CN117230159A - 利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法 - Google Patents
利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117230159A CN117230159A CN202311104908.2A CN202311104908A CN117230159A CN 117230159 A CN117230159 A CN 117230159A CN 202311104908 A CN202311104908 A CN 202311104908A CN 117230159 A CN117230159 A CN 117230159A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- osglub5ter
- copy number
- sequence
- terminator
- melting peak
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 63
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims abstract description 109
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims abstract description 109
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 98
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 83
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims abstract description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 45
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 4
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 33
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 abstract description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 18
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 238000011002 quantification Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 56
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 31
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 31
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 31
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 24
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 22
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 13
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 238000007838 multiplex ligation-dependent probe amplification Methods 0.000 description 3
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 3
- 108090000344 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Proteins 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010309 melting process Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 229940100486 rice starch Drugs 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 101100283284 Oryza sativa subsp. japonica GLUB5 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002558 medical inspection Methods 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000013643 reference control Substances 0.000 description 1
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及基因检测技术领域,尤其涉及一种利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法。本发明在内源3'UTR序列中插入指纹序列,得到转基因终止子。当含有转基因终止子的表达盒在转基因生物体内正常表达时,利用转基因终止子序列和内源3'UTR序列的共用引物对,能在同一qPCR反应体系中扩增得到两种存在结构性差异的PCR产物。进而,本发明可通过分析所述PCR产物的熔解曲线,实现针对该转基因生物目的基因拷贝数的快速判定和准确定量。具有检测灵敏度高、结果准确性高、检测效率高、成本低、检测周期短等优点。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,尤其涉及一种利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法。
背景技术
随着分子生物技术快速发展,特别是转基因技术的出现,给植物育种带来新的技术手段。转基因拷贝数是影响目的基因表达水平和遗传稳定性的重要因素,因此,检测转入目标基因的拷贝数是转基因研究中关键的一步。
目前应用于拷贝数变异检测的技术主要有:比较基因组杂交技术(comparativegenome hybridization,CGH)、TaqMan荧光探针技术、变性高效液相色谱(denaturing highperformance liquid chromatography,DHPLC)技术、多重连接探针扩增技术(multiplexligation-dependent probe amplification,MLPA)和新一代测序技术等。尽管这些技术应用广泛,但其缺陷依旧明显:CGH技术分辨率在Mb水平,更小片段的拷贝数片段则不易检出,同时该技术操作繁琐,通量低、耗时长且成本昂贵,需要较为大量的模板DNA,不利于大范围的推广;TaqMan荧光探针合成原料成本高、获取难度大,且通常无法克服信噪比低的缺陷,实验数据可重复性差;DHPLC技术在实践应用中,分辨力常受到实验设计、检测环境等因素的影响,存在可靠性和稳定性欠佳的问题;MLPA技术操作复杂,且需要毛细管电泳进行产物分析,整个实验耗时过长;新一代测序技术适合大样本的检测,但其依托的测序平台价格昂贵,且需要专业实验操作和数据分析人员,不适宜在普通实验室、基层医院或医学检验所开展。
实时荧光定量PCR技术(quantitative real-time PCR,qPCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量,通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。常规qPCR用于拷贝数分析时,需要至少两对引物,一对引物用于扩增目的基因,一对引物用于扩增内参基因(一般选取基因组中的单拷贝基因),通过扩增效率和Ct值计算各自的表达量并转换成相对定量或绝对定量,最终通过目的基因的量与内参基因的量的比值计算得出目的基因的拷贝数。该方法最常见的问题有:两对引物扩增效率不一致;每次实验都需检测扩增效率或固定扩增效率但批次之间会有差异;目的基因检测与内参基因检测在不同样品孔中,不同反应体系中操作中的微小差异容易导致定量变化。由于qPCR的灵敏度较高,上述微小差异最终可能导致计算所得的定量值偏离实际较远,故常规qPCR在鉴定拷贝数时存在较大的误差。
发明内容
有鉴于背景技术中存在的技术问题,本发明的目的是提供一种利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法,具有检测灵敏度高、结果准确性高、检测效率高及检测成本低等优点。
具体的,本发明的技术方案如下:
第一方面,本发明提供了一种利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法,以水稻OsGluB5基因3'UTR OsGluB5Ter为内源序列,在内源3'UTR的序列中插入长度大于10bp的DNA指纹序列,得到转基因终止子OsGluB5Ter-T;基于所述转基因终止子OsGluB5Ter-T的序列,在所述DNA指纹序列的两侧设计共用引物对;以转基因生物为待测样品;使用所述共用引物对,以待测样品的基因组DNA为模板,进行qPCR,得到PCR产物;分析所述PCR产物的熔解曲线,根据转基因终止子OsGluB5Ter-T序列熔解峰和内源3'UTROsGluB5Ter序列熔解峰的荧光强度比值,判定转基因生物目的基因拷贝数;所述转基因终止子OsGluB5Ter-T序列熔解峰和内源3'UTR OsGluB5Ter序列熔解峰对应的温度差值≥1.2℃。
转基因生物中含有基因表达盒,所述基因表达盒包括启动子、基因编码区和终止子等元件,其中,所述终止子元件来源于植物内源序列。本发明以水稻OsGluB5基因(LOC_Os02g16820)3'UTR OsGluB5Ter为内源序列,然后在所述内源3'UTR的序列中插入DNA指纹序列,得到转基因终止子元件,命名为OsGluB5Ter-T。
本发明所述转基因生物包含转基因表达盒中的OsGluB5Ter-T元件。当该表达盒在转基因生物体内正常表达时,该OsGluB5Ter-T元件及其对应的OsGluB5Ter内源序列在该转基因生物体同时获得表达。进而,本发明通过向转基因表达盒的终止子元件中插入DNA指纹序列的方式,使转基因生物体内通过转基因终止子序列和内源3'UTR序列形成的结构差异计算基因的表达量。
