CN113249446A

CN113249446A - 一种基于核酸等温扩增的全基因组5hmC水平的定量方法及其应用

Info

Publication number: CN113249446A
Application number: CN202110396129.9A
Authority: CN
Inventors: 戴宗; 李运达; 邹小勇; 许宇智
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2021-04-13
Filing date: 2021-04-13
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2041-04-13
Also published as: CN113249446B

Abstract

本发明公开了一种基于核酸等温扩增的全基因组5hmC水平的定量方法及其应用，其主要基于全基因组5hmC检测探针组，使用葡糖基转移酶修饰技术以及链置换线性等温扩增技术实现对全基因组5hmC含量测定。本发明中的检测方法特异性强，能抗C，5mC，5fC和5caC等相似的衍生物的干扰，而且灵敏性强，5hmC线性检测范围为0.016％～0.16％(5hmC/总DNA)，检出限约为0.003％，可以满足痕量样品检测需求，推动了全基因组5hmC含量检测在癌症等疾病检测或监控中的应用。

Description

一种基于核酸等温扩增的全基因组5hmC水平的定量方法及其应用

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基于核酸等温扩增的全基因组5hmC水平的定量方法及其应用。

背景技术

DNA甲基化作为一种重要的表观遗传学修饰途径，在生物体生长发育过程中发挥着极为关键的作用。DNA甲基化的不同形式蕴含不同的遗传信息，甲基胞嘧啶5mC作为甲基化形式中最丰富的一种，其含量的稳定与否关系着生物体各项生命活动能否正常进行。5mC的氧化产物——羟甲基胞嘧啶5hmC、醛基胞嘧啶5fC和羧基胞嘧啶5caC，是去甲基化过程中重要的中间体形式，它们的分布和含量直接影响着DNA甲基化和去甲基化过程的动态平衡，进而影响着整个正常生理活动的进行。其中，5hmC是5mC的氧化产物中含量最高的一种，且在哺乳动物不同组织或细胞中呈现出显著差异，对其进行准确检测，不仅对研究生命发展过程具有重要意义，还可对癌症等疾病的诊断和治疗起指导性作用。

相关技术中，5hmC的检测主要包括两个方面，特定基因的检测以及全基因组的检测。特定基因的检测是为了研究5hmC在基因中的具体分布，其分布可以使用单碱基分辨率的重亚硫酸盐测序确定，但是重亚硫酸盐会导致DNA降解，且测序成本较高，难以推广应用。而全基因组的检测则主要依靠薄层色谱法、色谱-质谱法和基于抗体的检测方法和测序技术等，但这些方法都存在修饰和富集方法的局限，而且需要昂贵的分析仪器或检测试剂，灵敏度较低。

因此，开发一种快速高效、灵敏度高的全基因组5hmC水平的定量方法具有极高的应用价值和实用价值。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于核酸等温扩增的全基因组5hmC水平的定量方法，通过将引物链修饰到5hmC位点，然后利用等温扩增反应检测该引物链，实现了5hmC信号的快速放大，解决了传统方法检测需要昂贵仪器、操作复杂、灵敏度低等问题。

本发明的第一个方面，提供一组5hmC检测探针，该5hmC检测探针包括模型链、引物链和模板链。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述模型链的核苷酸序列为：5’-GAGACCGGAGTCCGCTTTCCTCTTCCGGAAAATGTAAGCCGAACCTAAAGCAATCACCAGGG-3’(SEQID NO.1)；其中，所述模型链核苷酸序列中的自5’端第26位碱基C为5hmC。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述引物链的核苷酸序列为：5’-GATCGGAAGAGCAGTCGTCTGAACTCCAGTCAC-3’(SEQ ID NO.3)；所述引物链5’端连接有二苯并环辛炔。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述模板链的核苷酸序列为：5’-ATTCCGTATTAGTAGATCTCTCTCTCCTCGAGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG-3’(SEQ ID NO.4)。

根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述5hmC检测探针还包括互补链。

在本发明的一些优选实施方式中，所述互补链的核苷酸序列为：5’-CCCTGGTGATTGCTTTAGGTTCGGCTTACATTTTCCGGAAGAGGAAAGCGGACTCCGGTCTC-3’(SEQ ID NO.2)。

