CN103409514A - 一种基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，该方法首先将滚环扩增引物固定到芯片上成微阵列，然后用β-葡萄糖基转移酶处理待检测基因组DNA，将基因组DNA中所有5hmC进行糖基化修饰，再用亚硫酸钠处理修饰后DNA，然后将检测不同C位点的开环探针置于同一反应管中进行杂交连接；再将连接后产物同芯片杂交，固定芯片的特异引物以连接探针为模板进行滚环扩增，最后不同荧光检测探针同芯片杂交：根据芯片不同矩阵点荧光的类型和强弱，判断出基因组DNA不同C位点是否发生了羟甲基化及其频率大小。该方法可操作性强，特异性强，灵敏度高，检测结果准确，检测效率高，且检测成本低，应用范围广泛。

Description

一种基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法

技术领域

本发明属于基因芯片技术，特别设计基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法。

背景技术

早在上世纪70年代，Penn等人首次发现在哺乳动物DNA中存在5-羟甲基化胞嘧啶（5hmC）(Pennetal.,1972)。然而由于研究方法的落后，5hmC一直没有受到应有的重视。直到2009年，Kriaucionis和Tahiliani两位科学家证实小鼠的Purkinje细胞，颗粒神经元以及胚胎干细胞存在5hmC(Kriaucionis and Heintz,2009;Tahiliani et al.,2009)，在哺乳动物的其他组织中同样检测到大量5hmC的存在(Globisch et al.,2010)，人们才意识到5hmC对于调节机体生理生化的重要性研究。因此，5hmC已成为表观遗传学研究的热点。然而，如何调控基因组5hmC的含量以及如何高效检测基因组特定位点的5hmC状态，则对其调控的分子机制显得尤为重要。对于前者，新近发现TET蛋白家族使人们对5hmC有了更深入的了解，TET是一种能够催化5甲基胞嘧啶产生5羟甲基胞嘧啶的加氧酶。TET蛋白家族有3个成员，分别是Tet1，Tet2和Tet3。它们都含有一个序列保守的C-端催化结构域片(Ito et al.,2010;Tahiliani et al.,2009)，并具有2-氧化戊二酸和2价铁原子依赖型双加氧酶的典型特征(Aravind and Koonin,2001;Loenarz and Schofield,2009)。通过调控TET的表达来调节特定基因的5hmC含量，来实现5hmC参与信号通路调控的机制研究。而对于高效检测基因组特定位点的5hmC状态，目前只能检测有限的5hmC位点，或者检测结果存在假阳性，检测结果不准确以及检测成本高的限制。因此，很有必要在现有技术的基础之上，研究设计一种基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法。

发明内容

发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种检测结果准确，高通量，高特异性，高灵敏度，成本低，操作简便易行的5-羟甲基化胞嘧啶的检测方法。

技术方案：为了实现以上目的，本发明所采取的技术方案为：

一种基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其包括以下步骤：

（1）首先将滚环扩增引物固定到芯片上成微阵列；

（2）然后用β-葡萄糖基转移酶处理待检测基因组DNA，将待检测基因组DNA中所有5-羟甲基化胞嘧啶进行糖基化修饰，再用亚硫酸钠处理糖基化修饰后的DNA，DNA中所有未发生羟甲基化胞嘧啶C反转成尿嘧啶U，而糖基化修饰5-羟甲基化胞嘧啶不被反转；

然后将检测不同C位点的开环探针I和开环探针II放置于同一反应管中，并进行杂交连接，若特定C位点发生羟甲基化，则开环探针I能连接成环（从而可用于检测5-羟甲基化胞嘧啶）；若未发生羟甲基化，则开环探针II能连接成环（可用于检测尿嘧啶U）；

（3）再将步骤（2）连接成环后产物同步骤（1）芯片杂交，固定芯片的滚环扩增引物以步骤（2）中的连接成环后产物为模板进行滚环扩增；然后采用不同荧光检测探针同芯片杂交，根据芯片不同矩阵点荧光的类型和强弱，检测出待测基因组DNA中不同C位点是否发生了羟甲基化及其频率大小，从而实现快速检测待测基因组DNA中5-羟甲基化胞嘧啶。

作为优选方案，以上所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其中步骤（1）所述的滚环扩增引物长23bp，其包括5’端8个T和3’端15bp，近3’端15bp与开环探针I或开环探针II的5’端的15bp序列互补。

