KR20190103934A - 정성적 또는 정량적 돌연변이 유전형 분석방법 및 이 방법을 수행하기 위한 실시간 pcr 키트 - Google Patents

정성적 또는 정량적 돌연변이 유전형 분석방법 및 이 방법을 수행하기 위한 실시간 pcr 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돌연변이 형질을 구분할 수 있는 프로브 또는 프라이머와 함께 내부 대조구(internal control, IC)를 이용하여 돌연변이의 동형접합 형태(homozygous type)와 이형접합 형태(heterozygous type)를 구분하며, 특정한 돌연변이 유전형질을 정량적으로 분석할 수 있는 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-Time PCR) 기반의 효율적인 SNP 형질분석 및 정량분석 방법에 관한 것이다. 좀 더 자세하게는, 돌연변이 유전자형과 관계없이 PCR로 증폭되는 내부 대조구와 특정한 돌연변이 형질을 선별하여 PCR로 증폭할 수 있는 FenDEL 프로브 또는 ARMS 프라이머를 이용한 표적 유전자의 PCR 반응을 동시에 수행하며, PCR 결과 내부 대조구의 증폭산물량을 기준으로 표적 유전자의 증폭산물량의 상대적인 변화를 분석함으로써 돌연변이 유전형질을 판정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 종 구분이 가능한 돌연변이 마커에 대한 FenDEL 프로브와 내부 대조구의 동시 실시간 중합효소 연쇄반응을 활용하여 이종 개체 혼합시료의 혼입률을 정량적으로 분석하는 방법에 관한 것이다.

Description

정성적 또는 정량적 돌연변이 유전형 분석방법 및 이 방법을 수행하기 위한 실시간 PCR 키트 {Qualitative or quantitative mutant genotyping methods and real-time PCR kits for performing the methods}
본 발명은 돌연변이 형질을 구분할 수 있는 프로브 및 프라이머와 함께 내부 대조구(internal control, IC)를 이용하여 돌연변이의 동형접합 형태(homozygous type)와 이형접합 형태(heterozygous type)를 구분하며 특정한 돌연변이 유전형질을 정량적으로 분석할 수 있는 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-Time PCR) 기반의 효율적인 돌연변이 유전형 분석방법 및 이종 혼입률 정량 분석방법에 관한 것이다. 좀 더 자세하게는, 본 발명은 돌연변이 유전자형과 관계없이 PCR로 증폭되는 내부 대조구와 특정한 돌연변이 형질을 선택적으로 증폭할 수 있는 표적 유전자 PCR 반응을 동시에 수행하고, PCR 결과 내부 대조구의 증폭산물 양을 기준으로 표적 유전자의 증폭산물 양의 상대적인 변화를 분석함으로써 돌연변이 유전형질을 판정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 종 구분이 가능한 돌연변이 마커에 대한 PCR과 내부 대조구 PCR을 동시에 수행하여 이종 개체 혼합시료의 혼입률을 정량적으로 분석하는 방법에 관한 것이다.
실시간 중합효소 연쇄반응(real-time polymerase chain reaction, real-time PCR)은 정량 중합효소 연쇄반응(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)이라고도 불리며 중합효소 연쇄반응을 기반으로 하는 분석기술이다.
중합효소 연쇄반응은 분자생물학 실험에서 가장 강력한 기술 중 하나이며, 이 기술을 이용하면 DNA 혹은 cDNA 중의 특정 염기서열을 수천 배 내지 수만 배로 복제하거나 증폭할 수 있다.
엔드 포인트(End point) PCR이라고도 불리는 전통적인 PCR 방법은 증폭된 DNA의 양을 검출하거나 정량하기 위해서 PCR 반응이 완전히 완료된 이후 전기영동을 수행하고 그 결과를 이미지로 확인해야 한다. 반면 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR 또는 qPCR)은 표적 DNA 분자의 증폭과 정량을 동시에 수행할 수 있다.
PCR은 이론적으로 표적 DNA의 양이 두 배씩 증폭되므로 반응이 완료된 PCR 산물의 양으로 최초의 DNA 양을 구할 수 있다. 그러나 PCR 반응에 영향을 미치는 여러 인자로 인해 실제 정확한 분석은 쉽지 않다. 실제로 PCR의 초기 사이클에서는 PCR 산물의 양이 급격히 증가하는 지수기(exponential phase)가 나타나지만 PCR 반응 동안 효소의 활성 감소, dNTP 및 Mg+ 등의 감소로 인하여 정체기(plateau)가 나타나게 된다. 따라서, 정확한 DNA 양을 측정하고자 할 때는 DNA 양이 기하급수적으로 증가하는 구간, 즉 지수기에서 측정해야 한다. 그러므로 PCR 반응이 완료된 후 반응결과를 분석하는 전통적인 방법으로는 정확한 DNA 양을 측정하기 어렵다. 이러한 분석방법의 한계를 극복하기 위해 개발된 기술이 실시간 중합효소 연쇄반응이다. 실시간 중합효소 연쇄반응에서는 PCR 산물의 양을 사이클마다 매번 측정하므로 PCR 산물 양의 변화 양상, 즉 지수기와 정체기를 구분할 수 있다.
실시간 중합효소 연쇄반응에서는 형광 리포터를 이용하여 사이클마다 매번 변화된 DNA 양을 측정하게 된다. 형광 리포터로는 'SYBR Green'과 같이 염기서열과는 관계없이 이중 가닥 DNA(dsDNA)에 결합할 수 있는 물질을 이용하거나 'TaqMan 프로브'나 '분자 비콘(Molecular Beacons)' 등과 같이 특정 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머나 프로브에 결합된 형광물질이 사용된다. 사이클마다 형광 신호의 세기는 PCR 장비에 연결된 형광 측정 장치를 통해 측정되고, 형광 신호 세기의 변화가 반응에 따라 곡선 그래프로 나타나게 되어 실시간으로 PCR 산물이 얼마나 생성되는지를 확인할 수 있다.
실시간 중합효소 연쇄반응의 장점은 첫째, PCR 반응에 대한 실시간 모니터링이 가능하며, 둘째, 사이클마다 증폭된 PCR 산물의 양을 정확하게 측정할 수 있고, 셋째, 하나의 튜브 안에서 반응 및 분석이 완료되므로 PCR 이후 별도의 실험이 필요 없다는 것이다.
실시간 중합효소 연쇄반응의 기본적인 용도는 유전자 발현 해석과 도입 유전자의 복제수 해석과 같은 정량분석이지만, SNP 유전형 분석, 유전자 조작 식품 검사, 바이러스 병원균 검출과 같은 정성적인 분석에도 활용되고 있는데, 이것은 중합효소 연쇄반응 후 증폭 산물을 별도의 전기영동으로 확인할 필요가 없어서 간편하고 신속하게 결과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 원하지 않는 다른 주형이나 증폭 산물의 오염으로 인한 잘못된 PCR 결과를 얻을 위험을 낮출 수 있기 때문이다.
실시간 중합효소 연쇄반응을 이용하는 핵산 정량분석으로는 절대정량(absolute quantification)과 상대정량(relative quantification)의 두 가지 방식이 있다(Dhannasekaran, S. et al. 2010. Immunol Methods, 354(1-2): 34-9). 절대정량은 표준 DNA를 이용하여 검량선을 작성하고 이를 이용하여 표적 DNA의 양을 측정하는 방식으로, 이 방식은 필수적으로 검체와 표준 DNA의 PCR 효율이 동일해야 한다(Bar, T. et al. 2012. Nucleic Acids Research., 40(4): 1395-1406). 상대정량은 참조 유전자의 발현량을 기준으로 표적 유전자의 상대적 발현량의 차이를 결정하는 방식이다. 따라서 상대정량 실험에서는 발현량을 알고 싶은 표적 유전자 외에 반드시 참조 유전자도 함께 측정해야 한다. 참조 유전자는 시료 간의 주형량 표준화(보정)를 위한 것이며, 통상 항존 유전자(housekeeping gene)가 참조 유전자로서 많이 이용된다. 발현량 비교를 위해서는 우선 참조 유전자의 정량 값을 이용해 시료 간의 주형량을 표준화하고 표준화된 값을 대조군 시료와 비교해 발현량의 변동을 조사하게 된다.
상대정량은 검량선을 이용해 정량하는 방식 외에 검량선을 이용하지 않고 상대적인 정량 값을 수리적 계산으로 측정하는 비교정량(comparative quantification) 방식이 있다. 비교정량 방식으로 발현량을 분석하기 위해서는 분석에 사용되는 모든 시료는 동일한 방식으로 준비되어야 하며 측정되는 모든 유전자에 대해 PCR 증폭 효율이 거의 일정해야 하며, 또한 교정용 표준(calibrator) 시료가 표준물질로 사용되어야 한다.
정량분석에 사용되는 검량선은 표준 DNA 또는 표준 시료의 단계적 희석에 의해 얻어지는데 미지 시료의 절대적인 정량 또는 상대적인 정량의 기준이 되므로 검량선의 품질은 매우 중요하다. 검량선의 품질은 PCR의 증폭 효율을 계산하기 위해 사용되는 기울기와 직선성(상관계수, R2값)으로 평가된다.
검량선의 기울기를 통해 PCR 증폭 효율을 산출하는 수식은 검량선의 X축, Y축을 취하는 방법과 초기 주형량을 대수로 변환했을 때 달라지지만 X축을 초기 주형 농도(Log10), Y축을 Ct 값으로 대입했을 경우 ‘Efficiency (E) = -1 +10(-1/slope)’의 수식이 적용되며, 이 경우 기울기가 -3.1에서 -3.6 사이라면 증폭 효율은 90~110%이다. 통상적으로 적정수준으로 받아들여지는 증폭효율은 80~120%이며 증폭 효율이 낮은 경우에는 프라이머를 재설계하거나 PCR 저해 물질의 존재가 의심되므로 시료의 조제 방법을 재검토하게 된다.
검량선의 직선성은 상관계수(R2)로 나타내며 그 값이 1에 가까울수록 직선에 가까운 것이다. 실시간 중합효소 연쇄반응에서 일반적으로 받아들여지는 직선성은 0.98 이상이다.
단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)은 한 개의 염기가 치환된 형태의 DNA 다형성으로 인구집단에서 1% 이상의 빈도로 존재한다. 개인이 어떤 SNP 형질을 갖느냐에 따라서 질병 감수성과 치료제 반응과 같은 대사 과정에 중요한 개인별 차이가 나타나기도 한다. 특히 SNP는 복합 다중 유전자 편중을 갖는 질병에 대한 개인별 유전자의 분포를 조사할 때 유용하게 이용되고 있다.
SNP 유전형 분석(genotyping)이란 SNP의 염기서열을 판별하는 것을 말하며, 이는 DNA 변이를 구별할 수 있는 다양한 분자생물학적 분석기술을 이용하여 수행한다. 대부분의 SNP 판별 방법은 혼성화(hybridization)나 핵산 분해효소 또는 중합효소 등 효소를 이용하는 방식을 기반으로 하고 있으며 직접적인 염기서열분석을 통해 SNP를 판별하기도 한다.
중합효소 연쇄반응 또는 실시간 중합효소 연쇄반응을 활용하는 대표적인 SNP 판별 방법으로는 ARMS-PCR(Tetra-primer amplification refractory mutation system PCR) (Newton, C. R. et al. 1989. Nucleic Acids Research, 17 (7): 25032516), 알릴 특이적 PCR(Allele-specific PCR; AS-PCR) (Gaudet, M. I. et al. 2009. Methods Mol Biol., 578: 415-424), SSCP(Single-strand conformational polymorphism) 분석법 (Masato, O. et al. 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 86 (8): 2766-2770), DHPLC(Denaturing high performance liquid chromatography) (Oefner, P. J. et al. 1995. Am J Hum Genet.,57: 10310), 전체 앰플리콘에 대한 고해상도 용융(High-resolution melting of the entire amplicon) (Pasay C. et al. 2008. Med. Vet. Entomol.,22(1): 8288 ) 등이 있다.
