CN111751526B - 人体液中抗gm、iidd、nr自身抗体检测试剂盒及方法 - Google Patents

人体液中抗gm、iidd、nr自身抗体检测试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了人体液中抗GM、IIDD、NR自身抗体检测试剂盒及方法，检测试剂盒包括试纸条、工作液和封闭蛋白液；检测方法包括将工作液、封闭蛋白液混合形成样品稀释液，在样品稀释液中加入待检测样品；将待检测样品滴加到试纸条的样品垫上；取下试纸条上的吸水垫和样品垫，对载体膜进行洗涤，洗涤结束后再将吸水垫和碳量子标垫固定在载体膜的两端；将试纸条的碳量子标垫端浸入工作液中，5～10min于紫外灯下观察显色情况。本发明在检测过程中样品层析方法为倒层析法，同时载体膜洗涤方法为超声洗涤，有效的增加的检测灵敏度和特异性，强阳性血清稀释万倍以上仍可检测出抗体。

Description

人体液中抗GM、IIDD、NR自身抗体检测试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种人体液中抗GM、IIDD、NR自身抗体检测试剂盒及方法。
背景技术
抗神经节苷脂(Ganglioside，GM)抗体与许多神经系统疾病有关，例如急性和慢性多发性神经根神经病，包括吉兰-巴雷综合征的不同变体，慢性炎症性脱髓鞘多发性神经根神经病和多灶性运动神经病。也已经报道了这种抗体存在于副肿瘤周围神经病，神经退行性疾病，多发性硬化，重症肌无力和肌萎缩性侧索硬化中，更好地了解抗神经节苷脂抗体在不同神经系统疾病中的病理生理作用，可能会提高其作为诊断和预后生物标志物的效用。
特发性炎症性脱髓鞘疾病(Idiopathic inflammatory demyelinatingdiseases，IIDD)是中枢神经系统(CNS)自身免疫性炎症性和脱髓鞘疾病的异质性组。这些疾病包括多发性硬化症(MS)、急性弥漫性脑脊髓炎(ADEM)和视神经脊髓炎(NMO)。IIDD仍需要对其发病原因和潜在机制有更深入的了解，以实施更有效的疗法和诊断方法。不同自身抗体临床差异性也为探索免疫介导的神经炎症和脱髓鞘机制以及内在保护机制的提供了机会。
近年来，在患有慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(chronic inflammatorydemyelinating polyneuropathy，CIDP)的患者中已鉴定出一系列针对位于郎飞氏结(Nodeof rnvier，NR)的蛋白质的自身抗体。这些抗体靶向神经纤维蛋白，与发病机理有关。许多CIDP患者对免疫抑制或免疫调节疗法的反应高度敏感，自身抗体的检测有助于将CIDP与其他慢性多发性神经病区分开来。
目前针对这些疾病疑似患者血液和脑脊液中自身抗体检测的方法主要有间接免疫荧光法、流式细胞术、酶联免疫吸附法、蛋白质免疫印迹法、免疫斑点法，其中间接免疫荧光法与蛋白质免疫印迹法均均有操作复杂，操作技巧强(需专业人士或有经验人士操作)，且检测时长较长(需两天)；酶联免疫吸附法与流式细胞术检测成本高，同时需要特殊设备及需要有经验人士操作；免疫斑点法虽然提高了检测灵敏度，但是检测周期也需要1h。另外，使用这些方法在临床检测上的累积灵敏度估计为60％～80％，而且均存在操作繁琐，检测成本高，抗体需求量大，检测过程耗时等不足。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种人体液中抗GM、IIDD、NR抗体检测试剂盒及方法，解决现有的检测方法或检测试剂盒检测成本高、抗体需求量大、检测灵敏度低、检测过程耗时等问题。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案予以实现：
人体液中抗GM、IIDD、NR自身抗体检测试剂盒，包括试纸条、工作液和封闭蛋白液；
所述的试纸条包括垫板、设置有对照线和检测线的载体膜、吸水垫、碳量子标垫和样品垫；所述的载体膜检测线上固化有靶抗原Ag，Ag表示抗GM、IIDD、NR自身抗体对应的靶抗原中的某一抗原；对照线上固化有阴性对照抗原；所述的吸水垫、载体膜、样品垫、碳量子标垫均铺设在垫板上，吸水垫设置在载体膜对照线端，样品垫或碳量子标垫设置在载体膜检测线端；
其中，工作液为1×PBS或1×TBS或100mM磷酸钠盐缓冲液、0.5％～1％Triton X-100的混合液或0.5％～1％Tween-20、0.8％～1.0％NaCl的混合液，工作液的pH＝7.2～7.5；
封闭蛋白液通过以下方法制备得到：
将pET28a-GST或pET28a质粒载体转化至大肠杆菌中，得到含有pET28a-GST或pET28a质粒的菌体；将含有pET28a-GST或pET28a质粒菌体的菌液离心处理，所得上清液中加入破菌液，超声破碎15～35min后离心处理，取上清液，加入5％～10％BSA、2％～5％的PEG12000和1×蛋白酶抑制剂，得到为蛋白封闭液；
所述的质粒载体pET28a-His的破菌液为20mM Tris-HCl、10～200mM NaCl和10～100mM咪唑的混合液，破菌液的pH＝7.4～9.0；所述的质粒载体pET28a-GST的破菌液为1×PBS。
具体的，所述的CQD-Ab垫经过以下方法制备得到：
步骤1，将柠檬酸和尿素混合溶解后，微波加热直至溶液从无色透明变为棕色固体；溶解棕色固体，离心，取上清即为碳量子点水溶液；在碳量子点水溶液中依次加入PBS、NHS，使PBS终浓度为0.01M，NHS在的终浓度为4～5mg/mL，混匀后室温静置15～30min；再向溶液中加入PEG2000，PEG2000在溶液中的浓度为8～20mg/L，在37℃下反应2～4h，离心，弃上清，得到碳量子点溶液；