作为优选方案，以上所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，所述芯片是普通玻璃片或是微球，其表面是聚丙烯酰胺修饰；被固定的扩增引物5’端为丙烯酰胺基团修饰。

作为优选方案，以上所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，步骤（2）所述的开环探针I和开环探针II均为合成的寡核苷酸，开环探针I和开环探针II均由4部分组成，分别包括30bp的C位点检测部分、17bp的通用荧光检测探针杂交部分、15bp的通用扩增引物杂交部分以及5bp的连接序列部分；其中开环探针I和开环探针II的C位点检测部分和通用荧光检测探针杂交部分不同，而通用扩增引物杂交部分和连接序列部分的序列长度和组成均相同。以上所述的开环探针I和开环探针II的C位点检测部分，其中仅对应C位点互补碱基开环探针I为A，而开环探针II为G，其余序列相同。

作为优选方案，以上所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，步骤（2）所述的连接成环是指开环探针I或与开环探针II分别与对应的C位点所在序列互补配对后，开环探针I或与开环探针II的5’和3’端在连接酶作用下被连接起来。

作为优选方案，以上所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，步骤（3）所述的滚换扩增，是指连接成环的探针与芯片固定的滚环扩增引物杂交后，扩增引物以连接成环的探针为模板进行引物延伸反应。

作为优选方案，以上所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，步骤（3）所述的不同荧光检测探针是指若C位点碱基为C或mC则荧光探针为Cy3标记，若C位点碱基为hmC则荧光探针为Cy5标记。

以上所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，具体的操作工艺流程如图1所示：

(a)为开环捕获探针结构示意图（探针5’端为G用来检测hmC位点，若为A则用来检测C和mC位点）。其中1是待检测5hmC位点所在序列的互补序列；2为芯片通用滚环扩增引物的结合位置；3为芯片通用荧光检测探针的杂交位置；4为1与2间连接序列。

(b)将检测5hmC位点的不同捕获探针和待测基因组DNA（经糖基化、亚硫酸钠处理后，探针5’端为G）置于同一管中进行配对；

(c)单管中多个开环探针捕获不同5hmC位点并连接成环。5hmC1、5hmC2、5hmC3……5hmCn为基因组DNA上不同5hmC位点;P1、P2、P3……Pn为不同开环检测探针。

(d)闭环探针与芯片上的滚环扩增引物杂交并进行在片滚环扩增。

(e)通用荧光探针与扩增产物杂交，然后根据芯片不同矩阵点荧光的类型和强弱，检测出待测基因组DNA中不同C位点是否发生了羟甲基化。

有益效果：本发明提供的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法和现有技术相比具有以下优点：

a.本发明能够实现基因组5-羟甲基化胞嘧啶（5hmC）位点的高通量检测，本发明将大量不同开环探针在同一个反应管中识别不同C位点的5hmC，并能在识别后连接成闭环探针，随后芯片上特异扩增引物识别该特异闭环探针，并以该闭环探针为模板进行在片滚环扩增，最后通过特异通用荧光检测探针识别放大的模板，通过荧光信号的类型和有无即可实现对5hmC位点的高通量检测。

b.本发明检测5hmC位点信息的特异性与灵敏度高。由于开环检测探针与对应的5hmC位点之间具有惟一对应关系，这种探针设计特点可保证检测探针能特异性识别5hmC位点所在序列信息，从而可保证检测5hmC位点信息的准确性，克服现有技术检测结果假阳性等结果不准确的不足。并且，由于滚环扩增同普通的PCR扩增相比，具有扩增单分子DNA的能力，同时通过滚环扩增还能实现对检测信号成千上万倍的放大，因而具有灵敏度与特异性极高的特点，这种滚环扩增的特点可实现对微量样本的高灵敏检测，取得了很好的技术效果。

c.成本低，对于芯片的检测来说，不同位点需要不同荧光探针是造成检测试验成本高的主要因素，而本发明中同一张芯片只需要2个通用荧光检测探针即可实现对不同C位点的识别，可极大降低试验成本；另外芯片制备简单、操作方便。