本发明中的模型链、互补链是基于P53抑癌基因中一段序列得到，使其具有接近实际样品特征的序列和长度效果，引物链和模板链均通过Nupack软件在传统链置换扩增模板上修改设计得到的，具有很好的结合特异性，用于模拟在真实环境中检测。

在本发明的一些实施方式中，本发明中选择的P53抑癌基因序列是P53抑癌基因中启动子和外显子1中易发生羟甲基化的序列(NCBI序列号：AF287146.1，碱基范围为437～498位)。

本发明的第二个方面，提供一种检测制剂，该检测制剂中含有本发明第一个方面所述的全基因组5hmC检测探针。

本发明中的检测制剂是基于本发明第一个方面所述的全基因组5hmC检测探针制备得到的，其特异性强，能抗C，5mC，5fC和5caC等相似的衍生物的干扰，而且灵敏性强，5hmC线性检测范围为0.016％～0.16％(5hmC/总DNA)，检出限约为0.003％，可以满足痕量样品检测需求。

本发明的第三个方面，提供本发明第二个方面所述的检测制剂在制备全基因组5hmC定量检测试剂盒中的应用。

根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述全基因组5hmC定量检测试剂盒的使用方法为：

(1)将模型链或样品DNA进行N3-5gmC修饰；

(2)将修饰后的模型链或样品DNA与引物链结合得到5gmC探针；

(3)将5gmC探针与DNA模板进行扩增，根据扩增产物的荧光信号强度计算样品中的5hmC含量。

在本发明的一些优选实施方式中，步骤(1)中N₃-5gmC修饰的反应体系为：

反应液	用量
		10μM模型链	10μL
2mM UDP-6-N<sub>3</sub>-Glu	3μL
		T4-βGT	8μL
10×缓冲液A	5μL
		DEPC水	24μL
总计	50μL

其中，缓冲液A中含有50mM的醋酸钾，20mM醋酸Tris，10mM醋酸钾，1mM二硫苏糖醇，缓冲液A的pH为7.9。

在本发明的一些优选实施方式中，步骤(2)中5gmC探针的制备体系为：

反应液	用量
		1.6μM上述步骤(1)制备得到的N<sub>3</sub>-5gmC	30μL
100μM引物链	25μL
		10×PBS缓冲液	6μL
总计	61μL

在本发明的一些优选实施方式中，步骤(3)中扩增反应的具体操作为：

在0～4℃条件下，将溶液A和溶液B混合，在36～38℃下扩增14～16min，其中，所述溶液A的溶液体系为：

其中，缓冲液B中含有50mM醋酸钾，20mM醋酸Tris，10mM醋酸钾，100μg/mL牛血清白蛋白(BSA)，缓冲液B的pH为7.9。

所述溶液B的溶液体系为：

反应液	用量
		20×SYBR Green II染料	2μL
Nt.BsmAI切刻内切酶	1μL
		Klenow片段	1μL
10×缓冲液C	2μL
		DEPC水	4μL
总计	10μL

其中，缓冲液C中含有50mMNaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，1mM DTT，缓冲液C的pH为7.9。

在本发明的一些优选实施方式中，所述基因片段为打断的基因组全长DNA。

所述基因组全长DNA的打断方式包括超声处理。当然，本领域技术人员也可以采用其他本领域常规操作获得基因片段。

在本发明的一些更优选实施方式中，所述基因片段的长度为200～500bp。

在本发明的一些更优选实施方式中，所述基因片段的长度为250bp。

在本发明的一些优选实施方式中，所述步骤(2)还包括对5gmC探针的纯化。

在本发明的一些更优选实施方式中，所述5gmC探针纯化采用DNA纯化柱。

特定基因5hmC的检测方法通常是使用葡萄糖修饰5hmC，再利用内切酶区分该基因5hmC含量，但这种方法仅能针对于该基因的引物，无法同时检测多个基因，不能反映全基因组5hmC含量，在应用上有一定的局限。但本发明中的检测方法使用葡糖基转移酶修饰，修饰条件温和且效率高，可以后续修饰多种衍生物。而且，本申请还是基于链置换线性等温扩增技术，利用两种酶协同作用，切口酶在双链的一端产生缺口，然后用不具有5’-3’外切酶活性的聚合酶从缺口的3’端开始扩增并置换掉原来的DNA链，从而不需要变温循环。通过葡糖基转移酶修饰和链置换线性等温扩增技术的结合，利用葡糖基转移酶在5hmC位点上无差别修饰扩增引物链进行链置换线性等温扩增，在保证灵敏度的基础上，实现全基因组5hmC的高效特异性检测。