OsGluB5Ter-T中插入有DNA指纹序列。当含有OsGluB5Ter-T的基因表达盒在转基因生物体内正常表达时,以该转基因生物的基因组DNA(含转基因终止子OsGluB5Ter-T序列和内源3'UTR OsGluB5Ter序列)为模板,利用转基因终止子OsGluB5Ter-T序列和内源3'UTROsGluB5Ter序列的共用引物对,能在同一qPCR反应体系中扩增得到两种存在结构性差异(大小不同、GC比例不同、含量不同)的PCR产物。
本发明对PCR产物进行熔解曲线分析,基于转基因终止子OsGluB5Ter-T序列和内源3'UTR OsGluB5Ter序列扩增产物的结构性差异,可在熔解曲线中呈现两个单一可区分的熔解峰。
进而,当转基因终止子序列熔解峰和内源3'UTR序列熔解峰对应的温度差值≥1.2℃时,本发明可通过分析所述PCR产物的熔解曲线,根据转基因终止子OsGluB5Ter-T序列熔解峰和内源3'UTR OsGluB5Ter序列熔解峰的荧光强度(和扩增产物含量相关)比值,实现针对该转基因生物目的基因拷贝数的快速判定和准确定量,具有检测灵敏度高、结果准确性高、检测效率高、成本低、检测周期短等优点。
相较于其他的转基因终止子序列和内源3'UTR序列的组合,本发明优选的转基因终止子序列(OsGluB5Ter-T)和内源3'UTR序列(OsGluB5Ter)对应的熔解曲线峰线条清晰更易区分,无干扰峰,且重复性好。
在本发明中,所述DNA指纹序列及共用引物对的设计原则优选包括:使转基因终止子序列与内源3′UTR序列的扩增产物因GC含量的差异而在待测样品中呈现两个单一可区分的熔解峰。
在本发明优选的实施方式中,所述共用引物对的序列分别如SEQ ID NO.4和SEQID NO.5所示。以L452转基因水稻为例,此对引物扩增水稻内源3′UTR序列时,获得的片段长度为82bp;扩增水稻转基因终止子序列时,获得片段长度为114bp,二者存在32bp的碱基差异,且GC含量存在明显差异。
在本发明中,进行qPCR时,可以只以待测转基因样品的基因组DNA为模板,也可以分别以待测转基因样品的基因组DNA和对照野生型样品的基因组DNA为模板。当分别以待测转基因样品的基因组DNA和对照野生型样品的基因组DNA为模板时,待测转基因样品的基因组DNA的扩增产物中既含有内源3'UTR序列,又含有转基因终止子序列;而野生型样本的基因组DNA扩增产物中只含有内源3'UTR序列。野生型样本的基因组DNA扩增产物可用于对照实验。
在本发明优选的实施方式中,所述qPCR的反应体系以10μL计,包括0.5μl上游引物10μM,0.5μl下游引物10μM,5μl qCR Master Mix 2x,0.1μl CXR 100x*,1μl模板DNA 10±2ng,用ddH2O补足10μl。
在本发明优选的实施方式中,所述qPCR的反应程序为:50℃,1min;94-95℃,7min;94-95℃,10-20sec;60-62℃收集荧光信号1min,共计25个循环;60℃-95℃持续收集荧光信号,建立熔解曲线。进一步优选地,所述60℃-95℃持续收集荧光信号的程序为:60℃,1min;温度增量步进:0.2℃/sec至95℃,5sec;20℃,10sec。上述优选的反应程序获得的熔解曲线区分度更好。
在本发明中,所述熔解曲线的获取方法优选包括:把qPCR法扩增后的PCR产物缓慢升温至95℃,扩增产物双链DNA随温度升高逐渐变性解链产生单链,解链过程中嵌到双链中的荧光染料会被释放出来,利用仪器自动检测反应管内荧光信号的变化,绘制出扩增产物荧光信号随温度变化的熔解曲线,并得到相应PCR产物的熔解曲线峰图。
本发明提供的利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法在一个PCR反应体系中进行,读取单管PCR产物的数据,便可计算转基因植株中目的基因拷贝数;整个扩增和检测过程均为闭管操作,可避免污染和假阳性结果;使用一对引物扩增,其扩增效率完全相同,避免了不同管不同批次间的差异,与常规方法相比准确度大大提高;无需构建标准曲线、无需筛选严格的符合扩增效率的引物;扩增片段短,采用较高的退火温度,保证了扩增的特异性。
本发明建立了一种快速检测转基因生物中目的基因拷贝数的方法,该方法能显著提高其准确性和特异性,且操作简单,耗时短,费用低廉,为转基因生物中目的基因拷贝数的快速检测提供了有效方法。
在本发明优选的实施方式中,转基因生物目的基因拷贝数=K×(转基因终止子序列熔解峰荧光值/内源3'UTR序列熔解峰荧光值),K为常数。更具体的,所述K的值优选根据内源序列在作物中的拷贝倍数确定。
当内源序列在作物中的拷贝倍数为C时,K=C×n(n为作物的倍性)。例如,当所述转基因生物为二倍体的水稻,且选取的内源3'UTR序列OsGluB5Ter为单拷贝时,则K=C×n=1×2=2,即K值为2。
本发明所述方法适用于各类由水稻内源3'UTR序列OsGluB5Ter改造的转基因农作物。
在本发明中,所述DNA指纹序列的长度≥10bp,优选为20-40bp,所述DNA指纹序列的插入不影响基因的正常功能。
进一步优选地,在本发明中,所述内源3'UTR序列(OsGluB5Ter)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示;和/或,所述DNA指纹序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步优选地,在本发明中,所述转基因终止子序列为OsGluB5Ter-T,其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明在所述含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法的结果判断过程中,优选采用如下判断方法:
