CN116590390A - 一种利用终止子中插入dna指纹序列快速检测转基因拷贝数的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种利用终止子中插入DNA指纹序列快速检测转基因拷贝数的方法。本发明所述方法基于内源终止子序列和插入有DNA指纹序列的转基因终止子序列间差异，利用共用引物对，在同一qPCR反应体系中扩增得到转基因终止子序列和内源终止子序列，进而通过分析其熔解曲线，根据二者熔解峰的荧光强度比值，能准确定量并快速检测转基因生物目的基因拷贝数。该DNA指纹序列的插入不影响基因在转基因生物体内正常表达，该方法具有检测灵敏度高、结果准确性高、检测效率高、成本低、检测周期短等优点。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种利用终止子中插入DNA指纹序列快速检测转基因拷贝数的方法。
背景技术
随着分子生物技术快速发展，特别是转基因技术的出现，给植物育种带来新的技术手段。转基因拷贝数是影响目的基因表达水平和遗传稳定性的重要因素，因此，检测转入目标基因的拷贝数是转基因研究中关键的一步。
目前应用于拷贝数变异检测的技术主要有：比较基因组杂交技术(comparativegenome hybridization,CGH)、TaqMan荧光探针技术、变性高效液相色谱(denaturing highperformance liquid chromatography,DHPLC)技术、多重连接探针扩增技术(multiplexligation-dependent probe amplification,MLPA)和新一代测序技术等。尽管这些技术应用广泛，但其缺陷依旧明显：CGH技术分辨率在Mb水平，更小片段的拷贝数片段则不易检出，同时该技术操作繁琐，通量低、耗时长且成本昂贵，需要较为大量的模板DNA，不利于大范围的推广；TaqMan荧光探针合成原料成本高、获取难度大，且通常无法克服信噪比低的缺陷，实验数据可重复性差；DHPLC技术在实践应用中，分辨力常受到实验设计、检测环境等因素的影响，存在可靠性和稳定性欠佳的问题；MLPA技术操作复杂，且需要毛细管电泳进行产物分析，整个实验耗时过长；新一代测序技术适合大样本的检测，但其依托的测序平台价格昂贵，且需要专业实验操作和数据分析人员，不适宜在普通实验室、基层医院或医学检验所开展。
实时荧光定量PCR技术(quantitative real-time PCR，qPCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量，通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。常规qPCR用于拷贝数分析时，需要至少两对引物，一对引物用于扩增目的基因，一对引物用于扩增内参基因(一般选取基因组中的单拷贝基因)，通过扩增效率和Ct值计算各自的表达量并转换成相对定量或绝对定量，最终通过目的基因的量与内参基因的量的比值计算得出目的基因的拷贝数。该方法最常见的问题有：两对引物扩增效率不一致；每次实验都需检测扩增效率或固定扩增效率但批次之间会有差异；目的基因检测与内参基因检测在不同样品孔中，不同反应体系中操作中的微小差异容易导致定量变化。由于qPCR的灵敏度较高，上述微小差异最终可能导致计算所得的定量值偏离实际较远，故常规qPCR在鉴定拷贝数时存在较大的误差。
发明内容
有鉴于背景技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种基于实时荧光定量PCR熔解曲线法的转基因植株目的基因拷贝数检测方法，所述方法在内源终止子序列中加入一段DNA指纹序列(DFP)用于拷贝数检测，具有检测灵敏度高、结果准确性高、检测效率高及检测成本低等优点。
具体的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种转基因生物目的基因拷贝数检测方法，包括如下步骤：
S1、在内源终止子序列中插入DNA指纹序列，得到转基因终止子序列；所述DNA指纹序列大于10bp；
基于所述转基因终止子序列，在所述DNA指纹序列的两侧设计共用引物对；
S2、以转基因生物为待测样品；
使用步骤S1所述共用引物对，以待测样品的基因组DNA为模板，或者，分别以待测样品的基因组DNA和对照野生型样品的基因组DNA为模板，进行qPCR，得到PCR产物；
S3、分析步骤S2所述PCR产物的熔解曲线，根据转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰的荧光强度比值，判定转基因生物目的基因拷贝数；