本发明的有益效果是：

1.本发明中的探针组中模型链、互补链是基于P53抑癌基因中一段序列得到，使其具有接近实际样品特征的序列和长度效果，引物链和模板链均通过Nupack软件在传统链置换扩增模板上修改设计得到的，具有很好的结合特异性，用于模拟在真实环境中检测。

2.本发明中的检测制剂是基于全基因组5hmC检测探针制备得到的，其特异性强，能抗C，5mC，5fC和5caC等相似的衍生物的干扰，而且灵敏性强，5hmC线性检测范围为0.016％～0.16％(5hmC/总DNA)，检出限约为0.003％，可以满足痕量样品检测需求。

3.本发明中的检测方法检测步骤简单，应用价值高，可以推动全基因组5hmC含量检测在癌症等疾病检测或监控中的应用。

附图说明

图1为本发明实施例中的5hmC(a)与N₃-5gmC(b)的MALDI-TOF MS对比图；

图2为本发明实施例中的5hmC(a)与N₃-5gmC(b)的熔解曲线对比图；

图3为本发明实施例中的N₃-5gmC合成5gmC探针的凝胶电泳图，其中，泳道1为引物链，泳道2为5gmC探针，泳道3为引物链+5gmC探针+1×PBS，泳道4为引物链+5gmC探针；

图4为本发明实施例中的5gmC探针扩增检测可行性对比图；

图5为本发明实施例中的全基因组5hmC水平定量检测方法的原理示意图；

图6为本发明实施例中的5gmC探针修饰特异性的凝胶电泳图，泳道1为C-DNA模型链，泳道2为5mC-DNA模型链，泳道3为5hmC-DNA模型链，泳道4为5fC-DNA模型链，泳道5为5caC-DNA模型链；

图7为本发明实施例中的5gmC探针扩增反应特异性；

图8为本发明实施例中的等温扩增影响因素对比图，其中，a为Klenow片段浓度对检测效果的影响示意图；b为Nt.BsmAI切刻内切酶浓度对检测效果的影响示意图；c为模板链浓度对检测效果的影响示意图；

图9为本发明实施例中的模型链5hmC标准曲线；

图10为本发明实施例中的基因组全长DNA(泳道1)和打断后的DNA片段(泳道2)的凝胶电泳图；

图11为本发明实施例中的实际样品5hmC检测标准曲线；

图12为本发明实施例中的成年小鼠脑组织、新生小鼠脑组织和成年小鼠肾组织中的5hmC含量对比。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

核苷酸序列构建

分别构建4组探针序列(模型链、互补链、引物链和模板链)，其核苷酸分别为：

模型链序列：5’-GAGACCGGAGTCCGCTTTCCTCTTCCGGAAAATGTAAGCCGAACCTAAAGCAATCACCAGGG-3’(SEQ ID NO.1)；

其中，所述模型链核苷酸序列中的自5’端第26位碱基C为5hmC。

互补链序列：5’-CCCTGGTGATTGCTTTAGGTTCGGCTTACATTTTCCGGAAGAGGAAAGCGGACTCCGGTCTC-3’(SEQ ID NO.2)；

引物链序列：5’-GATCGGAAGAGCAGTCGTCTGAACTCCAGTCAC-3’(SEQ ID NO.3)；

其中，该引物链5’端连接有二苯并环辛炔(DBCO)。

模板链序列：5’-ATTCCGTATTAGTAGATCTCTCTCTCCTCGAGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG-3’(SEQ ID NO.4)。