若样本的OsGluB5Ter-T熔解峰缺失,仅存在OsGluB5Ter熔解峰,则该样本的OsGluB5Ter-T目的基因拷贝数为0;
若样本的OsGluB5Ter-T熔解峰荧光值/OsGluB5Ter熔解峰荧光值在0.25-0.74之间,则该样本的OsGluB5Ter-T目的基因拷贝数为1;
若样本的OsGluB5Ter-T熔解峰荧光值/OsGluB5Ter熔解峰荧光值在0.75-1.44之间,则该样本的OsGluB5Ter-T目的基因拷贝数为2;
若样本的OsGluB5Ter-T熔解峰荧光值/OsGluB5Ter熔解峰荧光值在1.45-1.74之间,则该样本的OsGluB5Ter-T目的基因拷贝数为3。
进一步优选地,采用如下判断方法:
若样本的OsGluB5Ter-T熔解峰缺失,仅存在OsGluB5Ter熔解峰,则该样本的OsGluB5Ter-T目的基因拷贝数为0;
若样本的OsGluB5Ter-T熔解峰荧光值/OsGluB5Ter熔解峰荧光值在0.30-0.70之间,则该样本的OsGluB5Ter-T目的基因拷贝数为1;
若样本的OsGluB5Ter-T熔解峰荧光值/OsGluB5Ter熔解峰荧光值在0.80-1.40之间,则该样本的OsGluB5Ter-T目的基因拷贝数为2;
若样本的OsGluB5Ter-T熔解峰荧光值/OsGluB5Ter熔解峰荧光值在1.50-1.70之间,则该样本的OsGluB5Ter-T目的基因拷贝数为3。
上述判断方法得到的拷贝数检测结果准确性高,重复性好。
在本发明进一步提供的具体实施方式中,所述转基因生物选择L452转基因水稻,其内源3'UTR序列为OsGluB5Ter,转基因终止子序列为OsGluB5Ter-T;该目的基因拷贝数的检测方法具体包括如下步骤:
(1)设计转基因终止子序列与内源3'UTR序列共同的上下游引物:根据OsGluB5Ter终止子(SEQ ID NO.1)及插入32bpDNA指纹序列的OsGluB5Ter-T转基因终止子(SEQ IDNO.2)的序列特点,设计上下游引物,使内源3'UTR序列与转基因终止子序列扩增片段大小不同。
(2)提取野生型对照及待测转基因样本的基因组DNA;
(3)配制反应体系:在反应体系中加入上游引物、下游引物、DNA聚合酶,dNTPs以及PCR Buffer,DNA饱和性染料,后分别加入野生型基因组DNA和待测转基因样本的基因组DNA;
(4)进行PCR反应:将配制好的反应体系置于PCR仪进行PCR反应,实现基因扩增;
(5)分析熔解曲线并判定目的基因的拷贝数:根据熔解曲线中PCR产物熔解峰的荧光强度比值,判定待测样本目的基因的拷贝数。
优选的,步骤(1)中上下游引物设计原则为,使内源3'UTR序列与转基因终止子序列的扩增产物由于GC含量的差异而在待测样品中呈现可区分的两个单一的熔解峰。
进一步优选的,上游引物选择OsGluB5Ter-qPCR-F3(36nt):
5’-cataataagcatttctttatctcttcataataattc-3’(SEQ ID NO.4);
下游引物选择OsGluB5Ter-qPCR-R3(21nt):
5’-agattcggtgccaggtataac-3’(SEQ ID NO.5)。
优选的,步骤(3)中以单管反应体系10μL计,各个加入物的用量为:0.5μl上游引物10μM,0.5μl下游引物10μM,5μl qCR Master Mix 2x,0.1μl CXR 100x*,1μl模板DNA 10±2ng,用ddH2O补足10μl。
优选的,步骤(3)所述DNA饱和性染料包括但不局限于SYBR green、EvaGreen、LCGreen@PLUS、ResoLight、SYTO9中的任意一种。
优选的,步骤(4)中PCR反应参数设置为:50℃,1min;94-95℃,7min;94-95℃,10-20sec,60-62℃(收集荧光信号)1min,共计25个循环;60℃-95℃持续收集荧光信号,建立熔解曲线,(60℃,1min,温度增量步进:0.2℃/sec至95℃,5sec);20℃,10sec。
优选的,步骤(5)根据下式判定待测样本目的基因的拷贝数:
OsGluB5Ter-T拷贝数=2×(OsGluB5Ter-T熔解峰荧光值/OsGluB5Ter熔解峰荧光值)。
若样本的OsGluB5Ter-T熔解峰缺失,仅存在OsGluB5Ter熔解峰,则该样本的OsGluB5Ter-T目的基因拷贝数为0;
若样本的OsGluB5Ter-T熔解峰荧光值/OsGluB5Ter熔解峰荧光值在0.25-0.74之间,则该样本的OsGluB5Ter-T目的基因拷贝数为1;
若样本的OsGluB5Ter-T熔解峰荧光值/OsGluB5Ter熔解峰荧光值在0.75-1.44之间,则该样本的OsGluB5Ter-T目的基因拷贝数为2;
若样本的OsGluB5Ter-T熔解峰荧光值/OsGluB5Ter熔解峰荧光值在1.45-1.74之间,则该样本的OsGluB5Ter-T目的基因拷贝数为3。
本发明利用实时荧光定量PCR熔解曲线法进行转基因植株目的基因拷贝数检测,扩增产物双链DNA随温度升高逐渐变性解链产生单链,解链过程中嵌到双链中的荧光染料会被释放出来,仪器自动检测反应管内荧光信号的变化,最后绘制出扩增产物荧光信号随温度变化的熔解曲线,并得到相应PCR产物的熔解曲线峰图,根据熔解曲线中转基因终止子序列和内源3′UTR序列产物熔解峰的荧光强度比值,能准确定量目的基因拷贝数。
本发明提供的转基因生物目的基因拷贝数检测方法普适性广,成本低;不涉及荧光探针的酶切或链置换反应,因此所有适合PCR的DNA聚合酶均适用于本体系,且无需添加其他特殊组分;同时适用于各种型号的荧光定量PCR平台。