所述转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰由待测转基因样品的基因组DNA扩增产物熔解得到；
所述转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰对应的温度差值≥1℃。
转基因生物中含有基因表达盒，所述基因表达盒包括启动子、基因编码区和终止子等元件；所述终止子元件来源于植物内源序列，该终止子元件插入有DNA指纹序列；当该基因表达盒在转基因生物体内正常表达时，以该转基因生物的基因组DNA为模板，利用转基因终止子序列和内源终止子序列的共用引物对，能在同一qPCR反应体系中扩增得到两种存在结构性差异的PCR产物。进而，通过分析所述PCR产物的熔解曲线，根据转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰的荧光强度比值，能准确定量转基因生物目的基因拷贝数，且具有检测灵敏度高、结果准确性高、检测效率高、成本低、检测周期短等优点。
在本发明中，所述内源序列是指该转基因生物对应的野生型生物自身所拥有的、可实现自我复制的内源基因。
本发明通过在内源终止子序列中插入DNA指纹序列的方式，使转基因终止子序列和内源终止子序列形成结构差异。
本发明基于所述转基因终止子序列(即插入有DNA指纹序列的内源终止子序列)，在所述DNA指纹序列的两侧设计共用引物对；然后以转基因生物为待测样品，以待测样品的基因组DNA为模板，利用所述共用引物对，对转基因终止子序列和内源终止子序列进行扩增，进而扩增得到两种具有结构性差异(大小不同、GC比例不同、含量不同)的PCR产物。
本发明对PCR扩增产物进行熔解曲线分析，基于转基因终止子序列和内源终止子序列扩增产物的结构性差异，可在熔解曲线中呈现两个单一可区分的熔解峰。
在本发明中，当转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰对应的温度差值≥1℃时，可基于转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰对应的荧光强度(和扩增产物含量相关)比值，实现针对该转基因生物目的基因拷贝数的快速判定和准确定量。
在本发明中，步骤S1所述DNA指纹序列及共用引物对的设计原则优选包括：使转基因终止子序列与内源终止子序列的扩增产物因GC含量的差异而在待测样品中呈现两个单一可区分的熔解峰。
在本发明中，步骤S2在进行qPCR时，可以只以待测转基因样品的基因组DNA为模板，也可以分别以待测转基因样品的基因组DNA和对照野生型样品的基因组DNA为模板。当分别以待测转基因样品的基因组DNA和对照野生型样品的基因组DNA为模板时，待测转基因样品的基因组DNA的扩增产物中既含有内源终止子序列，又含有转基因终止子序列；而野生型样本的基因组DNA扩增产物中只含有内源终止子序列。野生型样本的基因组DNA扩增产物可用于对照实验。
在本发明中，步骤S3所述熔解曲线的获取方法优选包括：把qPCR法扩增后的PCR产物缓慢升温至95℃，扩增产物双链DNA随温度升高逐渐变性解链产生单链，解链过程中嵌到双链中的荧光染料会被释放出来，利用仪器自动检测反应管内荧光信号的变化，绘制出扩增产物荧光信号随温度变化的熔解曲线，并得到相应PCR产物的熔解曲线峰图。
本发明提供的转基因生物目的基因拷贝数检测方法在一个PCR反应体系中进行，读取单管PCR产物的数据，便可计算转基因植株中目的基因拷贝数；整个扩增和检测过程均为闭管操作，可避免污染和假阳性结果；使用一对引物扩增，其扩增效率完全相同，避免了不同管不同批次间的差异，与常规方法相比准确度大大提高；无需构建标准曲线、无需筛选严格的符合扩增效率的引物；扩增片段短，采用较高的退火温度，保证了扩增的特异性。
本发明建立了一种快速检测转基因生物中目的基因拷贝数的方法，该方法能显著提高其准确性和特异性，且操作简单，耗时短，费用低廉，为转基因生物中目的基因拷贝数的快速检测提供了有效方法。
在本发明优选的实施方式中，转基因生物目的基因拷贝数＝K×(转基因终止子序列熔解峰荧光值/内源终止子序列熔解峰荧光值)，K为常数。更具体的，所述K的值优选根据内源序列在作物中的拷贝倍数确定。
当内源序列在作物中的拷贝倍数为C时，K＝C×n(n为作物的倍性)。例如，当所述转基因生物为二倍体的水稻，且选取的内源终止子序列OsALSTer为单拷贝时，则K＝C×n＝1×2＝2，即K值为2；当所述转基因生物为二倍体玉米，且选取的内源终止子序列ZmALSTer为单拷贝时，则n＝2，K值为2；当所述转基因生物为六倍体的小麦，且选取的内源终止子序列为两拷贝时，则K＝C×n＝2×6＝12，即K值为12等。