步骤2，在步骤1制备得到的碳量子点溶液中加入EDC和NHS，EDC在溶液中的浓度为4～10mg/mL，NHS在溶液中的浓度为4～5mg/mL；混匀室温静置15～30min；向溶液中加入羊抗人IgG二抗，羊抗人IgG二抗在溶液中的浓度为6～8mg/mL，37℃反应2h～4h，离心，弃上清，得到碳量子标二抗；
步骤3，将玻璃纤维垫用预处理液湿润后，37℃干燥后用0.5％～1％海藻糖湿润一半的玻璃纤维垫；再在整个玻璃纤维垫上平铺步骤2得到的碳量子标二抗，在37℃下烘干，得到碳量子标垫；
其中，预处理液由0.01M PBS、0.1％～0.2％PVA、0.5％-2％Tween 20、0.5％～1％海藻糖混合而成，预处理液pH＝7.0～7.2。
本发明还公开了人体液中抗GM、IIDD、NR自身抗体检测方法，采用本发明所述的检测试剂盒进行检测，该方法包括以下步骤：
步骤1，将工作液和封闭蛋白液按照体积比为5:1～15:1的比例混合形成样品稀释液；在样品稀释液中加入待检测样品；其中，样品稀释液：待检测样品体积比为10:1；
步骤2，将加有样品稀释液的待检测样品滴加到试纸条的样品垫上，倾斜试纸条使待检测样品均匀的流过包含有靶蛋白Ag的载体膜上，在室温下静置2～3min；
步骤3，取下步骤2处理后的试纸条上的吸水垫和样品垫，对载体膜进行洗涤，洗涤结束后将吸水垫和碳量子标垫固定在载体膜的两端；
步骤4，将步骤3处理后的试纸条的碳量子标垫端浸入工作液中，5～10min于紫外灯下观察显色情况。
进一步的，所述的步骤3中，将载体膜加入本发明所述的工作液中，超声洗涤10～30s，洗涤2～3次。
本发明还公开了人体液中抗GM、IIDD、NR自身抗体检测材料的制备方法，该方法用于获取本发明所述得靶抗原Ag，包括以下步骤：
步骤1，获取靶抗原Ag的CDS序列作为目的基因，将带有酶切位点的目的基因插入pET28a质粒载体中，得到重组质粒载体pET28a-Ag；Ag表示GM、IIDD、NR疾病自身抗体对应的靶抗原中的某一抗原；
步骤2，将重组载体pET28a-Ag转化至大肠杆菌中，得到含有靶抗原Ag的菌体；
步骤3，采用亲和层析法对步骤2得到的含有靶抗原Ag的菌体进行纯化，具体为：
步骤3.1，向步骤2得到的含有靶抗原Ag的菌体中加入破菌液，震荡涡旋后超声破碎15～35min，于4-8℃离心20～30min，所得上清即为初始样品液；
其中，菌液：破菌液的体积比为20:1；His标签抗原对应的破菌液为20mM Tris-HCl、10～200mM NaCl和10～100mM咪唑的混合液，破菌液的pH＝7.4～9.0；GST标签抗原对应的破菌液为1×PBS；
步骤3.2，用去离子水清洗亲和层析柱，再用破菌液平衡10～30倍柱体积，向平衡好的亲和层析柱中加入步骤3.1的初始样品液，4℃结合1～2小时；
步骤3.3，用第一缓冲液洗涤步骤3.2得到的亲和层析柱10～30倍柱体积，用第一洗脱液对洗涤后的预装柱进行梯度洗脱，收集洗脱液，将洗脱液通过脱盐处理，得到纯化后的靶抗原Ag；
其中，His标签抗原对应的第一缓冲液为20mM Tris-HCl和100～1000mM NaCl混合液，第一缓冲液的pH为7.4～9.0；GST标签抗原对应的第一缓冲液为1×PBS；
His标签抗原对应的第一洗脱液为20mM Tris-HCl和10～1000mM咪唑的混合液或20mM Tris-HCl和10～300mM Glu的混合液；GST标签抗原对应的第一洗脱液为50mMTris-HCl、10～100mM还原型谷胱甘肽的混合液，第一洗脱液pH为8.0；
步骤4，将经过步骤3纯化后的产物进行验证，将验证无误后的靶抗原Ag固化在载体膜上，得到人体液中GM、IIDD、NR自身抗体检测材料。
进一步的，在步骤3纯化的基础上还可采用离子交换层析法、疏水层析法或凝胶过滤层析法进行进一步纯化。
具体的，所述的离子交换层析法纯化过程为：
首先，将亲和层析后的洗脱样用第二缓冲液进行透析，期间置换第二缓冲液3～4次，每次透析时间2～8小时，将样品从透析袋中取出，得到初始样品液；
其中，阳离子交换层析法中第二缓冲液为pH＝5.0～7.0的20mM PB，阴离子交换层析法中第二缓冲液为pH＝7.0～9.0的20mM Tris；
然后，用去离子水清洗离子交换层析柱10～30倍柱体积，再用第二缓冲液处理10～30倍柱体积，将初始样品液以1ml/min流速上样；
最后，用第二缓冲液洗涤上样后的离子交换层析柱，用第二洗脱液对洗涤后的进行梯度洗脱，收集洗脱液，得到进一步纯化后的靶抗原Ag；
其中，阳离子交换层析法中第二洗脱液为pH＝5.0～7.0的20mM PB和50～1000mMNaCl的混合液；阴离子交换层析法中第二洗脱液为pH＝7.0～9.0的20mM Tris和50～1000mM NaCl的混合液。
具体的，所述的疏水层析法纯化过程为：
首先，在亲和层析的洗脱样中加入NaCl或(NH4)2SO4，使洗脱样中NaCl终浓度为0.6～2.0M、(NH4)2SO4终浓度为0.4～2.0M，得到初始样品液；
然后，用去离子水清洗疏水层析柱，再用第三缓冲液处理10～30倍柱体积，将初始样品液以1ml/min流速上样；
其中，第三缓冲液为pH＝6.0～9.0、20mM PB或0.4～2.0M(NH4)2SO4或pH＝6.0～9.0、20mM Tris和0.6～2.0M NaCl的混合液；
最后，用第三缓冲液洗涤10～30倍柱体积，用第三洗脱液对洗涤后的疏水层析柱进行梯度洗脱，收集洗脱液，得到进一步纯化后的靶抗原Ag；
其中，第三洗脱液为pH＝6.0～9.0、20mM PB或2.0～0.4M(NH4)2SO4或pH＝6.0～9.0、20mM Tris和2.0～0.6M NaCl的混合液。
具体的，所述的凝胶过滤层析法纯化过程为：
首先，用去离子水清洗凝胶过滤层析柱，再用第四缓冲液处理10～30倍柱体积，将亲和层析后的洗脱样品以1ml/min流速上样；
然后，用第四缓冲液洗涤，收集洗脱液，得到进一步纯化后的靶抗原Ag；