실시간 중합효소 연쇄반응을 기반으로 하는 SNP 유전형 분석방법은 다른 SNP 판별 기술에 비해 대용량 분석, 원하지 않는 다른 주형이나 증폭 산물의 오염으로 인한 잘못된 PCR 결과 발생의 위험 감소 및 노동력 절감 등 많은 장점이 있기 때문에 기초 연구와 진단분야에서 활발하게 이용되고 있다.
실시간 중합효소 연쇄반응을 이용하여 SNP 형질을 구별하기 위해서는 두 종류의 가수분해 프로브를 동시에 사용하는 것이 일반적인 방식이다(Wittwe, C. T. et al., 1997. BioTechniques, 22: 176-181). 대표적인 가수분해 프로브인 TaqMan 프로브는 SNP와 그 주변 서열에 상보적인 염기서열을 갖는 수 개에서 수십 개의 염기로 구성된 올리고뉴클레오타이드이며, 5' 말단과 3' 말단에 각각 리포터 염료와 소광제(quencher)가 수식된 중합체이다. 돌연변이 형질에 따라 다른 종류의 형광물질이 리포터로 사용되는데 예를 들면 돌연변이 형질 1은 ‘VIC'로, 그리고 돌연변이 형질 2는 'FAM'으로 수식된 TaqMan 프로브를 사용하는 식이다. 또한, TaqMan 프로브의 염기서열 길이는 각 SNP 형질에 대한 특이도를 부여하기 위해서 가급적 짧아야 하는데 이로 인해 Tm 값이 필연적으로 낮아지게 되어 안정한 어닐링 상태 유지가 어려워지므로 이를 극복하기 위해 가격이 비싼 MGB(Minor Groove Binder)가 결합된 구조의 MGB-TaqMan 프로브를 사용하기도 한다(Kutyavin, I. V. et al. 2000. Nucleic Acids Res., 28: 655-661). MGB-TaqMan 프로브는 일반적인 TaqMan 프로브와 유사하지만 3' 말단에 마이너 그루브 결합부분을 더해 줌으로써 프로브의 길이가 짧아도 Tm이 높기 때문에 PCR 조건에서 안정한 어닐링 상태를 유지하게 된다.
MGB와 같이 별도의 변형 프로브를 사용하지 않고 TaqMan 프로브와 함께 AMRS (amplification refractory mutation system) PCR 원리를 적용하여 SNP를 분석하기도 한다(Ellison, G. et al. 2010. J. Exp. Clin. Cancer Res., 29: 132). 그러나 ARMS PCR은 SNP를 구분할 수 있는 최적의 PCR 조건을 찾기가 매우 까다롭다(Punia, P. et al., http://www.horizonpress.com/pcrbooks).
FenDEL ( FEN 1 activity de creasing l ed by a probe) 시스템은 DNA 폴리머레이즈의 플랩 엔도뉴클레이즈(Flap endonuclease; "FEN") 특이도를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이를 분석할 수 있는 새로운 SNP 검출기술로서(본 출원인의 대한민국특허 10-1598398호), 좀 더 자세히 설명하면, 프로브의 3' 말단 서열과 센스 프라이머의 3' 말단 서열이 상보적이며, 프로브 5' 말단이 PCR 산물의 SNP 포인트에 대응하도록 위치하며, 프로브 5' 말단의 일부가 SNP 포인트의 돌연변이를 만나면 2염기 이상의 플랩구조가 형성되면서 중합반응이 중단되는 특성을 이용하여 시험대상 시료의 SNP 포인트에 돌연변이가 존재하는지를 밝히는 기술이다. 실시간 중합효소 연쇄반응과 혼성화 프로브(hybridization probe) 또는 TaqMan 프로브 등의 가수분해 프로브 등을 이용하는 방법은 단순히 온도에 따른 프로브의 상보적 결합력의 차이를 이용하여 SNP를 구분하는 반면, FenDEL 시스템은 온도에 따른 구분이 아니라 효소의 특성을 이용하기 때문에 검사의 특이성이 뛰어나고 다종 분석에 장점이 있다. FenDEL 프로브를 이용하는 실시간 중합효소 연쇄반응은 신속하고 민감도와 특이도가 우수하고 경제적인 유전자 돌연변이 탐지수단으로서, 높은 특이도와 민감도가 요구되는 종양 특이적인 돌연변이 검출에 적용 가능한 방법 중 하나이다.
MGB-TaqMan 등 형광 프로브와 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 SNP 유전자형 분석은 PCR 반응이 최종 종료된 시점에서 리포터 염료의 형광 신호를 이용하게 된다. 즉 PCR 반응이 끝날 때 두 SNP 형질을 각각 대변하는 리포터 염료의 형광 신호가 측정되고 측정된 형광 신호의 종류와 비율 분석 등을 통해 시료의 SNP 유전자형을 판정하는 방식이다. 그리고 일반적으로 리포터 염료의 신호는 플롯(plot) 형태로 가시화되어 형질분석에 이용되고 있다.
측정된 형광 신호의 SNP 호출(SNP calling), 유전형질 판독 및 가시화 등 일련의 분석과정은 자동 분석 프로그램에 의해 수행된다. 그러나 희소 대립인자를 분석하거나 SNP 유전자형의 신호 구분이 분명하지 않은 경우는 형질 판정에 주의를 기울여야 한다. 즉 정확한 SNP 호출은 데이터 품질을 평가하고 형광신호 임계값(threshold)을 설정하며 SNP의 유전자형을 결정하는 전문가의 수작업을 필요로 한다. 이러한 문제를 피하기 위해서 모든 유전형질 분석실험에 양성 대조군 분석을 포함하거나 K-mer라 불리는 통계적 분석이 사용되기도 한다(Ranade, K. et al. 2001. Genome Res., 11: 1262-1268).
실시간 중합효소 연쇄반응을 이용하여 시료의 절대량 또는 상대적인 양을 측정하기 위해서는 PCR 산물이 지수 함수적으로 증가하기 시작하는 PCR 주기, 즉 Ct(Threshold cycle) 값을 기초 정보로 활용하며, SNP 유전형질을 분석하는 경우에는 PCR 반응 종료 시점에서 형광의 종류와 형광 신호의 크기 값(Rn 또는 RFU)을 기초 정보로 활용하는 것이 일반적이다.
Ct(Threshold cycle)란 형광 신호가 임계값을 넘어가는 주기를 말하며 사용되는 실시간 중합효소 연쇄반응 기기에 따라서 Cp(cross point cycle) 또는 Cq(quantification cycle)라는 용어로 사용되기도 한다. Ct 값의 변화는 PCR에 사용되는 표적 DNA의 양과 관계되는데 Ct 값의 크기는 반응시 가하는 최초 주형의 농도와 반비례한다. 즉 Ct 값이 크면 PCR에 사용된 최초 주형의 농도가 낮다는 것이고 Ct 값이 작으면 최초 주형의 농도가 높다는 것이다.
분석기기에 따라서 형광 신호의 크기 값은 Rn 또는 RFU로 다르게 표현되고 있다. Rn (Relative normalized fluorescence)은 PCR 웰 간에 발생하는 형광 신호의 편차를 보정하기 위해 사용되는 값으로, 리포터 염료에서 방출되는 형광 신호의 크기 값을 참조 시료에서 방출되는 형광 신호의 크기 값으로 나누어 정규화된 값을 말한다. ABI 사의 7300/7500 Real Time PCR System 등이 Rn을 사용하는 대표적인 분석기기이다. 또 다른 형광 검출 분석에 사용되는 측정 단위인 RFU (Relative fluorescent units)는 PCR 웰 간에 편차를 보정할 필요가 없는 분석기기에서 사용되는 형광 신호의 단위로 RFU 값은 증폭된 DNA의 양이 많을수록 높아지며 그 값은 0에서 수천까지의 범위일 수 있다. Bio-Rad 사의 CFX-96 Real Time System 등이 RFU를 사용하는 대표적인 분석기기이다.
일반적으로 PCR 반응시 프라이머와 PCR 산물 간의 결합 경쟁 때문에 PCR 산물의 증가가 더이상 일어나지 않는 정체기가 나타나는 것으로 알려져 있다(Kainz, P. et al. 2000. Biochim Biophys Acta, 1494(1-2): 23-27). 즉, 더 많은 PCR 산물이 표적에 결합할수록 프라이머가 표적에 결합할 가능성이 작아지게 되어 새로운 합성이 일어날 수 없는 상황이 되기 때문이다. 따라서, PCR 주기의 증가가 반드시 PCR 생성물의 총량을 증가시키지는 않으며 결과적으로 정체기에서 확인되는 총 PCR 산물과 출발 표적의 양 사이에는 상관관계가 없게 되는 것이다. 또한, 실시간 중합효소 연쇄반응에 어떤 종류의 분석기를 이용하느냐에 따라서 동일한 분석 조건이라 하더라도 최종 검출되는 형광 신호의 크기는 다르게 나타날 수 있다. 또한, 동일한 분석기를 이용하더라도 측정 당시의 기기 상태, 예를 들면 발광의 세기와 검출기 상태 및 광원으로부터의 거리를 결정하는 웰의 위치에 따라서 형광 값은 다를 수 있다. 이와 같은 이유로 실시간 중합효소 연쇄반응 분석에서 PCR 반응 종료 단계의 Rn 또는 RFU 값을 시료의 정량적 분석에는 활용하지 못하고 있었다.
상기와 같이 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 다양한 유전형질 분석방법 및 유전자 정량분석 방법이 개발되어 왔지만, 여전히 좀 더 경제적이고 효율적인 개선된 기술이 필요하다.
본 발명의 목적은 실시간 중합효소 연쇄반응에서 돌연변이 유전자형과 관계없이 PCR 반응으로 증폭되는 내부 대조구와 특정한 돌연변이 형질을 선택적으로 증폭할 수 있는 PCR 반응을 하나의 웰에서 동시에 시행하며, PCR 결과 생성된 내부 대조구의 증폭산물 양을 기준으로 선택적으로 증폭된 돌연변이 형질의 증폭산물 양의 상대적인 변화를 비교 분석함으로써 표적 유전자의 돌연변이 유전형을 기존의 방법보다 명확하고 경제적으로 판정할 수 있는 정성적 분석방법을 제공하려는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 종 구분이 가능한 돌연변이 마커에 대하여 FenDEL 프로브와 내부 대조구를 이용한 이중 PCR (dual PCR)을 활용하여 이종 개체 혼합시료의 혼입률을 정량적으로 분석할 수 있는 방법을 제공하려는 것이다.
이를 위하여 본 발명자들은 실시간 중합효소 연쇄반응을 기반으로 돌연변이 유전자형을 판정하기 위해서 공동의 내부 대조구를 특정한 돌연변이 시험시료와 함께 PCR 증폭하였으며, 그 결과 측정되는 내부 대조구의 Ct 값과 특정한 돌연변이 시험시료의 Ct 값의 상대적인 값의 변화, 그리고 내부 대조구의 증폭곡선상의 정체기 또는 지수기의 형광 세기와 특정한 돌연변이 시험시료의 증폭곡선상의 지수기 형광 세기의 상대적인 변화 값을 산출하였다. 그리고 산출된 값을 토대로 다양한 관계식을 적용함으로써 돌연변이 유전자형을 명확하게 판정하고 특정 돌연변이 형질의 혼입률을 정량적으로 분석할 수 있는 수식을 도출하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 용어, '증폭 플롯(plot)'은 실시간 중합효소 연쇄반응에서 매 주기별로 측정되는 형광 신호의 크기 값을 연결하여 곡선으로 표현한 것을 말한다. 증폭될 표적 핵산의 최초 복제수가 많을수록 형광 값의 증가가 관찰되는 시작 주기가 빠르다.
본 발명에서 용어, '패시브 참조 염료(passive reference dye)’는 PCR 웰 간에 발생하는 형광 신호의 편차를 보정하기 위해 사용되는 참조 염료를 말하며, 반응에 영향을 미치지 않는 참조 염료이면 특별한 제한은 없으나 ROX 염료가 가장 일반적으로 사용된다.
