结果在200bp-2000bp，主峰在400-500bp左右。

2、对步骤1的两种方法构建的文库的微生物污染进行分析，分析方法参照文献：Smallwood S A,Lee H J,Angermueller C,et al.Single-cell genome-wide bisulfitesequencing for assessing epigenetic heterogeneity.[J].Nature Methods,2014,11(8):817.。

结果见图3和图4。结果表明，文献方法构建的文库中仅有61％的reads来源于人类基因组(A549细胞)(图3)，而本发明文库中来源于人类基因组(A549细胞)的reads数比例为81％(图4)。本发明防污染性能提高20％。说明本方法，具有更好的防污染能力，更易操作。

3、对步骤1的两种方法构建的文库的Mapping率比较。

结果如图5所示。结果表明，本方法文库测序数据Mapping可达到57.44％。而文献方法的Mapping仅可到36.07％。本发明方法(Method2)比文献方法(Method1)提高21.36％(图5A)。相同Reads数下本发明方法(Method2)在CpG检测数量上大于文献方法(Method1)(图5B)。

序列表

<110> 博奥生物集团有限公司

<120> 一种单细胞甲基化测序技术及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(29)

<223> n=a or t or c or g

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(31)

<223> h=a or t or c

<400> 1

ttcagacgtg tgctcttccg atctnnnnnh h 31

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(29)

<223> n=a or t or c or g

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> h=a or t or c

<400> 2

cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnh 30

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caagcagaag acggcatata gcctgtgact ggagttcaga cgtgtgctct tccgatct 58

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33

Claims

1.一种单细胞甲基化测序文库的构建方法，包括如下步骤：

(1)将单细胞裂解并进行重亚硫酸盐转化；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述随机引物甲包括5个N和2个H；

所述随机引物乙包括6个N和1个H。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述测序平台为illumina测序平台；

所述测序接头甲为P5测序接头；

所述测序接头乙为P7测序接头。

4.如权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于：

所述BstDNA聚合酶为Bst DNA聚合酶大片段、Bst2.0DNA聚合酶或Bst3.0DNA聚合酶。

5.权利要求1-4任一所述的方法制备得到的单细胞甲基化测序文库。

6.一种用于构建单细胞甲基化测序文库的试剂盒，包括权利要求1-4中任一所述的BstDNA聚合酶、引物甲和引物乙。

7.单细胞甲基化测序方法，包括如下步骤：利用权利要求1-4任一所述方法构建单细胞甲基化测序文库，然后对所述单细胞甲基化测序文库进行测序。

8.权利要求1-4任一所述方法在单细胞DNA甲基化研究中的应用。

9.权利要求5所述的单细胞甲基化测序文库或权利要求6所述的试剂盒在单细胞DNA甲基化研究中的应用。

10.权利要求7所述的单细胞甲基化测序方法在单细胞DNA甲基化研究中的应用。