本发明提供的转基因生物目的基因拷贝数检测方法操作简单,耗时短;无需样本特殊处理等步骤,整个操作流程仅需要1.5小时左右即可完成样本的分析。
本发明提供的转基因生物目的基因拷贝数检测方法,结果分析简单,实验数据可重复性好;对每个样本只需知道其熔解峰信号强度便可完成结果判定,无需参照标准品,可完全依靠仪器配套的软件同时分析大量样本。
第二方面,本发明提供了一种转基因生物目的基因拷贝数检测试剂盒,包括上述共用引物对(序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示)。
进一步地,所述试剂盒优选还包括DNA聚合酶、dNTPs、PCRBuffer和DNA饱和性染料。所述DNA饱和性染料优选自SYBR green、EvaGreen、LCGreen@PLUS、ResoLight、SYTO9中的任意一种。
利用本发明提供的试剂盒进行转基因生物目的基因拷贝数的检测,同样具有检测灵敏度高、结果准确性高、检测效率高、成本低、检测周期短及普适性广等优点。
第三方面,本发明还提供了用于检测转基因生物目的基因拷贝数的终止子,所述终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供的终止子可辅助目的基因(如mSCL1等)的稳定表达,同时可用于检测转基因生物目的基因拷贝数,检测效果良好。
有益效果:
本发明提供了一种利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法。OsGluB5Ter-T中插入有DNA指纹序列。当含有OsGluB5Ter-T的基因表达盒在转基因生物体内正常表达时,以该转基因生物的基因组DNA(含转基因终止子OsGluB5Ter-T序列和内源3′UTR OsGluB5Ter序列)为模板,利用转基因终止子OsGluB5Ter-T序列和内源3′UTROsGluB5Ter序列的共用引物对,能在同一qPCR反应体系中扩增得到两种存在结构性差异(大小不同、GC比例不同、含量不同)的PCR产物。本发明对PCR产物进行熔解曲线分析,基于转基因终止子OsGluB5Ter-T序列和内源3′UTR OsGluB5Ter序列扩增产物的结构性差异,可在熔解曲线中呈现两个单一可区分的熔解峰。进而,当转基因终止子序列熔解峰和内源3′UTR序列熔解峰对应的温度差值≥1.2℃时,本发明可通过分析所述PCR产物的熔解曲线,根据转基因终止子OsGluB5Ter-T序列熔解峰和内源3′UTR OsGluB5Ter序列熔解峰的荧光强度(和扩增产物含量相关)比值,实现针对该转基因生物目的基因拷贝数的快速判定和准确定量,具有检测灵敏度高、结果准确性高、检测效率高、成本低、检测周期短等优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
图1是本发明实施例1中转基因终止子序列OsGluB5Ter-T和内源3′UTR序列OsGluB5Ter的序列特点,及拷贝数检测q-PCR引物设计示意图。
图2本发明实施例3中转基因终止子OsGluB5Ter-T可辅助目的基因正常表达结果图,其中左侧深色(黑色)柱子表达OsGluB5Ter的5个株系的相对表达量,右侧浅色(灰色)柱子表达OsGluB5Ter-T的5个株系的相对表达量。
图3为本发明实施例4中拷贝数为0、1和多拷贝的样品OsGluB5Ter-T基因检测实验结果图。其中,A图为水稻野生型WT的熔解曲线图,只有一个单峰,拷贝数为0;B图为L452熔解曲线图,两个峰,且转基因终止子序列熔解峰和内源3′UTR序列熔解峰荧光强度的比值为1/2,为单拷贝;C图为L452熔解曲线图,转基因终止子序列熔解峰和内源3′UTR序列熔解峰荧光强度的比值为为3/2,为3拷贝;D图为L452熔解曲线图,转基因终止子序列熔解峰和内源3′UTR序列熔解峰荧光强度的比值相差很大,为多拷贝。
图4是本发明对比例1中相对标准曲线法检测基因拷贝数的标准曲线;其中,A图为内参水稻淀粉分支酶基因(RBE4)的标准曲线;B图为目标基因(SbSAG Ter)的标准曲线。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的保护范围。
若未特别指明,本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得;若未具体指明,本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例以L452转基因水稻中转基因终止子序列OsGluB5Ter-T与内源3′UTR序列OsGluB5Ter为例,进行序列比对及引物设计。
本实施例基于转基因技术,使用水稻内源性3'UTR OsGluB5Ter序列,根据序列特点进行改造修饰,即在该3'UTR 230bp处加入32bp的DNA指纹,该转基因终止子序列命名为OsGluB5Ter-T。将OsGluB5Ter-T作为转基因表达元件终止子构建在pC1300载体上,重组载体命名为L452,并成功导入水稻植株中花11(ZH11)。根据OsGluB5Ter(SEQ ID NO.1)及OsGluB5Ter-T(SEQ ID NO.2)的序列特点,在DNA指纹序列(SEQ ID NO.3)两侧设计上下游特异性检测引物(SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5),如表1所示。
表1转基因水稻L452拷贝数检测引物
