CN110982883A - 一种高通量单细胞基因组5-羟甲基嘧啶单分子可视化分析方法 - Google Patents

一种高通量单细胞基因组5-羟甲基嘧啶单分子可视化分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高通量单细胞基因组5‑羟甲基嘧啶单分子可视化分析方法，属于分析化学技术领域，利用微流控芯片技术获得包裹单细胞基因组的琼脂糖凝胶微球；对其中的单细胞进行裂解处理后，每个琼脂糖凝胶微球中均包裹单细胞基因组。随后通过特异性的化学反应对单细胞基因组5‑hmC和5‑hmU标记上引物，然后滚环扩增后并杂交荧光探针，实现修饰碱基5‑hmC和5‑hmU的单分子可视化分析。本发明通过微流控液滴法可以在短时间内形成大量液滴，高效地得到包裹单细胞基因组的高通量琼脂糖凝胶微球，进而实现高通量单细胞目标物的分析，避免细胞异质性带来的差异，实现准确检测，反应具有特异性，高产率、反应条件简单、反应速度快等优势。

Description

一种高通量单细胞基因组5-羟甲基嘧啶单分子可视化分析 方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及一种高通量单细胞基因组5-羟甲基嘧啶单分子可视化分析方法。
背景技术
在人类基因组中除了A、T、C、G四种经典碱基外还包含有经过化学修饰的DNA碱基。通常来说这些化学修饰碱基由内源性酶或者外源性因子产生。当前，研究人员已经在哺乳动物基因组中发现多种化学修饰的碱基，其中最著名的是5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)及其氧化衍生物5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)，5-甲酰基胞嘧啶(5-formylcytosine，5-fC)和5-羧胞嘧啶(5-carboxylcytosine，5-caC)。这些化学修饰碱基具有深刻影响基因组功能和细胞过程的潜力，当前这些表观遗传标记已被证明在调节基因表达中起重要作用。
当前已经有研究表明，5-hmU在基因组DNA中含量很低。例如在mES细胞中，5-hmU约占基因组DNA的0.00005％，这一含量相仅为5-hmC丰度的0.1％。这就使得5-hmU的分析十分困难，尤其是在单个细胞中的分析，并且5-hmU和5-hmC之间的结构相似性也阻碍了对这些修饰的区分。近来，已经报道了两种化学方法能够通过化学氧化将5-hmU转化为5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-fU)来检测基因组5-hmU。其中一种方法是通过在聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)过程中形成5-fU：G碱基配对，诱导的T到C碱基发生变化。但是，即使在优化条件下，这种碱基改变的比例也低于40％，并且无法使用功能标签标记5-hmU。另一种方法是通过(+)-生物素酰胺己酸酰肼对生成的5-fU进行标记，然后进行富集和测序分析。然而，这种肼试剂也对基因组DNA中存在的其他带有醛基的组分具有很高的反应性，尤其是5-fC和无碱基位点。
除了化学方法外，酶促识别还提供了其他分析修饰的DNA碱基的方法。当前已有研究人员采用人类单链选择性单功能尿嘧啶DNA糖基化酶(Human Singlestrand-selectiveMonofunctional Uracile-DNA Glycosylase，hSMUG1)切除并释放了活细胞中受损DNA中的尿嘧啶。但是hSMUG1还具有催化5-hmU和5-fU底物水解的功能，所以该方法不适用于哺乳动物基因组。除此之外，T4噬菌体β-葡萄糖基转移酶(β-GT)可用于标记和分析基因组DNA中的5-hmC，它能将叠氮化物-葡萄糖部分转移至双链(ds)DNA中的5-hmC：G。由于5-hmU和5-hmC在结构上相似，目前已发现β-GT在错配的5-hmU：G位点标记5-hmU残基，但匹配的5-hmU：A不是β-GT的活性底物。另外，这些现有方法均需要大量的DNA材料。因此，修饰碱基的识别和单细胞分析仍然具有挑战性。