본 발명에서 용어, 'Rn(Relative normalized fluorescence)'은 리포터 염료에서 방출되는 형광 신호의 크기 값을 패시브 참조 염료(passive reference dye)에서 방출되는 형광 신호의 크기 값으로 나누어 정규화된 값을 말한다.
본 발명에서 용어, '델타 Rn(ΔRn)'은 Rn에서 기저선(baseline)을 뺀 형광 신호의 크기 값을 의미한다.
본 발명에서 용어, '임계값(threshold)'은 실시간 중합효소 연쇄반응에서 Ct 값을 결정하기 위해 사용되는 델타 Rn을 말한다. 임계값은 일반적으로 기저선보다 높으면서 지수적으로 증폭을 시작하는 위치이며 자동 또는 수동으로 설정된다.
본 발명에서 용어, 'RFU(Relative fluorescent unit)'는 형광 검출 분석에 사용되는 측정 단위로서, 증폭된 DNA의 양이 많을수록 RFU 값은 커지며 RFU 값은 0에서 수천까지의 범위일 수 있다.
본 발명에서 'Raf (Relative Amplification efficiency)'는 특정한 돌연변이 형질의 내부 대조구 대비 상대적인 증폭효율을 말한다.
본 발명에서 용어, 'RCt (relative Ct)'는 특정한 돌연변이 형질의 Ct 값을 내부 대조구의 Ct 값으로 나눈 값이다.
본 발명에서 용어, 'ΔCt'는 특정 돌연변이 형질의 Ct 값에서 내부 대조구의 Ct 값을 뺀 값이다.
본 발명에서 용어, 'RΔRn1 (relative ΔRn1)'은 실시간 중합효소 연쇄반응의 형광 값이 ΔRn으로 표현되는 경우이면서 내부 대조구의 형광 값이 특정한 돌연변이 형질의 형광 값보다 큰 경우 내부 대조구의 형광 값을 특정한 돌연변이 형질의 형광 값으로 나눈 값이다.
본 발명에서 용어, 'RRFU1 (relative RFU1)'은 실시간 중합효소 연쇄반응의 형광 값이 RFU로 표현되는 경우이면서 내부 대조구의 형광 값이 특정한 돌연변이 형질의 형광 값보다 큰 경우 내부 대조구의 형광 값을 특정한 돌연변이 형질의 형광 값으로 나눈 값이다.
본 발명에서 용어, 'RΔRn2 (relative ΔRn2)'은 실시간 중합효소 연쇄반응의 형광 값이 ΔRn으로 표현되는 경우이면서 특정한 돌연변이 형질의 형광 값이 내부 대조구의 형광 값보다 큰 경우 특정한 돌연변이 형질의 형광 값을 내부 대조구의 형광 값으로 나눈 값이다.
본 발명에서 용어, 'RRFU2 (relative RFU2)'은 실시간 중합효소 연쇄반응의 형광 값이 RFU로 표현되는 경우이면서 특정한 돌연변이 형질의 형광 값이 내부 대조구의 형광 값보다 큰 경우 특정한 돌연변이 형질의 형광 값을 내부 대조구의 형광 값으로 나눈 값이다.
본 발명에서 용어, 'ΔΔRn1'은 실시간 중합효소 연쇄반응의 형광 값이 ΔRn으로 표현되는 경우이면서 내부 대조구의 형광 값이 특정한 돌연변이 형질의 형광 값보다 큰 경우 내부 대조구의 형광 값에서 특정한 돌연변이 형질의 형광 값을 뺀 값이다.
본 발명에서 용어, 'ΔRFU1'은 실시간 중합효소 연쇄반응의 형광 값이 RFU로 표현되는 경우이면서 내부 대조구의 형광 값이 특정한 돌연변이 형질의 형광 값보다 큰 경우 내부 대조구의 형광 값에서 특정한 돌연변이 형질의 형광 값을 뺀 값이다.
본 발명에서 용어, 'ΔΔRn2'는 실시간 중합효소 연쇄반응의 형광 값이 ΔRn으로 표현되는 경우이면서 특정한 돌연변이 형질의 형광 값이 내부 대조구의 형광 값보다 큰 경우 특정한 돌연변이 형질의 형광 값에서 내부 대조구의 형광 값을 뺀 값이다.
본 발명에서 용어, 'ΔRFU2'는 실시간 중합효소 연쇄반응의 형광 값이 RFU로 표현되는 경우이면서 특정한 돌연변이 형질의 형광 값이 내부 대조구의 형광 값보다 큰 경우 특정한 돌연변이 형질의 형광 값에서 내부 대조구의 형광 값을 뺀 값이다.
본 발명에서 용어, 'C 값(c-value)'은 SNP를 비롯한 돌연변이 유전자형 구분을 명확히 하기 위해 실험조건별로 산출되는 값으로서 동일 수량의 표준 이형접합자와 표준 동형접합자 DNA의 실시간 중합효소 연쇄반응 결과 확인 가능한 Ct 값과 형광 값을 기초로 산출될 수 있는 다양한 상대 값(ΔCt, RCt, ΔΔRn, ΔRFU, RΔRn, RRFU) 또는 다양한 상관관계 값(상대 Ct 값과 상대 형광 값을 곱하거나 나눈 값) 각각의 평균값이다.
본 발명은 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용하여 하나 이상의 돌연변이 대립 유전형질을 경제적이고 정확하게 판정하고 및/또는 특정한 돌연변이 형질의 혼입률을 효과적으로 분석하기 위한 것이다.
본 발명은 특정한 돌연변이 형질의 분석을 위한 증폭과 동시에 내부 대조구 증폭을 수행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 내부 대조구는 돌연변이 형질과는 관계없이 공통으로 증폭되는 유전자임을 특징으로 한다. 내부 대조구로는 항존 유전자(housekeeping gene)를 선택하는 것이 바람직하다.
본 발명은 돌연변이 형질을 구분하여 증폭할 수 있는 프라이머나 프로브를 이용하는 것을 특징으로 한다. 돌연변이 형질을 구분하는 방법은 돌연변이 형질을 선택적으로 증폭할 수 있는 돌연변이 형질 특이적 프라이머(allele-specific primer)를 사용하는 방법(이하, ARMS)이거나 DNA 폴리머레이즈의 FEN (Flap endonuclease) 특이도를 이용하여 SNP 등의 돌연변이를 검출할 수 있는 FenDEL 시스템을 이용하는 방법일 수 있다.
본 발명은 증폭 여부 및 증폭량을 확인할 수 있는 TaqMan 프로브와 같은 형광 수식 프로브를 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 실시간 중합효소 연쇄반응에서 측정되는 Ct 값과 증폭곡선의 지수기 또는 정체기의 형광 값을 함께 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 실시간 중합효소 연쇄반응에서 측정되는 내부 대조구의 형광 값은 증폭곡선의 지수기 또는 정체기의 형광 값이며, 특정한 돌연변이 형질의 형광 값은 증폭곡선의 지수기의 형광 값으로 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 특정한 돌연변이 형질의 Ct 값은 내부 대조구의 Ct 값보다 항상 큰 값이며, 특정한 돌연변이 형질의 형광 값은 내부 대조구의 형광 값보다 작거나 또는 큰 값임을 특징으로 한다.
본 발명은 실시간 중합효소 연쇄반응에서 측정되는 내부 대조구와 특정한 돌연변이 형질의 상대적인 Ct 값(상대 Ct 값, 이하 명세서 및 도면에서 "Rct" 또는 "ΔCt (delta Ct)"와 혼용함)과 내부 대조구와 특정한 돌연변이 형질의 상대적인 형광 값(상대 형광 값, 이하 명세서 및 도면에서 "RΔRn", "RRFU", "ΔΔRn" 또는 "ΔRFU"와 혼용함)을 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 내부 대조구와 특정한 돌연변이 형질의 상대 Ct 값 또는 상대 형광 값을 산출하는 방법은 큰 값에서 작은 값을 빼거나 큰 값을 작은 값으로 나누는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 내부 대조구와 특정한 돌연변이 형질의 상대 Ct 값과 상대 형광 값을 곱하거나 나눈 상관관계 값을 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 실시간 중합효소 연쇄반응에서 측정되는 Ct 값 및 형광 값을 기반으로 하는 다양한 상대 값 및 상관관계 값의 계수(이하에서 "C-값(C-value)"와 혼용함)를 각각 산출하고 이를 이용하여 돌연변이 유전자형을 판정하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 'C-값(C-value)'은 동일한 분석조건으로 동일 수량의 표준 이형접합자와 표준 동형접합자 DNA의 실시간 중합효소 연쇄반응 결과 확인되는 Ct 값과 형광 값을 기초로 산출되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 'C-값' 산출을 위한 분석조건은 미지의 시험시료 분석조건과 동일하고 분석에 사용되는 분석기 종류와 키트의 조제 조건이 동일함을 특징으로 한다.
본 발명은 Ct 값과 형광 값을 기반으로 산출된 다양한 상대 값 또는 상관관계 값을 각각의 C-값으로 나누어 그 값이 1보다 큰 경우와 작은 경우로 돌연변이 형질의 접합자 형태를 판단할 수 있음을 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 돌연변이 유전형 판정을 위한 상관관계식은 Ct 값만으로 산출된 ΔCt, RCt 또는 형광 값만으로 산출된 ΔΔRn, ΔRFU, RΔRn, RRFU를 각각의 C-값으로 나눈 경우보다 Ct 값 기반의 산출 값과 형광 값 기반의 산출 값을 곱하거나 나눈 뒤 C-값으로 나눈 경우 유전형질을 좀 더 명확하게 구분할 수 있음을 특징으로 한다.
본 발명에서 상관관계식은 특정한 돌연변이 형질의 형광 값이 내부 대조구의 형광 값보다 작은 경우에는 Ct 값 기반의 산출 값과 형광 값 기반의 산출 값을 곱하는 것을 특징으로 한다. 예컨대, Raf1 = (RCt x RΔRn1) / C-value이다.
본 발명에서 상관관계식은 특정한 돌연변이 형질의 형광 값이 내부 대조구의 형광 값보다 큰 경우에는 Ct 값 기반의 산출 값과 형광 값 기반의 산출 값을 나누는 것을 특징으로 한다. 예컨대, Raf2 = (RCt ÷ RRFU2) / C-value이다.
또한, 본 발명은 특정한 돌연변이 형질의 혼입률을 알고 있는 표준시료를 이용하여 검량선을 작성하고 작성된 검량선을 이용하여 미지의 시험시료의 특정한 돌연변이 형질의 혼합률을 측정하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 검량선 작성에 이용되는 표준시료는 특정한 돌연변이 형질의 혼입률이 다른 두 개 이상의 표준시료를 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 검량선은 실시간 중합효소 연쇄반응에서 측정되는 상대 Ct 값 또는 상대 형광 값 또는 상대 Ct 값과 상대 형광 값을 곱하거나 나눈 상관관계 값을 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상대 Ct 값, 상대 형광 값 또는 상대 Ct 값과 상대 형광 값을 곱하거나 나눈 상관관계 값을 이용하여 각각 작성된 검량선 중에서 기울기가 작은 검량선을 이용하는 경우보다 기울기가 큰 검량선을 이용하여 미지의 시험시료의 특정한 돌연변이 형질 혼입률을 분석한 결과가 좀 더 정확한 값을 산출할 수 있음을 특징으로 한다.