模型链位点修饰

将上述实施例中的模型链序列中的5hmC修饰为N₃-5gmC，其步骤为：

(1)N₃-5gmC的制备：

构建如表1所示的反应体系：

表1N₃-5gmC修饰反应体系

反应液	用量
		10μM模型链	10μL
2mMUDP-6-N<sub>3</sub>-Glu	3μL
		T4-βGT	8μL
10×缓冲液A	5μL
		DEPC	24μL
总计	50μL

其中，缓冲液A中含有50mM的醋酸钾(Potassium acetate)，20mM醋酸Tris(Tris-acetate)，10mM醋酸钾(Magnesium acetate)，1mM二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)，缓冲液A溶液pH为7.9。

将反应体系于37℃孵育24h，然后用寡核苷酸纯化柱(UNIQ-10Spin ColumnOligoDNA Purification Kit，上海生工)纯化，获得N₃-5gmC。

(2)5gmC探针的制备：

构建如表2所示的反应体系：

表2 5gmC探针制备反应体系

将反应体系于37℃孵育24h，然后用DNA纯化柱(DNA Clean&Concentrator-5，ZymoResearch)纯化，获得5gmC探针(5gmC-Primer)。

效果验证

(1)5gmC修饰情况验证实验：

采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对上述实施例制备得到的5gmC探针进行表征，结果如图1所示。

如图1所示，hmC模型链理论分子量为19093，实测分子离子峰为19141，UDP-6-N₃-Glu修饰后N₃-5gmC模型链理论分子量为19281，实测分子离子峰为19290。实测值与理论值存在的微小误差，这可能是由于DNA分子本身质量太大导致的波动，从整体上看，该误差属于合理误差范围内，可以认为N₃-5gmC合成成功。

为了进一步验证合成是否成功，采用溶解曲线对比的方式进行表征，结果如图2所示。

由于核苷酸进行小分子修饰后，其碱基结构会发生改变，进而会影响其解链温度(Tm)。如图2所示，可以发现，修饰前后的模型链的溶解曲线并不相同，修饰后的Tm值相比修饰前下降了约2℃，从而可以进一步验证N₃-5gmC的成功合成。

(2)5gmC探针合成情况验证实验：

采用凝胶电泳对5gmC探针和引物链进行表征，结果如图3所示。

5gmC探针的长度为62mer，引物链长度为33mer，过click反应后会形成“Y”字形结构，空间位阻大大增加，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳能有效区分出两者的差异。其中，实验所用的15％聚丙烯酰胺凝胶电泳配方为：30％(29:1)丙烯酰胺4mL，超纯水3.1mL，5×TBE缓冲液800μL，四甲基乙二胺(TEMED)5μL，10％过硫酸铵100μL。将待测样品在80V电压下运行70min，随后用4S Red(核酸染剂)染色30min，在凝胶成像系统中拍照。如图3所示，泳道1为引物链，泳道2为5gmC探针，泳道3为引物链+5gmC探针+1×PBS，泳道4为引物链+5gmC探针，从图像中可以看出，反应接近完全，产率较高，且1×PBS是反应必备条件，直接影响反应是否能够成功。

(3)反应可行性验证：

为了进一步验证反应整体可行性，将修饰前后的5hmC模板链(修饰后为5gmC探针)分别进行扩增反应，具体扩增反应步骤如下：

反应体系如表3所示。

表3 扩增反应体系

缓冲液C中含有50mMNaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，1mM DTT，缓冲液C的pH为7.9。

将溶液A和溶液B按照上述反应体系分别配制，使用时溶液A和溶液B混合均匀，之后快速离心使管壁体沉至管底，所有操作在冰上或低温环境下进行。混合均匀后立即转移至实时荧光定量PCR仪中进行等温扩增反应，反应温度设为37℃，每30s采集一次信号，反应时间设为15min。

设置空白组作为对照(将5gmC探针替换为等浓度的未修饰模型链)。

结果如图4所示，在使用等浓度5gmC探针和模型链的实验组和空白组中，使用5gmC探针后有明显的线性扩增，虽然空白组未修饰的5hmC模型链也有一定扩增，但是扩增效率较低，可以判断该现象应为等温扩增体系本身的非特异性扩增所导致，可以后续作为背景值作为参考。