由于L452转基因水稻基因组中的OsGluB5Ter-T序列比水稻基因组中的OsGluB5Ter内源序列多出32bp的DNA指纹序列,因此,在32bp的DNA指纹序列两端设计引物,可有效区分转化事件中载体区段的OsGluB5Ter-T序列(SEQ ID NO.2),水稻基因组中的OsGluB5Ter终止子扩增长度为82bp(较短),L452转基因水稻基因组中的OsGluB5Ter-T终止子扩增长度为114bp(较长)。两个大小不同的片段,在实时荧光定量PCR(qPCR)中呈现出不同大小的溶解曲线峰,而溶解曲线峰值可进一步反映不同扩增片段的含量,由于基因组中内源序列拷贝数是固定的,因此可通过上述方法中比较两个片段熔解曲线峰值来反映转基因的拷贝数。
实施例2
本实施例以L452转基因水稻中转基因终止子序列OsGluB5Ter-T与内源3'UTR序列OsGluB5Ter为例,构建SYBR Green I实时定量PCR反应体系。
以野生型中花11(ZH11)的内源3'UTR序列OsGluB5Ter作为2拷贝对照,挑选转基因水稻L452 T0株系,分别选取各植株幼嫩叶片,采用CTAB法提取DNA(参照CTAB法标准步骤进行),DNA模板稀释至10ng/ul待用;检测转基因水稻L452转基因水稻中目的基因拷贝数,使用的定量试剂是qCR Master mix kit(上海普洛麦格生物产品有限公司),具体体系如下:
表2SYBR Green I实时定量PCR体系
SYBR Green I实时定量PCR的反应程序:50℃,1min;94-95℃,7min;94-95℃,10-20sec,60-62℃(收集荧光信号)1min,共计25个循环;60℃-95℃持续收集荧光信号,建立熔解曲线,(60℃,1min,温度增量步进:0.2℃/sec至95℃,5sec);20℃,10sec。
实施例3
为了鉴定转基因终止子OsGluB5Ter-T是否可辅助目的基因mSCL1的正常表达,本实施例对经抗性筛选获得的阳性愈伤组织进行RNA提取,并进行相对定量分析,实验结果显示转基因终止子OsGluB5Ter-T与内源3'UTR OsGluB5Ter均可辅助目的基因正常表达,结果如图2所示。
在mSCL1目的基因上设计特异性引物,序列如表3所示:
表3转基因水稻L452 mSCL1目的基因特异性引物
实施例4
本实施例在实施例2的基础上,使用熔解曲线分析转基因水稻目的基因拷贝数。
SYBR Green I实时定量PCR反应结束后,利用QuantStudioTM Design&Analysis SCSoftware软件进行数据分析,结合熔解峰图,并根据下式初步判定待测样本目的基因的拷贝数:L452转基因株系拷贝数=2*(OsGluB5Ter-T熔解峰荧光值/OsGluB5Ter熔解峰荧光值)。
通过实验数据分析,OsGluB5Ter-T基因拷贝数的参考范围是:
若样本的OsGluB5Ter-T熔解峰缺失,仅存在OsGluB5Ter熔解峰,则该样本的OsGluB5Ter-T目的基因拷贝数为0;若样本的OsGluB5Ter-T熔解峰荧光值/OsGluB5Ter熔解峰荧光值在0.30-0.70之间,则该样本的OsGluB5Ter-T目的基因拷贝数为1;若样本的OsGluB5Ter-T熔解峰荧光值/OsGluB5Ter熔解峰荧光值在0.80-1.40之间,则该样本的OsGluB5Ter-T目的基因拷贝数为2;若样本的OsGluB5Ter-T熔解峰荧光值/OsGluB5Ter熔解峰荧光值在1.50-1.70之间,则该样本的OsGluB5Ter-T目的基因拷贝数为3。
L452转基因水稻(OsGluB5Ter-T)qPCR拷贝数鉴定荧光比值参考范围如表4所示。
表4 L452转基因水稻(OsGluB5Ter-T)qPCR拷贝数鉴定荧光比值参考范围
OsGluB5Ter-T拷贝数 | OsGluB5Ter-T熔解峰荧光值/OsGluB5Ter熔解峰荧光值 |
0 | OsGluB5Ter熔解峰缺失,仅存在OsGluB5Ter熔解峰 |
1 | 0.30-0.70(0.25-0.74) |
2 | 0.80-1.40(0.75-1.44) |
3 | 1.50-1.70(1.45-1.74) |
利用q-PCR对46株L452 T0代转基因苗进行拷贝数检测,设置3个重复,根据表3拷贝数鉴定荧光比值参考范围,结果表明:7个样是单拷贝、20个样是双拷贝、10个样是3拷贝,9个样为多拷贝。图3显示拷贝数为0、1和多拷贝的样品OsGluB5Ter-T基因检测实验结果图。表5为统计部分样品qPCR拷贝数检测结果。
表5 L452转基因水稻(OsGluB5Ter-T)qPCR拷贝数(1-3拷贝)部分
对比例1
本对比例使用常规相对标准曲线法,检测L452转基因水稻中目的基因的拷贝数,用于同实施例4的检测结果进行比较。
(1)获取DNA样品和引物
挑选L452转基因水稻T0代株系,用常规qPCR鉴定拷贝数的内参对照法来计算样品基因的拷贝数。以常用的水稻淀粉分支酶基因(RBE4)内参基因(一般选取基因组中的单拷贝基因);以基因表达元件的另一个高粱来源的3'UTR SbSAG Ter作为目的基因,进行qPCR扩增。L452转基因水稻包含两个紧密连锁的基因表达盒,其中一个基因表达盒包含OsGluB5Ter-T终止子元件,另一个基因表达盒包含SbSAG Ter终止子元件,通过比较SbSAGTer扩增的Ct值与RBE4的Ct值来计算SbSAG Ter的拷贝数,也能确定L452转基因水稻的拷贝数,具体引物序列如表6所示。
表6相对标准曲线检测L452转基因水稻拷贝数引物
(2)qPCR-相对标准曲线法反应体系