在本发明中，所述转基因生物不局限于特定类别，所有转基因生物(如水稻、玉米、小麦、高粱和大豆等)都可适用该方法。本发明所述方法适用于各类由本生物源终止子改造的转基因农作物，例如：对于转基因水稻，可选择OsALSTer终止子；对于转基因玉米，可选择ZmALSTer终止子。且该方法并不局限于ALSTer终止子，还可以是任意的本生物源的终止子。
第二方面，本发明提供了一种具体的转基因生物目的基因拷贝数检测方法。
在该方法中，所述内源终止子序列选择水稻基因OsALS(LOC_Os02g30630)的终止子OsALSTer。所述转基因生物包含终止子元件中加入的DNA指纹序列。
在该方法中，所述DNA指纹序列的长度≥10bp，优选为20-40bp，更优选为30bp。所述DNA指纹序列的插入不影响基因的正常功能。
进一步优选的，所述内源终止子序列(OsALSTer)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述DNA指纹序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步优选的，所述转基因终止子序列为OsALSTer-T，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
在该方法中，所述转基因生物包含转基因表达盒中的OsALSTer-T元件。当该表达盒在转基因生物体内正常表达时，该OsALSTer-T元件及其对应的OsALSTer内源序列在该转基因生物体同时获得表达。进而，本发明通过向转基因表达盒的终止子元件中插入DNA指纹序列的方式，使转基因生物体内通过转基因终止子序列和内源终止子序列形成的结构差异计算基因的表达量。
相较于其他的转基因终止子序列和内源终止子序列的组合，本发明优选的转基因终止子序列(OsALSTer-T)和内源终止子序列(OsALSTer)对应的熔解曲线峰线条清晰更易区分，无干扰峰，且重复性好。
在本发明优选的实施方式中，所述共用引物对的序列分别如SEQ ID NO.4和SEQID NO.5所示。
以L446转基因水稻为例，此对引物扩增水稻内源终止子序列序列时，获得的片段长度为94bp；扩增水稻转基因终止子序列时，获得片段长度为124bp，二者存在30bp的碱基差异，且GC含量存在明显差异。
在本发明优选的实施方式中，步骤S2所述qPCR的反应体系以10μL计，包括0.5μl上游引物10μM，0.5μl下游引物10μM，5μl qCR Master Mix 2x，0.1μl CXR 100x*，1μl模板DNA 10±2ng，用ddH2O补足10μl。
在本发明优选的实施方式中，步骤S2所述qPCR的反应程序为：50℃，1min；94-95℃，7min；94-95℃，10-20sec；60-62℃收集荧光信号1min，共计25个循环；60℃-95℃持续收集荧光信号，建立熔解曲线。进一步优选的，所述60℃-95℃持续收集荧光信号的程序为：60℃，1min；温度增量步进：0.2℃/sec至95℃，5sec；20℃，10sec。上述优选的反应程序获得的熔解曲线区分度更好。
本发明在所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法的结果判断过程中，优选采用如下判断方法：
若转基因终止子序列熔解峰荧光值/内源终止子序列熔解峰荧光值为0.25-0.83，则所述转基因生物目的基因拷贝数为1；
若转基因终止子序列熔解峰荧光值/内源终止子序列熔解峰荧光值为0.85-1.43，则所述转基因生物目的基因拷贝数为2；
若转基因终止子序列熔解峰荧光值/内源终止子序列熔解峰荧光值为1.45-1.92，则所述转基因生物目的基因拷贝数为3。
进一步优选的，采用如下判断方法：
若转基因终止子序列熔解峰缺失，仅存在内源终止子序列熔解峰，则所述转基因生物目的基因拷贝数为0；
若转基因终止子序列熔解峰荧光值/内源终止子序列熔解峰荧光值为0.30-0.80，则所述转基因生物目的基因拷贝数为1；
若转基因终止子序列熔解峰荧光值/内源终止子序列熔解峰荧光值为0.90-1.40，则所述转基因生物目的基因拷贝数为2；
若转基因终止子序列熔解峰荧光值/内源终止子序列熔解峰荧光值为1.50-1.90，则所述转基因生物目的基因拷贝数为3。
上述判断方法得到的拷贝数检测结果准确性高，重复性好。