具有可推广应用的优点。

d.重复性好，由于本检测方法的整个操作过程具有标准化操作流程，且通过大量实验优选设计出的探针及杂交均属特异性设计，可保证检测芯片的重复性。

附图说明

图1是本发明提供的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶方法的工艺流程图。

图2是按本发明提供的方法，同时检测4只小鼠的BDNF基因的3个不同羟甲基化胞嘧啶位点，40572，41685和42178的芯片结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

以下实施例1至3所用到的探针及其引物的序列如表1所示：

序号	名称	序列
			序列1	(1)hmC开环检测探针骨架	5′-ggtccgacgaccagactcccgaccagactccactgg-3′
序列2	(2)非hmC开环检测探针骨架	5′-ggtccgacgaccagactccctcaagcactggggagc-3′
			序列3	(3)hmC通用荧光检测探针	5′-Cy5-cgaccagactccactgg-3′
序列4	(4)非hmC通用荧光检测探针	5′-Cy3-ctcaagcactggggagc-3′
			序列5	(5)双引物滚环通用引物	5′-ggtccgacgaccagac-3′
序列6	(6)滚环扩增引物	5′-tttttttt+被检测位点自cgcg始15碱基序列-3′

实施例1

实现慢性炎性疼痛小鼠脊髓BDNF基因（NT_039207.8）68个CCGG序列首个C位点（194-59366）羟甲基化胞嘧啶（hmC）状态的检测。

（1）针对上述68个CCGG序列首个C位点分别设计5’端带有丙烯酰胺修饰的特异性扩增引物，稀释成20uM后固定于丙烯酰胺处理后的玻片上成为微阵列芯片。针对上述68个CCGG序列每个C位点分别设计2个开环检测探针，分别为开环检测探针I和开环检测探针II（其中开环探针I用来检测非hmC状态，开环探针II用来检测hmC状态。开环检测探针的主体序列见列表1。

（2）将1ug小鼠脊髓DNA经T4-BGT处理，即用β-葡萄糖基转移酶处理小鼠待检测基因组DNA，将小鼠待检测基因组DNA中所有5-羟甲基化胞嘧啶进行糖基化修饰，再用亚硫酸钠处理糖基化修饰后的DNA，DNA中所有未发生羟甲基化胞嘧啶C反转成尿嘧啶U，而糖基化修饰5-羟甲基化胞嘧啶不被反转（操作步骤按照NEB公司EpiMark^TMBisulfiteConversionKit进行）。

（3）然后将上述136个开环探针稀释后，在20μL反应管至终浓度为1μM，并将上述处理后基因组DNA置于该管中，42℃温浴30min后，在16℃用连接酶连接开环探针30min(按照TAKARA公司T4连接酶说明书进行)。然后将连接产物置于上述步骤（1）芯片上，同特异扩增引物37℃杂交30min后用Bst扩增酶37℃滚环扩增30min（按照NEB公司提供的Bst酶说明）。缓冲液洗涤芯片3min后，用2μM双色通用荧光探针37℃杂交2，洗涤芯片5min后扫描芯片。根据微阵列点荧光的颜色及信号强弱即可判断出每个CCGG序列首个C位点hmC状态。

结果表明，慢性炎性疼痛状态下，小鼠脊髓BDNF基因68个CCGG位点中有3个位点（314，32906和41813）发生了羟甲基化（hmC型），57个位点为发生羟甲基化（mC和C型），8个位点（720，2946，32281，34183，38096，42015，42363，58736）为杂合型（hmC、mC和C型）。而正常小鼠脊髓BDNF基因68个CCGG位点中有1个位点（41813）发生了羟甲基化（hmC型），65个位点为发生羟甲基化（mC和C型），2个位点（38096，42363）为杂合型（hmC、mC和C型）。因此，慢性炎性疼痛小鼠脊髓BDNF基因发生了明显的羟甲基化增加现象。

如图2所示，按实施例1方法同时检测4只疼痛小鼠的BDNF基因（NT_039207.8）的3个不同hmC位点（32131，32906和422363）的芯片结果。其中1代表待检测位点为hmC型；2代表杂合型；3代表该位点为mC和C型。