使用同实施例2的方法获取野生型中花11(ZH11)和待测样本的基因组DNA并稀释至10ng/ul待用,其中以野生型中花11(ZH11)为对照,利用qPCR-相对标准曲线法,检测L452转基因水稻中SbSAG Ter目的基因拷贝数,具体体系如表7所示。
表7SYBR Green I实时定量PCR体系
(3)qPCR-相对标准曲线法反应程序
SYBR Green I实时定量PCR的反应程序:95℃,7min;94-95℃,15sec,60-62℃,30sec,72℃(收集荧光信号),15sec,共计40个循环;60℃-95℃设置熔解曲线循环,(60℃,5s;温度增量步进:0.2℃/sec至95℃,5sec);20℃,10sec,结束。
(4)qPCR-相对标准曲线法分析拷贝数
通过扩增效率和Ct值计算各自的表达量并转换成相对定量,最终通过目的基因的量与内参基因的量的比值计算得出目的基因的拷贝数,结果如图3所示。表8显示熔解曲线法检测结果的部分样本的相对标准曲线法拷贝数和Southern Blot拷贝数检测结果。
表8拷贝数检测结果比较
/>
结果表明:熔解曲线法比相对标准曲线法的拷贝数的数据更加稳定、波动更小,从而使得拷贝数分析更加准确。RBE4为内参的拷贝数检测结果与Southern Blot拷贝数检测结果匹配率只有26.7%,熔解曲线法与Southern Blot拷贝数检测结果匹配率有80%。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法,其特征在于,以OsGluB5基因3'UTR OsGluB5Ter为内源序列,在内源3'UTR的序列中插入长度大于10bp的DNA指纹序列,得到转基因终止子OsGluB5Ter-T;基于所述转基因终止子OsGluB5Ter-T的序列,在所述DNA指纹序列的两侧设计共用引物对;以转基因生物为待测样品;使用所述共用引物对,以待测样品的基因组DNA为模板,进行qPCR,得到PCR产物;分析所述PCR产物的熔解曲线,根据转基因终止子OsGluB5Ter-T序列熔解峰和内源3'UTR OsGluB5Ter序列熔解峰的荧光强度比值,判定转基因生物目的基因拷贝数;所述转基因终止子OsGluB5Ter-T序列熔解峰和内源3'UTROsGluB5Ter序列熔解峰对应的温度差值≥1.2℃。
2.根据权利要求1所述利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法,其特征在于,所述内源3'UTR OsGluB5Ter的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,和/或,所述DNA指纹序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1或2所述转利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法,其特征在于,所述转基因终止子OsGluB5Ter-T的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1-3任意一项所述利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法,其特征在于,转基因生物目的基因拷贝数=K×(转基因终止子OsGluB5Ter-T序列熔解峰荧光值/内源3′UTR OsGluB5Ter序列熔解峰荧光值),K为常数。
5.根据权利要求1-4任意一项所述利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法,其特征在于,
若样本的OsGluB5Ter-T熔解峰缺失,仅存在OsGluB5Ter熔解峰,则该样本的OsGluB5Ter-T目的基因拷贝数为0;
若样本的OsGluB5Ter-T熔解峰荧光值/OsGluB5Ter熔解峰荧光值在0.25-0.74之间,则该样本的OsGluB5Ter-T目的基因拷贝数为1;
若样本的OsGluB5Ter-T熔解峰荧光值/OsGluB5Ter熔解峰荧光值在0.75-1.44之间,则该样本的OsGluB5Ter-T目的基因拷贝数为2;
若样本的OsGluB5Ter-T熔解峰荧光值/OsGluB5Ter熔解峰荧光值在1.45-1.74之间,则该样本的OsGluB5Ter-T目的基因拷贝数为3。
6.根据权利要求1-5任意一项所述利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法,其特征在于,所述qPCR的反应体系以10μL计,包括0.5μl上游引物10μM,0.5μl下游引物10μM,5μl qCR Master Mix 2x,0.1μl CXR 100x*,1μl模板DNA 10±2ng,用ddH2O补足10μl。
7.根据权利要求1-6任意一项所述利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法,其特征在于,所述qPCR的反应程序为:50℃,1min;94-95℃,7min;94-95℃,10-20sec;60-62℃收集荧光信号1min,共计25个循环;60℃-95℃持续收集荧光信号,建立熔解曲线;
优选地,所述60℃-95℃持续收集荧光信号的程序为:60℃,1min;温度增量步进:0.2℃/sec至95℃,5sec;20℃,10sec。
8.转基因生物目的基因拷贝数检测试剂盒,其特征在于,包括所述共用引物对;所述共用引物对的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