基于核酸等温扩增的全基因组5hmC水平的定量检测方法

根据上述实施例中的验证，可以有效说明上述实施例中的方法可以有效定量检测全基因组5hmC水平，因此，基于上述实施例的记载，构建下述完整的全基因组5hmC水平定量检测方法的检测步骤：

(1)将模型链或打断后的DNA按照表1所示体系与T4-βGT、UDP-6-N₃-Glu和NEB稀释液4混合，在37℃条件下孵化24h，得到N₃-5gmC(可使用MALDI-TOF MS和溶解曲线表征验证产物是否正确，如错误则重新进行该步骤)；

(2)将步骤(1)制备得到的N₃-5gmC与引物链按照表2所示体系进行反应，在37℃条件下孵化24h，得到“Y”型结构产物5gmC探针(可使用聚丙烯酰氨凝胶电泳表征验证)；

(3)使用长度特异性核酸纯化柱对步骤(2)得到的5gmC探针进行纯化，除去多余的引物链。

(4)低温条件下(或冰上)配制如表3所示扩增体系，将扩增体系溶液A和溶液B混合后立即进行扩增，反应温度设为37℃，每30s采集一次信号，反应时间设为15min，根据荧光信号强度计算5hmC水平。

本实施例中的全基因组5hmC水平定量检测方法的原理示意图如图5所示。

上述实施例中的检测方法效果验证

(1)特异性验证实验：

由于在实际样品检测中，样品中所含成分复杂，由于碱基结构的相似性，DNA的其他甲基化形式如5mC，5fC，5caC也会对5hmC的检测造成一定的干扰，因此，为了验证上述实施例中的检测方法的特异性，将模型链的5hmC碱基分别替换为C，5mC，5fC和5caC，然后对这5份样品采取完全相同的修饰处理条件和检测条件进行检测，从而可以获得上述实施例中的检测方法的实际特异性。

①修饰情况检测：

采用上述实施例中的MALDI-TOF-MS法检测各组样品的修饰情况，结果如图6所示。

结果如图6所示，泳道1为C-DNA模型链，泳道2为5mC-DNA模型链，泳道3为5hmC-DNA模型链，泳道4为5fC-DNA模型链，泳道5为5caC-DNA模型链，可以看出，仅5hmC-DNA模型链可以与引物链结合生成“Y”型结构产物5gmC探针，其他相似碱基(C，5mC，5fC和5caC)均为出现5gmC探针条带，因此，可以说明其他相似碱基并不会干扰上述实施例中的检测方法的准确性，上述实施例中的检测方法具有良好的特异性。

②扩增特异性：

采用上述实施例中的扩增体系进行扩增(将反应后的C，5mC，5hmC，5fC和5caC五种样品经核酸纯化柱纯化后按照表3所示的扩增体系分别进行等温扩增反应，反应时间为15min)，结果如图7所示。

实验结果表明经UDP-6-N₃-Glu和引物链在相同反应条件下处理后的其他形式的胞嘧啶衍生物(C，5mC，5fC和5caC)对等温扩增结果几乎不会有影响，与空白值基本相同，说明上述实施例中的检测方法具有良好的特异性。

(2)方法准确性和精确度评估：

①等温扩增条件优化：在链置换线性等温扩增反应中，由于DNA模板、聚合酶、切口酶的用量是影响扩增效果的重要因素，因此，为了保证扩增反应的快速、高效进行，获得最佳的扩增效果，需要考察这些因素对扩增反应的实际影响。

首先，根据上述实施例中的基于核酸等温扩增的全基因组5hmC水平的定量检测方法，调整DNA聚合酶Klenow片段的浓度(Klenow片段浓度分别为0.10U、0.15U、0.20U、0.25U、0.30U)，考察检测效果。

Klenow片段浓度对检测效果的影响如图8A所示，随着聚合酶浓度的增加，反应速率不断加快，在浓度为0.25U时表现出最佳的扩增效果，浓度继续加大扩增效率也不再增加，因此，可以确定最佳Klenow片段浓度为0.25U。