其中，第四缓冲液为1×PBS。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明在检测过程中样品层析方法为倒层析法，同时载体膜洗涤方法为超声洗涤，有效的增加了检测灵敏度和特异性。强阳性血清稀释万倍以上仍可检测出抗体。
(2)本发明的检测方法具有操作简单，不需要专业的设备辅助，且检测周期短，整个检测过程仅需20min左右。
(3)本发明在检测过程中单独制备了封闭蛋白，该封闭材料来源于与检测材料同源的对照细胞，将该封闭蛋白应用于自身抗体的检测能有效的降低杂质蛋白带来的污染，增加检测灵敏度。
(4)本发明的检测采用原核表达的方式获取抗原，获取周期更短，成本更低，一次获得的量更大，有助于获得质量稳定的试剂盒。同时通过多种纯化方法结合使用，极大的提高了靶抗原的纯度。因此，本发明的检测试剂盒具有更高的灵敏度和特异性。
附图说明
图1是本发明的试纸条的结构正视图。
图2是本发明的试纸条的结构侧视图。
图3是本发明的检测方法的流程示意图。
图4是本发明实施例3得到的结果，A图为阳性和阴性显色结果，B图为血清样品和脑脊液样品中阳性检出率。
具体实施方式
本发明公开了一种人体液中抗GM、IIDD、NR自身抗体检测试剂盒，该试剂能够对GM、IIDD、NR相关的二十几种自身抗体进行检测。
本发明的检测试剂盒具体包括试纸条、工作液和封闭蛋白液；
其中，试纸条包括垫板、设置有对照线和检测线的载体膜、吸水垫、碳量子标垫和样品垫；载体膜检测线上固化有靶抗原Ag，Ag表示GM、IIDD、NR自身抗体对应的靶抗原中的某一抗原，即表1中的不同靶抗原；对照线上固化有阴性对照抗原。吸水垫、载体膜、样品垫、碳量子标垫均铺设在垫板上，吸水垫设置在载体膜对照线端，样品垫或碳量子标垫设置在载体膜检测线端，如图1、图2所示。
本发明的碳量子标垫经过以下方法制备得到，具体包括碳量子点制备、二抗的标记以及碳量子标二抗的固定：
步骤1，碳量子点制备：
将柠檬酸和尿素混合溶解后，微波加热直至溶液从无色透明变为棕色固体；溶解棕色固体，离心，取上清即为碳量子点水溶液；在碳量子点水溶液中依次加入PBS、NHS，使PBS终浓度为0.01M，NHS在的终浓度为4～5mg/mL，混匀后室温静置15～30min；再向溶液中加入PEG2000，PEG2000在溶液中的浓度为8～20mg/L，在37℃下反应2～4h，离心，弃上清，得到碳量子点溶液；
步骤2，二抗的标记：
在步骤1制备得到的碳量子点溶液中加入EDC和NHS，EDC在溶液中的浓度为4～10mg/mL，NHS在溶液中的浓度为4～5mg/mL；混匀室温静置15～30min；向溶液中加入羊抗人IgG二抗，羊抗人IgG二抗在溶液中的浓度为6～8mg/mL，37℃反应2h～4h，离心，弃上清，得到碳量子标二抗。并加入适量的二抗保存液(0.01M PBS、20％甘油、1×蛋白酶抑制剂)，-20℃保存备用。
步骤3，碳量子标二抗的固定：
将玻璃纤维垫用预处理液湿润后，37℃干燥后用0.5％～1％海藻糖湿润一半的玻璃纤维垫；再在整个玻璃纤维垫上平铺步骤2得到的碳量子标二抗，在37℃下烘干，得到碳量子标垫；
其中，预处理液由0.01M PBS、0.1％～0.2％PVA、0.5％-2％Tween 20、0.5％～1％海藻糖混合而成，预处理液pH＝7.0～7.2。
本发明中的阴性对照抗原可选GAPDH或actin。
本发明的工作液为1×PBS或1×TBS或100mM磷酸钠盐缓冲液、0.5％～1％TritonX-100或0.5％～1％Tween-20、0.02％～0.05％EDTA的混合液，工作液的pH＝6.8～7.2；
本发明的封闭蛋白液通过以下方法制备得到：
将pET28a-GST或pET28a质粒载体转化至大肠杆菌中，具体使用诱导的方式将pET28a-GST或pET28a质粒在大肠杆菌中进行自身抗体靶抗原的表达。得到含有pET28a-GST或pET28a质粒的菌体；将含有pET28a-GST或pET28a质粒菌体的菌液离心处理，所得上清液中加入破菌液，超声破碎15～35min后离心处理，取上清液，加入5％～10％BSA、2％～5％的PEG12000和1×蛋白酶抑制剂，得到为蛋白封闭液。
其中，本发明中质粒载体的破菌液为1×PBS。
碳量子点是一种新型碳材料，由于其光学性质特殊，无毒性，制备简单，生物相容性良好等诸多优点，其在生物传感和成像领域具有巨大的应用潜能。本发明基于免疫层析法将碳量子点标记在IgG二抗上，利用紫外光使碳量子点发光显色。
本发明的载体膜具体可选NC膜或PVDF膜。
本发明试剂盒涉及的检测的自身抗体及靶抗原信息如表1所示：
表1枢神经脱髓鞘、郎飞氏结、神经节苷脂自身抗体及靶抗原Ag
中枢神经脱髓鞘靶抗原 郎飞氏结靶抗原 神经节苷脂靶抗原
AQP1 CASPR1 GM1、GM2、GM3、GM4
MBP NF155 GD-1α、GD-1β、GD2、GD3
GFAP NF186 GT-1α、GT-1β
Flotillin1 CNTN1 GQ-1β
Flotillin2 CNTN2 Sulfatides
本发明还公开了一种人体液中GM、IIDD、NR自身抗体检测方法，该检测方法基于本发明的上述检测试剂盒进行检测，该方法流程图如图3所示，该方法包括以下步骤：
步骤1，样品稀释和封闭：
将工作液和封闭蛋白液按照体积比为5:1～15:1的比例混合形成样品稀释液；在样品稀释液中加入待检测样品，对待检测样品进行稀释和封闭，降低背景，提高检测灵敏度。其中，样品稀释液：待检测样品体积比为10:1，本发明中所述的待检测样品一般为血清或脑脊液。
步骤2，样品倒层析：
将加有样品稀释液的待检测样品滴加到试纸条的样品垫上，倾斜试纸条使待检测样品均匀的流过包含有靶抗原Ag的载体膜上，在室温下静置2～3min。
步骤3，载体膜洗涤：
取下步骤2处理后的试纸条上的吸水垫和样品垫，对载体膜进行洗涤，去除杂质。具体为超声洗涤10～30s，洗涤2～3次。洗涤结束后再将吸水垫和碳量子标垫固定在载体膜的两端。
