CN108103151A - 一种基于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检测和分型的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检测和分型的方法及其应用,该方法通过将待检核酸与表面带有序列特异性核酸结合蛋白的微球混合或者将待检核酸、序列特异性核酸结合蛋白及微球混合,室温孵育,借助显微工具进行微球观测,即可完成核酸检测及分型。本发明的方法可在不经传统核酸检测中进行的核酸扩增、核酸杂交等复杂、耗时、费钱程序的情况下,快速、简单地实现低至飞摩级DNA分子的检测。本发明利用了序列特异性核酸结合蛋白对核酸分子的特异性识别和结合特性,成功避免了目前核酸检测和分型领域中核酸杂交和扩增等关键瓶颈问题,实现了可视化、数字化、超灵敏的核酸快速检测,在核酸检测领域具有极其广泛的巨大的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域,具体涉及涉及一种基于序列特异性核酸结合 蛋白的核酸检测和分型的方法及其应用。
背景技术
对于基础研究、各种检测及诊断应用,DNA检测和基因分型一直很重要。 因此,DNA检测和基因分型技术一直受到广泛关注,从而促进了该类技术发展。 归纳起来,主要有三类DNA检测和基因分型技术被广泛应用。第一种是基于聚 合酶链反应(PCR)的各种技术。PCR是最常用的DNA检测和基因分型技术。 基于PCR的DNA检测和基因分型主要依赖于特异性引物的设计和多重PCR扩 增。PCR检测可以通过传统PCR(tPCR),定量PCR(qPCR)和最近开发的数 字PCR来实现。因为具有明显的优点,如实时检测和高灵敏度,Q-PCR在几乎 所有的研究、检测和诊断实验室中得到高度普及。现在已经开发出更准确的数字 PCR,作为临床检测工具,具有很大的潜力和优势。然而,PCR技术在用于区分 高度相关的基因型时,要受到多重扩增和高度特异性引物的限制。除PCR技术 外,DNA微阵列等多种DNA杂交技术也被广泛用于检测和分型DNA。然而, 由于其昂贵的设备,复杂的检测流程和难以避免的非特异性杂交,DNA微阵列 技术不能像PCR一样成为常规DNA检测和基因分型工具。DNA测序是另一种有效的DNA检测和基因分型技术。特别是随着下一代测序(NGS)技术的出现, 诸如IlluminaNovaSeq等NGS平台的DNA测序工具越来越多。然而,由于需要 昂贵的设备和化学试剂,它们仍然不能像PCR一样用于常规研究,检测和诊断。 此外,近年来还开发出了各类核酸等温扩增技术用于核酸检测,如滚环扩增 (RCA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、多重置换扩增(MDA)、环介导等温扩 增技术(LAMP)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)、解旋酶依赖扩增(HDA)、 切刻酶扩增反应(NEAR)等,但这些检测技术都依赖形形色色的核酸扩增程序才 能实现核酸的检测。因此,相比之下,如果克服了引物设计的限制,PCR仍然 是最方便、经济高效的DNA检测和基因分型的平台。
Ishino等人于1987年首先在大肠杆菌(E.coli)的基因组中发现了成簇的规 律间隔的短回文重复序列(CRISPR),并由Jansen等人在2002年定义为CRISPR。 现在,已知的CRISPR系统包括三种不同类型(类型I,II和III)。I型和III型 系统由多种Cas蛋白组成,而II型系统只需要一种Cas蛋白Cas9。Cas9与 CRISPR相关的RNA(crRNA)和反式激活的crRNA(tracrRNA)相关联。TracrRNA能够激活Cas9核酸酶,crRNA与目标DNA的20个核苷酸序列互补。 因此后者决定了CRISPR-Cas9系统的特异性。crRNA引导的Cas9核酸酶可以 与原始毗邻基序(PAM)相邻的靶DNA结合,并在PAM序列(NGG)上游三 个碱基处切割靶DNA。将tracrRNA和crRNA整合成一个单导向RNA(sgRNA) 后,极大地简化了II型CRISPR系统的应用。由sgRNA引导着Cas9去切割靶 DNA。目前,CRISPR-Cas9系统由于其简便性和高效性,被许多研究者广泛应 用于基因组编辑领域。另外,dCas9(dead Cas9)是由Cas9改造而成,其失去 了核酸酶活性,但保留基因转录激活结构域(AD)或抑制结构域(ID),dCas9 (deadCas9)作为一种新的人工转录因子已被广泛应用于内源性基因表达调控。
尽管Cas9/sgRNA已广泛应用于基因编辑和调控,但目前还没有充分地探讨 用于核酸检测领域。凭借高特异性的DNA识别及切割能力(能够区分单碱基), Cas9/sgRNA及其他CRISPR相关核酸酶(如Cpf1等)在DNA检测和分型上有 具有很大的潜力。最近,CRISPR-Cas9系统已被用于检测Zika病毒并且能够对 美国和非洲Zika病毒进行分型。鉴于CRISPR的工具的高度特异性,CRISPR-Cas9 在区分病毒株时可以达到单碱基的分辨率,可以在单碱基水平上对直系同源的细 菌和病毒进行分型检测。最近CRISPR系统(III型的Cas13a/C2c2)已经应用于 Zika病毒的检测并且具有超高灵敏度(病毒颗粒的量低至2aM。这些研究表明, CRISPR系统用于开发核酸检测技术时具有很大的潜力和优势。然而,在目前报 道的基于Cas9的核酸检测方法中,他们是先用待检测RNA反转录出单链DNA, 再生成双链DNA,然后用Cas9/sgRNA系统切割双链DNA来达到分型RNA的 目的。因此,CRISPR系统,特别是Cas9/sgRNA系统目前尚未充分开发用于核 酸的检测和分型。
转录激活因子样效应物(transcription activator-like effector,TALE)是CRISPR 技术出现前使用的一种基因编辑工具。该种蛋白是一种典型的序列特异性DNA 结合蛋白,可通过改变其重复单元中的两个关键氨基酸就可以构建靶向特定序列 的TALE蛋白。TALE蛋白融合核酸内切酶如FolI后,则成为TALEN(transcription activator-likeeffector nuclease),是至今仍然在使用的基因编辑工具。TALE蛋白 融合转录激活结构域(AD)或转录抑制结构域(ID)后,则成为TALE-TF (transcription activator-likeeffector-transcription factor),是靶向调控细胞内特定 基因表达的人造转录因子。TALE已经充分地开发用于基因编辑和基因调控,但 极少报道用于核酸检测,其用于核酸检测的价值未被充分挖掘利用。
发明内容
发明目的:针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种基于序列特异性核 酸结合蛋白(sequence-specific nucleic acid-binding proteins,指这类蛋白可识别并 结合特定序列的核酸)的核酸检测和分型的方法,简称为PABE方法,即“蛋白 辅助的微球纠缠(Protein-Assistant Beads Entanglement)”。该方法只经一个步骤 即可完成核酸检测与分型,本发明开发的基于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检 测和分型的方法,可在不经传统核酸检测中进行的核酸扩增、核酸杂交等复杂、 耗时、费钱程序的情况下,快速(数分钟)、简单(一步法)地实现低至飞摩(fM) 级DNA分子的检测。
本发明还提供基于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检测和分型的方法的应 用。
技术方案:为了实现上述目的,如本发明所述的一种基于序列特异性核酸结 合蛋白的核酸检测和分型的方法,包括如下步骤:将待检核酸与表面带有序列特 异性核酸结合蛋白的微球混合或者将待检核酸、序列特异性核酸结合蛋白及微球 混合,室温孵育数分钟,借助显微工具进行微球的观测,即可完成核酸检测及分 型。
其中,所述核酸包括核糖核酸(RNA)与脱氧核糖核酸(DNA)。
其中,所述序列特异性核酸结合蛋白包括各种可序列特异性识别并结合核酸 分子的蛋白或各种可序列特异性识别并结合核酸分子的蛋白复合物所述序列特 异性识别并结合核酸分子的蛋白包括锌指蛋白(Zinc finger)、转录激活因子样效 应物(transcription activator-like effector,TALE)、CRISPR核酸酶、Ago蛋白、 重组酶、限制性内切酶或转录因子;所述蛋白复合物为锌指蛋白、转录激活因子 样效应物、CRISPR核酸酶、Ago蛋白、重组酶、限制性内切酶或转录因子的复 合物。
所述CRISPR核酸酶包括具有天然核酸切割活性的CRISPR核酸酶、人工改 性后失去部分或全部核酸切割活性的CRISPR核酸酶。
所述CRISPR核酸酶的复合物是指CRISPR核酸酶与其匹配的RNA结合形 成的CRISPR核酸酶/RNA复合物,该类CRISPR核酸酶/RNA复合物可在RNA 的引导下识别并结合特定序列的DNA或RNA。所述特定序列指与CRISPR核酸 酶/RNA复合物中的RNA可退火杂交的序列。