在本发明进一步提供的具体实施方式中，所述转基因生物选择L446转基因水稻，其内源终止子序列为OsALSTer，转基因终止子序列为OsALSTer-T；该目的基因拷贝数的检测方法具体包括如下步骤：
(1)设计转基因终止子序列与内源终止子序列共同的上下游引物：根据OsALSTer终止子(SEQ ID NO.1)及插入30bpDNA指纹序列的OsALSTer-T转基因终止子(SEQ ID NO.2)的序列特点，设计上下游引物，使内源终止子序列与转基因终止子序列扩增片段大小不同。
(2)提取野生型对照及待测转基因样本的基因组DNA；
(3)配制反应体系：在反应体系中加入上游引物、下游引物、DNA聚合酶，dNTPs以及PCR Buffer，DNA饱和性染料，后分别加入野生型基因组DNA和待测转基因样本的基因组DNA；
(4)进行PCR反应：将配制好的反应体系置于PCR仪进行PCR反应，实现基因扩增；
(5)分析熔解曲线并判定目的基因的拷贝数：根据熔解曲线中PCR产物熔解峰的荧光强度比值，判定待测样本目的基因的拷贝数。
优选的，步骤(1)中上下游引物设计原则为，使内源终止子序列与转基因终止子序列的扩增产物由于GC含量的差异而在待测样品中呈现可区分的两个单一的熔解峰。
进一步优选的，上游引物选择OsALSTer-qPCR-F1(25nt)：
5’-GCTCTTCTGTTTTACTTGTTTGATG-3’(SEQ ID NO.4)；
下游引物选择OsALSTer-qPCR-R1(24nt)：
5’-ATGCCTACAGAAAACAACACACTA-3’(SEQ ID NO.5)。
优选的，步骤(3)中以单管反应体系10μL计，各个加入物的用量为：0.5μl上游引物10μM，0.5μl下游引物10μM，5μl qCR Master Mix 2x，0.1μl CXR 100x*，1μl模板DNA 10±2ng，用ddH2O补足10μl。
优选的，步骤(3)所述DNA饱和性染料包括但不局限于SYBR green、EvaGreen、LCGreen@PLUS、ResoLight、SYTO9中的任意一种。
优选的，步骤(4)中PCR反应参数设置为：50℃，1min；94-95℃，7min；94-95℃，10-20sec，60-62℃(收集荧光信号)1min，共计25个循环；60℃-95℃持续收集荧光信号，建立熔解曲线，(60℃，1min，温度增量步进：0.2℃/sec至95℃，5sec)；20℃，10sec。
优选的，步骤(5)根据下式判定待测样本目的基因的拷贝数：
OsALSTer-T拷贝数＝2×(OsALSTer-T熔解峰荧光值/OsALSTer熔解峰荧光值)。
若样本的OsALSTer-T熔解峰缺失，仅存在OsALSTer熔解峰，则该样本的OsALSTer-T目的基因拷贝数为0；
若样本的OsALSTer-T熔解峰荧光值/OsALSTer熔解峰荧光值在0.25-0.83之间，则该样本的OsALSTer-T目的基因拷贝数为1；
若样本的OsALSTer-T熔解峰荧光值/OsALSTer熔解峰荧光值在0.85-1.43之间，则该样本的OsALSTer-T目的基因拷贝数为2；
若样本的OsALSTer-T熔解峰荧光值/OsALSTer熔解峰荧光值在1.45-1.92之间，则该样本的OsALSTer-T目的基因拷贝数为3。
本发明利用实时荧光定量PCR熔解曲线法进行转基因植株目的基因拷贝数检测，扩增产物双链DNA随温度升高逐渐变性解链产生单链，解链过程中嵌到双链中的荧光染料会被释放出来，仪器自动检测反应管内荧光信号的变化，最后绘制出扩增产物荧光信号随温度变化的熔解曲线，并得到相应PCR产物的熔解曲线峰图，根据熔解曲线中转基因终止子序列和内源终止子序列产物熔解峰的荧光强度比值，能准确定量目的基因拷贝数。
本发明提供的转基因生物目的基因拷贝数检测方法普适性广，成本低；不涉及荧光探针的酶切或链置换反应，因此所有适合PCR的DNA聚合酶均适用于本体系，且无需添加其他特殊组分；同时适用于各种型号的荧光定量PCR平台。
本发明提供的转基因生物目的基因拷贝数检测方法操作简单，耗时短；无需样本特殊处理等步骤，整个操作流程仅需要1.5小时左右即可完成样本的分析。
本发明提供的转基因生物目的基因拷贝数检测方法，结果分析简单，实验数据可重复性好；对每个样本只需知道其熔解峰信号强度便可完成结果判定，无需参照标准品，可完全依靠仪器配套的软件同时分析大量样本。
第三方面，本发明提供了一种转基因生物目的基因拷贝数检测试剂盒，包括上述共用引物对。
进一步的，所述试剂盒优选还包括DNA聚合酶、dNTPs、PCRBuffer和DNA饱和性染料。所述DNA饱和性染料优选自SYBR green、EvaGreen、LCGreen@PLUS、ResoLight、SYTO9中的任意一种。