优选的，本步骤中使用工作液对载体膜进行洗涤，工作液为1×PBS或1×TBS或100mM磷酸钠盐缓冲液、0.5％～1％Triton X-100的混合液或0.5％～1％Tween-20、0.8％～1.0％NaCl的混合液，工作液的pH＝7.2～7.5。
步骤4，显色：
将步骤3处理后的试纸条的碳量子标垫端浸入工作液中，5～10min于紫外灯下观察显色情况。
本发明检测试剂盒中靶抗原Ag可通过现有技术获取，也可通过本发明的下述方法获取，优选本发明的制备方法。具体的，本发明的人体液中GM、IIDD、NR自身抗体检测材料的制备方法包括以下步骤：
步骤1，获取靶抗原Ag的CDS序列作为目的基因，将带有酶切位点的目的基因插入pET28a质粒载体中，得到重组质粒载体pET28a-Ag；Ag表示GM、IIDD、NR疾病自身抗体对应的靶抗原中的某一抗原；
步骤1.1，通过人工合成或者PCR方法获得自身抗体靶抗原Ag的CDS序列作为目的基因，并在目的基因两端加设NheI/NotI的酶切位点；
步骤1.2，将带有酶切位点的目的基因插入pET28a载体中，插入位点为NheI/NotI，得到重组载体，将该重组载体命名为pET28a-Ag；
步骤1.3，对重组质粒pET28a-Ag进行测序，将测序正确的带有目的基因的菌种与载体菌种扩大培养后进行质粒提取，得到重组载体pET28a-Ag。具体的，本发明的载体菌种可选DH5α、TOP10或JM109。
步骤2，将重组载体pET28a-Ag转化至大肠杆菌中，得到含有靶抗原Ag的菌体。
具体的，使用诱导的方式将重组载体pET28a-Ag在大肠杆菌中进行自身抗体靶抗原的表达，以获得足够量的自身抗体靶抗原Ag。具体的，可采用诱导剂IPTG。优选的，本发明中可选的大肠杆菌有BL21(DE3)、Arctic express，Arctic RIL express。
步骤3，采用亲和层析法对步骤2得到的含有靶抗原Ag的菌体进行纯化；具体的，亲和层析法纯化过程包括：
步骤3.1，向步骤2得到的含有靶抗原Ag的菌体中加入破菌液，震荡涡旋后超声破碎15～35min，于4-8℃离心20～30min，所得上清即为初始样品液；
其中，菌液：破菌液的体积比为20:1；
在本发明的具体实施例中，His标签抗原对应的亲和层析法中的破菌液为20mMTris-HCl、10～200mM NaCl和10～100mM咪唑的混合液，破菌液的pH＝7.4～9.0；GST标签抗原对应的亲和层析法中的破菌液为1×PBS。
步骤3.2，用去离子水清洗亲和层析柱，再用破菌液平衡10～30倍柱体积，向平衡好的亲和层析柱中加入步骤3.1的初始样品液，4℃结合1～2小时，确保菌液中的目标蛋白充分结合在柱上；
步骤3.3，用第一缓冲液洗涤步骤3.2得到的亲和层析柱10-30倍柱体积，去除未结合到柱上的蛋白；然后用第一洗脱液对洗涤后的预装柱进行梯度洗脱，洗脱目的蛋白，收集洗脱液，将洗脱液通过脱盐处理，得到纯化后的靶抗原Ag；
在本发明的具体实施例中，His标签抗原对应的亲和层析法中第一缓冲液为20mMTris-HCl和100～1000mM NaCl混合液，洗涤液的pH为7.4～9.0；第一洗脱液为20mM Tris-HCl和10～1000mM咪唑的混合液或20mM Tris-HCl和10～300mM Glu的混合液。GST标签抗原对应的亲和层析法中的第一缓冲液为1×PBS；第一洗脱液为50mMTris-HCl、10～100mM还原型谷胱甘肽的混合液，第一洗脱液pH为8.0。
步骤4，将经过步骤3纯化后的产物进行验证，确保纯化的靶抗原Ag正确，将验证无误后的靶抗原Ag固化在载体膜上，得到人体液中GM、IIDD、NR自身抗体检测材料。
在本发明中，若部件靶抗原在经过亲和层析后不能满足实验要求，在步骤3纯化的基础上还可采用离子交换层析法、疏水层析法或凝胶过滤层析法进行进一步纯化。
其中，离子交换层析法纯化过程为：
首先，将亲和层析后的洗脱样用第二缓冲液进行透析，期间置换第二缓冲液3～4次，每次透析时间2～8小时，将样品从透析袋中取出，得到初始样品液；其中，在本发明实施例中，阳离子层析法中第二缓冲液为pH＝5.0～7.0的20mM PB，阴离子层析法中第二缓冲液为pH＝7.0～9.0的20mM Tris。
然后，用去离子水清洗离子交换层析柱10～30倍柱体积，再用第二缓冲液处理10～30倍柱体积，将初始样品液以1ml/min流速上样；
最后，用第二缓冲液洗涤上样后的离子交换层析柱，用第二洗脱液对洗涤后的进行梯度洗脱，收集洗脱液，得到进一步纯化后的靶抗原Ag。
其中，在本发明的下列实施例中，阳离子交换层析法中第二洗脱液为pH＝5.0～7.0的20mM PB和50～1000mM NaCl的混合液；阴离子交换层析法中第二洗脱液为pH＝7.0～9.0的20mM Tris和50～1000mM NaCl的混合液。
疏水层析法纯化过程为：
首先，在亲和层析的洗脱样中加入NaCl或(NH4)2SO4，使洗脱样中NaCl终浓度为0.6～2.0M、(NH4)2SO4终浓度为0.4～2.0M，得到初始样品液；
然后，用去离子水清洗疏水层析柱，再用第三缓冲液处理10～30倍柱体积，将初始样品液以1ml/min流速上样；其中，第三缓冲液为pH＝6.0～9.0、20mM PB或0.4～2.0M(NH4)2SO4或pH＝6.0～9.0、20mM Tris和0.6～2.0M NaCl的混合液；
最后，用第三缓冲液洗涤10～30倍柱体积，用第三洗脱液对洗涤后的疏水层析柱进行梯度洗脱，收集洗脱液，得到进一步纯化后的靶抗原Ag；其中，第三洗脱液为pH＝6.0～9.0、20mM PB或2.0～0.4M(NH4)2SO4或pH＝6.0～9.0、20mM Tris和2.0～0.6M NaCl的混合液。
凝胶过滤层析法纯化过程为：
首先，用去离子水清洗凝胶过滤层析柱，再用第四缓冲液处理10～30倍柱体积，将亲和层析后的洗脱样品以1ml/min流速上样；
然后，用第四缓冲液洗涤，收集洗脱液，得到进一步纯化后的靶抗原Ag；其中，第四缓冲液为1×PBS。