所述重组酶包括Rad51、SSAP或uvsX,所述重组酶可结合单链DNA分子, 并在单链DNA分子的引导下识别并结合特定序列的DNA。所述特定序列指与单 链DNA分子可退火杂交的序列。
所述Ago蛋白包括各种Ago蛋白;该类蛋白可在引导DNA的引导下识别 并结合特定序列的DNA或RNA。所述特定序列指与引导DNA分子可退火杂交 的序列。
所述限制性内切酶为经过人工改性后失去部分或全部核酸切割活性的核酸 内切酶。
进一步地,所述CRISPR核酸酶包括Cas9蛋白以及其他具有类似功能的 CRISPR核酸酶,如Cpf1、C2c1、c2c3、CasX、CasY、ARMAN-1Cas9、ARMAN-4 Cas9、Cas3、Cas10、Cas13a/C2c2、Cas13b等,以及其他新发现的类似功能物。
所述Cas9包括在引导RNA(guided RNA,gRNA)的辅助下可靶向目标DNA 的各种Cas9蛋白,包括具有天然活性的可切割双链DNA的Cas9核酸酶、具有 部分DNA切割活性的Cas9核酸酶(即具有切刻活性的Cas9核酸酶(nike Cas9, nCas9,如D10A-Cas9及H840A-Cas9)、无核酸酶活性的Cas9(nuclease-deficient Cas9;也称为dead cas9,dcas9)。
所述引导RNA包括单分子引导RNA(single-guided RNA,sgRNA)和双分 子引导RNA;其中,所述双分子gRNA由反式激活CRISPR RNA(trans-activating CRISPR RNA,tracrRNA)和CRISPR RNA(CRISPR RNA,crRNA)两种组分 构成;其中,所述sgRNA是tracrRNA和crRNA的人工嵌合体(也称为single chimeric guide RNA)。
其中,所述表面带有序列特异性核酸结合蛋白的微球包括以各种方式将序列 特异性核酸结合蛋白及其复合物连接到各种颗粒物表面形成的微球。
所述引导RNA可在RNA的5′或/和3′端增加一段序列,该序列可与带有 一段与之序列互补的DNA或RNA片段(可称为捕获序列)退火;依靠捕获序 列上标记的化学分子,如生物素、地高辛等,将Cas9/RNA、nCas9/RNA、 dCas9/RNA连接到表面带有链霉亲和素(streptavidin)或地高辛抗体的微球上, 形成Cas9/RNA-微球、nCas9/RNA-微球、dCas9/RNA-微球等。其中以生物素化 的捕获序列与链霉亲和素包被的磁性微球为最佳。
所述引导RNA即可以体内表达制备,也可以体外表达制备,还可以体外化 学合成;当用化学合成制备引导RNA时,也可以直接在引导RNA的5′或/和3′ 端化学标记生物素、地高辛等分子,用于将Cas9/RNA、nCas9/RNA、dCas9/RNA 连接到表面带有链霉亲和素(streptavidin)或地高辛抗体的微球上。
所述引导RNA也可以对常规引导RNA序列进行加长,使引导RNA分子上 增加新的序列,这些序列可被特定蛋白分子结合,如发卡核酸配体(hairpin aptamer)序列(SAM系统)、脚手架RNA(scaffold RNA,scRNA)等。使用这 类引导RNA时,可将可与这类引导RNA结合的蛋白(如MS2结合蛋白PP7-PCP、 com-Com等)连接到微球表面,利用引导RNA与微球表面蛋白间的结合作用, 将Cas9/RNA、nCas9/RNA、dCas9/RNA等固定到微球表面,形成Cas9/RNA-微球、nCas9/RNA-微球、dCas9/RNA-微球等。
所述Cas9包括各类Cas9融合蛋白(如Cas9-VP64、Cas9-VPR、Cas9-tag等)。 使用这类Cas9融合蛋白时,可利用融合蛋白(VP64、VPR、tag)与固定在微球 表面的融合蛋白的抗体之间的结合,将Cas9/RNA、nCas9/RNA、dCas9/RNA等 固定到微球表面,形成Cas9/RNA-微球、nCas9/RNA-微球、dCas9/RNA-微球等。 所述tag包括各种标签(tag)序列,如组氨酸标签(His tag)、MYC标签(MYC tag)、谷胱甘肽(GSH)、Flag等。
所述Cas9包括Cas9-链亲和素结合肽融合蛋白。使用这类Cas9融合蛋白时, 可利用链亲和素结合肽(SBP)与固定在微球表面的链霉亲和素(streptavidin) 之间的结合,将Cas9/RNA、nCas9/RNA、dCas9/RNA等固定到微球表面,形成 Cas9/RNA-微球、nCas9/RNA-微球、dCas9/RNA-微球等。
所述Cas9包括Cas9-生物素连接酶(Biotin Protein Ligase,如BirA)底物 序列(如AviTag序列)融合蛋白(如Cas9-AviTag、nCas9-AviTag、dCas9-AviTag 等)。使用这类Cas9融合蛋白时,可利用生物素连接酶对Cas9-生物素酶底物序 列融合蛋白进行生物化处理(即标记生物素),借助生物素与固定在微球表面的 链霉亲和素(streptavidin)之间的结合,将Cas9/RNA、nCas9/RNA、dCas9/RNA 等固定到微球表面,形成Cas9/RNA-微球、nCas9/RNA-微球、dCas9/RNA-微球 等。
所述锌指(ZNF)蛋白、转录激活物样效应物(TALE)蛋白既可以为ZNF 及TALE蛋白本身,也可以为ZNF及TALE蛋白与其他蛋白或多肽的融合蛋白。 使用这类ZNF及TALE融合蛋白时,可利用固定在微球表面的对应抗体分子将 ZNF及TALE蛋白固定到微球上。
所述ZNF及TALE蛋白包括ZNF及TALE-链亲和素结合肽融合蛋白。使用 这类融合蛋白时,可利用链亲和素结合肽(SBP)与固定在微球表面的链霉亲和 素(streptavidin)之间的结合,将ZNF及TALE蛋白等固定到微球表面,形成 ZNF及TALE蛋白-微球等。
所述ZNF及TALE蛋白包括ZNF及TALE-生物素连接酶(Biotin Protein Ligase,如BirA)底物序列(如AviTag序列)融合蛋白(如ZNF-AviTag及 TALE-AviTag等)。使用这类ZNF及TALE融合蛋白时,可利用生物素连接酶对 ZNF及TALE-生物素酶底物序列融合蛋白进行生物化处理(即标记生物素),借 助生物素与固定在微球表面的链霉亲和素(streptavidin)之间的结合,将生物素 化的ZNF-AviTag及TALE-AviTag等固定到微球表面,形成ZNF-微球、TALE- 微球等。
所述序列特异性核酸结合蛋白及其复合物连接到各种颗粒物表面形成的微 球,包括上述未竟的其他各种直接或间接的连接方式。如SunTag系统中的dCas9- 肽表位(peptide epitope)融合蛋白与单链可变片段抗体的结合等。
所述序列特异性核酸结合蛋白及其复合物包括各种撕裂结构的蛋白,如splitCas9、Cas9-split-GFP等;已经通过这种撕裂结构间的互作将序列特异性核酸结 合蛋白及其复合物连接到微球表面。
作为优选,所述微球包括人造颗粒物或天然颗粒物质。
所述人造颗粒物包括以各种材料制备而成的各种金属材料微球(如磁性微 球)、有机材料微球(如聚丙烯微球、聚乳酸微球、聚丙烯酰胺微球、壳聚糖微 球、琼脂糖微球等)或无机材料微球(如二氧化硅微球等)。
进一步地,所述人造颗粒物包括各种规格、形貌和物化属性的颗粒物。如各 种尺寸(纳米到微米)的颗粒物;表面多形(如球型、立方体、星状等形貌)的 颗粒物;具有表面不同修饰、荧光标记、内在荧光、颜色、电荷等物化属性的颗 粒物。
所述天然颗粒物包括噬菌体、细菌或真核细胞。
所述噬菌体、细菌、真核细胞等颗粒物,可将序列特异性核酸结合蛋白及其 复合物连接通过各种连接分子,如抗体、多肽配体、核酸配体等连接到这些天然 颗粒物质的表面;也可以通过表面展示技术将ZNF、TALE、天然或改性CRISPR 核酸酶、Ago蛋白、重组酶等表达到这些天然颗粒物质的表面,形成可直接与靶 核酸分子结合的微球(如ZNF、TALE-微球等),或复合引导核酸分子后可与靶 核酸分子结合的微球(如结合RNA后的天然或改性CRISPR核酸酶、结合DNA 后的Ago蛋白或重组酶等)。
其中,所述显微工具包括各类显微镜或基因扫描仪等。检测工具可随微球物 化属性的不同,选择适宜的仪器进行观察和拍照。
本发明所述的基于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检测和分型的方法在各 种可视化、数字化核酸快检和分型中的应用。
其中,所述核酸快检包括床旁即时诊断(POCT)、野战生化检测等。
本发明所述基于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检测和分型的方法,除了使 用各种微球作为信号报告物外,本发明也可以将微球取消,使用荧光等分子标记 序列特异性核酸结合蛋白及其复合物,利用荧光共振能量传递(FRET)、撕裂 (split)结构荧光蛋白的复合等方式,进行与目标核酸分子共结合后两个或多个 序列特异性核酸结合蛋白及其复合物的靠近信息的报告。