利用本发明提供的试剂盒进行转基因生物目的基因拷贝数的检测，同样具有检测灵敏度高、结果准确性高、检测效率高、成本低、检测周期短及普适性广等优点。
有益效果：
本发明提供了一种转基因生物目的基因拷贝数检测方法，所述方法在内源终止子中插入DNA指纹序列，得到转基因终止子序列，然后利用共用引物对，在同一qPCR反应体系中扩增得到转基因终止子序列和内源终止子序列，进而通过分析其熔解曲线，根据二者熔解峰的荧光强度比值，准确定量并快速检测转基因生物目的基因拷贝数。该DNA指纹序列的插入不影响基因在转基因生物体内正常表达，该方法具有检测灵敏度高、结果准确性高、检测效率高、成本低、检测周期短等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
图1是本发明实施例1中转基因终止子序列OsALSTer-T和内源终止子序列OsALSTer的序列特点，及拷贝数检测q-PCR引物设计示意图。
图2为本发明实施例3中拷贝数为0/1/2/3的样品OsALSTer-T基因检测实验结果图。其中，A图为水稻野生型WT的熔解曲线图，只有一个单峰，拷贝数为0；B图为L446熔解曲线图，两个峰，且转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰荧光强度的比值为1/2，为单拷贝；C图为L446熔解曲线图，转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰荧光强度的比值为1，为2拷贝；D图为L446熔解曲线图，转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰荧光强度的比值为为3/2，为3拷贝。
图3是本发明对比例1中相对标准曲线法检测基因拷贝数的标准曲线；其中，A图为内参水稻淀粉分支酶基因(RBE4)的标准曲线；B图为目标基因(AtHSP Ter)的标准曲线。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例以L446转基因水稻中转基因终止子序列OsALSTer-T与内源终止子序列OsALSTer为例，进行序列比对及引物设计。
本实施例基于转基因技术，使用水稻内源性OsALSTer终止子，根据序列特点进行改造修饰，即在该终止子172bp处加入30bp的DNA指纹，该转基因终止子序列命名为OsALSTer-T。将OsALSTer-T作为转基因表达元件终止子构建在pC1300载体上，重组载体命名为L446，并成功导入水稻植株中花11(ZH11)。根据OsALSTer终止子(SEQ ID NO.1)及OsALSTer-T(SEQ ID NO.2)的序列特点，在DNA指纹序列(SEQ ID NO.3)两侧设计上下游特异性检测引物(SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5)，如表1所示。
表1转基因水稻L446拷贝数检测引物
由于L446转基因水稻基因组中的OsALSTer-T序列比水稻基因组中的OsALSTer内源序列多出30bp的DNA指纹序列，因此，在30bp的DNA指纹序列两端设计引物，可有效区分转化事件中载体区段的OsALSTer-T序列(SEQ ID NO.2)，水稻基因组中的OsALSTer终止子扩增长度为94bp(较短)，L446转基因水稻基因组中的OsALSTer-T终止子扩增长度为124bp(较长)。两个大小不同的片段，在实时荧光定量PCR(qPCR)中呈现出不同大小的溶解曲线峰，而溶解曲线峰值可进一步反映不同扩增片段的含量，由于基因组中内源序列拷贝数是固定的，因此可通过上述方法中比较两个片段熔解曲线峰值来反映转基因的拷贝数。
实施例2
本实施例以L446转基因水稻中转基因终止子序列OsALSTer-T与内源终止子序列OsALSTer为例，构建SYBR Green I实时定量PCR反应体系。
以野生型中花11(ZH11)的内源终止子序列OsALSTer作为2拷贝对照，挑选转基因水稻L446 T0株系，分别选取各植株幼嫩叶片，采用CTAB法提取DNA(参照CTAB法标准步骤进行)，DNA模板稀释至10ng/ul待用；检测转基因水稻L446转基因水稻中目的基因拷贝数，使用的定量试剂是qCR Master mix kit(上海普洛麦格生物产品有限公司)，具体体系如下:
表2 SYBR Green I实时定量PCR体系