本发明检测试剂盒中的阴性对照抗原可通过现有技术获取，也可通过本发明的下述方法获取，优选本发明的方法。具体的，采用本发明方法制备阴性对照抗原的过程也包括四个步骤，其中步骤1、步骤2与本发明的靶抗原Ag的获取方法中步骤1、步骤2相同，仅是将靶抗原Ag替换为阴性对照抗原，具体为：
步骤1，获取阴性对照抗原的CDS序列作为目的基因，将带有酶切位点的目的基因插入pET28a质粒载体中，得到重组质粒载体。
步骤2，将重组载体转化至大肠杆菌中，得到含有阴性对照抗原的菌体。
步骤3，向步骤2得到的含有阴性对照抗原的菌体中加入PBS，菌液：PBS体积比为20:1，震荡涡旋后超声破碎15～35min，于4-8℃离心20-30min，所得上清即为阴性对照抗原样品；
步骤4，将步骤3获得阴性对照抗原样品固化在载体膜上。
以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是以下实施例仅是本发明的较佳实施例，本发明并不局限于以下具体实施例中，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
本发明下述实施例中所用的亲和层析柱、离子交换层析柱、疏水层析柱、凝胶过滤层析柱均为市售，采购与GE公司。pET28a载体采购于上海酶研生物科技有限公司，载体菌种DH5α、TOP10、JM109，大肠杆菌BL21(DE3)、Arctic express，Arctic RIL express菌株采购于北京索莱宝科技有限公司；载体膜采购于GE公司。
实施例1
本实施例公开了一种人体液中抗GM、IIDD、NR自身抗体检测材料的制备方法，本实施例中的靶抗原为AQP4(中枢神经脱髓鞘)，阴性对照抗原为GAPDH，该制备方法具体包括：
1、质粒构建：
通过人工合成或者PCR方法获得自身抗体靶抗原AQP4和GAPDH的CDS序列作为目的基因，并在目的基因两端加设NheI/NotI的酶切位点；
将带有酶切位点的目的基因插入pET28a载体中，插入位点为NheI/NotI，得到重组载体，将该重组载体命名为pET28a-AQP4和pET28a-GAPDH，具体为：
取pET28a质粒的甘油菌种接种于卡那霉素抗性的3mL LB液体培养基，置37℃恒温培养箱，220r/min，过夜摇菌。第二日吸取菌液500μL保存菌种，剩余2.5mL菌液用质粒小提试剂盒提取，测浓度。
pET28a载体酶切：50μL酶切体系，3μg载体，NheI、NotI酶各1μL，10×酶切Buffer 5μL，ddH2O补齐至50μL，37℃水浴酶切2h。
酶切产物回收，0.8％琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，按照凝胶回收试剂盒说明书进行载体片段回收。
目的基因与载体片段连接：20μL连接体系，50ng pET28a载体，200ng靶抗原基因片段，T4连接酶1μL，ddH2O补齐至20μL，16℃连接过夜。
将上述连接产物质粒分别转化入大肠杆菌Top10感受态细胞中，涂布于卡那霉素固体LB培养板，37℃过夜，第二日挑取5个菌株，接种于卡那霉素抗性的液体LB培养基，37℃过夜培养。次日，各管吸取500μL菌液，-20℃保存，剩余菌液质粒小提，酶切鉴定正确的菌株送测序再次鉴定。测序鉴定正确的菌株留取菌种，-80℃保存。
测序正确的带有目的基因菌种及载体菌种DH5α扩大培养进行质粒大提，测浓度，得到重组载体pET28a-Ag和pET28a-GAPDH。
2、蛋白诱导表达
使用诱导的方式将重组载体pET28a-AQP4和pET28a-GAPDH在大肠杆菌BL21(DE3)中进行自身抗体靶抗原和阴性对照抗原的表达，得到含有靶抗原的菌体和阴性对照抗原的菌体；
3、靶抗原AQP4的纯化
采用亲和层析法对得到的含有靶抗原AQP4的菌体进行纯化，纯化方法为首先进行亲和层析，然后进行离子交换层析。
4、阴性对照抗原的获得
向步骤2得到的含有阴性对照抗原的菌体中加入PBS，菌液：PBS体积比为20:1，震荡涡旋后超声破碎15～35min，于4-8℃离心20-30min，所得上清即为阴性对照抗原样品。
5、靶抗原AQP4和阴性对照抗原的固化
将经过纯化后靶抗原AQP4固化在载体膜的近样品垫端，将阴性对照抗原固化在载体膜的近吸水垫端，得到人体液中GM、IIDD、NR自身抗体检测试纸条。
本发明表1中的其他靶抗原对应的检测试纸条的制备方法同实施例1，区别在于不同靶抗原对应的标签和纯化方法不同，具体见表2。
表2 GM、IIDD、NR自身抗体对应靶抗原表达纯化相关信息
Figure BDA0002559770050000181
Figure BDA0002559770050000191
实施例2
本实施例公开了一种检测试剂盒，该试剂盒包括试纸条、工作液和封闭蛋白液；
试纸条为实施例1中靶抗原对应的试纸条，具体的，试纸条包括垫板、设置有对照线和检测线的载体膜、吸水垫、样品垫和碳量子标垫；载体膜检测点上固化有靶抗原Ag，Ag表示GM、IIDD、NR疾病自身抗体对应的靶抗原中的某一抗原；对照线上固化有阴性对照抗原。吸水垫、载体膜、样品垫、碳量子标垫均铺设在垫板上，吸水垫设置在载体膜对照线端，样品垫或碳量子标垫设置在载体膜检测点端，如图1、图2所示。
其中，工作液为1×PBS、0.5％Triton X-100、0.04％EDTA的混合液，工作液的pH＝6.8。
封闭蛋白液通过以下方法制备得到：
使用采用诱导剂IPTG将pET28a-GST质粒载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到含有pET28a-GST质粒的菌体；将菌液5000～7500g，离心5min，加入破菌液1×PBS以10～30％的功率超声破碎15～35min，6000～7500g，离心25min以上，上清中加入1/4体积的质量分数25％的BSA、2％的PEG12000和蛋白酶抑制剂，得到封闭蛋白液，于4℃保存备用。