微流控液滴技术为单细胞的操作和分析提供了一个平台。该技术使用不混溶的多相流生成单分散液滴，可作为独立隔室微反应器。利用该技术可以在短时间内形成大量液滴，这使高通量单细胞分析能够揭示大群体的细胞异质性。根据这些特点，现有各种微流控液滴系统用于捕获，培养，分选和检测单细胞，但是当前还没有将微流控方法用于特异性检测单细胞5-hmU和5-hmC的相关报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种高通量单细胞基因组5-羟甲基嘧啶单分子可视化分析方法，包括以下步骤：
1)通过微流控芯片获取包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球，对包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球中的单细胞进行裂解处理后，使每个琼脂糖凝胶微球中均包裹单细胞基因组；
2)通过特异性的化学反应给单细胞基因组中的5-羟甲基胞嘧啶和5-羟甲基尿嘧啶标记上引物；
3)经滚环扩增后并杂交荧光探针，实现修饰碱基5-羟甲基胞嘧啶和5-羟甲基尿嘧啶的单分子可视化分析。
优选地，步骤1)中，将包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球于4℃下，固化3～5h，取出进行破乳化处理；然后将细胞裂解液加入经破乳化处理的凝胶微球中，37℃震荡裂解过夜，制得包裹单细胞基因组的琼脂糖凝胶微球。
优选地，破乳化处理是依次利用异丙醇、无水乙醇和PBS对凝胶微球进行破乳化处理。
优选地，包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球中琼脂糖含量为1.5％w/v。
优选地，步骤2)中，采用马来酰亚胺修饰的DNA引物标记基因组5-羟甲基尿嘧啶；采用DBCO修饰的DNA引物标记基因组5-羟甲基胞嘧啶。
优选地，步骤3)中，滚环扩增产物杂交荧光探针后，利用荧光共聚焦显微镜进行单分子成像分析。
优选地，通过滚环扩增过程产生长的单链DNA扩增产物，且包含多个周期性重复的序列，每个滚环扩增产物能够捕获多个荧光探针分子以实现信号放大。
优选地，单个细胞中5-羟甲基胞嘧啶和5-羟甲基尿嘧啶的位点数量通过每个包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球中的斑点数量进行评估，用于实现单细胞内修饰碱基的单分子可视化分析。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明所述的微流控液滴技术，可以在短时间内形成大量液滴，高效地得到包裹单细胞基因组的高通量琼脂糖凝胶微球，进而实现高通量单细胞目标物的分析，避免细胞异质性带来的差异，实现准确检测。
2)本发明所述的马来酰亚胺修饰、DBCO修饰的DNA引物标记基因组5-hmU和5-hmC的酶促过程，反应具有特异性，高产率、反应条件简单、反应速度快。
3)本发明所述的方法通过RCA过程产生长的单链DNA扩增产物，且包含多个周期性重复的序列，每个RCA产物可以捕获多个荧光探针分子以实现信号放大。
4)单个细胞中5-hmU和5-hmC的位点数量可以通过每个凝胶微球中的斑点数量来评估，即可实现单细胞内修饰碱基的单分子可视化分析。
附图说明
图1为本发明的原理图；
图2为凝胶微球中的单细胞5-hmU分析；其中，(A)为凝胶微球包裹单细胞表征结果；(B)为该方法特异性成像结果展示；(C)为不同对照条件的单细胞5-hmU荧光强度及亮点个数统计分析结果；
图3为本发明所述方法得到的不同细胞系中双目标物5-hmU和5-hmC的分析结果；其中，(A)为5-hmU和5-hmC的强度分布、点数统计以及二者的共定位率分析；(B)为对应(A)图的凝胶微球荧光成像图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
参见图1，本发明公开的高通量单细胞基因组5-羟甲基嘧啶单分子可视化分析方法，首先，利用微流控芯片技术获得包裹单细胞基因组的琼脂糖凝胶微球，对其中的单细胞进行裂解处理后，每个琼脂糖凝胶微球中均包裹单细胞基因组；随后，通过特异性的化学反应对单细胞基因组5-hmC和5-hmU标记上引物；然后，滚环扩增后并杂交荧光探针，实现修饰碱基5-hmC和5-hmU的单分子可视化分析。