SYBR Green I实时定量PCR的反应程序：50℃，1min；94-95℃，7min；94-95℃，10-20sec，60-62℃(收集荧光信号)1min，共计25个循环；60℃-95℃持续收集荧光信号，建立熔解曲线，(60℃，1min，温度增量步进：0.2℃/sec至95℃，5sec)；20℃，10sec。
实施例3
本实施例在实施例2的基础上，使用熔解曲线分析转基因水稻目的基因拷贝数。
SYBR Green I实时定量PCR反应结束后，利用QuantStudioTMDesign&Analysis SCSoftware软件进行数据分析，结合熔解峰图，并根据下式初步判定待测样本目的基因的拷贝数：L446转基因株系拷贝数＝2*(OsALSTer-T熔解峰荧光值/OsALSTer熔解峰荧光值)。
通过实验数据分析，OsALSTer-T基因拷贝数的参考范围是：
若样本的OsALSTer-T熔解峰缺失，仅存在OsALSTer熔解峰，则该样本的OsALSTer-T目的基因拷贝数为0；若样本的OsALSTer-T熔解峰荧光值/OsALSTer熔解峰荧光值在0.30-0.80之间，则该样本的OsALSTer-T目的基因拷贝数为1；若样本的OsALSTer-T熔解峰荧光值/OsALSTer熔解峰荧光值在0.90-1.40之间，则该样本的OsALSTer-T目的基因拷贝数为2；若样本的OsALSTer-T熔解峰荧光值/OsALSTer熔解峰荧光值在1.50-1.90之间，则该样本的OsALSTer-T目的基因拷贝数为3。
L446转基因水稻(OsALSTer-T)qPCR拷贝数鉴定荧光比值参考范围如表3所示。
表3 L446转基因水稻(OsALSTer-T)qPCR拷贝数鉴定荧光比值参考范围
| OsALSTer-T拷贝数 | OsALSTer-T熔解峰荧光值/OsALSTer熔解峰荧光值 |
| 0 | OsALSTer熔解峰缺失，仅存在OsALSTer熔解峰 |
| 1 | 0.30-0.80(0.25-0.83) |
| 2 | 0.90-1.40(0.85-1.43) |
| 3 | 1.50-1.90(1.45-1.92) |
利用q-PCR对67株L446 T0代转基因苗进行拷贝数检测，设置3个重复，根据表3拷贝数鉴定荧光比值参考范围，结果表明：7个样是单拷贝、29个样是双拷贝、8个样是3拷贝。图2显示拷贝数为0/1/2/3的部分样品检测实验结果图。表4为统计部分样品qPCR拷贝数。
表4 L446转基因水稻(OsALSTer-T)qPCR拷贝数(1-3拷贝)部分
对比例1
本对比例使用常规相对标准曲线法，检测L446转基因水稻中目的基因的拷贝数，用于同实施例3的检测结果进行比较。
(1)获取DNA样品和引物
挑选L446转基因水稻T0代株系，用常规qPCR鉴定拷贝数的内参对照法来计算样品基因的拷贝数。以常用的水稻淀粉分支酶基因(RBE4)内参基因(一般选取基因组中的单拷贝基因)；以基因表达元件的另一个拟南芥来源的终止子AtHSP Ter作为目的基因，进行qPCR扩增。L446转基因水稻包含两个紧密连锁的基因表达盒，其中一个基因表达盒包含OsALSTer-T终止子元件，另一个基因表达盒包含AtHSP Ter终止子元件，通过比较AtHSPTer扩增的Ct值与RBE4的Ct值来计算AtHSP Ter的拷贝数，也能确定L446转基因水稻的拷贝数，具体引物序列如表5所示。
表5相对标准曲线检测GAT转基因水稻(GAT-5400)拷贝数引物
(2)qPCR-相对标准曲线法反应体系
使用同实施例2的方法获取野生型中花11(ZH11)和待测样本的基因组DNA并稀释至10ng/ul待用，其中以野生型中花11(ZH11)为对照，利用qPCR-相对标准曲线法，检测L446转基因水稻中AtHSP Ter目的基因拷贝数，具体体系如表6所示。
表6SYBR Green I实时定量PCR体系
(3)qPCR-相对标准曲线法反应程序
SYBR Green I实时定量PCR的反应程序：95℃，7min；94-95℃，15sec，60-62℃，30sec，72℃(收集荧光信号)，15sec，共计40个循环；60℃-95℃设置熔解曲线循环，(60℃，5s；温度增量步进：0.2℃/sec至95℃，5sec)；20℃，10sec，结束。
(4)qPCR-相对标准曲线法分析拷贝数
通过扩增效率和Ct值计算各自的表达量并转换成相对定量，最终通过目的基因的量与内参基因的量的比值计算得出目的基因的拷贝数，结果如图3所示。表7显示熔解曲线法检测结果为0-3拷贝的部分样本的相对标准曲线法拷贝数结果。
表7相对标准曲线法与熔解曲线法qPCR拷贝数检测结果比较