碳量子标垫经过以下方法制备得到：
步骤1，碳量子点的制备：
在10mL ddH2O中加入3-5g柠檬酸和3-5g尿素，待完全溶解后，于微波炉中加热4-5min，若溶液从无色透明变为棕色固体证明形成了碳量子点。将得到的棕色固体用适量ddH2O溶解，3000g，20min离心，取上清即为碳量子点水溶液。取1mL碳量子点水溶液，先加入1/10体积的0.1M的PBS缓冲液(pH＝7.4)，再加入NHS使其终浓度为4～5mg/mL，涡旋混匀后室温静置15～30min。向溶液中加入PEG2000使其终浓度8～20mg/L，于摇床中37℃反应2～4h，10000g，离心30min，弃上清，加入适量0.01M的PBS缓冲液(pH＝7.4)，4℃保存备用。
步骤2，二抗的标记：
取上述制备好的碳量子点溶液，稀释至0.02-0.05mg/mL，加入EDC和NHS，二者终浓度分别为4mg/mL～10mg/mL和4～5mg/mL，涡旋混匀后室温静置15～30min。向溶液中加入羊抗人IgG二抗，终浓度为6～8mg/mL，于摇床中37℃反应2～4h，20000g，4℃，离心2～3h以上，弃上清，得到碳量子标二抗；加入适量二抗保存液(0.01M PBS、20％～30％甘油、1×蛋白酶抑制剂)，-20℃保存备用。
步骤3，碳量子标二抗的固定：
将玻璃纤维垫裁成与试纸条规格一致，玻璃纤维垫用预处理液湿润后，37℃干燥后用0.5％～1％海藻糖湿润一半的玻璃纤维垫，室温密封保存备用。用2.5μL枪慢慢平铺在处理好的玻璃纤维垫上，每个玻璃纤维垫上平铺10μL的碳量子标二抗，放入37℃培养箱中烘干，4℃密封保存。
其中，预处理液由0.01M PBS、0.1％～0.2％PVA、0.5％-2％Tween 20、0.5％～1％海藻糖混合而成，预处理液pH＝7.0～7.2。
实施例3
本实施例公开了一种人体液中抗GM、IIDD、NR自身抗体检测方法，采用实施例2记载的检测试剂盒进行检测，具体包括：
样品稀释和封闭：将工作液和封闭蛋白液按照体积比为10:1的比例混合后涡旋震荡数秒，室温静置5min，得到样品稀释液；按照样品稀释液：待检测样品体积比为10:1在样品稀释液中加入待检测样品。
样品倒层析：将稀释和封闭后的待检测样品加入到带小孔的2mL EP管中，将小孔底部接触样品垫，保持一定倾斜角度，使待检测样品均匀、匀速流过包含有靶抗原的NC膜上，在室温下静置2～3min。
载体膜洗涤：取下试纸条上的吸水垫和样品垫，将试纸条放入加有3mL工作液的10mL离心管中，超声洗涤10～30s，洗涤2～3次。洗涤结束后再将吸水垫和碳量子标垫固定在载体膜的两端。
显色：将组装好的试纸条的碳量子标垫端浸入工作液中，静置2～5min，约5～10min于紫外灯下观察显色情况。
结果如图4所示，阳性和阴性结果如图4中A所示，阳性样品检测结果中检测线颜色较对照线深。同时，分别对100例已经明确为AQP1阳性的血清样品和100例已经明确为AQP1阳性的脑脊液样品进行检测，结果如图4中B所示，100例AQP1阳性血清中阳性检出率为95％；脑脊液样品阳性检出率分别为100％。
根据实施例1和实施例2的方法分别制备AQP1等22个靶抗原的检测试剂盒，按照实施例3提供的方法分别对100例已经明确的阳性血清样品和100例已经明确的阳性脑脊液样品进行检测，并统计其阳性率，结果见表3。
表3、22个自身抗体检测阳性率
Figure BDA0002559770050000211
Figure BDA0002559770050000221
本发明方法可以提高血清和脑脊液的阳性检出率，有效的增加检测灵敏度和特异性。

Claims (7)

1.人体液中抗GM、IIDD、NR自身抗体检测试剂盒，其特征在于，包括试纸条、工作液和封闭蛋白液；
所述的试纸条包括垫板、设置有对照线和检测线的载体膜、吸水垫、碳量子标垫和样品垫；所述的载体膜检测线上固化有靶抗原Ag，Ag表示抗GM、IIDD、NR自身抗体对应的靶抗原中的某一抗原，具体为：IIDD自身抗体对应的靶抗原AQP1、MBP、GFAP、Flotillin1、Flotillin2，NR自身抗体对应的靶抗原CASPR1、NF155、NF186、CNTN1、CNTN2，GM自身抗体对应的靶抗原GM1、GM2、GM3、GM4、GD-1α、GD-1β、GD2、GD3、GT-1α、GT-1β、GQ-1β、Sulfatides；
对照线上固化有阴性对照抗原，所述阴性对照抗原可选GAPDH或actin；所述的吸水垫、载体膜、样品垫、碳量子标垫均铺设在垫板上，吸水垫设置在载体膜对照线端，样品垫或碳量子标垫设置在载体膜检测线端；
其中，工作液为1×PBS或1×TBS或100mM磷酸钠盐缓冲液、0.5% ~1%Triton X-100的混合液或0.5%~1%Tween-20、0.8%~1.0%NaCl的混合液，工作液的pH=7.2~7.5；
封闭蛋白液通过以下方法制备得到：
将pET28a-GST或pET28a质粒载体转化至大肠杆菌中，得到含有pET28a-GST或pET28a质粒的菌体；将含有pET28a-GST或pET28a质粒菌体的菌液离心处理，所得上清液中加入破菌液，超声破碎15~35min后离心处理，取上清液，加入5%~10%BSA、2%~5%的PEG12000和1×蛋白酶抑制剂，得到为蛋白封闭液；
所述的质粒载体pET28a-His的破菌液为20mM Tris-HCl、10~200mM NaCl和10~100mM咪唑的混合液，破菌液的pH=7.4~9.0；所述的质粒载体pET28a-GST的破菌液为1×PBS。
2.如权利要求1所述的人体液中抗GM、IIDD、NR自身抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的碳量子标垫经过以下方法制备得到：