본 발명은 실시간 PCR을 이용하여 돌연변이를 검출하는 방법에 있어서,
(가) 하나의 튜브 안에서 시험구의 특정한 돌연변이 형질을 선별 증폭하는 실시간 PCR과 상기 특정 돌연변이를 포함하는 유전체 내의 유전자 중 하나를 내부 대조구로 지정하여 내부 대조구에 대한 실시간 PCR을 수행하는 단계;
(나) 상기 특정 돌연변이 형질에 대한 동형접합자(homozygote) 시료와 이형접합자(heterozygote) 시료가 특정 몰비로 존재하는 표준시료에 대한 실시간 PCR을 상기 (가)와 동일 조건 및 동일 기종으로 수행하는 단계;
(다) 상기 내부 대조구 PCR과 시험구 PCR에서 측정한 Ct 값 및 PCR 종료 시점의 형광 값인 ΔRn 및 RFU 중 하나 이상을 얻는 단계;
(라) 내부 대조구 PCR에서 측정한 Ct 값과 시험구 PCR에서 측정한 Ct 값 중 작은 값으로 큰 값을 나눈 값인 RCt (relative Ct), Ct 값 중 큰 값에서 작은 값을 뺀 값인 ΔCt (delta Ct), 형광 값 중 작은 값으로 큰 값을 나눈 값인 RΔRn, RRFU, 형광 값 중 큰 값에서 작은 값을 뺀 값인 ΔΔRn, ΔRFU 및 이들 값을 곱한 값 또는 이들 값을 나눈 값 중 하나 이상의 값을 얻는 단계;
(마) 상기 표준시료에 대한 PCR 결과 동형접합자 시료 및 이형접합자 시료에 대한 각 Ct 값 및 각 형광 값 ΔRn 및 RFU 중 하나 이상을 얻는 단계;
(바) 상기 표준시료 중 동형접합자 시료와 이형접합자 시료의 Ct 값, 형광 값인 ΔRn 값 또는 RFU 값, 이들 값의 상대값인 ΔCt, RCt, ΔΔRn, ΔRFU, RΔRn, RRFU 및 이들 상대값을 곱한 값 또는 상대값을 나눈 값 및 이들 값의 평균값인 C-값을 구하는 단계;
(사) 상기 (라)에서 얻은 내부 대조구와 시험구의 Ct 값, ΔRn 값, RFU 값, 이들의 상대값인 ΔCt, RCt, ΔΔRn, ΔRFU, RΔRn, RRFU 및 이들 상대값을 곱한 값 또는 이들 상대값을 나눈 값을 각각 상응하는 상기 (바) 단계의 평균값인 C-값으로 나누는 단계; 및
(아) 상기 (사) 단계에서 얻은 값이 1보다 큰 경우 이형접합자로, 1보다 작은 경우 동형접합자로 구분하는 단계;를 포함하는 실시간 PCR을 이용하여 돌연변이를 확인하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 돌연변이가 염기의 삽입(insertion), 결실(deletion), 치환(substitution) 및 단일 염기서열 다형성(single nucleotidepolymorphism, SNP) 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 실시간 PCR을 이용하여 돌연변이를 확인하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 돌연변이가 식물, 동물, 미생물, 인체, 농수산물 및 그 가공품에 존재하는 돌연변이임을 특징으로 하는, 실시간 PCR을 이용하여 돌연변이를 확인하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 특정한 돌연변이 형질을 선별 증폭하는 실시간 PCR 방법이 FenDEL-PCR, ARMS-PCR, TaqMan-PCR, MGB-TaqMan-PCR 및 PNA-PCR 중 선택된 하나임을 특징으로 하는, 실시간 PCR을 이용하여 돌연변이를 확인하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 내부 대조구로서 항존 유전자(house keeping gene)를 선택함을 특징으로 하는, 실시간 PCR을 이용하여 돌연변이를 확인하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 (나) 단계, (마) 단계 및 (바) 단계가 여타 단계와 별도로 진행되어 동형접합자 표준시료 및 이형접합자 표준시료에 대한 각 Ct 값 및 각 형광 값 ΔRn 및 RFU 중 하나 이상 또는 표준시료 중 동형접합자 시료와 이형접합자 시료의 Ct 값, 형광 값인 ΔRn 값 또는 RFU 값 또는 이들의 상대값인 ΔCt, RCt, ΔΔRn, ΔRFU, RΔRn, RRFU 및 이들 상대값을 곱한 값 또는 상대값을 나눈 값의 평균값인 C-값이 프로토콜화되어 제공됨을 특징으로 하는, 실시간 PCR을 이용하여 돌연변이를 확인하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법을 수행하기 위하여 내부 대조구에 대한 프라이머 및 프로브; 동형접합자 시료, 이형접합자 시료를 포함하는 표준시료; 상기 표준시료에 대한 프라이머 및 프로브; 및 시험대상 시료의 돌연변이 형질을 구분할 수 있는 프라이머 및 프로브;를 포함하는 것을 특징으로 하는 실시간 PCR 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법을 수행하기 위하여
동형접합자 표준시료와 이형접합자 표준시료에 대한 각 Ct 값 및 각 형광 값 ΔRn 및 RFU 중 하나 이상 또는 표준시료 중 동형접합자 시료와 이형접합자 시료의 Ct 값, 형광 값인 ΔRn 값 또는 RFU 값, 이들 값의 상대값인 ΔCt, RCt, ΔΔRn, ΔRFU, RΔRn, RRFU 및 이들 상대값을 곱한 값 또는 상대값을 나눈 값과 이들 값의 평균값인 C-값이 기록된 프로토콜;
내부 대조구에 대한 프라이머 및 프로브; 및
시험대상 시료의 돌연변이 형질을 구분할 수 있는 프라이머 및 프로브;를 포함하는 것을 특징으로 하는 실시간 PCR 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 실시간 PCR을 이용하여 돌연변이를 검출하는 방법에 있어서,
(가) 하나의 튜브 안에서 시험구의 특정한 돌연변이 형질을 선별 증폭하는 실시간 PCR과 상기 특정 돌연변이를 포함하는 유전체 내의 유전자 중 하나를 내부 대조구로 하여 내부 대조구에 대한 실시간 PCR을 수행하는 단계;
(나) 상기 특정 돌연변이 형질에 대한 동형접합자(homozygote) 표준시료와 이형접합자(heterozygote) 표준시료 및 동형접합자와 이형접합자가 특정 몰비로 존재하는 하나 이상의 표준시료에 대한 실시간 PCR을 상기 (가)와 동일 조건 및 동일 기종으로 수행하는 단계;
(다) 상기 내부 대조구 PCR과 시험구 PCR에서 측정한 Ct 값 및 PCR 종료 시점의 형광 값인 ΔRn 및 RFU 중 하나 이상을 얻는 단계;
(라) 내부 대조구 PCR에서 측정한 Ct 값과 시험구 PCR에서 측정한 Ct 값 중 작은 값으로 큰 값을 나눈 값인 RCt (relative Ct), Ct 값 중 큰 값에서 작은 값을 뺀 값인 ΔCt (delta Ct), 형광 값 중 작은 값으로 큰 값을 나눈 값인 RΔRn, RRFU, 형광 값 중 큰 값에서 작은 값을 뺀 값인 ΔΔRn, ΔRFU 및 이들 값을 곱한 값 또는 이들 값을 나눈 값 중 하나 이상의 값을 얻는 단계;
(마) 상기 표준시료에 대한 PCR 이후 각 표준시료에 대한 각 Ct 값 및 각 형광 값 ΔRn 및 RFU 중 하나 이상을 얻는 단계;
(바) 상기 표준시료 중 동형접합자 표준시료와 이형접합자 표준시료의 Ct 값, 형광 값인 ΔRn 값 또는 RFU 값의 상대값인 ΔCt, RCt, ΔΔRn, ΔRFU, RΔRn, RRFU 및 이들 상대값을 곱한 값 또는 상대값을 나눈 값의 평균값인 C-값을 구하는 단계;
(사) 상기 (바) 단계에서 얻은 값을 이용하여 상기 표준시료에 대하여 검량곡선을 작성하는 단계;
(아) 상기 (라)에서 얻은 내부 대조구와 시험구의 Ct 값, ΔRn 값, RFU 값, 이들의 상대값인 ΔCt, RCt, ΔΔRn, ΔRFU, RΔRn, RRFU 및 이들 상대값을 곱한 값 또는 이들 상대값을 나눈 값을 각각 상응하는 상기 (바) 단계의 평균값인 C-값으로 나누는 단계; 및
(자) 상기 (아) 단계에서 얻은 값을 상기 (사) 단계에서 얻은 검량곡선에 대입하여 시험구의 동형접합자/이형접합자 혼합률을 산출하는 단계;를 포함하는 실시간 PCR을 이용하여 특정 돌연변이 혼합률을 확인하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 돌연변이가 염기의 삽입(insertion), 결실(deletion), 치환(substitution) 및 단일 염기서열 다형성(single nucleotidepolymorphism, SNP) 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 돌연변이가 식물, 동물, 미생물, 인체, 농수산물 및 그 가공품에 존재하는 돌연변이임을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 특정한 돌연변이 형질을 선별 증폭하는 실시간 PCR 방법이 FenDEL-PCR, ARMS-PCR, TaqMan-PCR, MGB-TaqMan-PCR 및 PNA-PCR 중 선택된 하나임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 내부 대조구로서 항존 유전자(house keeping gene)를 선택함을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 (나), (마), (바) 및 (사) 단계가 여타 단계와 별도로 진행되어 동형접합자 표준시료, 이형접합자 표준시료 및 동형접합자와 이형접합자가 특정 몰비로 존재하는 하나 이상의 표준시료에 대한 각 Ct 값 및 각 형광 값 ΔRn 및 RFU 중 하나 이상 또는 표준시료 중 동형접합자 시료와 이형접합자 시료의 Ct 값, 형광 값인 ΔRn 값 또는 RFU 값의 상대값인 ΔCt, RCt, ΔΔRn, ΔRFU, RΔRn, RRFU 및 이들 상대값을 곱한 값 또는 상대값을 나눈 값의 평균값인 C-값, 및 표준시료에 대하여 작성된 검량곡선이 프로토콜화되어 제공됨을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 방법을 수행하기 위하여
내부 대조구에 대한 프라이머 및 프로브;
동형접합자 시료, 이형접합자 시료 및 동형접합자와 이형접합자가 일정 비율로 혼합된 두 개 이상의 혼합시료를 포함하는 표준시료;
상기 표준시료에 대한 프라이머 및 프로브; 및
시험대상 시료의 돌연변이 형질을 구분할 수 있는 프라이머 및 프로브;를 포함하는 것을 특징으로 하는 실시간 PCR 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법을 수행하기 위하여
동형접합자 표준시료, 이형접합자 표준시료 및 동형접합자와 이형접합자가 특정 몰비로 존재하는 하나 이상의 표준시료에 대한 각 Ct 값 및 각 형광 값 ΔRn 및 RFU 중 하나 이상 또는 표준시료 중 동형접합자 시료와 이형접합자 시료의 Ct 값, 형광 값인 ΔRn 값 또는 RFU 값의 상대값인 ΔCt, RCt, ΔΔRn, ΔRFU, RΔRn, RRFU 및 이들 상대값을 곱한 값 또는 상대값을 나눈 값의 평균값인 C-값, 또는 표준시료에 대하여 작성된 검량곡선이 기록된 프로토콜;
내부 대조구에 대한 프라이머 및 프로브; 및
시험대상 시료의 돌연변이 형질을 구분할 수 있는 프라이머 및 프로브;를 포함하는 것을 특징으로 하는 실시간 PCR 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 키트가 농산물, 축산물, 수산물 및 이들의 가공품 중 어느 하나의 품종판별 또는 품종의 혼입도 판별용임을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 실시간 중합효소 연쇄반응을 기반으로 하는 돌연변이 대립 형질의 동형 및 이형 접합 형태를 빠르고 명확하게 구별할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 시료 중 특정한 돌연변이 형질의 혼입 비율을 정량적으로 분석할 수 있다.
본 발명의 방법에 의하면, 돌연변이 형질의 판정 및 정량적 분석을 위해서 실시간 중합효소 연쇄반응 결과에서 확인되는 Ct 값과 형광 신호 값을 함께 활용함으로써 좀 더 정확하게 돌연변이 유전자형을 판정하고 또는 시료 중 특정한 돌연변이 형질의 혼입률을 효율적으로 정량할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 실시간 중합효소 연쇄반응을 기반으로 돌연변이 형질을 판정하기 위해 돌연변이 형질을 각각 반영하는 두 종류의 형광표지 프로브를 사용하는 기존의 방법과 달리 공동으로 사용하는 내부 대조구 증폭산물 반영 형광 표지 프로브와 두 돌연변이 형질 중 한쪽의 형질만을 반영하는 형광표지 프로브를 사용하므로 한 개의 시험관 내에서 다수의 돌연변이를 동시에 분석할 수 있는 경제적인 수단이 제공된다.