本发明的检测原理如图1所示,利用序列特异性核酸结合蛋白及其复合物对 特定核酸序列的特异性识别并结合特性,针对目标核酸序列选择一对或多个序列 特异性核酸结合蛋白的结合位点(binding sites),这些结合位点间具有相对接近 的空间距离;再根据这些结合位点制备可特异性结合这些位点的一对或多个序列 特异性核酸结合蛋白,并将这些序列特异性核酸结合蛋白连接到微球表面。检测 时,如果待检核酸样品中具有目标核酸分子,则由于这些序列特异性核酸结合蛋 白与一个核酸分子上不同结合位点的结合,借助目标核酸分子将一对或多个微球 在空间上拉近,使它们成为成对、或成堆、或成串存在的微球;而当待检核酸样 品中不存在目标核酸分子时,则无法形成成对、或成堆、或成串的微球,微球呈 分散状态存在。通过计数检测溶液中成对、或成堆、或成串微球的数量,可数出 检测溶液中目标核酸分子的个数。本发明的实现只经一个步骤,即将待检核酸与 表面带有序列特异性核酸结合蛋白的微球混合,或待检核酸、序列特异性核酸结 合蛋白及微球混合,室温孵育数分钟,用显微镜等简单工具显微观察和拍照,即 可完成检测。本发明中通过检测高危型人乳头状瘤病毒DNA、细菌DNA、哺乳 动物细胞DNA、植物细胞DNA等目标核酸分子,论证了该方法的可行性、可靠 性、灵敏性、简单性、优越性。
有益效果:与现有技术相比,本发明具有如下优点:
本发明开发了一种基于序列特异性核酸结合蛋白对目标核酸进行可视化快 速检测和分型的新方法。该方法可以简单、快速、超灵敏地对目标核酸分子进行 特异性检测和分型。本发明利用了序列特异性核酸结合蛋白对核酸分子的特异性 识别和结合特性,成功避免了目前核酸检测和分型领域中核酸杂交和扩增等关键 瓶颈问题,实现了可视化、数字化、超灵敏的核酸快速检测。该方法在核酸检测 领域具有极其广泛的巨大的应用价值。
本发明基于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检测及分型方,可在不经传统核 酸检测中进行的核酸扩增、核酸杂交等复杂、耗时、费钱程序的情况下,快速(数 分钟)、简单(一步法)地实现低至飞摩(fM)级DNA分子的检测。本发明基 于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检测及分型新技术,完全可用床旁即时诊断 (POCT)、野战生化检测等核酸快检领域。
附图说明
图1为基于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检测和分型的方法的原理及流 程示意图;针对目标核酸分子选择两个序列特异性核酸结合蛋白及其复合物结合 位点,制备靶向两个结合位点的序列特异性核酸结合蛋白及其复合物,并将其连 接到微球表面,检测目标核酸分子时,只需将两种表面连接序列特异性核酸结合 蛋白及其复合物的微球与待检DNA混合,简单孵育后,即可通过显微镜等工具 观察成对微球的出现。通过计数到待检核酸溶液中成对微球的个数即可获得待检 核酸溶液中目标核酸分子的个数,如果待检核酸溶液中不存在目标核酸分子,则 不会出现成对微球,仅能观察到单分散存在的微球;
图2为选用Cas9/sgRNA复合物作为序列特异性核酸结合蛋白进行目标DNA 分子检测的原理及流程示意图;针对目标核酸分子选择两个Cas9/sgRNA复合物 结合位点,制备靶向两个结合位点的Cas9/sgRNA复合物,并将其连接到微球表 面,检测目标核酸分子时,只需将两种表面连接Cas9/sgRNA复合物的微球与待 检DNA混合,简单孵育后,即可通过显微镜等工具观察成对微球的出现,通过 计数到待检核酸溶液中成对微球的个数即可获得待检核酸溶液中目标核酸分子 的个数,如果待检核酸溶液中不存在目标核酸分子,则不会出现成对微球,仅能 观察到单分散存在的微球;
图3为选用TALE蛋白作为序列特异性核酸结合蛋白进行目标DNA分子检 测的原理及流程示意图;针对目标核酸分子选择两个TALE蛋白结合位点,制备 靶向两个结合位点的TALE蛋白,并将其连接到微球表面。检测目标核酸分子时, 只需将两种表面连接TALE蛋白的微球与待检DNA混合,简单孵育后,即可通 过显微镜等工具观察成对微球的出现,通过计数到待检核酸溶液中成对微球的个 数即可获得待检核酸溶液中目标核酸分子的个数,如果待检核酸溶液中不存在目 标核酸分子,则不会出现成对微球,仅能观察到单分散存在的微球;
图4为选用Cas9/sgRNA复合物作为序列特异性核酸结合蛋白进行目标DNA 分子检测的典型连接方式的示意图;针对目标核酸分子选择两个Cas9/sgRNA复 合物结合位点,制备靶向两个结合位点的sgRNA,这些sgRNA除常规的sgRNA 序列外,在其3′末端额外延长一段序列。合成一段可与sgRNA 3′末端额外延 长序列退火的寡核苷酸并在其末端标记生物素(biotin)(称之为捕获DNA),通 过生物素将捕获DNA连接到链亲和素修饰的磁性微球(如Dynabeads)的表面, 再通过sgRNA 3′末端额外延长序列与捕获DNA的退火将Cas9/sgRNA复合物连 接到磁性微球表面,检测目标核酸分子时,只需将两种表面连接Cas9/sgRNA复 合物的微球与待检DNA混合,简单孵育后,即可通过显微镜等工具观察成对微 球的出现,通过计数到待检核酸溶液中成对微球的个数即可获得待检核酸溶液中 目标核酸分子的个数,如果待检核酸溶液中不存在目标核酸分子,则不会出现成 对微球,仅能观察到单分散存在的微球;
图5为选用TALE蛋白作为序列特异性核酸结合蛋白进行目标DNA分子检 测的典型连接方式的示意图;针对目标核酸分子选择两个TALE蛋白结合位点, 制备靶向两个结合位点的TALE蛋白,这些TALE蛋白除常规的TALE蛋白序列 外,在其C端或N端额外融合表达一段连接序列(linker)及链亲和素结合肽 (streptavidin-binding peptide,SBP)序列,通过SBP将TALE蛋白连接到链亲 和素修饰的磁性微球(如Dynabeads)的表面,检测目标核酸分子时,只需将两 种表面连接TALE蛋白的微球与待检DNA混合,简单孵育后,即可通过显微镜等工具观察成对微球的出现,通过计数到待检核酸溶液中成对微球的个数即可获 得待检核酸溶液中目标核酸分子的个数。如果待检核酸溶液中不存在目标核酸分 子,则不会出现成对微球,仅能观察到单分散存在的微球;
图6为用PABE方法检测HPV18 L1基因片段示意图;图6中分别展示了 HPV18 L1基因片段、Cas9/sgRNA、捕获序列-微球混合;Cas9/sgRNA、捕获序 列-微球混合(对照反应1);以及单独捕获序列-微球(对照反应2)的状态;左 图为显微镜明场拍摄的微球照片,右图为左图调节亮度和对比度后的图片,以便 更清晰地看出视野里的微球状态;箭头指出了视野中的成对微球;
图7为用PABE方法检测HPV18 L1基因片段示意图;图7中分别展示了 HPV18 L1基因片段、Cas9/sgRNA、捕获序列-微球混合后的状态(两个视野); 上图为显微镜明场拍摄的微球照片,下图为上图调节亮度和对比度后的图片,以 便更清晰地看出视野里的微球状态;图片底部展示了一个更加放大的视野,清晰 地显示了单分散微球和成对微球,成对微球为共同结合一个DNA分子后纠缠在 一起的两个微球;箭头指出了视野中的成对微球;
图8为用PABE方法检测HPV18 L1基因片段示意图;图8中展示了HPV18 L1基因片段、Cas9/sgRNA、捕获序列-微球混合后的状态(一个视野)。该图分 别展示了该视野该显微镜明场(左上)、绿色荧光通道(左下)、红色荧光通道(右 下)的图像。说明微球成像可在普通显微镜的明场及两种常用荧光通道下均可观 察成像。右上为明场视野调节亮度和对比度后的图片,以便更清晰地看出视野里 的微球状态。箭头指出了视野中的成对微球。
图9为用PABE方法检测不同浓度的HPV18 L1基因片段示意图;图9中展 示了六个浓度HPV18 L1基因片段下微球状态的一个典型视野,柱状图显示了统 计每个浓度下8个视野中的成对委屈的数量,箭头指出了视野中的成对微球,
图10为用PABE方法检测不同浓度的HPV18 L1基因片段示意图;图10中 展示了浓度为1nM HPV18 L1基因片段下微球状态的一个典型视野,箭头指出 了视野中的成对微球,图中除了大量成对微球外,还出现了不少三个球球连接的 情况,这是由三个微球结合两个DNA分子造成;
图11为用PCR扩增方法制备的两个sgRNA靶点间具有不同间距的靶DNA 电泳图;间距长度从100bp到1000bp,为100bp梯状(ladder)DNA,每种 DNA的两端均带有两个不同的sgRNA靶点序列;
图12为用PABE方法检测不同长度的DNA片段示意图;两靶向HPV18 E6-E7基因的两个sgRNA的DNA靶点序列分别连接到不同长度的DNA片段的 两端,用dCas9/sgRNA进行检测,检测原理如图4所示,其中sgRNA为两种序 列不同的sgRNA,箭头指出了视野中的成对微球;
图13为用PABE方法检测大肠杆菌T7 RNA聚合酶基因片段(PCR扩增产 物)的示意图;用PCR技术从两种细菌的基因组DNA(gDNA)中分别扩增大 肠杆菌T7 RNA聚合酶基因片段,将扩增产物用用dCas9/sgRNA进行检测,检 测原理如图4所示,其中sgRNA为两种序列不同的sgRNA,箭头指出了视野中 的成对微球;
图14为用PABE方法检测大肠杆菌基因组DNA(gDNA)的示意图;将两 种细菌的基因组DNA(gDNA)用dCas9/sgRNA进行检测,检测原理如图4所 示,其中sgRNA为两种序列不同的sgRNA。箭头指出了视野中的成对微球;
图15为用PABE方法检测HPV E6-E7片段的示意图;用靶向HPV16 E6-E7 基因及HPV18 E6-E7基因的dCas9/sgRNA检测从HeLa及SiHa细胞gDNA中扩 增的HPV E6-E7基因片段,检测原理如图4所示,其中sgRNA为两种序列不同 的sgRNA,箭头指出了视野中的成对微球;
图16为用PABE方法检测人宫颈癌细胞基因组DNA(gDNA)的示意图; 将人宫颈癌细胞株HeLa的基因组DNA(gDNA)用靶向HPV16 E6-E7基因及 HPV18 E6-E7基因的dCas9/sgRNA进行检测,检测原理如图4所示,其中sgRNA 为两种序列不同的sgRNA,箭头指出了视野中的成对微球;
图17为用PABE方法检测人宫颈癌细胞基因组DNA(gDNA)的示意图; 将人宫颈癌细胞株SiHa的基因组DNA(gDNA)用靶向HPV16E6-E7基因及 HPV18 E6-E7基因的dCas9/sgRNA进行检测,检测原理如图4所示,其中sgRNA 为两种序列不同的sgRNA,箭头指出了视野中的成对微球;
图18为用PABE方法检测人宫颈癌细胞基因组DNA(gDNA)的示意图; 将人宫颈癌细胞株C-33a的基因组DNA(gDNA)用靶向HPV16 E6-E7基因及 HPV18 E6-E7基因的dCas9/sgRNA进行检测,检测原理如图4所示,其中sgRNA 为两种序列不同的sgRNA,箭头指出了视野中的成对微球;
图19为用PABE方法检测植物细胞基因组DNA(gDNA)的示意图;将来 自转基因及非转基因植物的基因组DNA(gDNA)用靶向转基因NOS终止子序 列的两个sgRNA(NOSterminator 1;NOS terminator 1;表2)检测及HPV18E6-E7 基因的dCas9/sgRNA进行检测,检测原理如图4所示,其中sgRNA为两种序列 不同的sgRNA,箭头指出了视野中的成对微球;
图20为用基于TALE-SBP蛋白的PABE方法检测人宫颈癌细胞基因组DNA (gDNA)的示意图;将人宫颈癌细胞株HeLa的基因组DNA(gDNA)用靶向 HPV16 E6-E7基因及HPV18 E6-E7基因的dCas9/sgRNA进行检测,检测原理如 图5所示,其中sgRNA为两种序列不同的sgRNA,箭头指出了视野中的成对微 球;
图21为用TALE-SBP蛋白的PABE方法检测人宫颈癌细胞基因组DNA (gDNA)的示意图;将人宫颈癌细胞株SiHa的基因组DNA(gDNA)用靶向 HPV16 E6-E7基因及HPV18 E6-E7基因的dCas9/sgRNA进行检测,检测原理如 图5所示,其中sgRNA为两种序列不同的sgRNA,箭头指出了视野中的成对微 球;
图22为用TALE-SBP蛋白的PABE方法检测人宫颈癌细胞基因组DNA (gDNA)的示意图;将人宫颈癌细胞株C-33a的基因组DNA(gDNA)用靶向 HPV16 E6-E7基因及HPV18 E6-E7基因的dCas9/sgRNA进行检测,检测原理如 图5所示,其中sgRNA为两种序列不同的sgRNA,箭头指出了视野中的成对微 球。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 用PABE方法检测HPV18 L1基因片段
CRISPR核酸酶复合物Cas9/sgRNA是目前用于靶向结合特定核酸序列的序 列特异性DNA或RNA结合蛋白,因此可用于本发明的PABE检测中,检测原 理如图2所示。在本实施例1及实施例2~7中采用给sgRNA的3′末端增加一段 可与微球表面固定的捕获序列退火杂交的序列的方式,实现基于Cas9/sgRNA的 PABE检测(图4)。
实验方法:
HPV18 L1基因上Cas9/sgRNA结合位点的选择:设计两个HPV18 L1基因 特异的sgRNA靶点,两个靶点的序列及其PAM序列分别为:5′-GCA TCA TAT TGC CCA GGT ACA GG-3′(HPV18L1-1;表2)和5′-AAA CCA AAT TTA TTT GGG TCA GG-3′(HPV18L1-2;表2)。两个靶点之间的距离为839bp。针对两个 靶点合成体外转录法制备sgRNA的双链DNA(dsDNA)模板。
体外转录法制备sgRNA:根据T7聚合酶(New England Biolabs)的使用说 明,用T7聚合酶通过体外转录合成sgRNA。使用表1中(SEQ IDNO.1-19)列 出的寡核苷酸经过三次PCR扩增出sgRNA的DNA模板。用F1和R(7个循环) 进行第一次PCR(PCR1)。用第一次PCR的产物作为模板,F2和sgR1作为引 物进行第二次PCR(30个循环)(PCR2);用第二PCR的产物作为模板,F3和 sgR1作为引物进行第三次PCR(30个循环)(PCR3)。PCR1反应体系(50μL) 为:HS(Premix;#R040A;Takara)、200pM F1(表3)、200pM R(表3)。PCR1反应程序为:95℃3分钟;5~10个循环:95℃20秒,58℃15 秒和72℃40秒;72℃5分钟。PCR2反应体系(50μL)为:HS (Premix;#R040A;Takara)、200pM F2(表3)、200pM sgR1(表3)、5~10ng (2μl)PCR1反应产物。PCR2反应程序为:95℃3分钟;25个循环:95℃20 秒,58℃15秒和72℃40秒;72℃5分钟。PCR3反应体系为: HS(Premix;#R040A;Takara)、200pM F3(表3)、200pM sgR1(表3)、5~10 ng(2μl)PCR2反应产物。PCR3反应程序为:95℃3分钟;28~30个循环:95℃ 20秒,58℃15秒和72℃40秒;72℃5分钟。PCR程序均在PCR仪Mastercycler Pro(Eppendorf)上进行。PCR1及PCR2反应结束后,将反应液进行琼脂糖凝 胶电泳,切胶回收后定量,之后用于下一轮PCR的模板。PCR3的产物进行琼脂 糖凝胶电泳,切胶回收后定量,作为体外转录的模板。将纯化后的sgRNA模板 用T7 RNA聚合酶(NewEngland Biolabs)在37℃孵育过夜进行体外转录。转录 反应体系(20μL)为:1μL T7 RNA聚合酶(M0251S;NEB)、2μL 10×T7 RNA 聚合酶缓冲液(NEB)、1μL rNTP(NEB)、10μL(约200~1000ng)DNA模板、 6μL ddH2O(RNase Free)。将体外转录的RNA与Trizol溶液混合,然后用氯仿 和异丙醇依次萃取,用乙醇沉淀。将纯化的RNA溶解在无RNase的ddH2O中, 并通过光谱法进行定量。本实验中在常规sgRNA序列的3′末端额外延长一段序 列:5′-CGG AAC CTTACG AAT ACC AGA TGC-3′(sgRNA1-tag;表4)。
用PCR制备HPV18L1基因片段:通过PCR扩增制备HPV18的L1基因片 段。用含有HPV18全长L1基因序列的质粒DNA作为模板,PCR扩增出的L1 基因片段。PCR引物为HPV18L1-F和HPV18L1-R引物(表1)。PCR反应体系 (50μL):HS(Premix;#R040A;Takara)、10pmol HPV18L1-F、 10pmol HPV18L1-R和10ng pMD19-HPV18质粒。PCR程序如下:95℃5分钟; 30个循环:95℃15秒,58℃15秒和72℃60秒;72℃5分钟。用1.5%琼脂 糖凝胶对PCR产物进行电泳检测,用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒(Axygen) 回收L1片段。纯化的L1片段用NanoDrop(Thermo)定量。然后将纯化的L1 片段作为用本发明技术检测的靶DNA。用PCR制备的HPV18 L1基因片段的长 度为:900bp。
捕获微球的制备:生物素修饰捕获序列(5′-biotin-TTT TTT TGC ATC TGG TATTCG TAA GGT TCC G-3′;Capture Sequence 1;表4)连接磁珠,制备成带 有捕获序列的捕获磁珠。取0.3μL(3μg)链亲和素包被微球(DynabeadsTMM-280 Streptavidin,ThermoFisher),使用50μL含0.5%BSA的PBS清洗三遍后,加入 1μL(10μM)生物素修饰捕获序列,室温孵育10分钟,再次使用50μL含0.5% BSA的PBS清洗3遍后,将微球转入新管;将磁珠悬浮于50μL含0.5%BSA 的PBS中。取15μL上述磁珠滴加到载玻片上,盖上盖玻片,在显微镜下观察 拍照,作为阴性对照。