步骤1，将柠檬酸和尿素混合溶解后，微波加热直至溶液从无色透明变为棕色固体；溶解棕色固体，离心，取上清即为碳量子点水溶液；在碳量子点水溶液中依次加入PBS、NHS，使PBS终浓度为0.01M，NHS在的终浓度为4~5mg/mL，混匀后室温静置15~30min；再向溶液中加入PEG2000， PEG2000在溶液中的浓度为8~20mg/L，在37℃下反应2~4h，离心，弃上清，得到碳量子点溶液；
步骤2，在步骤1制备得到的碳量子点溶液中加入EDC和NHS，EDC在溶液中的浓度为4~10mg/mL，NHS在溶液中的浓度为4~5mg/mL；混匀室温静置15~30min；向溶液中加入羊抗人IgG二抗，羊抗人IgG二抗在溶液中的浓度为6~8mg/mL，37℃反应2h~4h，离心，弃上清，得到碳量子标二抗；
步骤3，将玻璃纤维垫用预处理液湿润后，37℃干燥后用0.5%~1%海藻糖湿润一半的玻璃纤维垫；再在整个玻璃纤维垫上平铺步骤2得到的碳量子标二抗，在37℃下烘干，得到碳量子标垫；
其中，预处理液由0.01M PBS、0.1%~0.2% PVA、0.5%-2% Tween 20、0.5%~1%海藻糖混合而成，预处理液pH=7.0~7.2。
3.人体液中抗GM、IIDD、NR自身抗体检测材料的制备方法，该方法用于获取权利要求1或2中靶抗原Ag，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，获取靶抗原Ag的CDS序列作为目的基因，将带有酶切位点的目的基因插入pET28a质粒载体中，得到重组质粒载体pET28a-Ag；Ag表示抗GM、IIDD、NR自身抗体对应的靶抗原中的某一抗原，具体为：IIDD自身抗体对应的靶抗原AQP1、MBP、GFAP、Flotillin1、Flotillin2，NR自身抗体对应的靶抗原CASPR1、NF155、NF186、CNTN1、CNTN2，GM自身抗体对应的靶抗原GM1、GM2、GM3、GM4、GD-1α、GD-1β、GD2、GD3、GT-1α、GT-1β、GQ-1β、Sulfatides；
步骤2，将重组载体pET28a-Ag转化至大肠杆菌中，得到含有靶抗原Ag的菌体；
步骤3，采用亲和层析法对步骤2得到的含有靶抗原Ag的菌体进行纯化，具体为：
步骤3.1，向步骤2得到的含有靶抗原Ag的菌体中加入破菌液，震荡涡旋后超声破碎15~35min，于4-8℃离心20~30min，所得上清即为初始样品液；
其中，菌液：破菌液的体积比为20:1；His标签抗原对应的破菌液为20mM Tris-HCl、10~200mM NaCl和10~100mM咪唑的混合液，破菌液的pH=7.4~9.0；GST标签抗原对应的破菌液为1×PBS；
步骤3.2，用去离子水清洗亲和层析柱，再用破菌液平衡10~30倍柱体积，向平衡好的亲和层析柱中加入步骤3.1的初始样品液，4℃结合1~2小时；
步骤3.3，用第一缓冲液洗涤步骤3.2得到的亲和层析柱10~30倍柱体积，用第一洗脱液对洗涤后的预装柱进行梯度洗脱，收集洗脱液，将洗脱液通过脱盐处理，得到纯化后的靶抗原Ag；
其中，His标签抗原对应的第一缓冲液为20mM Tris-HCl和100~1000mM NaCl混合液，第一缓冲液的pH为7.4~9.0；GST标签抗原对应的第一缓冲液为1×PBS；
His标签抗原对应的第一洗脱液为20mM Tris-HCl和10~1000mM咪唑的混合液或20mMTris-HCl和10~300mM Glu的混合液；GST标签抗原对应的第一洗脱液为50mMTris-HCl、10~100mM还原型谷胱甘肽的混合液，第一洗脱液pH为8.0；
步骤4，将经过步骤3纯化后的产物进行验证，将验证无误后的靶抗原Ag固化在载体膜上，得到人体液中GM、IIDD、NR自身抗体检测材料。
4.如权利要求3所述的人体液中抗GM、IIDD、NR自身抗体检测材料的制备方法，其特征在于，在步骤3纯化的基础上还可采用离子交换层析法、疏水层析法或凝胶过滤层析法进行进一步纯化。
5.如权利要求4所述的人体液中抗GM、IIDD、NR自身抗体检测材料的制备方法，其特征在于，所述的离子交换层析法纯化过程为：
首先，将亲和层析后的洗脱样用第二缓冲液进行透析，期间置换第二缓冲液3~4次，每次透析时间2~8小时，将样品从透析袋中取出，得到初始样品液；
其中，阳离子交换层析法中第二缓冲液为pH=5.0~7.0的20mM PB，阴离子交换层析法中第二缓冲液为pH=7.0~9.0的20mM Tris；
然后，用去离子水清洗离子交换层析柱10~30倍柱体积，再用第二缓冲液处理10~30倍柱体积，将初始样品液以1ml/min流速上样；
最后，用第二缓冲液洗涤上样后的离子交换层析柱，用第二洗脱液对洗涤后的进行梯度洗脱，收集洗脱液，得到进一步纯化后的靶抗原Ag；
其中，阳离子交换层析法中第二洗脱液为pH=5.0~7.0的20mM PB和50~1000mM NaCl的混合液；阴离子交换层析法中第二洗脱液为pH=7.0~9.0的20mM Tris和50~1000mM NaCl的混合液。
6.如权利要求4所述的人体液中抗GM、IIDD、NR自身抗体检测材料的制备方法，其特征在于，所述的疏水层析法纯化过程为：
首先，在亲和层析的洗脱样中加入NaCl或(NH4)2SO4，使洗脱样中NaCl终浓度为0.6~2.0M、(NH4)2SO4终浓度为0.4~2.0M，得到初始样品液；
然后，用去离子水清洗疏水层析柱，再用第三缓冲液处理10~30倍柱体积，将初始样品液以1ml/min流速上样；
其中，第三缓冲液为pH=6.0~9.0、20mM PB或0.4~2.0M(NH4)2SO4或pH=6.0~9.0、20mMTris和0.6~2.0M NaCl的混合液；
最后，用第三缓冲液洗涤10~30倍柱体积，用第三洗脱液对洗涤后的疏水层析柱进行梯度洗脱，收集洗脱液，得到进一步纯化后的靶抗原Ag；
其中，第三洗脱液为pH=6.0~9.0、20mM PB或2.0~0.4M(NH4)2SO4或pH=6.0~9.0、20mMTris和2.0~0.6M NaCl的混合液。