实施例2

实现慢性类风湿疼痛病人血浆DNA的BDNF基因(AC_000143.1)33个CGCG序列的首个C位点羟甲基化胞嘧啶（hmC）状态的检测。

（1）针对上述33个CGCG序列首个C位点分别设计5’端带有丙烯酰胺修饰的特异性扩增引物，稀释成20uM后固定于丙烯酰胺处理后的玻片上成为微阵列芯片。然后针对上述33个CGCG序列每个C位点分别设计2个开环检测探针，分别为开环检测探针I和开环检测探针II（其中开环探针I用来检测非hmC状态，开环探针II用来检测hmC状态。开环检测探针的主体序列见列表1。

（2）将1ug病人血浆DNA经T4-BGT处理，即用β-葡萄糖基转移酶处理小鼠待检测基因组DNA，将小鼠待检测基因组DNA中所有5-羟甲基化胞嘧啶进行糖基化修饰，再用亚硫酸钠处理糖基化修饰后的DNA，DNA中所有未发生羟甲基化胞嘧啶C反转成尿嘧啶U，而糖基化修饰5-羟甲基化胞嘧啶不被反转（操作步骤按照NEB公司EpiMark^TMBisulfiteConversionKit进行）。将66个开环探针稀释后，在20μL反应管至终浓度为1μM，并将上述处理后基因组DNA置于该管中，42℃温浴30min后，在16℃用连接酶连接开环探针30min(按照TAKARA公司T4连接酶说明书进行)。

（3）然后将连接产物置于步骤（1）制备得到的芯片上，同特异扩增引物37℃杂交30min后，用Bst扩增酶37℃滚环扩增30min（按照NEB公司提供的Bst酶说明）。然后用缓冲液洗涤芯片3min，用2μM双色通用荧光探针37℃杂交2，洗涤芯片5min后扫描芯片。根据微阵列点荧光的颜色及信号强弱即可判断出每个CGCG序列首个C位点的hmC状态。最后分析血浆BDNF基因CGCG位点羟甲基化与慢性炎性疼痛的相关性。

结果表明，慢性类风湿疼痛病人BDNF基因的33个CGCG位点有4个位点（5760，6103，6250和8666）发生了羟甲基化（hmC型），27个位点未发生羟甲基化（mC和C型），2个位点（5956和9064）为杂合型（hmC、mC和C型）。而正常志愿者血样BDNF基因33个CCGG位点中仅有1个位点（6250）为杂合型，其余32个位点未发生羟甲基化（mC和C型）。因此，相对与正常，慢性类风湿疼痛病人血样BDNF基因发生了明显的羟甲基化增加现象。

实施例3

实现对慢性神经病理性疼痛小鼠脊髓DNA的BDNF基因19个CCGG序列（40945-59475）首个C和COMT基因（NT_187012.1）10个CCGG序列(771-15422)首个C的hmC状态联合检测。

（1）针对上述的BDNF基因19个CCGG序列（40945-59475）首个C和COMT基因（NT_187012.1）10个CCGG序列(771-15422)首个C，分别设计5’端带有丙烯酰胺修饰的特异性扩增引物，稀释成20uM后固定于丙烯酰胺处理后的玻片上成为微阵列芯片。针对每个C位点分别设计2个开环检测探针，分别为开环检测探针I和开环检测探针II（其中开环探针I用来检测非hmC状态，开环探针II用来检测hmC状态。开环检测探针的主体序列见列表1。

（2）将1ug小鼠脊髓DNA经T4-BGT处理，即用β-葡萄糖基转移酶处理小鼠待检测基因组DNA，将小鼠待检测基因组DNA中所有5-羟甲基化胞嘧啶进行糖基化修饰，再用亚硫酸钠处理糖基化修饰后的DNA，DNA中所有未发生羟甲基化胞嘧啶C反转成尿嘧啶U，而糖基化修饰5-羟甲基化胞嘧啶不被反转（操作步骤按照NEB公司EpiMark^TMBisulfiteConversionKit进行）。将58个开环探针稀释后，在20μL反应管至终浓度为1μM，并将上述处理后基因组DNA置于该管中，42℃温浴30min后，在16℃用连接酶连接开环探针30min(按照TAKARA公司T4连接酶说明书进行)。