结果表明：熔解曲线法比相对标准曲线法的拷贝数的数据更加稳定、波动更小，从而使得拷贝数分析更加准确。RBE4为内参的拷贝数检测结果与熔解曲线法匹配率只有48％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、在内源终止子序列中插入DNA指纹序列，得到转基因终止子序列；所述DNA指纹序列大于10bp；
基于所述转基因终止子序列，在所述DNA指纹序列的两侧设计共用引物对；
S2、以转基因生物为待测样品；
使用步骤S1所述共用引物对，以待测样品的基因组DNA为模板，或者，分别以待测样品的基因组DNA和对照野生型样品的基因组DNA为模板，进行qPCR，得到PCR产物；
S3、分析步骤S2所述PCR产物的熔解曲线，根据转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰的荧光强度比值，判定转基因生物目的基因拷贝数；
所述转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰由待测转基因样品的基因组DNA扩增产物熔解得到；
所述转基因终止子序列熔解峰和内源终止子序列熔解峰对应的温度差值≥1℃。
2.根据权利要求1所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，转基因生物目的基因拷贝数＝K×(转基因终止子序列熔解峰荧光值/内源终止子序列熔解峰荧光值)，K为常数。
3.根据权利要求1或2所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，所述内源终止子序列选择水稻ALS基因终止子OsALSTer。
4.根据权利要求1-3所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，所述内源终止子序列如SEQ ID NO.1所示；所述转基因终止子序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求1-3所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，所述DNA指纹序列如SEQ ID NO.3所示。
6.根据权利要求3-5任意一项所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，
若转基因终止子序列熔解峰缺失，仅存在内源终止子序列熔解峰，则所述转基因生物目的基因拷贝数为0；
若转基因终止子序列熔解峰荧光值/内源终止子序列熔解峰荧光值为0.25-0.83，则所述转基因生物目的基因拷贝数为1；
若转基因终止子序列熔解峰荧光值/内源终止子序列熔解峰荧光值为0.85-1.43，则所述转基因生物目的基因拷贝数为2；
若转基因终止子序列熔解峰荧光值/内源终止子序列熔解峰荧光值为1.45-1.92，则所述转基因生物目的基因拷贝数为3。
7.根据权利要求3-6任意一项所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，步骤S2所述qPCR的反应体系以10μL计，包括0.5μl上游引物10μM，0.5μl下游引物10μM，5μlqCR Master Mix 2x，0.1μl CXR 100x*，1μl模板DNA 10±2ng，用ddH2O补足10μl。
8.根据权利要求3-7任意一项所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，步骤S2所述qPCR的反应程序为：50℃，1min；94-95℃，7min；94-95℃，10-20sec；60-62℃收集荧光信号1min，共计25个循环；60℃-95℃持续收集荧光信号，建立熔解曲线；
优选的，所述60℃-95℃持续收集荧光信号的程序为：60℃，1min；温度增量步进：0.2℃/sec至95℃，5sec；20℃，10sec。
9.转基因生物目的基因拷贝数检测试剂盒，其特征在于，包括所述共用引物对；
优选的，还包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR Buffer和DNA饱和性染料。
10.根据权利要求9所述转基因生物目的基因拷贝数检测试剂盒，其特征在于，所述DNA饱和性染料选自SYBR green、EvaGreen、LCGreen@PLUS、ResoLight、SYTO9中的任意一种。
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