7.如权利要求4所述的人体液中抗GM、IIDD、NR自身抗体检测材料的制备方法，其特征在于，所述的凝胶过滤层析法纯化过程为：
首先，用去离子水清洗凝胶过滤层析柱，再用第四缓冲液处理10~30倍柱体积，将亲和层析后的洗脱样品以1ml/min流速上样；
然后，用第四缓冲液洗涤，收集洗脱液，得到进一步纯化后的靶抗原Ag；
其中，第四缓冲液为1×PBS。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113817280A (zh) * 2021-09-08 2021-12-21 南京雷泰克材料科技有限公司 一种软质抗菌聚氯乙烯材料的制备方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103728447A (zh) * 2014-01-03 2014-04-16 北京晶泰美康生物科技有限公司 可控量子点位点特异性桥接偶联的抗体标记方法及其应用
CN104003370A (zh) * 2014-05-16 2014-08-27 南京航空航天大学 用于检测水中铍的荧光碳量子点探针的制备方法
WO2018035519A1 (en) * 2016-08-19 2018-02-22 Amrita Vishwa Vidyapeetham Compositions and methods for autoimmune disease treatment
WO2019067403A2 (en) * 2017-09-26 2019-04-04 Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute COMPOSITIONS AND METHODS FOR EVALUATION OF PAINFUL DEMYELINIZING AND NON-DEMYELING DISEASES
CN110079583A (zh) * 2019-05-27 2019-08-02 重庆博艾迈迪森生物科技有限公司 一种核酸的免疫层析检测方法、检测试剂盒及其应用
CN110187124A (zh) * 2019-05-20 2019-08-30 上海凯创生物技术有限公司 一种碳量子点的制备方法及其用途

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7473423B2 (en) * 1994-04-29 2009-01-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Human IgM antibodies, and diagnostic and therapeutic uses thereof particularly in the central nervous system
US20090075339A1 (en) * 1997-09-19 2009-03-19 Innexus Biotechnology International Limited Autophilic antibodies
EP1871367A2 (en) * 2005-01-28 2008-01-02 Xanthus Pharmaceuticals, Inc. Compounds for treating inflammatory and demyelinating diseases
US20130302831A1 (en) * 2012-02-29 2013-11-14 Roger A. Sabbadini Methods and kits for detecting and diagnosing neurotrauma
CN106432440B (zh) * 2016-07-21 2020-11-06 山东绿都生物科技有限公司 羊布鲁氏菌抗体ppa-elisa检测试剂盒及其制备方法
CN110606888B (zh) * 2019-08-12 2021-08-31 陕西脉元生物科技有限公司 人体液中抗gababr自身抗体的检测材料、制备方法及应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103728447A (zh) * 2014-01-03 2014-04-16 北京晶泰美康生物科技有限公司 可控量子点位点特异性桥接偶联的抗体标记方法及其应用
CN104003370A (zh) * 2014-05-16 2014-08-27 南京航空航天大学 用于检测水中铍的荧光碳量子点探针的制备方法
WO2018035519A1 (en) * 2016-08-19 2018-02-22 Amrita Vishwa Vidyapeetham Compositions and methods for autoimmune disease treatment
WO2019067403A2 (en) * 2017-09-26 2019-04-04 Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute COMPOSITIONS AND METHODS FOR EVALUATION OF PAINFUL DEMYELINIZING AND NON-DEMYELING DISEASES
CN110187124A (zh) * 2019-05-20 2019-08-30 上海凯创生物技术有限公司 一种碳量子点的制备方法及其用途
CN110079583A (zh) * 2019-05-27 2019-08-02 重庆博艾迈迪森生物科技有限公司 一种核酸的免疫层析检测方法、检测试剂盒及其应用

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