도 1은 내부 대조구(internal control, IC)와 한 종의 SNP 형질(외산 SNP 형질)만을 선별하여 증폭할 수 있는 FenDEL 프로브를 사용한 실시간 중합효소 연쇄반응으로 SNP 유전자형을 판정하는 방법(A)과 이형접합자(A/B heterozygote)와 동형접합자(B/B homozygote)를 구분하는 기본 개념도이다(B).
도 2는 100% 외산 참깨(B/B Homo)와 50% 혼합 참깨 (A/B Hetero)의 gDNA를 7500 Real Time PCR System (ABI 사)을 이용하여 3회씩 반복 분석한 증폭곡선(A)과 각 증폭곡선에서 측정된 Ct 값과 형광 값을 기초로 유전자형을 판단하기 위해 상관관계식 (Raf1 = RCt x RΔRn1 / C-value)을 적용한 결과이다(B).
도 3은 100% 국산 참깨(A/A Homo), 100% 외산 참깨(B/B Homo), 50% 혼합 참깨(A/B Hetero)의 gDNA를 CFX96 Real-Time System (Bio-Rad)을 이용하여 3회 반복 분석한 증폭곡선이다(set 1, 2, 3).
도 4는 100% 외산 참깨(B/B Homo)와 50% 혼합 참깨(A/B Hetero)의 gDNA를 CFX96 Real-Time System (Bio-Rad)을 이용하여 3회씩 반복 분석한 증폭곡선에서 측정된 Ct 값과 형광 값을 이용한 상관관계식으로 유전형을 구분한 것이다.
도 5는 100% 외산 참깨(B/B Homo)와 50% 혼합 참깨(A/B Hetero)의 gDNA를 7500 Real Time PCR System (ABI)을 이용하여 동일한 조건으로 10회씩 반복 분석한 증폭곡선에서 측정된 Ct 값과 형광 값을 이용하여 상관관계식 Raf1 (RCt x RΔRn1 / C-value)을 적용하여 재현성을 확인한 실험 결과이다.
도 6은 분석에 사용된 시약(5x qPCRMix, 10x Primer Mix)과 분석 일자를 달리한 3번의 반복 실험[3 배치(set 1, set 2, set 3)] 및 각 배치별 산출된 C-값과 3 배치의 평균 C-값을 상관관계식 Raf1 (RCt x RΔRn1 / C-value)에 적용하였을 때 유전형질 판정결과를 비교한 것이다.
도 7은 DNA 농도가 유전형 판정에 미치는 영향을 확인하기 위해 100% 국산 참깨(A/A Homo), 100% 외산 참깨(B/B Homo), 50% 혼합 참깨(A/B Hetero)의 gDNA를 각각 6.9ng(set 1, 2), 4.1ng(set 3, 4)씩 사용한 실시간 중합효소 연쇄반응 증폭곡선이다.
도 8은 ARMS PCR 기법을 사용하여 100% 국산 참깨(A/A Homo), 100% 외산 참깨(B/B Homo), 50% 혼합 참깨(A/B Hetero)의 gDNA를 2회 반복 분석한(set 1, 2) 증폭곡선이다.
도 9는 특정한 SNP 형질의 형광 값이 내부 대조구 형광 값보다 큰 경우 100% 국산 참깨(A/A Homo), 100% 외산 참깨(B/B Homo)와 50% 혼합 참깨(A/B Hetero)의 gDNA를 분석한 증폭곡선과 각 증폭곡선에서 측정된 Ct 값과 형광 값을 기초로 SNP 유전자형을 판단하기 위해 상관관계식 Raf2 ((RCt ÷ RRFU2) / C-value)을 적용한 결과이다.
도 10a, 10b는 외산 SNP 형질의 혼합률을 측정하기 위한 두 종류의 표준시료(70% 외산 SNP 형질 혼합, 80% 외산 SNP 형질 혼합)의 증폭곡선(10a)과 외산 80% 혼합시료 5종의 실시간 중합효소 연쇄반응 증폭곡선(10b)이다.
도 11은 표준시료의 실시간 중합효소 연쇄반응 증폭결과 산출된 상대 Ct 값(RCt), 상대 형광 값(ΔΔRn2) 및 이 두 값의 상관관계 값(RCt/ΔΔRn2)을 이용하여 각각의 검량선을 작성하고 이 검량선을 이용하여 5종의 외산 80% 혼합시료의 외산 SNP 형질 혼입률을 계산한 결과이다. 그래프의 "ddRn"은 "ΔΔRn"과 동일한 의미로 사용하였다.
이하, 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예의 기재에 국한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
[DNA 준비]
국산 생참깨와 외산(중국산) 생참깨로부터 유전체 DNA(gDNA)를 추출하여 실시간 중합효소 연쇄반응의 주형으로 사용하였다. 국산 및 외산 참깨 시료는 각각 10g씩을 취하여 막자사발을 이용하여 분쇄한 후, 분쇄된 참깨 가루 20mg씩을 취하여 gDNA 추출 및 정제에 사용하였다. DNA 추출 및 정제는 NucleoSpin Plant II kit(MN)를 이용하였으며 세부 방법은 추출 키트에서 제공되는 매뉴얼에 따랐다. 추출 및 정제된 국산과 외산 참깨의 gDNA는 Qubit dsDNA BR Assay kits(Thermo Fisher Scientific) 와 형광 검출 시스템을 이용하여 정량하였으며 세부 방법은 키트 및 형광 검출 시스템에서 제공되는 매뉴얼에 따랐다. PCR 실험에 주형으로 사용할 gDNA로서 A/A 동형접합자(homozygote)는 국산 100%, B/B 동형접합자(homozygote)는 외산 100%, A/B 이형접합자(heterozygote)는 국산과 외산 gDNA를 50%씩 동일 양 혼합하여 준비하였다. 또한, 혼합률 측정 실험을 위해 외산 참깨 gDNA가 각각 70%와 80% 혼합된 시료를 준비하였다. 이와 같이 준비된 gDNA는 실험에 사용하기까지 냉동보관하였다.
[ 프라이머 및 프로브 제작]
국산 참깨와 외산 참깨로부터 준비된 gDNA의 특정 부위를 공통적으로 PCR 증폭할 수 있는 프라이머와 TaqMan 프로브를 내부 대조구의 PCR 증폭 및 증폭 확인용으로 디자인하였으며, 국산 참깨와 외산 참깨를 구분할 수 있는 SNP 마커를 기초로 외산 참깨만을 PCR 증폭할 수 있도록 고안된 프라이머와 프로브를 특정한 SNP 형질의 PCR 증폭 및 증폭 확인용으로 디자인하였다. 디자인된 프라이머 및 프로브는 본 출원인인 (주)제노텍의 올리고뉴클레오타이드 합성 시스템을 이용하여 제작하였다. 각 실시예에서 사용된 프라이머 또는 프로브는 PCR 반응 조성물 제조를 원활히 하고 반복 실험 간의 실험 오차를 줄이기 위해 10x 프라이머 믹스 또는 10x 프로브 믹스 형태로 제조하여 사용하였다.
<내부 대조구 PCR 증폭용 프라이머와 프로브>
- 내부 대조구 전방 프라이머 : 5'-GTCCAACTCGGAATTTGCATGGAAG-3'
- 내부 대조구 후방 프라이머 : 5'-TTTTCACCAATTTTCCAACACTGG-3'
- 내부 대조구 TaqMan 프로브 : 5'-FAM-TAGAGGCGTCTATATATGATGGCA-BHQ1-3'
내부 대조구 유전자로 사용된 참깨 유전체 DNA의 염기서열 및 주변 염기서열은 표 1로 나타내었다.
-----------------------------------TATATATATATCGGTAATAAATACTTATTTACAAAGGTAACGAAATAATCTTTATATAGTTCAATTAAATCAAATTAATTAGGCGTTATGTGTATGAAATTAATATGTATACATTGAATTGAGTTATTAATCATAAATTCCACAACGATGTTATGTATATAT GTCCAACTCGGAATTTGCATGGAAG CTACGCTCTGACATAAACTAACACATAGATATTGACCTCTTACACTACATGTAGAGGCGTCTATATATGATGGCAGGACCCAGCTACTTAACACCCTTTCCACATTATTTTTGCAGAATTT CCAGTGTTGGAAAATTGGTGAAAA TTACACTTTTAGTCTCTTCGGATAGAAAATTCGTCATTTTTAGACTTATACTTTATGAAACTTTTAAATGATCCCAAAGTTAGAAAAAGATCGACATATCTAGTCCCATAAATTGTGTAAAGCAAGAACTAAATATGTCAAAATTTCTCAATTTCATGACCA-----------------------
<시험구의 표적 유전자 PCR 증폭용 프라이머와 프로브>
FenDEL 시스템용 프라이머와 프로브
- 표적 유전자 전방 프라이머 : 5'-TTCGGCAGAATTTCCTGCtGAAG-3'
- 표적 유전자 후방 프라이머 : 5'-CATGGACAACATAAACTCCCTACC-3'
- FenDEL 프로브 : 5'-CgTGCTTtaGCAGGAAATTCTGCCG-P-3'
- 표적 유전자 TaqMan 프로브 : 5'-JOE-TGTGGACATAGAACAAAGCAGC-BHQ1-3'
ARMS 용 프라이머와 프로브
- 표적 유전자 전방 ARMS 프라이머 : 5'-CAGAATTTCCTGCCGAAGCtAG-3'
- 표적 유전자 후방 프라이머 : 5'-AAGACCTAGTTGTTGCCCCAAG-3'
- 표적 유전자 TaqMan 프로브 : 5'-JOE-TGTGGACATAGAACAAAGCAGC-BHQ1-3'
소문자는 주형의 염기서열과 비상보적인 서열을 나타낸다. 이것은 SNP 구분 능력을 향상시키기 위해 인위적으로 치환한 염기이다.
진한 글씨의 염기는 외산 참깨의 SNP 형질을 나타낸다.
P는 인산(phosphate)을 의미한다.
표적 유전자로 사용된 참깨 원산지 구분 SNP 마커(국산 T, 외산 G)와 주변 염기서열은 표 2로 나타내었다.
---------------------------------AGGATCATTATGCTACTATATAAAGTTAAAATACGAAAACATCAAATGAACTAAGTTACGAGACTCTATGCTTCAATTCACATTACTATGTTTAATTTGAGTTGTGAAATATCCTAAAATCTTTCAAAGAAACTTCGTGTCGTATCGTCGTTTTTGTGTCAATGCATCATAAATAAATAACGATCTCTATTAATGTGCGGTCATTTTTGAATCTTTTCTTTTCGGCAGAATTTCCTGCCGAAGCAA[T/G]TTTGAATGCAGATACGTTAGCGGGATGTGGACATAGAACAAAGCAGCCATGTTTGCCCTTTTGGTAGGGAGTTTATGTTGTCCATGAATTTCTGGGAACAAAGACGGCTACAAACGACCTAGGAGTACTCGGACTTGTCTAGCTATATATCATTGATCAACCCCGGCAGGAGACAATCTCAAATTCCAAGCGCATAAAATTTTACTTGGGGCAACAACTAGGTCTTTGTGCATTTTTACTAGGAAT----------------------
[ qPCR 반응 및 확인]
상기와 같이 준비한 국산과 외산 참깨 gDNA를 주형으로 하고, 준비한 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 본 실시예에서 중합효소 및 반응 조성물은 5x qPCRMix (50mM Tris, pH 9.0, 7.5mM MgCl2, 300mM KCl, 50mM (NH4)2SO4, 5mM dNTPs, 0.05% Tween20, 3.5x α-E10 AFA 용액, 2.5x ROX dye, 5U Hot-Taq DNA 폴리머레이즈, (주)제노텍, 한국)를 사용하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응 조건은 95℃에서 10분간 변성, 95℃에서 30초 - 55℃에서 60초를 40회 반복 수행하였으며, 형광은 55℃에서 측정할 수 있도록 설정하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응에 분석기기로서 7500 Real Time PCR System (ABI) 또는 CFX96 Real-Time System (Bio-Rad)을 사용하였으며, 형광신호 변화를 정량적으로 분석하기 위한 Ct 값과 ΔRn 또는 RFU 값은 각 분석기기에서 제공되는 소프트웨어를 이용하여 결정하였다.