然后，根据上述实施例中的基于核酸等温扩增的全基因组5hmC水平的定量检测方法，调整Nt.BsmAI切刻内切酶(切口酶)的浓度(Nt.BsmAI切刻内切酶浓度分别为0.12U、0.18U、0.25U、0.32U、0.38U)，考察检测效果。

Nt.BsmAI切刻内切酶浓度对检测效果的影响如图8B所示，可以发现，Nt.BsmAI切刻内切酶浓度对扩增效果并不具有浓度相关性，但可以通过实验发现，Nt.BsmAI切刻内切酶浓度在0.25U时表现出最佳的扩增效果，因此，可以确定最佳Nt.BsmAI切刻内切酶浓度为0.25U。

根据上述实施例中的基于核酸等温扩增的全基因组5hmC水平的定量检测方法，调整模板链浓度(模板链浓度分别为20nM、40nM、60nM、80nM、100nM、120nM)，考察检测效果。

模板链浓度对检测效果的影响如图8C所示，可以发现，随着扩增模板的浓度增加，扩增速率不断加快，在浓度为100nM时表现出最佳扩增效果，继续加大浓度扩增效率不再增加，因此，可以确定最佳模板链浓度为100nM。

②标准曲线绘制：

根据上述实施例中的基于核酸等温扩增的全基因组5hmC水平的定量检测方法使用未修饰模型链(作为对照)按照上述实验条件进行反应，将5gmC探针和未修饰模型链配制为一系列不同浓度比例的混合液(5gmC探针占未修饰模型链的比例分别为1％、2％、4％、6％和10％)，在最佳反应条件下进行链置换线性等温扩增检测。利用实时荧光定量PCR测定不同5gmC探针浓度比例的混合液中的荧光强度，绘制荧光强度曲线，根据荧光强度的增量建立荧光值与5hmC浓度之间的标准曲线。

标准曲线如图9所示。可以发现，标准曲线具有良好线性关系，线性方程为：

y＝6293.8x+6532.6；

R²＝0.997。5hmC线性范围为0.016％～0.16％，检出限约为0.003％，此线性范围与生物样品实际含量相符合，可用于实际样品的检测。

③方法准确性计算：

采用标准加入法计算上述实施例中的基于核酸等温扩增的全基因组5hmC水平的定量检测方法的回收率。

具体步骤为：在已知含0.008％(5hmC/总DNA)5hmC的样品中分别加入0.016％、0.048％和0.096％的5hmC标准样品，计算回收率和相对标准偏差(RSD％)。每组实验样品平行测定三次，测定结果如表4所示。

表45hmC加标回收结果(n＝3，％代指在样品中5hmC碱基占所有碱基百分数)

回收率在96.4％～108.3％之间，低含量时，由于仪器波动或操作原因会导致回收率超100％，仍处于正常范围(90％～110％)，且RSD值在1.3％～6.8％之间，表明了上述实施例中的基于核酸等温扩增的全基因组5hmC水平的定量检测方法准确可靠，具有良好的准确性和重复性。

上述实施例中的检测方法实际检测效果验证

(1)样品DNA处理：

上述实施例中的基于核酸等温扩增的全基因组5hmC水平的定量检测方法是用于基因组全长DNA样品检测，但为了便于反应以及后续的纯化操作，可将样品中获得的基因组全长DNA使用超声打断至合适大小进行检测。

具体步骤为：

取样品中获得的基因组全长DNA，将其浓度稀释为20ng/μL并转移至130μL的微型超声管中。通过超声破碎仪将基因组DNA打断成250bp左右的小片段。为了验证DNA是否打断为合适的大小，可采用15％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了原基因组DNA与破碎后的DNA样品的长度差异。

聚丙烯酰胺凝胶电泳图如图10所示，条带1是未打断的基因组DNA，大部分条带都在电泳槽顶端，条带2是超声打断后的DNA，可以看到条带程弥散状，DNA长度在200～500bp之间，表明DNA已被打断为合适长度。

(2)绘制5hmC检测标准曲线：

将步骤(1)中打断的基因组DNA作为模板链，将其与未修饰的基因组DNA按照不同的比例混合在表3所示扩增体系中(体积百分数分别为100％、80％、60％、40％、20％、10％)，通过链置换线性等温扩增进行检测，得到荧光值与5hmC含量之间的关系，结果如图11所示。