（3）然后将连接产物置于步骤（1）制备得到的芯片上，同特异扩增引物37℃杂交30min后，用Bst扩增酶37℃滚环扩增30min（按照NEB公司提供的Bst酶说明）。用缓冲液洗涤芯片3min，用2μM双色通用荧光探针37℃杂交2，洗涤芯片5min后扫描芯片。根据微阵列点荧光的颜色及信号强弱即可判断出每个CGCG序列首个C位点hmC状态。最后分析BDNF基因19个CGCG位点羟甲基化和COMT基因（NT_187012.1）10个CCGG位点与慢性炎性疼痛的相关性。

结果表明，慢性病理性疼痛状态下，小鼠脊髓BDNF基因19个CCGG位点中有1个位点(58210)为hmC型，16个位点为mC和C型，其余2个位点(42178和57848)为杂合型。而正常小鼠脊髓BDNF基因19个CCGG位点中有18个位点为mC和C型，其余1个位点（42178）为杂合型。COMT基因的10个CCGG位点中，正常小鼠和疼痛小鼠均没有检测到羟甲基化发生。

因此，慢性炎性疼痛小鼠脊髓BDNF基因发生了明显的羟甲基化增加现象；而所检测的COMT基因则没有发生羟甲基化发生。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  徐州医学院

<120>  一种基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法

<130>  001

<160>  5   

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

ggtccgacga ccagactccc gaccagactc cactgg             36

 

<210>  2

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

ggtccgacga ccagactccc tcaagcactg gggagc           36

 

<210>  3

<211>  17

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

cgaccagact ccactgg                              17

 

<210>  4

<211>  17

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

ctcaagcact ggggagc                            17

 

<210>  5

<211>  17

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

ggtccgacga ccagac                            16

Claims (7)

1.一种基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）首先将滚环扩增引物固定到芯片上成微阵列；

（2）然后用β-葡萄糖基转移酶处理待检测基因组DNA，将待检测基因组DNA中所有5-羟甲基化胞嘧啶进行糖基化修饰，再用亚硫酸钠处理糖基化修饰后的DNA，DNA中所有未发生羟甲基化胞嘧啶C反转成尿嘧啶U，而糖基化修饰5-羟甲基化胞嘧啶不被反转；

然后将检测不同C位点的开环探针I和开环探针II放置于同一反应管中，并进行杂交连接，若特定C位点发生羟甲基化，则开环探针I能连接成环；若未发生羟甲基化，则开环探针II能连接成环；

（3）再将步骤（2）连接成环后产物同步骤（1）芯片杂交，固定芯片的滚环扩增引物以连接成环后产物为模板进行滚环扩增；然后采用不同荧光检测探针同芯片杂交，根据芯片不同矩阵点荧光的类型和强弱，检测出待测基因组DNA中不同C位点是否发生了羟甲基化及其频率大小，从而实现快速检测待测基因组DNA中5-羟甲基化胞嘧啶。

2.根据权利要求1所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，步骤（1）所述的滚环扩增引物长23bp，其包括5’端8个T和3’端15bp，近3’端15bp与开环探针I或开环探针II的5’端的15bp序列互补。

3.据权利要求1所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，所述芯片是普通玻璃片或是微球，其表面是聚丙烯酰胺修饰；被固定的扩增引物5’端为丙烯酰胺基团修饰。

4.据权利要求1所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，步骤（2）所述的开环探针I和开环探针II均为合成的寡核苷酸，开环探针I和开环探针II均由4部分组成，分别包括30bp 的C位点检测部分、17bp的通用荧光检测探针杂交部分、15bp的通用扩增引物杂交部分以及5bp的连接序列部分；其中开环探针I和开环探针II的C位点检测部分和通用荧光检测探针杂交部分不同，而通用扩增引物杂交部分和连接序列部分的序列长度和组成均相同。

5.据权利要求1所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，步骤（2）所述的连接成环是指开环探针I或与开环探针II分别与对应的C位点所在序列互补配对后，开环探针I或与开环探针II的5’和3’端在连接酶作用下被连接起来。

6.据权利要求1所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，步骤（3）所述的滚换扩增，是指连接成环的探针与芯片固定的滚环扩增引物杂交后，扩增引物以连接成环的探针为模板进行引物延伸反应。

7.据权利要求1所述的基于芯片的高通量高灵敏检测5-羟甲基化胞嘧啶的方法，其特征在于，步骤（3）所述的不同荧光检测探针是指若C位点碱基为C或mC则荧光探针为Cy3标记，若C位点碱基为hmC则荧光探针为Cy5标记。

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