实施例1
将MCF-7贴壁细胞消化并配制一定细胞密度的悬浮液；通过微流控芯片获取大量包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球，对其中的单细胞进行裂解处理后，每个琼脂糖凝胶微球中均包裹单细胞基因组。随后通过特异性的化学反应分别给单细胞基因组5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)及5-羟甲基尿嘧啶(5-hmU)标记上引物，然后滚环扩增(RCA)后并杂交荧光探针，用SYBR Green I对凝胶微球中的基因组染色，最后利用荧光共聚焦显微镜进行成像分析。
单个细胞中5-hmU和5-hmC的位点数量可以通过每个凝胶微球中的斑点数量来评估，即可实现单细胞内修饰碱基5-hmC和5-hmU的单分子可视化分析。
结果如图2和图3所示，利用显微镜的明场及荧光成像，对凝胶微球的单细胞包裹率进行了表征；进一步针对不同对照条件下单细胞中5-hmU的荧光强度及亮点个数，通过成像及统计结果证明本发明中单分子可视化方法的特异性。另外，本发明所述方法可以实现多个细胞系中、同时对两个目标物5-hmU和5-hmC的联合分析，分析结果包括荧光成像图、荧光强度分布、荧光点数统计以及两种目标物的共定位率分析等，可以为相关领域研究者提供坚实的数据基础。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种高通量单细胞基因组5-羟甲基嘧啶单分子可视化分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)通过微流控芯片获取包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球，对包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球中的单细胞进行裂解处理后，使每个琼脂糖凝胶微球中均包裹单细胞基因组；
2)通过特异性的化学反应给单细胞基因组中的5-羟甲基胞嘧啶和5-羟甲基尿嘧啶标记上引物；
3)经滚环扩增后并杂交荧光探针，实现修饰碱基5-羟甲基胞嘧啶和5-羟甲基尿嘧啶的单分子可视化分析。
2.根据权利要求1所述的高通量单细胞基因组5-羟甲基嘧啶单分子可视化分析方法，其特征在于，步骤1)中，将包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球于4℃下，固化3～5h，取出进行破乳化处理；然后将细胞裂解液加入经破乳化处理的凝胶微球中，37℃震荡裂解过夜，制得包裹单细胞基因组的琼脂糖凝胶微球。
3.根据权利要求1所述的高通量单细胞基因组5-羟甲基嘧啶单分子可视化分析方法，其特征在于，破乳化处理是依次利用异丙醇、无水乙醇和PBS对凝胶微球进行破乳化处理。
4.根据权利要求1所述的高通量单细胞基因组5-羟甲基嘧啶单分子可视化分析方法，其特征在于，包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球中琼脂糖体积含量为1.5％。
5.根据权利要求1所述的高通量单细胞基因组5-羟甲基嘧啶单分子可视化分析方法，其特征在于，步骤2)中，采用马来酰亚胺修饰的DNA引物标记基因组5-羟甲基尿嘧啶；采用DBCO修饰的DNA引物标记基因组5-羟甲基胞嘧啶。
6.根据权利要求1所述的高通量单细胞基因组5-羟甲基嘧啶单分子可视化分析方法，其特征在于，步骤3)中，滚环扩增产物杂交荧光探针后，利用荧光共聚焦显微镜进行单分子成像分析。
7.根据权利要求1～6中任意一项所述的高通量单细胞基因组5-羟甲基嘧啶单分子可视化分析方法，其特征在于，通过滚环扩增过程产生长的单链DNA扩增产物，且包含多个周期性重复的序列，每个滚环扩增产物能够捕获多个荧光探针分子以实现信号放大。
8.根据权利要求1～6中任意一项所述的高通量单细胞基因组5-羟甲基嘧啶单分子可视化分析方法，其特征在于，单个细胞中5-羟甲基胞嘧啶和5-羟甲基尿嘧啶的位点数量通过每个包裹单细胞的琼脂糖凝胶微球中的斑点数量进行评估，用于实现单细胞内修饰碱基的单分子可视化分析。
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