优选地,还包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR Buffer和DNA饱和性染料。
9.根据权利要求8所述转基因生物目的基因拷贝数检测试剂盒,其特征在于,所述DNA饱和性染料选自SYBR green、EvaGreen、LCGreen@PLUS、ResoLight、SYTO9中的任意一种。
10.用于检测转基因生物目的基因拷贝数的终止子,所述终止子的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311104908.2A CN117230159A (zh) | 2023-08-30 | 2023-08-30 | 利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311104908.2A CN117230159A (zh) | 2023-08-30 | 2023-08-30 | 利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117230159A true CN117230159A (zh) | 2023-12-15 |
Family
ID=89088872
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311104908.2A Pending CN117230159A (zh) | 2023-08-30 | 2023-08-30 | 利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117230159A (zh) |
-
2023
- 2023-08-30 CN CN202311104908.2A patent/CN117230159A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Collins et al. | Developmental validation of a single-tube amplification of the 13 CODIS STR loci, D2S1338, D19S433, and amelogenin: the AmpFℓSTR® Identifiler® PCR amplification kit | |
CN104894271B (zh) | 一种检测基因融合的方法及装置 | |
US20120276533A1 (en) | Method for Simultaneously Detecting Polymorphisms of Acetaldehyde Dehydrogenase 2 and Alcohol Dehydrogenase 2 | |
CN107488711B (zh) | 点突变的基因型检测的方法及其试剂盒 | |
CN104450869B (zh) | 一种双脱氧核苷修饰的引物方法、反应体系及其在突变检测中的应用 | |
CN112280848A (zh) | 一种人运动神经元基因拷贝数相对定量检测方法及试剂盒 | |
CN114736958A (zh) | 检测人运动神经元存活基因smn1拷贝数的试剂盒及分析方法 | |
CN110846408A (zh) | 用于检测ttn基因突变的引物组合及其应用 | |
EP2514820A1 (en) | Method for designing probe in dna microarray, and dna microarray provided with probe designed thereby | |
KR102084965B1 (ko) | 정성적 또는 정량적 돌연변이 유전형 분석방법 및 이 방법을 수행하기 위한 실시간 pcr 키트 | |
CN117230159A (zh) | 利用含指纹序列的终止子检测转基因拷贝数的方法 | |
CN109504749A (zh) | 转基因玉米l239及其子代纯合体和杂合体的kasp检测引物 | |
CN117327695A (zh) | 用于快速检测转基因拷贝数的终止子序列及方法 | |
CN115418394A (zh) | 用于检测cho细胞基因组dna的组合物、试剂盒及方法 | |
CN114606335A (zh) | 玉米抗甘蔗花叶病毒病基因的kasp分子标记的开发及应用 | |
CN116590390A (zh) | 一种利用终止子中插入dna指纹序列快速检测转基因拷贝数的方法 | |
CN109576350B (zh) | 一种dna与rna同时定量的试剂盒、方法及质控方法 | |
CN110651052B (zh) | 随机引物集合和使用其制备dna文库的方法 | |
CN116732227A (zh) | 转基因作物目的基因gat-ms拷贝数检测方法及试剂盒 | |
CN111363840A (zh) | 一种检测基于RNAi转基因植物双链RNA的试剂盒及其应用 | |
CN111793676A (zh) | 一种基因多态性检测的方法、试剂盒及其应用 | |
CN116606914A (zh) | 转基因生物目的基因拷贝数检测方法及试剂盒 | |
CN114507749B (zh) | 一种准确检测玉米转基因成分的引物组、试剂盒及方法 | |
CN114807407B (zh) | 一种检测大豆转基因品系的引物对组合、试剂盒及检测方法 | |
CN114507750B (zh) | 一种检测玉米转基因品系的引物组、试剂盒及检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |