CN110079583B

CN110079583B - 一种核酸的免疫层析检测方法、检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN110079583B
Application number: CN201910447081.2A
Authority: CN
Inventors: 申友锋; 徐建
Original assignee: Chongqing Boai Madison Biotechnology Co ltd
Current assignee: Chongqing Boai Madison Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-05-27
Filing date: 2019-05-27
Publication date: 2023-10-27
Anticipated expiration: 2039-05-27
Also published as: CN110079583A

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种分子检测方法，具体涉及一种核酸的免疫层析检测方法、检测试剂盒及其应用。本检测方法使用报告探针标记目的DNA片段，使用固定化的捕获探针结合被报告探针标记的所述目的DNA片段；所述报告探针和所述捕获探针均包含TALE蛋白，或者仅有报告探针包含TALE蛋白，或者仅有捕获探针包含TALE蛋白。该检测方法利用DNA序列特异性识别蛋白结合双链DNA，从而减少了检测前的DNA变性等复杂操作，缩短了核酸检测的时间并简化了检测操作。本技术方案可以应用到生物样品检验和疾病检测相关试剂盒的制备中。

Description

一种核酸的免疫层析检测方法、检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种分子检测方法，具体涉及一种核酸的免疫层析检测方法、检测试剂盒及其应用。

背景技术

体外诊断是现代检测医学的重要组成部分，体外诊断的临床应用贯穿了疾病预防、初步诊断、选择治疗方案和评价疗效的全过程。分子诊断是精准医疗和精准检测的技术基础，也是体外诊断中增速最快的子行业。分子诊断技术是指以DNA和RNA为诊断材料，用分子生物学技术来检测基因的存在、缺陷或表达异常。分子诊断技术具有对感染初期和基因性疾病检测的独特优势，目前，全球主要的分子诊断技术包括PCR、FISH、基因测序、基因芯片和蛋白芯片。分子诊断技术已广泛应用于传染病的诊断、流行病的调查、食品卫生检查、肿瘤和遗传病的早期诊断及法医鉴定等各个领域。国内外对分子诊断技术的研发方向集中在提高通量、准确定性和定量、降低检测成本和减少检测时间等方面。可视化、便携式的体外诊断方法和试剂盒是个人化医疗的未来发展方向，该技术使得在野外、基层和家庭进行快速核酸检测变为可能。

分子诊断的核心要素之一为对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测，现有技术中，对特定DNA或RNA序列进行定性或定量检测通常是采用聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR等手段，但上述过程较为耗时并且需要依赖复杂且昂贵的仪器，不便于在野外、基层和家庭等缺少仪器设备的地方进行DNA或RNA序列检测。中国专利CN104614524A(一种宫颈癌HPV快速检测装置的试纸条)公布了技术方案：“一种宫颈癌HPV快速检测装置的试纸条包括底板、样品垫、结合垫、吸收垫，所述底板一端上方为样品垫，底板另一端上方为吸收垫，样品垫一端下方重叠有结合垫，结合垫与吸收垫之间为硝酸纤维素膜垫，硝酸纤维素膜垫上设置有测试线和控制线，测试线和控制线上分别设置有核酸探针。”在上述专利的技术方案中，虽然试纸条便于携带且操作方便，但该技术方案存在如下技术问题：(1)在检测待测核酸样品时，需要将核酸的双链DNA(dsDNA)结构进行变性处理，使得双链结构变为单链结构，单链DNA(ssDNA)才能与试纸上的核酸探针结合，达到检测的目的；(2)核酸探针技术原理是碱基配对，互补的两条核酸单链通过退火形成双链，退火过程对温度等条件有一定要求，因此在使用上述专利的试纸条进行核酸检测时，需保证适宜的退火条件，否则会出现核酸探针不能和目的ssDNA结合的情况；(3)上述技术方案直接使用从生物样本中提取的核酸来进行检测，但如果核酸中目的DNA片段含量过少，试纸条由于其灵敏度的限制，不能够检测出生物样本中的核酸，出现假阴性情况；(4)该技术方案对核酸探针的特异性要求很高，若探针特异性不强，会和非目的DNA片段结合，出现假阳性的情况；(5)该技术方案缺少对待测核酸的纯化步骤，这就会导致探针可能非特异性结合到非目的片段上，出现假阳性的情况。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种核酸的免疫层析检测方法，该检测方法利用DNA序列特异性识别蛋白结合双链DNA(dsDNA)，从而减少了检测前的DNA变性等复杂操作，缩短了核酸检测的时间并简化了检测流程。

为达到上述目的，本发明提出了以下技术方案：

一种核酸的免疫层析检测方法，使用报告探针标记目的DNA片段，使用固定化的捕获探针结合报告探针标记的所述目的DNA片段；所述报告探针和所述捕获探针均包含TALE蛋白，或者仅有报告探针包含TALE蛋白，或者仅有捕获探针包含TALE蛋白。

采用上述技术方案，技术原理为：先使用报告探针标记目的DNA片段，再用固定化的捕获探针结合目的DNA片段，带有报告探针标记目的DNA片段就会被聚集在捕获探针所在区域，可以通过检测或者观察报告探针的信号来确定核酸样本中是否有目的DNA片段。TALE蛋白具有特异性识别dsDNA的功能，报告探针或捕获探针上的TALE蛋白均能特异性识别和结合目的DNA片段(该片段为双链DNA)，不用对核酸进行变性处理即可实现目的DNA片段的标记或者捕获。

制定本核酸检测方法的目的在于检测样本中是否目的DNA片段存在，所述目的DNA片段的选择有多种，依据核酸检测需求来确定，可以是病原体或生物制品中的整段或部分的特定基因，也可以是动植物、微生物细胞中的整段或部分的特定基因，还可以是不具有编码蛋白功能的DNA片段，但不限于以上形式。

免疫层析法(immune-chromatography)是一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于某一固相支持物的某一区带，液体在该固相支持物上可产生毛细管现象。当该干燥的固相支持物一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。随着技术的发展，免疫层析法不再局限于抗原和抗体的特异性识别，免疫层析法检测的对象也不再局限于样品中的抗原蛋白。固定在固相支持物上的蛋白分子可以特异性识别核酸，也可将ssDNA固定在固相支持物上。通过与核酸序列特异性识别的蛋白分子或固定在固相支持物上的ssDNA来结合目的核酸序列，来实现对样品中的核酸的检测。在本方案中，免疫层析法是指上述所有的检测方式，是一种广义的免疫层析法。

本技术方案的有益效果具体如下：

本技术方案使用TALE(Transcription Activator–Like Effector)蛋白作为特异性识别目的DNA(dsDNA)片段上的靶序列的检测分子。TALE蛋白一直被应用于靶向基因组操作中，TALE蛋白连接核酸酶形成TALEN(ranscription activator-like effectornucleases)可以对基因组进行靶向基因组编辑，比如基因敲除、基因敲入、基因组修饰、基因转录激活或抑制等。发明人研究发现利用TALE蛋白可进行目的DNA片段的识别和结合，进而使用TALE蛋白进行核酸检测。现有技术中的核酸检测通常采用核酸探针杂交或PCR的方法进行，检测过程需要对待测核酸进行变性和退火等复杂操作。

TALE蛋白是由特异性识别DNA的相互串联的重复单元和两侧的N-末端序列及C-末端序列组成。每个重复单元包含33-35个氨基酸，每个重复单元的第12和13位残基是靶向识别的关键位点，被称作重复可变双氨基酸残基(RVD，repeat-variable diresidue)位点。TALE上的每个RVD仅能识别一个核酸的碱基，RVD和碱基的对应关系为：NI(A),HD(C),NG(T),NN(G或A)。TALE蛋白是符合上述规则的一类蛋白的统称。TALE蛋白可根据需求，依照靶序列的碱基排列情况，由人工编辑而成。虽然TALE蛋白结构已经被研究发现，但TALE蛋白的应用集中于基因组编辑、基因组表观修饰等领域上，一直未被应用于核酸检测领域。长期以来，研究者一直认为NI和NG依赖范德华力来识别和结合碱基A和T，在体外环境中，范德华力的结合力较弱，并不能形成TALE蛋白-目的序列的稳定结合结构，导致TALE蛋白在体外环境下结合核酸上的靶序列的效果较差，易出现因为结合不稳固而检测失败的现象。另外，RVD与核酸识别和结合的特异性不仅由互相连接的作用力决定，还和一些核苷酸形成空间位阻有关，这就进一步导致了TALE蛋白和目的序列的结合过程受到了更多不可控因素的影响。TALE蛋白发挥结合功能的话，对蛋白构象要求非常高,对蛋白活性要求也非常高。上述技术困难阻碍了TALE蛋白的多领域应用，形成了该蛋白主要应用于核酸编辑和基因组表观修饰的技术偏见。

发明人克服了上述技术偏见，采用TALE蛋白制作报告探针和捕获探针，对核酸实现了体外检测，解决了现有技术中的核酸探针技术方案必须通过dsDNA变性步骤来实现核酸探针和ssDNA的杂交的技术问题，也解决了现有技术的抗原抗体检测方法中窗口期无法检测病原体的问题。发明人在利用TALE蛋白进行核酸检测时，对TALE蛋白的设计和制备进行了研究。发明人在纯化TALE蛋白时采用了非变性纯化的方法，以保证蛋白质的构像和活性。发明人发现，由于N、H、D氨基酸比较亲水，而I氨基酸比较疏水，亲疏水性在体外蛋白和核酸的结合中和蛋白质构象的维持中，起到了非常重要的作用。以上原因导致RVD中NI对A碱基的识别和结合效果不好，因此在设计TALE蛋白的靶序列时，要保证靶序列中G和C碱基含量较高，尽量靶序列中不含有A碱基。发明人研究发现维持A碱基含量在35％以下(A碱基的个数占靶序列总碱基的个数的百分比)，可以使TALE蛋白和目的基因的结合效果较好。另外，将TALE蛋白固定在固体支持物上也可以使得TALE蛋白的核酸结合位点暴露出来，有助于TALE蛋白对目的核酸的识别和结合。在本发明中，TALE蛋白的靶序列是指TALE蛋白特异性识别和结合的核苷酸序列。在本发明中TALE蛋白的靶序列长度为16-17个碱基，该靶序列对应的TALE蛋白可以维持较好的构象，使得蛋白的靶序列结合位点充分暴露，并且蛋白易于合成且性质稳定。

综上所述，本技术方案的有益效果在于：TALE蛋白可直接识别dsDNA，简化了核酸检测步骤，提高了检测效率；克服了TALE蛋白只用作基因组编辑和表观遗传学修饰的技术偏见，将TALE蛋白应用于核酸检测中。

进一步，所述核酸检测方法依次包括以下步骤：

步骤(1)报告探针的制备：将TALE蛋白连接到胶体金颗粒上，得报告探针；

步骤(2)捕获探针的制备：将TALE蛋白固定在固相支持物上，得捕获探针；

步骤(3)标记目的DNA片段：将核酸样本与报告探针接触，形成核酸样本-报告探针混合物，所述核酸样本为从待测样品中抽提得到的总核酸，目的DNA片段位于核酸样本中；

以及，步骤(4)检测目的DNA片段：将核酸样本-报告探针混合物与捕获探针接触。

采用上述技术方案，核酸样本为从待测样品中抽提得到的总核酸，待测样本是指疑似含有目的DNA片段的样本。待测样本可以为多种形式，包括但不限于以下形式：生物制品，蘸取或擦拭过含有目的DNA片段的微生物疑似聚集部位的棉球或取样器，动植物细胞或组织等。报告探针中的TALE蛋白识别并结合目的DNA片段，将胶体金颗粒标记在目的DNA片段上。捕获探针中的TALE蛋白识别并结合被胶体金颗粒标记的目的DNA片段，将目的DNA片段固定在固相支持物上，从而使胶体金颗粒聚集在捕获探针所在区域，颗粒聚集后可行成肉眼可见的显色区域，实现对目的DNA片段的检测。

被固定在固相支持物上的捕获探针所在区域出现肉眼可观察的浅红色、红色或紫红色的印记，即为阳性，表示核酸样本中含有目的DNA片段；被固定在固相支持物上的捕获探针所在区域没有出现印记，即为阴性，表示核酸样本中可能不含有目的DNA片段，或核酸样本中目的DNA片段含量过低。

本方案的有益效果如下：

上述技术方案可以克服TALE蛋白识别DNA序列过短的问题，识别DNA序列(目的DNA片段上的靶序列)过短可能会导致TALE蛋白结合到了非目的DNA片段上，可能会得出错误的检测结果。自然界中的TALE蛋白一般包括1.5-33.5个重复单元，人工合成的TALE蛋白可以包括任意个重复单元。但过多个数的重复单元会导致整个TALE蛋白的分子量过大，降低了TALE蛋白的稳定性，增加了TALE蛋白的合成难度或TALE蛋白表达的难度。人工合成的TALE蛋白的重复序列一般为17个左右(该蛋白含有17个RVD，蛋白可与dsDNA上的连续17个碱基识别和结合)。以含有17个重复单元的TALE蛋白为例，该蛋白可识别dsDNA上的连续17个碱基，作为一种通过核酸的碱基序列来识别目的DNA序列的检测探针，能够识别的连续碱基的个数较少，这就会导致TALE蛋白可能结合在非目的DNA片段上(该非目的DNA片段上具有和TALE蛋白形成全部或部分配对的核酸序列)。目的DNA片段通常长度有限(几百bp左右)，导致了在目的DNA片段上寻找适合的TALE蛋白的靶序列时，靶序列的供选择的范围有限，增加了获得特异性较强的靶序列的难度。待检测的核酸样本一般都是从某生物样本中提取的整个基因组，基因组中含有大量的非目的DNA片段，有可能在非目的DNA片段上存在和靶序列相同或者相似的碱基序列，TALE蛋白可能会和基因组上非目的DNA片段结合，最后可能会导致核酸检测假阳性的出现。

本技术方案采用报告探针上的TALE蛋白结合目的DNA片段，相当于是对目的DNA片段的第一次识别和筛选，然后捕获探针上的TALE蛋白又一次结合目的DNA片段，相当于是对目的DNA片段的第二次识别和筛选。经过两次识别和筛选，非目的DNA片段同时被捕获探针固定和被报告探针标记的可能性大大降低，从而提高了检测的准确性。双TALE的技术方案比较适合用于检测遗传性疾病，基因突变、缺失或者移码之类的，一个TALE设计在序列的保守区域(即正常型和突变型序列一致的位点)，另一个TALE设计在突变位点。

另外，由于TALE蛋白一直未被用于核酸检测，也就没有人发现使用TALE蛋白进行核酸检测存在假阳性问题。发明人在使用TALE蛋白进行核酸检测的尝试中，发现了由于TALE蛋白受到合成难度和蛋白稳定性的限制，不能人工合成获得含有重复单元过多的TALE蛋白。TALE蛋白识别的连续碱基个数有限(17个碱基左右)，会导致由于TALE蛋白识别的靶序列长度过短，TALE蛋白可能会结合上非目的DNA片段，所以用单个TALE蛋白直接对核酸样本进行检测的特异性和准确性较低，而本技术方案解决了上述技术问题。TALE蛋白和胶体金结合后，TALE蛋白两端和胶体金结合较为紧密，中间的重复串联序列与胶体金的结合相对松弛，使得TALE蛋白的靶序列结合位点暴露，更有利于TALE识别目的DNA片段。

综上所述，有益效果在于：

(1)双重TALE蛋白识别目的DNA片段的方案可增加核酸检测的准确性。

(2)在使用TALE蛋白进行核酸检测的过程中发现并解决了由于TALE蛋白的核酸靶序列过短而造成的非目的DNA片段结合的问题。

(3)对遗传病检测有较高的效率。

进一步，所述核酸检测方法依次包括以下步骤：

步骤(1)探针制备：所述报告探针由TALE蛋白连接胶体金颗粒制成、并且所述捕获探针由配体结合蛋白固定在固相支持物上制成，或者所述报告探针由配体结合蛋白连接胶体金颗粒制成、并且所述捕获探针由TALE蛋白固定在固相支持物上制成；

步骤(2)连接配体：在目的DNA片段上连接配体，所述目的DNA片段位于核酸样本中，得配体-核酸样本，所述配体用于结合配体结合蛋白，所述核酸样本为从待测样品中抽提得到的总核酸。

步骤(3)标记目的DNA片段：将配体-核酸样本与报告探针接触，形成配体-核酸样本-报告探针混合物；

以及，步骤(4)检测目的DNA片段：将配体-核酸样本-报告探针混合物与捕获探针接触。

采用上述技术方案，如果采取“所述报告探针由TALE蛋白连接胶体金颗粒制成、并且所述捕获探针由配体结合蛋白固定在固相支持物上制成”这一方案。报告探针中的TALE蛋白识别并结合目的DNA片段，将胶体金颗粒标记在目的DNA片段上。捕获探针中的配体结合蛋白可以与配体结合，从而将连接在配体上的目的DNA片段固定在固相支持物上。从而使胶体金颗粒聚集在捕获探针所在区域，颗粒聚集后可行成肉眼可见的显色区域，实现对目的DNA片段的检测。

如果采取“所述报告探针由配体结合蛋白连接胶体金颗粒制成、并且所述捕获探针由TALE蛋白固定在固相支持物上制成”这一方案。报告探针中的配体结合蛋白与配体结合，从而将胶体金颗粒标记在目的DNA片段上。然后捕获探针中的TALE蛋白结合经过标记目的DNA片段，从而使得该带有胶体金颗粒标记的目的DNA片段被固定在固相支持物上。从而使胶体金颗粒聚集在捕获探针所在区域，颗粒聚集后可行成肉眼可见的显色区域，实现对目的DNA片段的检测。

配体在本发明中是指一些可以连接在目的核酸序列上的小分子，配体结合蛋白是指可以特异性结合配体的蛋白分子，可以是配体的抗体，也可以是其他能够结合配体的蛋白分子。

进一步，所述配体-核酸样本由如下方法制备而成：将所述核酸样本加入到核酸体外扩增体系中，所述核酸体外扩增体系包括与配体连接的上游引物和与配体连接的下游引物；对核酸样本中的目的DNA片段进行体外扩增后，得所述配体-核酸样本。

采用上述技术方案，核酸样本为从待测样本中提取得到的总核酸，将核酸样本加入到核酸体外扩增体系中，对目的DNA片段进行体外扩增反应。由于上游引物和下游引物上均连接有配体，经体外扩增反应后，得到的扩增产物中含有连接有配体的目的DNA片段，即得配体-核酸样本。如果配体结合蛋白与胶体金颗粒连接形成报告探针，则通过配体和配体结合蛋白的结合，目的DNA片段便连接上了胶体金颗粒。如果配体结合蛋白固定在固相支持物上形成捕获探针，捕获探针结合配体，即使得与配体连接的目的DNA片段固定在了捕获探针所在位置，由于在此步骤之前目的DNA片段已经通过TALE蛋白与胶体金颗粒连接，所以胶体金颗粒在捕获探针所在位置聚集。由于胶体金颗粒为有色物质，颗粒聚集后可行成肉眼可见的显色区域。进而通过肉眼观察到浅红色、红色或紫红色的印记(印迹颜色深浅由胶体金颗粒聚集程度决定)，实现对待检测样品中核酸的检测。

核酸体外扩增是指通过无细胞系的化学反应实现目的核酸的扩增，核酸体外扩增体系是指核酸体外扩增所需要的各个要素的集合，包括了引物、酶和dNTP等要素。所述配体和配体结合蛋白为现有技术中的常规选择，例如，配体使用生物素，配基结合蛋白相应的使用亲和素；配体使用地高辛，配体结合蛋白相应的使用地高辛抗体；配体使用荧光素，配体结合蛋白相应的使用荧光素抗体。

本技术方案有益的效果在于：

(1)使用核酸体外扩增的方法，将配体通过引物连接到目的DNA片段上。

(2)使用核酸体外扩增技术，使得目的DNA片段的拷贝数量增多，将待检测核酸的信号放大，增加了本检测方法的灵敏度。

(3)核酸体外扩增的方法是针对目的DNA片段进行，其使用的引物对该目的DNA片段具有特异性。TALE蛋白识别的靶序列长度过短导致假阳性的问题已经在上文中充分论述。本技术方案通过核酸体外扩增和TALE蛋白的双重识别待检测核酸中的目的DNA片段，极大程度减少了假阳性。

进一步，所述配体为生物素，所述配体结合蛋白为亲和素；所述核酸体外扩增体系为PCR、qPCR、RPA、RAA或LAMP。

采用上述技术方案，生物素-亲和素系统(Biotin-Avidin-System，BAS)被广泛应用于分子生物学研究。生物素与亲和素之间具有高亲合力的牢固结合，且两种物质易于获取，方便改造制备。

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、定量PCR(qPCR)、重组酶聚合酶扩增法(Recombinase polymerase amplification，RPA)、重组酶介导扩增法(Recombinase-aid amplification，RAA)和环介导等温扩增法(Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)均为现有技术中对核酸进行体外扩增的方法，均可实现目的DNA片段的大量拷贝。其中，RPA、RAA和LAMP为在常温条件下对核酸进行扩增的方法，采用该方法可以使得核酸体外扩增反应脱离对仪器的依赖，操作简单且反应时间短。

进一步，所述固相支持物为硝酸纤维膜、玻璃纤维膜或尼龙膜；所述报告探针包被在玻璃纤维膜中。

采用上述技术方案，利用液体在硝酸纤维膜、玻璃纤维膜、尼龙膜和玻璃纤维膜中的毛细管现象，液体在上述膜中移动的同时带动液体中的物质(待测核酸)一起移动，从而实现了目的DNA片段的标记和检测。

核酸样本经过体外扩增反应后，扩增产物中含有过量的酶、过量的dNTP、过量的上下游引物等物质。这些成分的存在将直接影响到后续的检测操作，可能会封闭TALE蛋白或配体结合蛋白的结合域，从而影响核酸检测的准确程度。通常情况下，需要对扩增产物进行纯化处理，但该操作会增加技术方案的复杂程度。在本技术方案中，发明人使用硝酸纤维膜、玻璃纤维膜和尼龙膜，他们对小分子物质具有一定吸附作用，可以将过量的酶、过量的dNTP、过量的上下游引物吸收到其纤维结构上，从而一定程度上阻碍上述过量物质随液体移动，避免了上述过量物质与捕获探针的接触，减少了上述过量物质对检测结果的影响。

进一步，核酸检测试剂盒，包括核酸提取单元和可视化检测单元；

所述可视化检测单元包括依次固定在底板上的以下各部分：

样品垫：用于承接样品；

结合垫：所述结合垫的材质为玻璃纤维膜，报告探针包被在玻璃纤维膜中，所述报告探针为TALE蛋白-胶体金颗粒连接物；

固相支持物：TALE蛋白固定在固相支持物上形成捕获探针，所述固相支持物为硝酸纤维膜、玻璃纤维膜或尼龙膜；

吸水垫：由吸水材料制成。

采用上述技术方案，使用本发明所提供的试剂盒，核酸提取、试纸条检测和读取过程均不需要借助仪器，检测流程简单，成本低，可以应用于野外、家庭、基层和偏远地区的核酸检测操作中。本发明的试剂盒相比于现有技术的核酸检测，耗时更短，整个过程在15-30min内即可完成。本发明的试剂盒特异性和准确性更高，通过双TALE蛋白双重识别待检测核酸，极大程度减少了假阳性。

进一步，核酸检测试剂盒，包括核酸提取单元、核酸体外扩增单元和可视化检测单元；

所述可视化检测单元包括依次固定在底板上的以下各部分：

样品垫：用于承接样品；

结合垫：所述结合垫的材质为玻璃纤维膜，报告探针包被在玻璃纤维膜中；

固相支持物：固定化的捕获探针位于固相支持物上，所述固相支持物为硝酸纤维膜、玻璃纤维膜或尼龙膜；

吸水垫：由吸水材料制成；

在所述可视化检测单元中，所述报告探针由TALE蛋白连接胶体金颗粒形成、并且所述捕获探针由配体结合蛋白固定在固相支持物上形成，或者所述报告探针由配体结合蛋白连接胶体金颗粒形成、并且所述捕获探针由TALE蛋白固定在固相支持物上形成；

所述核酸体外扩增单元包括核酸体外扩增体系，所述核酸体外扩增体系包括与配体连接的上游引物和与配体连接的下游引物，所述配体用于结合配体结合蛋白；所述核酸体外扩增体系为PCR、qPCR、RPA、RAA或LAMP。

采用上述技术方案，本发明的试剂盒特异性和准确性更高，通过核酸体外扩增和TALE蛋白双重识别待检测核酸，极大程度减少了假阳性。核酸体外扩增使得目的DNA片段的拷贝数量增多，将待检测核酸的信号放大，增加了本检测试剂盒的灵敏度。

进一步，所述核酸提取单元包括裂解液，所述裂解液的pH值为8.0，所述裂解液中含有20mM Tris,25mM NaCl,2.5mM EDTA,0.05重量％SDS。

采用上述技术方案，十二烷基硫酸钠(SDS)，是一种能够使蛋白质变性的去污剂，它用于核酸抽提操作中破坏和裂解细胞壁，并能够破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来。采用本方案的裂解液可以实现总核酸的快速提取。

进一步，所述核酸检测试剂盒在制备疾病快速检测产品或疾病快速诊断产品中的应用，或者在生物制品的检验或检疫中的应用。

采用上述技术方案，本试剂盒具有特异性和准确性更高、检测耗时短和不依赖大型仪器等特点，比较适合对核酸样本进行快速检测或即时检验(point-of-care testing，POCT)。使用本方案的试剂盒制备疾病快速检测产品或疾病快速诊断产品或将本方案的试剂盒用于生物制品检验或检疫，可以快速准确的获取核酸检测结果，实现即时检验，缩短检测周期。

附图说明

图1为实施例1中TALE蛋白的WB照片。

图2为实施例1的待测核酸样本的琼脂糖电泳图，待测核酸样本是由实施例1的核酸抽提方法提取。

图3展示的是实施例1制备的试纸条，以及使用实施例1制备的试纸条进行生物样本的HPV16-E6检测的结果图。

图4展示的是实施例2制备的试纸条，以及使用实施例2制备的试纸条进行生物样品的烟草花叶病毒检测的结果图。

图5展示的是实施例3制备的试纸条，以及使用实施例3制备的试纸条进行生物样品的HPV16-E6、HPV18-E7同时检测的结果图。

图6展示的是实施例4制备的试纸条，以及使用实施例4制备的试纸条进行生物样品的博卡病毒检测的结果图。

图7展示的是实施例5制备的试纸条，以及使用实施例5制备的试纸条进行生物样品的手足口病病原体检测的结果图。

图8展示的是实施例6制备的试纸条，以及使用实施例6制备的试纸条进行生物样品的非洲猪瘟病原体检测的结果图。

图9展示的是实施例7中制备的双TALE蛋白试纸条，以及使用实施例7制备的双TALE蛋白试纸条进行生物样品的HPV16-E6检测的结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

实施例1：利用本发明技术方案的核酸检测方法进行HPV16(人乳头瘤病毒)检测

1.TALE靶序列设计和筛选

利用TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0(https://tale-nt.cac.cornell.edu/)设计筛选靶序列，筛选原则为：靶序列的长度为16-17bp，靶序列中G和C碱基含量较高，尽量靶序列中不含有A碱基。在本实施例中，将HPV16-E6的33-302bp序列放入TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0分析，最终选择靶序列如下：TTATGCACAGAGCTGCA(SEQ ID NO:1)，对应的TALE RVDs为NG NI NG NH HD NI HD NI NH NINH HD NG NH HD NI。

2.TALE载体构建和原核表达TALE蛋白

利用Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0试剂盒(addgene)，构建TALE蛋白表达载体，步骤如下：

1)根据上一步设计的TALE RVDs选择试剂盒中的相应模块，每个模块选择1.5μL，依次加入PCR管中，全部加完后，加入TALE骨架载体1.5μL，ddH₂O 1μL，反应液MIX 4μL；PCR仪的反应程序是：按照先37℃5min后22℃5min的顺序共进行15循环，然后80℃10min，最后4℃1min；反应完成后，获得TALE载体。

2)将步骤1)中TALE载体和pET-28a载体分别用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后，分别回收pET-28a骨架和TALE载体的插入片段，然后将pET-28a骨架和TALE载体的插入片段连接，获得重组的TALE原核表达载体，命名为pET-28a-TALE。

3)将pET-28a-TALE转化进入大肠杆菌BL21(DE3)，将转化后的大肠杆菌接入LB培养基，37℃摇菌培养3h，之后在菌液中加入1mM IPTG，诱导大肠杆菌表达TALE蛋白3h，然后以15000g的转速对菌液离心1min，收集菌体。在菌体中加入细菌裂解液，冰上裂解30min，然后以14000g的转速对裂解后的菌液离心10min，取上清，使用Qiagen NI-NTA纯化柱从上清中纯化蛋白，获得TALE蛋白(图1)。图1中左侧泳道为清洗后流出液(蛋白洗脱后，继续用ddH₂O清洗纯化柱，收集过住后的ddH₂O，即为清洗后的流出液，表明目的蛋白已经完全洗脱)，中间泳道为纯化后TALE蛋白，右侧泳道为蛋白marker。本实施例表达获得的TALE蛋白分子量为80kD。

3.TALE蛋白-胶体金试纸条制备

1)胶体金颗粒制备：取99ml ddH₂O于洄流圆底烧瓶中，加入1ml 1重量％HAuCL₄溶液，混匀。洄流圆底烧瓶置于电热套式恒温器中，在洄流圆底烧瓶中加入干净搅拌子，利用搅拌子进行低速搅拌并加热洄流圆底烧瓶使其内容的液体沸腾；迅速地一次性加入1ml1％柠檬酸三钠溶液，继续煮沸；观察溶液颜色变化，颜色的变化顺序依次为浅黄、黑色、紫色、紫红色，当溶液完全变为紫红色后，继续洄流处理10min；然后停止加热，冷却洄流圆底烧瓶中的液体至室温，得胶体金颗粒溶液。

2)亲和素的金标记：量取上述步骤1)获得的100ml胶体金颗粒溶液，在上述溶液中逐滴加入1mg亲和素溶液，搅拌30min。取10重量％BSA(牛血清白蛋白),逐滴加入混合溶液(胶体金颗粒与亲和素形成的混合溶液)，至BSA的终浓度为0.5重量％，然后搅拌15min；BSA作用为封闭非特异性位点，以及增加亲和素标记的胶体金颗粒的稳定性。取5重量％PEG2000，逐滴加入混合溶液(胶体金颗粒、亲和素与BSA形成的混合溶液)，至PEG2000的终浓度0.1重量％，搅拌15min。

3)胶体金喷点到结合垫：稀释亲和素标记的胶体金颗粒至5OD/μL，在上述5OD/μL的胶体金颗粒溶液中添加蔗糖、BSA、NaCl、表面活性剂，形成胶体金喷点混合溶液。上述物质的终浓度范围为：蔗糖10-20重量％，BSA 1-3重量％，NaCl 0.5-1重量％,表面活性剂0.5-1％。在本实施例中，表面活性剂具体为Tween-20，上述物质分别采用的终浓度为：蔗糖15重量％，BSA 2重量％，NaCl 0.75重量％,Tween-20 0.57重量％。在湿度30％,室温条件下，将胶体金喷点混合溶液用BIODOT仪器(BioDot公司)的AIRJET喷头喷到玻璃纤维膜制成的结合垫上，BIODOT仪器压力设置为10PSI，喷点参数为4μL/cm；将喷好的结合垫置于37℃干燥，待湿度恒定在20％后，收起干燥后的结合垫并密封贮存；喷点后的结合垫上有胶体金条带，适用时可按照需求对玻璃纤维膜进行切割，为避免边缘效应，胶体金条带两端边缘要弃除。

4)TALE蛋白喷点到硝酸纤维素膜(NC膜)：取出NC膜，在室温和正常湿度下平衡上述NC膜1h；用缓冲溶液将TALE蛋白稀释到合适浓度(0.1-5mg/mL)，缓冲系统可选磷酸盐，Tris，碳酸盐，pH范围为6.0-9.0。在本实施例中，使用磷酸盐缓冲液，pH7.0，在磷酸盐缓冲液中加入NaCl、蔗糖和Tween-20，得TALE喷点混合溶液，NaCl、蔗糖和Tween-20的终浓度均为1重量％。使用BIODOT仪器进行喷点，设定喷点量为0.75μL/cm，并使用TALE喷点混合溶液在NC膜上喷点。喷点后的NC膜置上有TALE蛋白条带(即为T线)。用磷酸盐缓冲液将生物素稀释到1mg/mL，使用BIODOT仪器进行喷点，设定喷点量为0.75μL/cm，喷点后的NC膜上有生物素条带(即为C线)。将喷点后的NC膜置于烘箱中干燥，烘箱温度为37℃，待湿度恒定在20％后，收起干燥后的NC膜，密封包装待用。

5)试纸条组装：将喷点后的NC膜的非点样面粘贴于PVC底板上，喷点后的结合垫粘贴在NC膜的一端，结合垫覆盖NC膜1mm，覆盖部分结合垫在上NC膜在下；吸水垫粘贴在NC膜的另一端，吸水垫覆盖NC膜2mm，覆盖部分吸水垫在上NC膜在下；样品垫粘贴在结合垫的一端，样品垫和NC膜分别位于结合垫相对的两端，样品垫覆盖结合垫2mm，覆盖部分样品垫在上结合垫在下。在BIODOT的CM剪切机中，将粘贴了NC膜、结合垫、吸水垫和样品垫的PVC底板剪切成检测用试纸条，得TALE蛋白-胶体金试纸条。

4.RPA引物设计

RPA引物设计遵循以下原则：

1)5’端3-5个核苷酸避免聚鸟嘌呤，最好是胞嘧啶，可以促进重组；

2)3’的3个核苷酸选择G或者C，有助于聚合酶稳定性；

3)避免出现引物中出现聚嘌呤或者聚嘧啶；

4)GC含量控制在30％-70％，引物长度控制在30-35个碱基范围内。

引物设计完成后，利用NCBI中的Primer-BLAST功能对引物进行分析比对，(比对网站为：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)，以保证序列唯一性。本实施例以HPV16-E6为例，设计引物为HPV16-F：CCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACA(SEQ IDNO:2)；HPV16-R：TTGTTGTATTGCTGTTCTAATGTTGTTCCA(SEQ ID NO:3)。引物扩增范围为HPV16-E6的33-302bp(SEQ ID NO:4)，扩增产物长度为270bp。在上下游引物的5'端均连接上了生物素(biotin)作为标记分子，形成biotin-HPV16-F和biotin-HPV16-R。

5.核酸快速提取

本实施例所用裂解液的pH为8.0，成份为20mM Tris,25mM NaCl,2.5mM EDTA,0.05重量％SDS。将刮拭有待检测样品的棉棒放入裂解液中，裂解15s；用一根滤纸浸入裂解液中结合核酸，3s后，将滤纸进入清洗液中，清洗液的pH为8.0，成分为10mM Tris,0.1重量％Tween-20)，3s后将滤纸放入RPA反应管中；本发明所用裂解液抽提核酸效果如图2所示，琼脂糖凝胶电泳结果表明抽提获得的核酸完整，浓度高，适合用作下一步检测。其中1-9泳道为本法抽提的核酸，10泳道为DNA marker。

6.RPA扩增待测样品核酸与可视化检测

将步骤4中设计的引物与RPA反应体系混合，将步骤5中吸附有待检测核酸的滤纸放入RPA反应管中，常温(室温)反应15min后，将RPA反应产物滴加到TALE胶体金试纸条的样品垫，水平放置TALE胶体金试纸条，5-10min内观察显色结果(图3，在图中T线在C线上)。若试纸条T线和C线均有红色条带，表明是阳性样品；若试纸条C线有带，T线无带，表明是阴性样品；若试纸条C线无带，则检测无效，需要重复检测。

实施例2：利用本发明技术方案的核酸检测方法进行烟草病毒病(烟草花叶病毒)的检测

1、特异性结合烟草花叶病毒的TALE蛋白的制备

本实施例中检测的目的DNA片段(基因)为GenBank:AF426837.1(SEQ ID NO:5)，针对上述基因，我们选择的靶序列为：AAGCTCGATCTTTTCCG(SEQ ID NO:6)，该靶序列对应的TALE RVDs为NI NI NH HD NG HD NH NI NG HD NG NG NG NG HD HD NH。靶序列的选择方法、TALE RVDs的设计方法、TALE原核表达载体构建和原核表达TALE蛋白等过程，同实施例1(1.TALE靶序列设计和筛选，2.TALE载体构建和原核表达TALE蛋白)。经过上述过程，得可以特异性结合烟草花叶病毒的TALE蛋白。

2.TALE蛋白-胶体金试纸条制备

TALE蛋白-胶体金试纸条制备过程基本同实施例1(3.TALE蛋白-胶体金试纸条制备)的过程一致，不同点在于：胶体金颗粒与上述步骤1(实施例2)中的TALE蛋白连接，形成TALE蛋白标记的胶体金颗粒(制备方法为现有技术中常规的胶体金颗粒标记蛋白质的方法：胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性)；使用TALE蛋白标记的胶体金颗粒点到结合垫；使用亲和素喷点到NC膜(形成T线)。最后制备的TALE蛋白-胶体金试纸条为亲和素包被在NC膜中，TALE蛋白标记的胶体金包被在结合垫上的形式。

3.核酸快速提取以及烟草花叶病毒基因扩增

样本核酸提取过程和RPA扩增过程基本同实施例1(4.RPA引物设计，5.核酸快速提取，和6.RPA扩增待测样品核酸与可视化检测)，不同点在于本实施例中使用的引物序列为：上游引物CCCTAAGCTCGATCTTTTCCGACACTCCATCATCG(SEQ ID NO:7)；下游引物CCCCATTCTTCAGCCCTAACGGCTTTGTCGATCTC(SEQ ID NO:8)；在上下游引物的5'端均连接上了生物素(biotin)作为标记分子。

将RPA反应产物滴加到TALE胶体金试纸条的样品垫，水平放置TALE胶体金试纸条，5-10min内观察显色结果(图4)。如图4所示，从下往上依次为T线和C线，若试纸条T线和C线均有红色条带，表明是阳性样品；若试纸条C线有带，T线无带，表明是阴性样品；若试纸条C线无带，则检测无效，需要重复检测。

实施例3：利用本发明技术方案的核酸检测方法进行HPV多重指标的检测

本实施例基本同实施例1，不同点在于：在检测HPV16的同时检测HPV18。HPV18-E7的序列见SEQ ID NO:9(GenBank:MH196518.1)；HPV16-E6的序列见SEQ ID NO:4。针对上述基因，我们选择的靶序列为：AAGCTCGATCTTTTCCG(SEQ ID NO:10，该序列针对SEQ ID NO:9设计，是位于SEQ ID NO:9上的TALE识别靶序列)；TACTGCGACGTGAGGT(SEQ ID NO:11，该序列针对SEQ ID NO:4设计，是位于SEQ ID NO:4上的TALE识别靶序列)。SEQ ID NO:10对应的TALE RVDs为NH NI NI HD NI HD NG NG HD NI HD NG NH HD NI NI；SEQ ID NO:11对应的TALE RVDs为NG NI HD NG NH HD NH NI HD NH NG NH NI NH NH NG。靶序列的选择方法、TALE RVDs的设计方法、TALE原核表达载体构建和原核表达TALE蛋白等过程，同实施例1(1.TALE靶序列设计和筛选，2.TALE载体构建和原核表达TALE蛋白)。经过上述过程，得可以分别特异性结合SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的两种TALE蛋白。

将两种TALE蛋白分别喷点到NC膜上，制备含有两条检测线(T线)的TALE蛋白-胶体金检测试纸条，用该试纸条进行待测核酸检测，样品核酸提取过程、RPA扩增过程等同实施例1的相应部分。进行RPA扩增时：

针对SEQ ID NO:4的上游引物为：

CCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACA(SEQ ID NO:12)；

针对SEQ ID NO:4的下游引物为：

TTGTTGTATTGCTGTTCTAATGTTGTTCCA G(SEQ ID NO:13)；

针对SEQ ID NO:9的上游引物为：

CCCTACAAGCTACCTGATCTGTGCACGGAACTG(SEQ ID NO:14)；

针对SEQ ID NO:9的下游引物为：

CCACAAATAAATCTTTAAATGCAAATTCAAATACCG(SEQ ID NO:15)。

在上下游引物的5'端均连接上了生物素(biotin)作为标记分子。

利用本实施例制备的TALE蛋白-胶体金检测试纸条对RPA扩增后的样本进行检测，结果如图5所示，从上往下依次为T1线、T2线和C线。其中，T1线为HPV16检测线，T2线为HPV18检测线。本发明的技术方案不限于两个指标的检测，多指标检测可以相应增加检测线。

实施例4：利用本发明技术方案的核酸检测方法进行博卡病毒的检测

本实施例基本同实施例1，不同点在于检测目的DNA片段(基因)不同。本实施例中检测的目的DNA片段(基因)为GenBank:MG953832.1(SEQ ID NO:16)，针对上述基因，我们选择的靶序列为：GGTTTGTTTTAGCTGA(SEQ ID NO:17)，该靶序列对应的TALE RVDs为NH NH NGNG NG NH NG NG NG NG NI NH HD NG NH NI。在RPA体外扩增时，选用的上游引物为：CCTATTGCCTAAAAATAGATGCATTACATCTTAC(SEQ ID NO:18)；选用的下游引物为：CCCTGGTAGAACTTCGTTATCTAGGGTTGCGTGG(SEQ ID NO:19)。在上下游引物的5'端均连接上了生物素(biotin)作为标记分子，引物由重庆擎科兴业生物技术有限公司合成。

利用本实施例制备的TALE蛋白-胶体金检测试纸条对RPA扩增后的样本进行检测，结果如图6所示，从下往上依次为T线和C线。

实施例5：利用本发明技术方案的核酸检测方法进行手足口病病原体的检测

本实施例基本同实施例1，不同点在于检测目的DNA片段(基因)不同。本实施例中检测的目的DNA片段(基因)为GenBank:JQ746659.19(SEQ ID NO:20)，针对上述基因，我们选择的靶序列为：TCCACCAGGGTGCTCT(SEQ ID NO:21)，该靶序列对应的TALE RVDs为NG HDHD NI HD HD NI NH NH NH NG NH HD NG HD NG。在RPA体外扩增时，选用的上游引物为：CCCGGACGTTTTGACGGAGGTGGGCGTGTTTGG(SEQ ID NO:22)；选用的下游引物为：CCCGGCAATGGTGCCCAGCACGTACTCAGGCAG(SEQ ID NO:23)。在上下游引物的5'端均连接上了生物素(biotin)作为标记分子，引物由重庆擎科兴业生物技术有限公司合成。

利用本实施例制备的TALE蛋白-胶体金检测试纸条对RPA扩增后的样本进行检测，结果如图7所示，从下往上依次为T线和C线。

实施例6：利用本发明技术方案的核酸检测方法进行非洲猪瘟的检测

本实施例基本同实施例1，不同点在于检测目的DNA片段(基因)不同。本实施例中检测的目的DNA片段(基因)为GenBank:KX354450.1(SEQ ID NO:24)，针对上述基因，我们选择的靶序列为：ATTAACCGCCAATCTT(SEQ ID NO:25)，该靶序列对应的TALE RVDs为NI NG NGNI NI HD HD NH HD HD NI NI NG HD NG NG。在RPA体外扩增时，选用的上游引物为：CCCACATATTAACCGCCAATCTTTAAAATGAC(SEQ ID NO:26)；选用的下游引物为：CCCTATTCCTAAATAATGCTCAACTGAAATTAAG(SEQ ID NO:27)。在上下游引物的5'端均连接上了生物素(biotin)作为标记分子。

利用本实施例制备的TALE蛋白-胶体金检测试纸条对RPA扩增后的样本进行检测，结果如图8所示，从下往上依次为T线和C线。

实施例7：双TALE蛋白检测HPV16-E6

本实施例中TALE蛋白-胶体金检测试纸条的制作方法基本同实施例1，不同点在于：本实施例对同一目的DNA片段(基因)设计了两个TALE蛋白，其中一个TALE蛋白与胶体金颗粒连接(喷点到结合垫上)，用于直接结合核酸抽提后的核酸样本中的目的DNA片段，另一个TALE蛋白固定在NC膜上作为T线。本实施例中核酸样本不用经过体外扩增反应，直接将样本滴加在本实施例制作的TALE蛋白-胶体金检测试纸条。具体的以检测HPV16-E6(SEQ IDNO:4)为例进行说明。针对SEQ ID NO:28设计TALE1RVDs为：NH NH NH NI NI NG HD HD NING NI NG NH HD NG NH NG，靶序列1为：GGGAATCCATATGCTGT(SEQ ID NO:28)；TALE2RVDs为：NG NI HD NG NH HD NH NI HD NH NG NH NI NH NH NG，靶序列2为TACTGCGACGTGAGGT(SEQ ID NO:11)靶序列1对应TALE蛋白用于与胶体金颗粒连接制备结合垫，靶序列2对应TALE蛋白用于制作T线。两个TALE蛋白识别同一目的DNA片段的不同核苷酸位点。

利用本实施例制作的TALE蛋白-胶体金检测试纸条进行核酸样本检测时，直接将抽提的核酸样本滴加在试纸条上进行检测，检测结果如图9所示，从下往上依次为T线和C线。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

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SEQUENCE LISTING

<110> 重庆市博艾迈迪森生物科技有限公司

<120> 一种核酸的免疫层析检测方法、检测试剂盒及其应用

<130> 2019/4/23

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> HPV16

<400> 1

ttatgcacag agctgca 17

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccacaggag cgacccagaa agttaccaca 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttgttgtatt gctgttctaa tgttgttcca 30

<210> 4

<211> 270

<212> DNA

<213> HPV16

<400> 4

cccacaggag cgacccagaa agttaccaca gttatgcaca gagctgcaaa caactataca 60

tgatataata ttagaatgtg tgtactgcaa gcaacagtta ctgcgacgtg aggtatatga 120

ctttgctttt cgggatttat gcatagtata tagagatggg aatccatatg ctgtatgtga 180

taaatgttta aagttttatt ctaaaattag tgagtataga cattattgtt atagtttgta 240

tggaacaaca ttagaacagc aatacaacaa 270

<210> 5

<211> 187

<212> DNA

<213> 烟草花叶病毒

<400> 5

ccctaagctc gatcttttcc gacactccat catcgtcttc gcctcagaac gatcgtaacc 60

taaactccgc cgatcggacg atggacggcg ttgccaccgg caacgaacgg gcggcgtata 120

agctgaaagg ctactttgat ttggccaaag aagagatcga caaagccgtt agggctgaag 180

aatgggg 187

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 烟草花叶病毒

<400> 6

aagctcgatc ttttccg 17

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccctaagctc gatcttttcc gacactccat catcg 35

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccccattctt cagccctaac ggctttgtcg atctc 35

<210> 9

<211> 133

<212> DNA

<213> HPV18

<400> 9

ccctacaagc tacctgatct gtgcacggaa ctgaacactt cactgcaaga catagaaata 60

acctgtgtat attgcaagac agtattggaa cttacagagg tatttgaatt tgcatttaaa 120

gatttatttg tgg 133

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> HPV18

<400> 10

aagctcgatc ttttccg 17

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> HVP16

<400> 11

tactgcgacg tgaggt 16

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cccacaggag cgacccagaa agttaccaca 30

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttgttgtatt gctgttctaa tgttgttcca g 31

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ccctacaagc tacctgatct gtgcacggaa ctg 33

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ccacaaataa atctttaaat gcaaattcaa ataccg 36

<210> 16

<211> 181

<212> DNA

<213> 博卡病毒

<400> 16

cctattgcct aaaaatagat gcattacatc ttacagcaga cctgatgtct gtacttctcc 60

agaaaactgg tttgttttag ctgaaaaaac ttactgtcac actcttgtta acgggctgcc 120

gcttccagaa cattacagaa aacactacca cgcaacccta gataacgaag ttctaccagg 180

g 181

<210> 17

<211> 16

<212> DNA

<213> 博卡病毒

<400> 17

ggtttgtttt agctga 16

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cctattgcct aaaaatagat gcattacatc ttac 34

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ccctggtaga acttcgttat ctagggttgc gtgg 34

<210> 20

<211> 166

<212> DNA

<213> 手足口病病毒

<400> 20

cccggacgtt ttgacggagg tgggcgtgtt tgggcagaat gcgcaattcc attatctgta 60

tagatccgga ttctgtgtgc acgtgcagtg caatgccagc aaattccacc agggtgctct 120

cttggttgcc atactgcctg agtacgtgct gggcaccatt gccggg 166

<210> 21

<211> 16

<212> DNA

<213> 手足口病病毒

<400> 21

tccaccaggg tgctct 16

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cccggacgtt ttgacggagg tgggcgtgtt tgg 33

<210> 23

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cccggcaatg gtgcccagca cgtactcagg cag 33

<210> 24

<211> 209

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒

<400> 24

cccacatatt aaccgccaat ctttaaaatg actatatcat tgataaaaat attggatggc 60

ttcagtaagc ttatatagta tcgccatact ataccaatac ctagttagca tttcgttgaa 120

tgaaatatta tccaatgtaa agttgattga taatgtatct agttcaccaa aaattcttaa 180

tttcagttga gcattattta ggaataggg 209

<210> 25

<211> 16

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒

<400> 25

attaaccgcc aatctt 16

<210> 26

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cccacatatt aaccgccaat ctttaaaatg ac 32

<210> 27

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ccctattcct aaataatgct caactgaaat taag 34

<210> 28

<211> 17

<212> DNA

<213> HPV16

<400> 28

gggaatccat atgctgt 17

Claims

1.一种非诊断目的的核酸的免疫层析检测方法，其特征在于，使用报告探针标记目的DNA片段，使用固定化的捕获探针结合报告探针标记的所述目的DNA片段；所述报告探针和所述捕获探针均包含TALE蛋白，或者仅有报告探针包含TALE蛋白，或者仅有捕获探针包含TALE蛋白；所述TALE蛋白的靶序列长度为16-17个碱基，且靶序列中A碱基含量在35%以下；

所述目的DNA片段来自人乳头瘤病毒HPV16的E6基因，或者来自烟草花叶病毒的接收号为AF426837.1的基因，或者来自人乳头瘤病毒HPV18的E7基因和人乳头瘤病毒HPV16的E6基因，或者来自博卡病毒的接收号为MG953832.1的基因，或者来自手足口病病原体的接收号为JQ746659.19的基因，或者来自非洲猪瘟病毒的接收号为KX354450.1的基因；

Ⅰ：针对所述报告探针和所述捕获探针均包含TALE蛋白的情况，所述核酸检测方法，在可视化检测单元中进行，依次包括以下步骤：

步骤（1）报告探针的制备：将TALE蛋白连接到胶体金颗粒上，得报告探针；

步骤（2）捕获探针的制备：将TALE蛋白固定在固相支持物上，得捕获探针；

步骤（3）标记目的DNA片段：将核酸样本与报告探针接触，形成核酸样本-报告探针混合物，所述核酸样本为从待测样品中抽提得到的总核酸，目的DNA片段位于核酸样本中；

以及，步骤（4）检测目的DNA片段：将核酸样本-报告探针混合物与捕获探针接触；

目的片段为人乳头瘤病毒HPV16的E6基因，连接到胶体金颗粒上的TALE蛋白的靶序列如SEQ ID NO:28所示，固定在固相支持物上的TALE蛋白的靶序列如SEQ ID NO:11所示；

Ⅱ：针对仅有报告探针包含TALE蛋白或者仅有捕获探针包含TALE蛋白的情况，所述核酸检测方法，在可视化检测单元中进行，依次包括以下步骤：

步骤（1）探针制备：所述报告探针由TALE蛋白连接胶体金颗粒制成、并且所述捕获探针由配体结合蛋白固定在固相支持物上制成，或者所述报告探针由配体结合蛋白连接胶体金颗粒制成、并且所述捕获探针由TALE蛋白固定在固相支持物上制成；

步骤（2）连接配体：在目的DNA片段上连接配体，所述目的DNA片段位于核酸样本中，得配体-核酸样本，所述配体用于结合配体结合蛋白，所述核酸样本为从待测样品中抽提得到的总核酸；

步骤（3）标记目的DNA片段：将配体-核酸样本与报告探针接触，形成配体-核酸样本-报告探针混合物；

以及，步骤（4）检测目的DNA片段：将配体-核酸样本-报告探针混合物与捕获探针接触；

Ⅱ-1：针对仅有捕获探针包含TALE蛋白的情况：

目的DNA片段来自人乳头瘤病毒HPV16的E6基因时，TALE蛋白的靶序列如SEQ ID NO:1所示；或者目的DNA片段来自人乳头瘤病毒HPV18的E7基因和人乳头瘤病毒HPV16的E6基因时，TALE蛋白的靶序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示；或者目的DNA片段来自博卡病毒的接收号为MG953832.1的基因时，TALE蛋白的靶序列如SEQ ID NO:17所示；或者目的DNA片段来自手足口病病原体的接收号为JQ746659.19的基因时，TALE蛋白的靶序列如SEQ IDNO:21所示；或者目的DNA片段来自非洲猪瘟病毒的接收号为KX354450.1的基因时，TALE蛋白的靶序列如SEQ ID NO:25所示；

Ⅱ-2：针对仅有报告探针包含TALE蛋白的情况：

目的DNA片段为来自烟草花叶病毒的接收号为AF426837.1的基因，TALE蛋白的靶序列如SEQ ID NO:6所示；

针对上述Ⅰ、Ⅱ两种情况，所述可视化检测单元包括依次固定在底板上的以下各部分：用于承接样品的样品垫、结合垫、固相支持物和吸水垫；所述报告探针包被在玻璃纤维膜材质的结合垫中；所述固相支持物为硝酸纤维膜、玻璃纤维膜或尼龙膜。

2.根据权利要求1所述的一种非诊断目的的核酸的免疫层析检测方法，其特征在于，所述配体-核酸样本由如下方法制备而成：将所述核酸样本加入到核酸体外扩增体系中，所述核酸体外扩增体系包括与配体连接的上游引物和与配体连接的下游引物；对核酸样本中的目的DNA片段进行体外扩增后，得所述配体-核酸样本。

3.根据权利要求2所述的一种非诊断目的的核酸的免疫层析检测方法，其特征在于，所述配体为生物素，所述配体结合蛋白为亲和素；所述核酸体外扩增体系为PCR、qPCR、RPA、RAA或LAMP。

4.根据权利要求1所述检测方法的核酸检测试剂盒，其特征在于，

包括核酸提取单元和可视化检测单元；

所述可视化检测单元包括依次固定在底板上的以下各部分：

样品垫：用于承接样品；

吸水垫：由吸水材料制成。

5.根据权利要求1所述检测方法的核酸检测试剂盒，其特征在于，

包括核酸提取单元、核酸体外扩增单元和可视化检测单元；

所述可视化检测单元包括依次固定在底板上的以下各部分：

样品垫：用于承接样品；

吸水垫：由吸水材料制成；

6. 根据权利要求4或5所述核酸检测试剂盒，其特征在于，所述核酸提取单元包括裂解液，所述裂解液的pH值为8.0，所述裂解液中含有20mM Tris,25mM NaCl,2.5mM EDTA,0.05重量% SDS。

7.根据权利要求4或5所述核酸检测试剂盒在制备疾病快速检测产品或疾病快速诊断产品中的应用，或者在生物制品的检验或检疫中的应用。