用Cas9/sgRNA结合HPV L1基因片段:重组Cas9蛋白购自NEB。Cas9反 应(30μL)由1×Cas9核酸酶反应缓冲液,1μM Cas9核酸酶(NEB),300nM sgRNA1(HPV18L1-1;表2)、300nMsgRNA(HPV18L1-2;表2),以及0.5μL RNA酶抑制剂(Thermo)。室温温育5分钟(该过程在下文中称为预组装)。将 与上述溶液与100ng DNA(2μL)(上述PCR扩增制备的HPV18 L1基因片段) 混合(32μL),在室温下孵育5分钟。取15μL表面带有捕获序列的链亲和素微 球,磁分离去除上清液(PBS),将上述Cas9/sgRNA与靶DNA的反应液(32μL) 与微球混合,使用1×Cas9核酸酶反应缓冲液补足到50μL,室温孵育5分钟。 取15μL反应液滴加到载玻片上,盖上盖玻片,在显微镜下观察拍照。按相同的 程序同步做一管对照反应,该对照反应中不加靶DNA,作为考察Cas9/sgRNA 对微球单分散性影响的对照。
实验结果:
通过对一个检测反应和两个对照反应的显微观察。发现在含有靶DNA的检 测反应中,出现紧密成对微球(paired beads)(图6、图7),而在两个对照反应 中,未出现紧密成对微球,仅有呈单分散微球(single beads)(图6、图7)。这 一结果符合实验预期,即两种Cas9/sgRNA复合物分别与靶DNA上的两个sgRNA 结合位点结合,sgRNA上的额外延长序列与微球表面的捕获序列杂交,从而将 两个微球拉近,形成紧密成对微球。而当无靶DNA存在时,微球无法相互靠近, 呈单分散分布。对照实验还表明,检测体系中的Cas9/sgRNA对微球单分散性没 有影响(图6)。进一步说明紧密成对微球是由微球、靶DNA及Cas9/sgRNA三 者间的结合造成的(图6、图7)。也就是说紧密成对微球的有无与多少,反映了 检测体系中靶DNA分子的有无及多少。更重要的是,一对紧密成对微球至少对 应一个靶DNA。
此外,观察到本实验中所用的磁性微球(Dynabeads)不仅在普通光学显微 镜的明场中观察拍照,也可以在荧光显微镜的两个常用通道,即绿色荧光通道和 红色荧光通道中可观察拍照(图8)。说明借助常用显微设备就可以进行本发明 检测结果的记录,无需依赖复杂昂贵设备。
基于上述原理和对应关系,本发明提出的核酸检测技术实现了对靶DNA分 子的可视化(visible)、数字化(digital)检测。这在核酸检测的历史上还未曾实 现过。此外,该检测过程中,未对靶DNA进行传统核酸检测技术中的核酸杂交、 扩增等处理,实现对DNA样品中靶DNA分子的高保真(high-fidelity)检测。 此外,本实验中虽然使用了具有DNA双链切割能力的Cas9核酸酶,但检测发 现Cas9/sgRNA结合靶DNA后,即使切割了靶DNA,但切割后的DNA并未在 切点处分离,而是仍联系在一起,才形成紧密成对微球,这与其他实验中观察到 的Cas9/sgRNA与DNA的互作特性相同(Nature 2014,507:62-67)。说明本实验 中紧密成对微球的出现是两个Cas9/sgRNA复合物与一个靶DNA的互作造成的。
实施例2 用PABE方法定量检测HPV18 L1基因片段
实验方法:
HPV18 L1基因上Cas9/sgRNA结合位点的选择:同实施例1。
体外转录法制备sgRNA:同实施例1。
用PCR制备HPV L1基因片段:同实施例1。
捕获微球的制备:同实施例1。
用dCas9/sgRNA结合HPV L1基因片段:重组dCas9蛋白购自金斯瑞 (GeneScript,南京)。dCas9反应(30μL)由1×dCas9反应缓冲液(组分同NEB Cas9核酸酶反应缓冲液),1μMdCas9(GeneScript),300nM sgRNA1 (HPV18L1-1;表2)、300nM sgRNA(HPV18L1-2;表2),以及0.5μL RNA 酶抑制剂(Thermo)。室温温育5分钟(该过程在下文中称为预组装)。将与上述溶液与不同质量(ng)的DNA(2μL)(上述PCR扩增制备的HPV18 L1基 因片段)混合(32μL),在室温下孵育5分钟。取15μL表面带有捕获序列的链 亲和素微球,磁分离去除上清液(PBS),将上述Cas9/sgRNA与靶DNA的反应 液(32μL)与微球混合,使用1×Cas9核酸酶反应缓冲液补足到60μL,室温孵 育5分钟。将反应液全部(60μL)全部转移到96孔板孔中,在倒置显微镜下观 察拍照。
实验结果:
通过对不同浓度HPV18 L1基因片段反应的显微观察。发现在含有1nM靶 DNA的检测反应中,紧密成对微球的数量最多(图9、图10),1nM靶DNA之 下,随着靶DNA浓度的降低,视野中紧密成对微球的数量逐渐减少;但直至最 低浓度1pM,仍有紧密成对微球;说明在该实施例检测中,PABE方法的检测灵 敏度已达1pM。当浓度高于1nM时,视野中紧密成对微球的数量却急剧减少。 经分析之后,当靶DNA浓度越高时,一个DNA分子上的两个sgRNA被一个磁 珠上的捕获探针结合的概率越高,因为在实施例1和本实施例中,使用了带有一 种延长序列的sgRNA和带有一种捕获序列的磁珠。因为一个磁珠上含有不止一 个捕获序列,一个磁珠上的两个捕获序列则可能结合一个DNA分子上的两个 sgRNA。这种情况下,靶DNA浓度越高,两个磁珠结合一个DNA分子的可能 性越小。
为了解决这一问题,通过设计了具有另一种3′延长序列(5′-CAA TCG GGC CGACGG CAA ACA TAC-3′;sgRNA2;表4)的sgRNA以及与之序列互补的捕 获序列(5′-Biotin-TTT TTT TGT ATG TTT GCC GTC GGC CCG ATT G-3′;即 Capture Sequence 2;表4)。针对靶DNA上的两个sgRNA靶点,分别制备了带 有两种不同3′延长序列的sgRNA,用两种sgRNA与dCas9蛋白预组装成两种 dCas9/sgRNA复合物。同时,用两种不同的捕获序列分别偶联一份链亲和素-磁 珠,制备成两种带有捕获序列的磁珠。检测靶DNA时,同时加入上述两种dCas9/sgRNA复合物和两种捕获序列-磁珠,则一个DNA分子上的两个sgRNA 靶点分别结合两种dCas9/sgRNA复合物,两种dCas9/sgRNA复合物分别结合两 种磁珠,避免与一个DNA分子结合的两个dCas9/sgRNA复合物与一个磁珠结合 的可能。依此原理进行了本发明中的其他实施例的实验。
实施例3 用PABE方法检测具有不同sgRNA靶点间距的靶DNA片段
实验方法:
体外转录法制备sgRNA:按实施例1的操作方法分别制备sgRNA1和 sgRNA2。制备针对靶DNA的sgRNA1时,使用F1、R、F2、F3、sgR1寡核酸 进行3轮PCR扩增制备sgRNA1转录模板。制备针对靶DNA的sgRNA2时,使 用F1、R、F2、F3、sgR2寡核酸进行3轮PCR扩增制备sgRNA2转录模板。PCR 反应体系及反应程序同实施例1。
靶DNA片段制备:合成两条分别带有两种sgRNA靶点序列和10bp的游离 碱基,所使用的引物中,上游引物为固定序列,在5′端带有HPV18-E6-E7-1的 目标序列(Ladder-F;表1);下游引物在5′端带有HPV18-E6-E7-2的目标序列 (Ladder-R100~100;表1)。下游引物的劽结构为 5′-GCCCAGTACAcgagcaattaagcgactcagaggN23-3′;小写序列表示sgRNA-PAM序列,其中N23表示根据要扩增的目标序列(本实施例中为pEGFP-C1载体序列) 每隔100bp设计的特异序列,共计10个下游引物(Ladder-F;表1);用这些引 物PCR扩增具有不同长度的DNA片段,制备成两端带有两个相同sgRNA靶点 的不同长度的DNA片段,作为本实施例中研究sgRNA靶点间距对PABE检测 技术影响的靶DNA。PCR模板序列来自pEGFP-C1载体(扩增对象为该载体上 的CMV-EGFP序列;Clontech)。PCR反应体系(50μL):HS(Premix;#R040A;Takara)、10pmol Ladder-F、10pmol Ladder-R和10ng pEGFP-C1质粒DNA。PCR程序如下:95℃5分钟;30个循环:95℃15秒, 58℃15秒和72℃60秒;72℃5分钟。用1.5%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电 泳检测,用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒(Axygen)回收L1片段。纯化的靶 DNA片段用NanoDrop(Thermo)定量。制备间隔50bp的靶DNA时,将两条 寡核苷酸(Ladder-F50、Ladder-R50;表1)退火后使用DNA聚合酶进行反向延 伸,反应体系(50μL)为:HS(Premix;#R040A;Takara)、100 pmol Ladder-F50及100pmol Ladder-R50。反应程序如下:95℃5分钟;15个循 环:95℃15秒,68℃60秒;72℃3分钟;反向延伸的产物使用PCR clean试 剂盒(Axygen)回收备用,纯化的靶DNA片段用NanoDrop(Thermo)定量。
捕获微球的制备:连接操作同实施例1。分别用两种生物素修饰的捕获序列(Capture Sequence 1、Capture Sequence 2;表4)连接两份磁珠,制备成带有不 同捕获序列的两种捕获磁珠。