실시예 1
내부 대조구(internal control, IC)와 외산 참깨의 SNP 형질만을 선별하여 증폭할 수 있는 FenDEL 프로브를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응으로 국산 동형접합자(A/A homozygote, 국산 100%), 외산 동형접합자(B/B homozygote, 외산 100%) 및 혼합 이형접합자(A/B heterozygote, 50%)를 판정하는 개념과 방법을 설명하기 위한 시험이다. 분석기기는 7500 Real Time PCR System (ABI) 또는 CFX96 Real-Time System (Bio-Rad)을 사용하였으며, PCR 반응물 조성은 아래와 같다.
<RT-PCR 반응물 조성>
각 반응 튜브에 5 ul (1.38ng/ul)의 참깨 gDNA와 2 ul의 10x Primer Mix (10 uM의 내부 대조구 전방 프라이머, 10 uM의 내부 대조구 후방 프라이머, 1.25 uM의 내부 대조구 TaqMan 프로브, 6 uM의 표적 유전자 전방 프라이머, 6 uM의 표적 유전자 후방 프라이머, 2.25 uM의 FenDEL 프로브, 5 uM의 표적 유전자 TaqMan 프로브) 그리고 4 ul의 5x qPCRMix와 멸균수를 혼합하여 최종 총 용량 20 ul로 맞추었다.
도 1은 내부 대조구와 한 종의 SNP 형질(외산 SNP 형질)만을 선별 증폭할 수 있는 FenDEL 프로브를 사용한 실시간 중합효소 연쇄반응으로 돌연변이 유전자형을 판정하는 방법(A)과 이형접합자(A/B heterozygote)와 동형접합자(B/B homozygote)를 구분하는 기본 개념도이다(B). 실시간 중합효소 연쇄반응 결과에서 IC 증폭곡선만이 확인되는 경우는 A/A 동형접합자 (국산 100%)로 판정하며, IC와 외산 SNP 형질의 증폭곡선이 함께 확인되는 경우는 Ct 값과 형광 값(ΔRn 또는 RFU)을 기초로 산출되는 다양한 계산 값을 이용하여 B/B 동형접합자(외산 100%)와 A/B 이형접합자(혼합 50%)를 판정할 수 있다.
(-△-) : 내부 대조구(IC)의 증폭곡선, (-○-) : 외산 SNP 형질(B)의 증폭곡선, (-×-) : 국산 SNP 형질(A)의 증폭곡선, CtJOE : 외산 SNP 형질(B)의 Ct 값, CtFAM : 내부 대조구(IC)의 Ct 값, ΔRnJOE : 외산 SNP 형질(B)의 형광 값, ΔRnFAM : 내부 대조구(IC)의 형광 값.
도 2는 100% 외산 참깨(B/B Homo)와 50% 혼합 참깨(A/B Hetero)의 gDNA를 7500 Real Time PCR System (ABI)을 이용하여 3회씩 반복 분석한 증폭곡선과 각 증폭곡선에서 측정된 Ct 값과 형광 값을 기초로 유전자형을 판단하기 위해 상관관계식 Raf1 (RCt x RΔRn1 / C-value)을 적용한 결과이다. 여기에서 C-값(C-value)은 3종의 이형접합 시료(#1, 3, 5)와 3종의 동형접합 시료(#2, 4, 6)를 대상으로 실시간 중합효소연쇄반응 결과 산출된 각 시료의 RCt x RΔRn1 값의 평균값이며, 그 값은 3.34이다. 상관관계식 Raf1은 RCt x RΔRn1을 C-값으로 나눈 값으로 ‘1’을 기준으로 동형접합체와 이형접합체를 구분하는 기준 값이다.
본 실시예에서 상관관계식 Raf1 결과 값이 이형접합자[A/B Hetero(50%)]에서는 1보다 크며, 동형접합자[B/B Homo(100%)]에서는 1보다 작음을 알 수 있다.
(-△-) : 내부 대조구(IC)의 증폭곡선, (-○-) : 외산 SNP 형질(B)의 증폭곡선, (-×-) : 국산 SNP 형질(A)의 증폭곡선.
표 3은 도 2에서 확인되는 100% 외산 참깨(B/B Homo)와 50% 혼합 참깨(A/B Hetero)의 gDNA를 7500 Real Time PCR System (ABI)을 이용하여 3회씩 반복 분석하고, 여기에서 얻은 증폭곡선에서 측정된 Ct 값과 형광 값을 기초로 유전자형을 판단하기 위해 다양한 상관관계식을 적용한 결과이다. Ct 값과 형광 값(ΔRn)을 기반으로 산출된 값들(ΔCt, RCt, ΔΔRn1, RΔRn1, ΔCt*ΔΔRn1, ΔCt*RΔRn1, RCt*ΔΔRn1, RCt*RΔRn1)과 각 산출 값들의 C-값(C-value)을 이용한 상관관계식을 적용한 결과 값이 ‘1’보다 작거나 큰 값으로 구분됨으로써 외산 100% 동형접합자(B/B homozygote)와 50% 혼합 이형접합자(A/B heterozygote)를 쉽게 판단할 수 있다. 이형접합자는 1보다 큰 값, 동형접합자는 1보다 작은 값이 얻어진다.
도 3은 100% 국산 참깨(A/A Homo), 100% 외산 참깨(B/B Homo), 50% 혼합 참깨(A/B Hetero)의 gDNA를 CFX96 Real-Time System (Bio-Rad)을 이용하여 3회 반복 분석한(set 1, 2, 3) 증폭곡선이다. 국산 100% gDNA를 주형으로 분석한 결과는 내부 대조구의 증폭곡선(-△-)만 확인되며, 50% 혼합 gDNA와 외산 100% gDNA를 주형으로 분석한 결과는 내부 대조구의 증폭곡선(-△-)과 외산 SNP 형질의 증폭곡선(-○-)이 동시에 확인된다.
(-△-) : 내부 대조구(IC)의 증폭곡선, (-○-) : 외산 SNP 형질(B)의 증폭곡선, (-×-) : 국산 SNP 형질(A)의 증폭곡선.
표 4는 도 3에서 확인되는 100% 외산 참깨(B/B Homo)와 50% 혼합 참깨 (A/B Hetero)의 gDNA를 CFX96 Real-Time System (Bio-Rad)을 이용하여 3회씩 반복 분석하고, 그 결과로 얻은 증폭곡선에서 측정된 Ct 값과 형광 값을 이용하여 다양한 상관관계식 및 상대적 계수를 적용한 결과이다. Ct 값과 형광 값(RFU)을 기반으로 산출된 값들(ΔCt, RCt, ΔRFU1, RRFU1, ΔCt*ΔRFU1, ΔCt*RRFU1, RCt*ΔRFU1, RCt*RRFU1)과 각 산출 값들의 C-값(C-value)을 이용한 상관관계식을 적용한 결과 값이 1보다 크면 50% 혼합 이형접합자(A/B heterozygote)로, 1보다 작으면 외산 100% 동형접합자(B/B homozygote)로 판단할 수 있다.
도 4는 도 3과 표2에서 확인되는 100% 외산 참깨(B/B Homo)와 50% 혼합 참깨 (A/B Hetero)의 gDNA를 CFX96 Real-Time System (Bio-Rad)을 이용하여 3회씩 반복 분석하고, 그 결과로 얻은 증폭곡선에서 측정된 Ct 값과 형광 값을 이용하여 상관관계식으로 유전형을 비교한 것이다. Ct 값과 형광 값(RFU)을 기반으로 산출된 8종류의 값들(ΔCt, RCt, ΔRFU1, RRFU1, ΔCt*ΔRFU1, ΔCt*RRFU1, RCt*ΔRFU1, RCt*RRFU1)을 각 값들의 평균값인 C-값(C-value)으로 나눈 값이 1보다 크면 50% 혼합 이형접합자(A/B heterozygote)로, 1보다 작으면 외산 100% 동형접합자(B/B homozygote)로 판단할 수 있다. 적용되는 상관관계식에 따라서 유전형의 차이를 확인할 수 있으며 Ct 값과 형광 값을 각각 사용하는 경우보다는 두 값을 함께 이용하는 경우 유전형이 좀 더 명확하게 구분될 수 있다.
도 5는 100% 외산 참깨(B/B Homo)와 50% 혼합 참깨(A/B Hetero)의 gDNA를 7500 Real Time PCR System (ABI)을 이용하여 동일한 조건으로 10회씩 반복 분석하고, 그 결과 얻은 증폭곡선에서 측정된 Ct 값과 형광 값을 이용하여 상관관계식 Raf1 (RCt x RΔRn1 / C-value)을 적용한 결과이다. 상관관계식 Raf1을 적용한 결과 값이 이형접합자[A/B Heterozygote (50%)]는 1.22±0.05이며, 동형접합자[B/B Homozygote (100%)]는 0.8±0.02로 반복 분석 간의 값의 차이는 크지 않다. 즉 동일한 조건[분석기기, PCR 반응조건(온도, 시간) 및 시약(5x qPCRMix, 10x Primer Mix 등)]의 실시간 중합효소 연쇄반응의 결과는 재현성이 있음을 알 수 있다.
도 6은 분석에 사용된 시약(5x qPCRMix, 10x Primer Mix)과 분석 일자를 다르게 한 3 배치(set 1, set 2, set 3) 실험결과를 비교한 것이다. 각 배치에서 100% 외산 참깨(B/B Homo)와 50% 혼합 참깨(A/B Hetero)의 gDNA를 7500 Real Time PCR System (ABI)을 이용하여 동일한 조건으로 4회씩 반복 분석하였으며, 각 증폭곡선에서 측정된 Ct 값과 형광 값을 이용하여 상관관계식 Raf1 (RCt x RΔRn1 / C-value)을 적용하였다. 실험 결과, 각 배치별 C-값(Calculated C-value)은 변화가 있지만 이들의 평균값으로 계산된 C-값(average C-value)을 적용하는 경우와 결과는 동일함을 알 수 있다.
실시예 2
내부 대조구와 외산 SNP 형질만을 선별하여 증폭할 수 있는 FenDEL 프로브를 이용하여 국산 동형접합자(A/A homozygote, 국산 100%), 외산 동형접합자(B/B homozygote, 외산 100%) 및 혼합 이형접합자(A/B heterozygote, 50%)를 판정하는 실시간 중합효소 연쇄반응에 있어서 주형으로 사용되는 gDNA의 양이 분석결과에 미치는 영향을 파악하기 위한 시험이다. 준비된 참깨 gDNA 5ul(6.9ng)를 사용한 경우와 3ul(4.1ng)를 사용한 경우에 각각 측정된 Ct 값과 형광 값을 이용하여 gDNA의 양이 형질 판정에 미치는 영향을 분석하였다. 이를 위해 CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) 분석기기를 사용하였으며, PCR 반응물 조성은 아래와 같다.
<RT-PCR 반응물 조성>
각 반응 튜브에 5ul(6.9ng) 또는 3ul(4.1ng)의 참깨 gDNA와 2ul의 10x 프라이머 혼합물 (primer mix) (10uM의 내부 대조구 전방 프라이머, 10uM의 내부 대조구 후방 프라이머, 1.25uM의 내부 대조구 TaqMan 프로브, 6uM의 표적 유전자 전방 프라이머, 6uM의 표적 유전자 후방 프라이머, 2.25uM의 FenDEL 프로브, 5uM의 표적 유전자 TaqMan 프로브) 그리고 4ul의 5x qPCR Mix와 멸균수를 혼합하여 최종 총 용량 20ul로 맞추었다.