如图11所示，经计算，其线性方程为：

y＝3.656×10⁵x+3789；

R²＝0.997，线性范围为0.018％～0.18％，符合大部分生物样品实际5hmC含量。

(3)实际样品测定：

由于生物体不同发育阶段和不同器官中的5hmC浓度差异性巨大，本实施例中选取具有代表性的三种样品，分别是成年小鼠脑组织、新生小鼠脑组织和成年小鼠肾组织，基于步骤(2)中的标准曲线，对三种样品中的5hmC含量进行检测，结果如图12所示。

由图12可知，成年小鼠脑组织、新生小鼠脑组织和成年小鼠肾组织中的5hmC含量分别占基因组DNA整体水平的0.16％、0.06％和0.03％，且所得结果与标准方法基本接近。结果表明5hmC在不同组织之间不是均匀分布的，具有组织差异性和发育阶段差异性，5hmC在生物体生长发育阶段起着重要的作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> 一种基于核酸等温扩增的全基因组5hmC水平的定量方法及其应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gagaccggag tccgctttcc tcttccggaa aatgtaagcc gaacctaaag caatcaccag 60

gg 62

<210> 2

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccctggtgat tgctttaggt tcggcttaca ttttccggaa gaggaaagcg gactccggtc 60

tc 62

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatcggaaga gcagtcgtct gaactccagt cac 33

<210> 4

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

attccgtatt agtagatctc tctctcctcg agacgtgact ggagttcaga cgtgtgctct 60

tccg 64

Claims

1.一组5hmC检测探针，其特征在于，所述5hmC检测探针包括模型链、引物链和模板链；其中，所述模型链的核苷酸序列为：5’-GAGACCGGAGTCCGCTTTCCTCTTCCGGAAAATGTAAGCCGAACCTAAAGCAATCACCAGGG-3’(SEQ ID NO.1)；

所述模型链核苷酸序列中的自5’端第26位碱基C为5hmC；

所述引物链的核苷酸序列为：5’-GATCGGAAGAGCAGTCGTCTGAACTCCAGTCAC-3’(SEQ IDNO.3)；

所述引物链5’端连接有二苯并环辛炔；

所述模板链的核苷酸序列为：5’-ATTCCGTATTAGTAGATCTCTCTCTCCTCGAGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCG-3’(SEQ ID NO.4)。

2.根据权利要求1所述的5hmC检测探针，其特征在于，所述5hmC检测探针还包括互补链，所述互补链的核苷酸序列为：5’-CCCTGGTGATTGCTTTAGGTTCGGCTTACATTTTCCGGAAGAGGAAAGCGGACTCCGGTCTC-3’(SEQ ID NO.2)。

3.一种检测制剂，其特征在于，所述检测制剂中含有权利要求1或2所述的5hmC检测探针。

4.权利要求3所述的检测制剂在制备全基因组5hmC定量检测试剂盒中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述全基因组5hmC定量检测试剂盒的使用方法为：

(1)将模型链或样品DNA进行N₃-5gmC修饰；

(2)将修饰后的模型链或样品DNA与引物链结合得到5gmC探针；

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(1)中N₃-5gmC修饰的反应体系为：

所述缓冲液A中含有50mM的醋酸钾，20mM醋酸Tris，10mM醋酸钾，1mM二硫苏糖醇；所述缓冲液A的pH为7.9。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(2)中5gmC探针的制备体系为：

1.6μM N₃-5gmC；30μL；

100μM引物链；25μL；

10×PBS缓冲液；6μL。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(3)中扩增反应的具体操作为：

所述溶液B的溶液体系为：

所述缓冲液B中含有50mM醋酸钾，20mM醋酸Tris，10mM醋酸钾，100μg/mL牛血清白蛋白；所述缓冲液B的pH为7.9；

所述缓冲液C中含有50mMNaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，1mM DTT；所述缓冲液C的pH为7.9。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述样品DNA为基因组全长DNA打断后的基因片段，其中，所述基因片段的长度为200～500bp。

10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)还包括对5gmC探针的纯化，所述5gmC探针纯化采用DNA纯化柱。