用dCas9/sgRNA结合不同长度靶DNA片段:重组dCas9蛋白购自金斯瑞(GeneScript,南京)。dCas9反应(30μL)由1×dCas9反应缓冲液(组分同NEB Cas9核酸酶反应缓冲液),1μM dCas9(GeneScript),300nM sgRNA1(表2)、 300nM sgRNA2(表2),以及0.5μL RNA酶抑制剂(Thermo)。室温温育5分 钟(该过程为预组装)。将与上述溶液与不同长度的靶DNA(100ng;2μL)混 合(32μL),在室温下孵育5分钟。取15μL表面带有捕获序列的链亲和素微球, 磁分离去除上清液(PBS),将上述Cas9/sgRNA与靶DNA的反应液(32μL) 与微球混合,使用1×Cas9核酸酶反应缓冲液补足到60μL,室温孵育5分钟。 将反应液全部(60μL)全部转移到96孔板孔中,在倒置显微镜下观察拍照。
实验结果:
通过设计特定PCR引物(Ladder-F、Ladder-R100~100;表1)扩增pEGFP-C1 载体序列,制备成两sgRNA靶点间不同间隔长度的靶DNA。间隔50bp的靶 DNA直接退火两寡核苷酸形成。电泳结果显示,成功制备不同长度靶DNA(图 11)。
通过对不同长度靶DNA片段反应的显微观察。发现在含有不同长度 (50-1000bp)靶DNA的检测反应中,均出现紧密成对微球(图12A-图12K)。 直至最短间距(50bp)的靶DNA,仍有紧密成对微球。说明靶DNA上两个sgRNA 靶点间的间距对PABE检测没有显著影响,均可以实现PABE检测。这种情况 对sgRNA的设计非常有利。
实施例4 用PABE方法检测细菌基因组DNA
实验方法:
体外转录法制备sgRNA:根据T7 RNA聚合酶设计两个sgRNA(T7 RNA Pol-1、T7 RNAPol-2;表2);按实施例3的操作方法分别制备sgRNA1和sgRNA2 (表3)。使用的寡核苷酸如表3中所示。
大肠杆菌基因组DNA(gDNA)制备:用细菌总DNA提取试剂盒(天根公 司)说明提取大肠杆菌DH5α和BL21的gDNA。纯化的大肠杆菌gDNA用 NanoDrop(Thermo)定量。
用PCR制备T7 RNA聚合酶基因片段:以大肠杆菌BL21及DH5α的基因 组DNA(gDNA)为模板,用T7 RNA聚合酶基因特异的一对PCR引物(T7 RNA Pol-F、T7 RNA Pol-R;表1)扩增T7 RNA聚合酶基因片段。PCR反应体系(50 μL):HS(Premix;#R040A;Takara)、10pmol T7 RNA Pol-F、 10pmol T7 RNA Pol-R和10ng大肠杆菌BL21或DH5αgDNA。PCR程序如下: 95℃10分钟;30个循环:95℃15秒,60℃15秒和72℃60秒;72℃8分钟。 用1.5%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测,用AxyPrep DNA凝胶提取试剂 盒(Axygen)回收T7 RNA Pol片段。纯化的T7 RNA聚合酶基因片段用NanoDrop (Thermo)定量。
捕获微球的制备:同实施例3。
用dCas9/sgRNA检测T7 RNA聚合酶基因片段:重组dCas9蛋白购自金斯 瑞(GeneScript,南京)。dCas9反应(30μL)由1×dCas9反应缓冲液(组分同 NEB Cas9核酸酶反应缓冲液),1μM dCas9(GeneScript),300nM sgRNA1(表 2)、300nM sgRNA2(表2),以及0.5μL RNA酶抑制剂(Thermo)。室温温育5 分钟(该过程在下文中称为预组装)。将与上述溶液与T7 RNA聚合酶基因片段 (100ng;2μL)混合(32μL),在室温下孵育5分钟。取15μL表面带有捕获 序列的链亲和素微球,磁分离去除上清液(PBS),将上述Cas9/sgRNA与靶DNA 的反应液(32μL)与微球混合,使用1×Cas9核酸酶反应缓冲液补足到60μL, 室温孵育5分钟。将反应液全部(60μL)全部转移到96孔板孔中,在倒置显微 镜下观察拍照。
用dCas9/sgRNA检测大肠杆菌gDNA:重组dCas9蛋白购自金斯瑞 (GeneScript,南京)。dCas9反应(30μL)由1×dCas9反应缓冲液(组分同NEB Cas9核酸酶反应缓冲液),1μMdCas9(GeneScript),300nM sgRNA1(表2)、300nM sgRNA2(表2),以及0.5μL RNA酶抑制剂(Thermo)。室温温育5分 钟(该为预组装)。将与上述溶液与不同大肠杆菌的gDNA(100ng;2μL)混合 (32μL),在室温下孵育5分钟。取15μL表面带有捕获序列的链亲和素微球, 磁分离去除上清液(PBS),将上述Cas9/sgRNA与靶DNA的反应液(32μL) 与微球混合,使用1×Cas9核酸酶反应缓冲液补足到60μL,室温孵育5分钟。 将反应液全部(60μL)全部转移到96孔板孔中,在倒置显微镜下观察拍照。
实验结果:
本实施例中,首先用PABE方法检测了T7 RNA聚合酶基因的扩增片段,结 果表明以大肠杆菌BL1基因组DNA为模板的T7 RNA聚合酶基因片段PCR扩 增产物中检测出T7 RNA聚合酶基因(图13),而在大肠杆菌DH5α基因组DNA 为模板的T7 RNA聚合酶基因片段PCR扩增产物中未检测出T7 RNA聚合酶基 因(图13)。这与大肠杆菌BL1基因组DNA中含有T7 RNA聚合酶基因,而大 肠杆菌DH5α基因组DNA中无T7 RNA聚合酶基因的事实相符合。大肠杆菌BL1与DH5α为生化试验中常用的两种工程菌,BL1为外源基因表达菌,含有T7 RNA 聚合酶基因,可表达T7 RNA聚合酶;而DH5α为外源基因质粒扩增菌,不含有 T7 RNA聚合酶基因,不表达T7 RNA聚合酶。
本实施例之后用PABE方法直接检测了大肠杆菌BL1及DH5α的基因组 DNA。仍然使用检测T7RNA聚合酶基因的sgRNA。结果表明在含有大肠杆菌 BL1基因组DNA的反应中出现大量紧密成对微球(图14),而在含有大肠杆菌 DH5α基因组DNA的反应中未出现紧密成对微球(图14)。检测结果与上面使 用T7RNA聚合酶基因扩增片段的检测结果一致,也与上面的两种菌的基因组特 征陈述一致。本实验说明PABE方法可直接检测细菌基因组DNA中的靶序列, 无需扩增、杂交等繁杂程序。细菌基因组DNA的大小接近400万个碱基对(bp), 相对于PCR扩增的T7RNA聚合酶基因片段,是一个高度复杂的DNA样品,说 明PABE方法可从细菌复杂的基因组DNA中高灵敏快速检测出目标DNA,也说 明PABE方法可用于微生物快速检测。这在医疗、食品、环境、军工等领域具有 重要应用价值。
实施例4 用PABE方法检测HPV E6-E7基因片段
实验方法:
体外转录法制备sgRNA:根据HPV16及HPV18的E6-E7基因分别设计一 对sgRNA(HPV16E6-E7-1、HPV16E6-E7-2;HPV18E6-E7-1、HPV18E6-E7-2; 表2);为了检测E6-E7基因,将一个sgRNA靶点设计在E6基因上,而将另一 个sgRNA靶点设计在E7基因上。按实施例3的操作方法分别制备sgRNA1和sgRNA2。使用的寡核苷酸如表3中所示。
人宫颈癌细胞基因组DNA(gDNA)制备:用动物细胞基因组DNA试剂盒 (天根公司)说明提取人宫颈癌细胞HeLa及SiHa的gDNA。纯化的人宫颈癌 细胞gDNA用NanoDrop(Thermo)定量。
用PCR制备HPV E6-E7基因片段:以HeLa及SiHa的gDNA的基因组DNA (gDNA)为模板,用HPV E6-E7特异的一对通用PCR引物(HPV E6-E7-F、 HPV E6-E7-R;表1)扩增HPV E6-E7基因片段。PCR反应体系(50μL): HS(Premix;#R040A;Takara)、10pmolHPV E6-E7-F、10pmol HPV E6-E7-R和10ng HeLa或SiHa细胞gDNA。PCR程序如下:95℃10分钟; 30个循环:95℃15秒,58℃15秒和72℃60秒;72℃8分钟。用1.5%琼脂 糖凝胶对PCR产物进行电泳检测,用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒(Axygen) 回收HPV E6-E7基因片段。纯化的HPV E6-E7基因片段用NanoDrop(Thermo) 定量。
捕获微球的制备:同实施例3。
用dCas9/sgRNA检测人宫颈癌细胞gDNA:重组dCas9蛋白购自金斯瑞(GeneScript,南京)。dCas9反应(30μL)由1×dCas9反应缓冲液(组分同NEB Cas9核酸酶反应缓冲液),1μM dCas9(GeneScript),300nM sgRNA1(表2)、 300nM sgRNA2(表2),以及0.5μL RNA酶抑制剂(Thermo)。室温温育5分 钟(该过程为预组装)。将与上述溶液与HeLa及SiHa基因组中扩增的HPV E6-E7 基因片段(100ng;2μL)混合(32μL),在室温下孵育5分钟。取15μL表面 带有捕获序列的链亲和素微球,磁分离去除上清液(PBS),将上述Cas9/sgRNA 与靶DNA的反应液(32μL)与微球混合,使用1×Cas9核酸酶反应缓冲液补足 到60μL,室温孵育5分钟。将反应液全部(60μL)全部转移到96孔板孔中, 在倒置显微镜下观察拍照。