도 7은 100% 국산 참깨(A/A Homo), 100% 외산 참깨(B/B Homo), 50% 혼합 참깨(A/B Hetero)의 gDNA를 각각 6.9ng (set 1, 2), 4.1ng (set 3, 4)씩 사용한 실시간 중합효소 연쇄반응 증폭곡선이다. 국산 100% gDNA를 주형으로 분석한 결과는 내부 대조구의 증폭곡선(-△-)만 확인되며, 50% 혼합과 외산 100% gDNA를 주형으로 분석한 결과는 내부 대조구의 증폭곡선(-△-)과 외산 SNP 형질의 증폭곡선(-○-)이 동시에 확인된다.
(-△-) : 내부 대조구(IC)의 증폭곡선, (-○-) : 외산 SNP 형질(B)의 증폭곡선, (-×-) : 국산 SNP 형질(A)의 증폭곡선
표 5는 도 7에서 확인되는 100% 외산 참깨(B/B Homo)와 50% 혼합 참깨 (A/B Hetero)의 gDNA를 사용한 실시간 중합효소 연쇄반응 증폭곡선에서 측정된 Ct 값과 형광 값을 이용하여 다양한 상관관계식을 적용한 결과이다. 주형으로 사용된 gDNA 양에 관계없이 Ct 값과 형광 값(RFU)을 기반으로 산출된 값들(ΔCt, RCt, ΔRFU1, RRFU1, ΔCt*ΔRFU1, ΔCt*RRFU1, RCt*ΔRFU1, RCt*RRFU1) 및 각 값들의 평균값인 C-값(C-value)을 이용한 상관관계식을 적용한 결과, 그 값이 1보다 크면 50% 혼합 이형접합자(A/B heterozygote)로, 1보다 작으면 외산 100% 동형접합자(B/B homozygote)로 판단할 수 있다.
실시예 3
내부 대조구(internal control, IC)와 외산 SNP의 형질만을 선별하여 증폭할 수 있는 ARMS 프라이머를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응으로 국산 동형접합자(A/A homozygote, 국산 100%), 외산 동형접합자(B/B homozygote, 외산 100%) 및 혼합 이형접합자(A/B heterozygote, 50%)를 판정하기 위한 시험이다. 분석기기는 7500 Real Time PCR System (ABI)을 사용하였으며, PCR 반응물 조성은 아래와 같다.
<RT-PCR 반응물 조성>
각 반응 튜브에 5ul(1.38ng/ul)의 참깨 gDNA와 2ul의 10x Primer Mix (6uM의 내부 대조구 전방 프라이머, 6uM의 내부 대조구 후방 프라이머, 1uM의 내부 대조구 TaqMan 프로브, 10uM의 표적 유전자 전방 ARMS 프라이머, 10uM의 표적 유전자 후방 프라이머, 5uM의 표적 유전자 TaqMan 프로브) 그리고 4ul의 5x qPCR Mix와 멸균수를 혼합하여 최종 총 용량 20ul로 맞추었다.
도 8은 100% 국산 참깨(A/A Homo), 100% 외산 참깨(B/B Homo), 50% 혼합 참깨(A/B Hetero)의 gDNA를 2회 반복 분석한(set 1, 2) 증폭곡선이다. 국산 100% gDNA를 주형으로 분석한 결과는 내부 대조구의 증폭곡선(-△-)만 확인되며, 50% 혼합과 외산 100% gDNA를 주형으로 분석한 결과는 내부 대조구의 증폭곡선(-△-)과 외산 SNP 형질의 증폭곡선(-○-)이 동시에 확인된다.
(-△-) : 내부 대조구(IC)의 증폭곡선, (-○-) : 외산 SNP 형질(B)의 증폭곡선, (-×-) : 국산 SNP 형질(A)의 증폭곡선
표 6은 도 8에서 확인되는 100% 외산 참깨(B/B Homo)와 50% 혼합 참깨(A/B Hetero)의 gDNA를 2회씩 반복 분석한 다음, 얻은 증폭곡선에서 측정된 Ct 값과 형광 값을 이용하여 다양한 상관관계식을 적용한 결과이다. Ct 값과 형광 값(ΔRn)을 기반으로 산출된 값들(ΔCt, RCt, ΔΔRn1, RΔRn1, ΔCt*ΔΔRn1, ΔCt*RΔRn1, RCt*ΔΔRn1, RCt*RΔRn1) 및 각 값들의 평균값인 C-값(C-value)을 이용한 상관관계식을 적용한 결과, 그 값이 1보다 크면 50% 혼합 이형접합자(A/B heterozygote)로, 1보다 작으면 외산 100% 동형접합자(B/B homozygote)로 판단할 수 있다.
실시예 4
외산 SNP 형질을 선별하여 PCR 증폭한 결과 PCR 종료 시점의 형광 값이 내부 대조구의 형광 값보다 큰 반응조건에 적용할 수 있는 이형접합자와 동형접합자 판정 상관관계식을 확인하기 위한 시험이다. CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) 분석기기를 사용하였으며, PCR 반응물 조성은 아래와 같다.
<RT-PCR 반응물 조성>
각 반응 튜브에 5ul(1.38ng/ul)의 참깨 gDNA와 2ul의 10x Primer Mix (1.5uM의 내부 대조구 전방 프라이머, 1.5uM의 내부 대조구 후방 프라이머, 1.25uM의 내부 대조구 TaqMan 프로브, 6uM의 표적 유전자 전방 프라이머, 6uM의 표적 유전자 후방 프라이머, 2.25uM의 FenDEL 프로브, 5uM의 표적 유전자 TaqMan 프로브) 그리고 4ul의 5x qPCR Mix와 멸균수를 혼합하여 최종 총 용량 20ul로 맞추었다.
도 9는 100% 국산 참깨(A/A Homo), 100% 외산 참깨(B/B Homo)와 50% 혼합 참깨(A/B Hetero)의 gDNA를 분석한 증폭곡선과 각 증폭곡선에서 측정된 Ct 값과 형광 값을 기초로 SNP 유전자형을 판단하기 위해 상관관계식 Raf2 (RCt / RRFU2 / C-value)를 적용한 결과이다. 상관관계식 Raf2를 적용한 결과, 그 값이 1보다 크면 이형접합자[A/B Hetero(50%)], 1보다 작으면 동형접합자[B/B Homo(100%)]임을 알 수 있다.
(-△-) : 내부 대조구(IC)의 증폭곡선, (-○-) : 외산 SNP 형질(B)의 증폭곡선, (-×-) : 국산 SNP 형질(A)의 증폭곡선
실시예 5
외산 SNP 형질의 혼합률을 측정하기 위해서 외산 참깨 gDNA의 혼합률이 각각 70%와 80%인 표준시료의 RCt 값, ΔΔRn 값 그리고 두 값을 함께 이용한 RCt/ΔΔRn 값을 산출하였고, 이를 이용하여 각각의 검량선을 작성하였다. 작성된 각각의 검량선을 기준으로 미지의 시험시료(실제로는 80% 외산 혼합 시료)의 혼합률을 측정하였다. 분석기기로 7500 Real Time PCR System (ABI)을 사용하였으며, PCR 반응물 조성은 아래와 같다.
<RT-PCR 반응물 조성>
각 반응 튜브에 5ul(1.38ng/ul)의 참깨 gDNA와 2ul의 10x Primer Mix (1uM의 내부 대조구 전방 프라이머, 1uM의 내부 대조구 후방 프라이머, 1.25uM의 내부 대조구 TaqMan 프로브, 10uM의 표적 유전자 전방 프라이머, 10uM의 표적 유전자 후방 프라이머, 2.25uM의 FenDEL 프로브, 3.5uM의 표적 유전자 TaqMan 프로브) 그리고 4ul의 5x qPCR Mix와 멸균수를 혼합하여 최종 총 용량 20ul로 맞추었다.
도 10은 외산 SNP 형질의 혼합률을 측정하기 위한 두 종류의 표준시료(70% 외산 SNP 형질 혼합, 80% 외산 SNP 형질 혼합)의 증폭곡선(A)과 외산 80% 혼합시료 5종의 실시간 중합효소 연쇄반응 증폭곡선(B)이다.
도 11은 표준시료의 실시간 중합효소 연쇄반응 증폭결과 산출된 상대 Ct 값(RCt), 상대 형광 값(ΔΔRn2) 및 두 값을 함께 이용한 상관관계 값(RCt/ΔΔRn2)을 이용하여 각각의 검량선을 작성하고 이 검량선을 이용하여 5종의 외산 80% 혼합시료의 외산 SNP 형질 혼합률을 계산한 결과이다.
(-△-) : 내부 대조구(IC)의 증폭곡선, (-○-) : 외산 SNP 형질(B)의 증폭곡선, (-×-) : 국산 SNP 형질(A)의 증폭곡선
두 종류 표준 시료의 실시간 중합효소 연쇄반응 분석결과 측정되는 Ct 값과 형광 값을 기초로 각각 RCt, ΔΔRn2, RCt/ΔΔRn2 값을 산출하고[도 11의 (A)], 이 값을 이용하는 세 종류의 검량선[검량선 1(RCt 값), 검량선 2(ΔΔRn2 값), 검량선 3(RCt/ΔΔRn2 값)]을 각각 작성하였다[도 11의 (C)]. 그리고 준비된 미지의 시험시료 5종(실제로는 외산 SNP 형질이 80% 혼합)의 외산 SNP 형질 혼합률을 각각의 검량선을 이용하여 분석하였다[도 11의 (B)]. 분석 결과, 검량선 1(RCt 값)을 이용할 경우 혼합률은 평균 74.868%[오차범위 3.294 ~ 8.045(평균 5.132)], 검량선 2(ΔΔRn2 값)를 이용할 경우 78.752%[0.344 ~ 3.821(평균 2.737)] 그리고 검량선 3(RCt/ΔΔRn2 값)을 이용할 경우 78.907%[0.114 ~ 2.75 (평균 1.798)] 임을 확인할 수 있다.
도 10 및 도 11에서 확인할 수 있듯이 실시간 중합효소 연쇄반응으로 측정될 수 있는 Ct 값과 형광 값을 기반으로 하는 상대 Ct 값과 상대 형광 값을 이용하여 검량선을 작성할 수 있다. 그러나 상대 Ct 값과 상대 형광 값을 함께 이용한 정량 방식이 실험간 오차를 줄이고 좀 더 정확한 혼합률 산출 결과를 제공할 수 있음을 확인할 수 있다.