实验结果:
本实施例中,用PABE方法检测了HPV E6-E7基因片段扩增产物,结果表 明从HeLa基因组扩增的HPV E6-E7基因片段产物中检测出HPV18E6-E7基因 (图15),而从SiHa基因组扩增的HPV E6-E7基因片段产物中检测出HPV16 E6-E7基因(图15)。这与人宫颈癌细胞HeLa是HPV18阳性细胞、人宫颈癌细 胞SiHa是HPV16阳性细胞的报道是相符合的,说明PABE技术可特异性检测 不同HPV亚型的E6-E7基因。
实施例6 用PABE方法检测哺乳动物细胞基因组DNA
本实施例中用PABE方法检测了人宫颈癌细胞基因组DNA中的HPV16及HPV18E6-E7基因。
实验方法:
体外转录法制备sgRNA:根据HPV16及HPV18的E6-E7基因分别设计两 个sgRNA(HPV16E6-E7-1、HPV16E6-E7-2;HPV18E6-E7-1、HPV18E6-E7-2; 表2);按实施例1的操作方法分别制备sgRNA1和sgRNA2。使用的寡核苷酸如 表3中所示。
人宫颈癌细胞基因组DNA(gDNA)制备:用动物细胞基因组DNA试剂盒 (天根公司)说明提取人宫颈癌细胞HeLa、SiHa及C-33a的gDNA。纯化的人 宫颈癌细胞gDNA用NanoDrop(Thermo)定量。
捕获微球的制备:同实施例3。
用dCas9/sgRNA检测人宫颈癌细胞gDNA:重组dCas9蛋白购自金斯瑞(GeneScript,南京)。dCas9反应(30μL)由1×dCas9反应缓冲液(组分同NEB Cas9核酸酶反应缓冲液),1μM dCas9(GeneScript),300nM sgRNA1(表2)、 300nM sgRNA2(表2),以及0.5μL RNA酶抑制剂(Thermo)。室温温育5分 钟(该过程为预组装)。将与上述溶液与不同人宫颈癌细胞的gDNA(100ng;2 μL)混合(32μL),在室温下孵育5分钟。取15μL表面带有捕获序列的链亲和 素微球,磁分离去除上清液(PBS),将上述Cas9/sgRNA与靶DNA的反应液(32 μL)与微球混合,使用1×Cas9核酸酶反应缓冲液补足到60μL,室温孵育5分 钟。将反应液全部(60μL)全部转移到96孔板孔中,在倒置显微镜下观察拍照。
实验结果:
通过对不同人宫颈癌细胞的gDNA反应的显微观察。发现在含有人宫颈癌 细胞HeLa gDNA和HPV18 sgRNA的反应中出现紧密成对微球(图16)、在含 有人宫颈癌细胞SiHagDNA和HPV16 sgRNA的反应中出现紧密成对微球(图 17)。而在其他反应中均未出现紧密成对微球(图16、图17、图18)。这与人宫 颈癌细胞HeLa是HPV18阳性细胞、人宫颈癌细胞SiHa是HPV16阳性细胞, 而人宫颈癌细胞C-33a是HPV阴性细胞的报道是相符合的,说明PABE技术可 高灵敏快速检测哺乳动物细胞基因组DNA中的靶序列,无需依赖于目前检测中 所依赖的核酸扩增、杂交等繁杂程序。
哺乳动物细胞基因组DNA是高度复杂的DNA样品,从这样复杂的DNA样 品环境中,使用微量DNA样品(100ng)无扩增高灵敏快速检测出靶序列是很 难的,是目前现有的核酸检测技术从未实现的。可见PABE方法的优越性。哺乳 动物细胞基因组DNA等真核生物基因DNA是医学、农业检测中必然面临的 DNA样品。本实施例检测说明PABE方法在临床医学检测、农业检测中具有重 要应用价值。
实施例7 用PABE方法检测植物细胞基因组DNA
本实施例中用PABE方法检测了植物基因组DNA中的转基因元件——NOS 终止子序列。
实验方法:
体外转录法制备sgRNA:根据NOS终止子序列设计一对sgRNA(NOS terminator-1、NOS terminator-2;表2);按实施例1的操作方法分别制备sgRNA1 和sgRNA2。使用的寡核苷酸如表3中所示。
植物细胞基因组DNA(gDNA)制备:用植物细胞基因组DNA试剂盒(天 根公司)说明提取植物细胞gDNA。纯化的植物gDNA用NanoDrop(Thermo) 定量。
捕获微球的制备:同实施例3。
用dCas9/sgRNA检测人宫颈癌细胞gDNA:重组dCas9蛋白购自金斯瑞(GeneScript,南京)。dCas9反应(30μL)由1×dCas9反应缓冲液(组分同NEB Cas9核酸酶反应缓冲液),1μM dCas9(GeneScript),300nM sgRNA1(表2)、 300nM sgRNA2(表2),以及0.5μL RNA酶抑制剂(Thermo)。室温温育5分 钟(该过程为预组装)。将与上述溶液与不同植物细胞的gDNA(100ng;2μL) 混合(32μL),在室温下孵育5分钟。取15μL表面带有捕获序列的链亲和素微 球,磁分离去除上清液(PBS),将上述Cas9/sgRNA与靶DNA的反应液(32μL) 与微球混合,使用1×Cas9核酸酶反应缓冲液补足到60μL,室温孵育5分钟。 将反应液全部(60μL)全部转移到96孔板孔中,在倒置显微镜下观察拍照。
实验结果:
通过对植物细胞的gDNA反应的显微观察。发现在含有转基因植物细胞 gDNA的反应中出现紧密成对微球(图19),而含有非转基因植物细胞gDNA 的反应中未出现紧密成对微球(图19)。说明PABE技术可高灵敏快速检测植物 细胞基因组DNA中的靶序列,无需依赖于目前检测中所依赖的核酸扩增、杂交 等程序。
植物细胞基因组DNA也是高度复杂的DNA样品,从这样复杂的DNA样品 环境中,使用微量DNA样品(100ng)无扩增高灵敏快速检测出靶序列也是很 困难的,是目前现有的核酸检测技术从未实现的。可见PABE方法的优越性。植 物细胞基因组DNA是农业、食品检测中必然面临的DNA样品。本实施例检测 说明PABE方法在农业、食品检测中具有重要应用价值。
实施例8 用基于TALE蛋白的PABE方法检测哺乳动物细胞基因组DNA
TALE是一种很好的序列特异性DNA结合蛋白,可用于本发明的PABE检 测中,检测原理如图3所示。在本实例中我们采用给TALE蛋白融合一个链亲和 素结合肽(SBP)的连接方式,将TALE蛋白用于PABE检测(图5)。本实施例 中用基于TALE蛋白的PABE方法检测了人宫颈癌细胞基因组DNA中的HPV16 及HPV18E6-E7基因。
实验方法:
TALE蛋白真核表达载体制备:先构建一个编码TALE恒定N端序列和恒定 C端序列的TALE骨架载体,并在该骨架载体的恒定N端及C端编码序列间留 好TALE可变序列(即与1个碱基结合的13个氨基酸编码序列)的插入位点; 此外在TALE骨架载体的恒定C端编码序列后融合连接子(如GS linker)及链 亲和素结合肽(SBP)编码序列,在SBP编码序列后融入一个终止密码子。用该 TALE骨架载体再进一步构建靶向特定序列的全长TALE-SBP融合蛋白表达载体 (即TALE-SBP表达载体)如本实施例中构建了靶向HPV18及HPV16E6-E7基 因的TALE-SBP蛋白表达载体。TALE-SBP基因的表达受上游CMV启动子的控 制。使用原核启动子如T7启动子,也可以将TALE-SBP蛋白表达载体构建成原 核表达载体。
TALE蛋白表达及分离:将TALE-SBP蛋白表达载体用脂质体转入293T细 胞,转染24小时后,用非变性裂解液裂解细胞,获得全细胞裂解物。将链霉亲 和素-磁珠加入全细胞裂解物中,孵育1小时。之后磁分离磁珠并用PBS/Tween20 溶液洗涤磁珠两次。将“TALE-SBP蛋白-链霉亲和素-磁珠”(简称“TALE磁珠”) 溶于PBS中保存备用。
人宫颈癌细胞基因组DNA(gDNA)制备:用动物细胞基因组DNA试剂盒 (天根公司)说明提取人宫颈癌细胞HeLa、SiHa及C-33a的gDNA。纯化的人 宫颈癌细胞gDNA用NanoDrop(Thermo)定量。
用TALE-SBP检测人宫颈癌细胞gDNA:将TALE磁珠与不同人宫颈癌细胞 的gDNA(100ng)混合与60μL DNA结合缓冲液中,在室温下孵育5分钟。将 反应液全部(60μL)全部转移到96孔板孔中,在倒置显微镜下观察拍照。
实验结果:
通过对不同人宫颈癌细胞的gDNA反应的显微观察。发现在含有人宫颈癌 细胞HeLa gDNA和HPV18 sgRNA的反应中出现紧密成对微球(图20)、在含 有人宫颈癌细胞SiHagDNA和HPV16 sgRNA的反应中出现紧密成对微球SiHa (图21)。而在其他反应中均未出现紧密成对微球(图20、21、22)。这与人宫 颈癌细胞HeLa是HPV18阳性细胞、人宫颈癌细胞SiHa是HPV16阳性细胞, 而人宫颈癌细胞C-33a是HPV阴性细胞的报道是相符合的,说明基于TALE-SBP 的PABE技术如实施例1~7中使用的基于Cas9/sgRNA及dCas9/sgRNA的PABE 技术一样,也可以高灵敏快速检测哺乳动物细胞基因组DNA中的靶序列,无需 依赖于目前检测中所依赖的核酸扩增、杂交等繁杂程序。
表1 PCR引物(用于PCR扩增制备靶DNA片段)
表2 sgRNA靶点-PAM序列(sgRNA序列同PAM序列前的20bp序列)
表3 用于制备sgRNA的体外转录模板的寡核苷酸
表4 制备捕获磁珠的生物素修饰捕获序列及其对应的sgRNA 3′端延长序列
序列表
<110> 东南大学
<120> 一种基于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检测和分型的方法及其应用
<160> 57
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taccaatata gagtatttag ggt 23
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ttcctcaaca tgtctgctat ac 22
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aagggmgtaa ccgaaawcgg t 21
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gtgcgcggaa gtgctgcaac cgagcacgac aggagtacat ctacgtatta gtcatc 56
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gcccagtaca cgagcaatta agcgactcag aggttggaaa tccccgtgag tcaaac 56
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gcccagtaca cgagcaatta agcgactcag aggtcgccct tgctcaccat ggtggc 56
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gcccagtaca cgagcaatta agcgactcag aggtgaagca ctgcacgccg taggtc 56
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gcccagtaca cgagcaatta agcgactcag aggttgccgt cgtccttgaa gaagat 56
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gcccagtaca cgagcaatta agcgactcag aggccccagg atgttgccgt cctcct 56
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gcccagtaca cgagcaatta agcgactcag aggcgatgtt gtggcggatc ttgaag 56
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gcccagtaca cgagcaatta agcgactcag aggcttgtac agctcgtcca tgccga 56
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gtgcgcggaa gtgctgcaac cgagcacgac aggagtacat ctacgtatta gtcatcagct 60
ccagt 65
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gcccagtaca cgagcaatta agcgactcag aggactggag ctgatgacta atacgtagat 60
gtact 65
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gagttcggct tccgtcaaca agtg 24
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gtccaattga gactcgtgca actg 24
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gcatcatatt gcccaggtac agg 23
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aatataaggg gtcggtggac cgg 23
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gaggaggagg atgaaataga tgg 23
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gtgctgcaac cgagcacgac agg 23
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cgagcaatta agcgactcag agg 23
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ctaggataaa ttatcgcgcg cgg 23
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atcatcgcaa gaccggcaac agg 23
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tttttttgca tctggtattc gtaaggttcc g 31
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tttttttgta tgtttgccgt cggcccgatt g 31
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caatcgggcc gacggcaaac atac 24
Claims (13)
1.一种基于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检测和分型的方法,其特征在于,包括如下步骤:将待检核酸与表面带有序列特异性核酸结合蛋白的微球混合或者将待检核酸、序列特异性核酸结合蛋白及微球混合,室温孵育,借助显微工具进行微球的观测,即可完成核酸检测及分型。
2.根据权利要求1所述的核酸检测和分型的方法,其特征在于,所述序列特异性核酸结合蛋白包括各种可序列特异性识别并结合核酸分子的蛋白或各种可序列特异性识别并结合核酸分子的蛋白复合物。
3.根据权利要求2所述的核酸检测和分型的方法,其特征在于,所述序列特异性识别并结合核酸分子的蛋白包括锌指蛋白、转录激活因子样效应物、CRISPR核酸酶、Ago蛋白、重组酶、限制性内切酶或转录因子;所述蛋白复合物为锌指蛋白、转录激活因子样效应物、CRISPR核酸酶、Ago蛋白、重组酶、限制性内切酶或转录因子的复合物。
4.根据权利要求3所述的核酸检测和分型的方法,其特征在于,所述CRISPR核酸酶包括具有天然核酸切割活性的CRISPR核酸酶、人工改性后失去部分或全部核酸切割活性的CRISPR核酸酶。
5.根据权利要求3所述的核酸检测和分型的方法,其特征在于,所述CRISPR核酸酶的复合物是指CRISPR核酸酶与其匹配的RNA结合形成的CRISPR核酸酶/RNA复合物,该类CRISPR核酸酶/RNA复合物可在RNA的引导下识别并结合特定序列的DNA或RNA;所述特定序列指与CRISPR核酸酶/RNA复合物中的RNA可退火杂交的序列。
6.根据权利要求3所述的核酸检测和分型的方法,其特征在于,所述重组酶包括Rad51、SSAP或uvsX,所述重组酶可结合单链DNA分子,并在单链DNA分子的引导下识别并结合特定序列的DNA;所述特定序列指与单链DNA分子可退火杂交的序列。
7.根据权利要求1所述的核酸检测和分型的方法,其特征在于,所述表面带有序列特异性核酸结合蛋白的微球包括以各种方式将序列特异性核酸结合蛋白及其复合物连接到各种颗粒物表面形成的微球。
8.根据权利要求1所述的核酸检测和分型的方法,其特征在于,所述微球包括人造颗粒物或天然颗粒物质。
9.根据权利要求1所述的核酸检测和分型的方法,其特征在于,所述人造颗粒物包括金属材料微球、有机材料微球或无机材料微球。
10.根据权利要求1所述的核酸检测和分型的方法,其特征在于,所述天然颗粒物包括噬菌体、细菌或真核细胞。
11.根据权利要求1所述的核酸检测和分型的方法,其特征在于,所述显微工具包括各类显微镜或基因扫描仪。
12.一种权利要求1所述的基于序列特异性核酸结合蛋白的核酸检测和分型的方法在各种可视化、数字化核酸快检和分型中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用,其特征在于,所述核酸快检包括床旁即时诊断和野战生化检测。
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