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004

Claims (17)

  1. 실시간 PCR을 이용하여 돌연변이를 확인하는 방법에 있어서,
    (가) 하나의 튜브 안에서 시험구의 특정한 돌연변이 형질을 선별 증폭하는 실시간 PCR과 상기 특정 돌연변이를 포함하는 유전체 내의 유전자 중 하나를 내부 대조구로 지정하여 내부 대조구에 대한 실시간 PCR을 수행하는 단계;
    (나) 상기 특정 돌연변이 형질에 대한 동형접합자(homozygote) 시료와 이형접합자(heterozygote) 시료가 특정 몰비로 존재하는 표준시료에 대한 실시간 PCR을 상기 (가)와 동일 조건 및 동일 기종으로 수행하는 단계;
    (다) 상기 내부 대조구 PCR과 시험구 PCR에서 측정한 Ct 값 및 PCR 종료 시점의 형광 값인 ΔRn 및 RFU 중 하나 이상을 얻는 단계;
    (라) 내부 대조구 PCR에서 측정한 Ct 값과 시험구 PCR에서 측정한 Ct 값 중 작은 값으로 큰 값을 나눈 값인 RCt (relative Ct), Ct 값 중 큰 값에서 작은 값을 뺀 값인 ΔCt (delta Ct), 형광 값 중 작은 값으로 큰 값을 나눈 값인 RΔRn, RRFU, 형광 값 중 큰 값에서 작은 값을 뺀 값인 ΔΔRn, ΔRFU 및 이들 값을 곱한 값 또는 이들 값을 나눈 값 중 하나 이상의 값을 얻는 단계;
    (마) 상기 표준시료에 대한 PCR 결과 동형접합자 시료 및 이형접합자 시료에 대한 각 Ct 값 및 각 형광 값 ΔRn 및 RFU 중 하나 이상을 얻는 단계;
    (바) 상기 표준시료 중 동형접합자 시료와 이형접합자 시료의 Ct 값, 형광 값인 ΔRn 값 또는 RFU 값, 이들 값의 상대값인 ΔCt, RCt, ΔΔRn, ΔRFU, RΔRn, RRFU 및 이들 상대값을 곱한 값 또는 상대값을 나눈 값 및 이들 각 값의 평균값인 C-값을 구하는 단계;
    (사) 상기 (라)에서 얻은 내부 대조구와 시험구의 Ct 값, ΔRn 값, RFU 값, 이들의 상대값인 ΔCt, RCt, ΔΔRn, ΔRFU, RΔRn, RRFU 및 이들 상대값을 곱한 값 또는 이들 상대값을 나눈 값을 각각 상응하는 상기 (바) 단계의 C-값으로 나누는 단계; 및
    (아) 상기 (사) 단계에서 얻은 값이 1보다 큰 경우 이형접합자로, 1보다 작은 경우 동형접합자로 구분하는 단계;를 포함하는 실시간 PCR을 이용하여 돌연변이를 확인하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 돌연변이는 염기의 삽입(insertion), 결실(deletion), 치환(substitution) 및 단일 염기서열 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 돌연변이는 식물, 동물, 미생물, 인체, 농수산물 및 그 가공품에 존재하는 돌연변이임을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    특정한 돌연변이 형질을 선별 증폭하는 실시간 PCR은 FenDEL-PCR, ARMS-PCR, TaqMan-PCR, MGB-TaqMan-PCR 및 PNA-PCR 중 선택된 하나임을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    내부 대조구로서 항존 유전자(house keeping gene)를 선택함을 특징으로 하는 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 (나) 단계, (마) 단계 및 (바) 단계는 여타 단계와 별도로 진행되어 동형접합자 표준시료 및 이형접합자 표준시료에 대한 각 Ct 값 및 각 형광 값 ΔRn 및 RFU 중 하나 이상 또는 표준시료 중 동형접합자 시료와 이형접합자 시료의 Ct 값, 형광 값인 ΔRn 값 또는 RFU 값의 상대값인 ΔCt, RCt, ΔΔRn, ΔRFU, RΔRn, RRFU 및 이들 상대값을 곱한 값 또는 상대값을 나눈 값의 각 평균값인 C-값이 프로토콜화되어 제공됨을 특징으로 하는 방법.
  7. 상기 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위하여
    내부 대조구에 대한 프라이머 및 프로브;
    동형접합자 시료, 이형접합자 시료를 포함하는 표준시료;
    상기 표준시료에 대한 프라이머 및 프로브; 및
    시험대상 시료의 돌연변이 형질을 구분할 수 있는 프라이머 및 프로브;를 포함하는 것을 특징으로 하는 실시간 PCR 키트.
  8. 상기 청구항 6의 방법을 수행하기 위하여
    동형접합자 표준시료와 이형접합자 표준시료에 대한 각 Ct 값 및 각 형광 값 ΔRn 및 RFU 중 하나 이상 또는 표준시료 중 동형접합자 시료와 이형접합자 시료의 Ct 값, 형광 값인 ΔRn 값 또는 RFU 값, 이들 값의 상대값인 ΔCt, RCt, ΔΔRn, ΔRFU, RΔRn, RRFU 및 이들 상대값을 곱한 값 또는 상대값을 나눈 값과 이들 각 값의 평균값인 C-값이 기록된 프로토콜;
    내부 대조구에 대한 프라이머 및 프로브; 및
    시험대상 시료의 돌연변이 형질을 구분할 수 있는 프라이머 및 프로브;를 포함하는 것을 특징으로 하는 실시간 PCR 키트.
  9. 실시간 PCR을 이용하여 돌연변이를 확인하는 방법에 있어서,
    (가) 하나의 튜브 안에서 시험구의 특정한 돌연변이 형질을 선별 증폭하는 실시간 PCR과 상기 특정 돌연변이를 포함하는 유전체 내의 유전자 중 하나를 내부 대조구로 하여 내부 대조구에 대한 실시간 PCR을 수행하는 단계;
    (나) 상기 특정 돌연변이 형질에 대한 동형접합자(homozygote) 표준시료와 이형접합자(heterozygote) 표준시료 및 동형접합자와 이형접합자가 특정 몰비로 존재하는 하나 이상의 표준시료에 대한 실시간 PCR을 상기 (가)와 동일 조건 및 동일 기종으로 수행하는 단계;
    (다) 상기 내부 대조구 PCR과 시험구 PCR에서 측정한 Ct 값 및 PCR 종료 시점의 형광 값인 ΔRn 및 RFU 중 하나 이상을 얻는 단계;
    (라) 내부 대조구 PCR에서 측정한 Ct 값과 시험구 PCR에서 측정한 Ct 값 중 작은 값으로 큰 값을 나눈 값인 RCt (relative Ct), Ct 값 중 큰 값에서 작은 값을 뺀 값인 ΔCt (delta Ct), 형광 값 중 작은 값으로 큰 값을 나눈 값인 RΔRn, RRFU, 형광 값 중 큰 값에서 작은 값을 뺀 값인 ΔΔRn, ΔRFU 및 이들 값을 곱한 값 또는 이들 값을 나눈 값 중 하나 이상의 값을 얻는 단계;
    (마) 상기 표준시료에 대한 PCR 이후 각 표준시료에 대한 각 Ct 값 및 각 형광 값 ΔRn 및 RFU 중 하나 이상을 얻는 단계;
    (바) 상기 표준시료 중 동형접합자 표준시료와 이형접합자 표준시료의 Ct 값, 형광 값인 ΔRn 값 또는 RFU 값의 상대값인 ΔCt, RCt, ΔΔRn, ΔRFU, RΔRn, RRFU 및 이들 상대값을 곱한 값 또는 상대값을 나눈 값의 각 평균값인 C-값을 구하는 단계;
    (사) 상기 (바) 단계에서 얻은 값을 이용하여 상기 표준시료에 대하여 검량곡선을 작성하는 단계;
    (아) 상기 (라) 단계에서 얻은 내부 대조구와 시험구의 Ct 값, ΔRn 값 또는 RFU 값, 이들의 상대값인 ΔCt, RCt, ΔΔRn, ΔRFU, RΔRn, RRFU 및 이들 상대값을 곱한 값 또는 이들 상대값을 나눈 값을 각각 상응하는 상기 (바) 단계의 C-값으로 나누는 단계; 및
    (자) 상기 (아) 단계에서 얻은 값을 상기 (사) 단계에서 얻은 검량곡선에 대입하여 시험구의 동형접합자/이형접합자 혼합률을 산출하는 단계;를 포함하는 실시간 PCR을 이용하여 특정 돌연변이 혼합률을 확인하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 돌연변이는 염기의 삽입(insertion), 결실(deletion), 치환(substitution) 및 단일 염기서열 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 청구항 9에 있어서,
    상기 돌연변이는 식물, 동물, 미생물, 인체, 농수산물 및 그 가공품에 존재하는 돌연변이임을 특징으로 하는 방법.
  12. 청구항 9에 있어서,
    특정한 돌연변이 형질을 선별 증폭하는 실시간 PCR은 FenDEL-PCR, ARMS-PCR, TaqMan-PCR, MGB-TaqMan-PCR 및 PNA-PCR 중 선택된 하나임을 특징으로 하는 방법.
  13. 청구항 9에 있어서,
    내부 대조구로서 항존 유전자(house keeping gene)를 선택함을 특징으로 하는 방법.
  14. 청구항 9에 있어서,
    상기 (나), (마), (바), (사) 단계는 여타 단계와 별도로 진행되어 동형접합자 표준시료, 이형접합자 표준시료 및 동형접합자와 이형접합자가 특정 몰비로 존재하는 하나 이상의 표준시료에 대한 각 Ct 값 및 각 형광 값 ΔRn 및 RFU 중 하나 이상 또는 표준시료 중 동형접합자 시료와 이형접합자 시료의 Ct 값, 형광 값인 ΔRn 값 또는 RFU 값의 상대값인 ΔCt, RCt, ΔΔRn, ΔRFU, RΔRn, RRFU 및 이들 상대값을 곱한 값 또는 상대값을 나눈 값의 각 평균값인 C-값, 또는 표준시료에 대하여 작성된 검량곡선이 프로토콜화되어 제공됨을 특징으로 하는 방법.
  15. 상기 청구항 9 내지 청구항 13 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위하여
    내부 대조구에 대한 프라이머 및 프로브;
    동형접합자 시료, 이형접합자 시료 및 동형접합자와 이형접합자가 일정 비율로 혼합된 두 개 이상의 혼합시료를 포함하는 표준시료;
    상기 표준시료에 대한 프라이머 및 프로브; 및
    시험대상 시료의 돌연변이 형질을 구분할 수 있는 프라이머 및 프로브;를 포함하는 것을 특징으로 하는 실시간 PCR 키트.
  16. 상기 청구항 14의 방법을 수행하기 위하여
    동형접합자 표준시료, 이형접합자 표준시료 및 동형접합자와 이형접합자가 특정 몰비로 존재하는 하나 이상의 표준시료에 대한 각 Ct 값 및 각 형광 값 ΔRn 및 RFU 중 하나 이상 또는 표준시료 중 동형접합자 시료와 이형접합자 시료의 Ct 값, 형광 값인 ΔRn 값 또는 RFU 값의 상대값인 ΔCt, RCt, ΔΔRn, ΔRFU, RΔRn, RRFU 및 이들 상대값을 곱한 값 또는 상대값을 나눈 값의 각 평균값인 C-값, 또는 표준시료에 대하여 작성된 검량곡선이 기록된 프로토콜;
    내부 대조구에 대한 프라이머 및 프로브; 및
    시험대상 시료의 돌연변이 형질을 구분할 수 있는 프라이머 및 프로브;를 포함하는 것을 특징으로 하는 실시간 PCR 키트.
  17. 청구항 15 또는 청구항 16에 있어서,
    상기 키트는 농산물, 축산물, 수산물 및 이들의 가공품 중 어느 하나의 품종판별 또는 품종의 혼입도 판별용임을 특징으로 하는 실시간 PCR 키트.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021118288A1 (ko) * 2019-12-11 2021-06-17 (주)제노텍 대립 유전자의 구분성을 높이는 pcr 방법 및 pcr 킷트
CN115436517A (zh) * 2022-09-05 2022-12-06 云南中烟工业有限责任公司 一种基于gc-ms的云产野坝子的产地溯源的线性判别方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120083868A (ko) * 2011-01-18 2012-07-26 (주)바이오니아 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 표적 유전자의 단일 염기 다형성 판별 방법 및 이를 이용한 표적 유전자의 단일 염기 다형성 판별 키트

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20120083868A (ko) * 2011-01-18 2012-07-26 (주)바이오니아 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 표적 유전자의 단일 염기 다형성 판별 방법 및 이를 이용한 표적 유전자의 단일 염기 다형성 판별 키트
WO2012099397A2 (ko) * 2011-01-18 2012-07-26 (주) 바이오니아 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 표적 유전자의 단일 염기 다형성 판별 방법 및 이를 이용한 표적 유전자의 단일 염기 다형성 판별 키트

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Genome Res., Vol. 10, pp. 258-266 (2000.02.29.) *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021118288A1 (ko) * 2019-12-11 2021-06-17 (주)제노텍 대립 유전자의 구분성을 높이는 pcr 방법 및 pcr 킷트
CN115436517A (zh) * 2022-09-05 2022-12-06 云南中烟工业有限责任公司 一种基于gc-ms的云产野坝子的产地溯源的线性判别方法
CN115436517B (zh) * 2022-09-05 2023-09-19 云南中烟工业有限责任公司 一种基于gc-ms的云产野坝子的产地溯源的线性判别方法

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