KR101755266B1 - Tale을 포함하는 질환 검출 또는 진단용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 각종 질환의 검출 또는 진단용으로 사용할 수 있는 조성물 또는 키트에 관한 것이다.

Description

TALE을 포함하는 질환 검출 또는 진단용 조성물{COMPOSITION FOR DETECTION OR DIAGNOSIS OF DISEASES CONTAINING TRANSCRIPTION ACTIVATOR-LIKE EFFECTOR}
본 발명은 각종 질환의 검출 또는 진단용으로 사용할 수 있는 조성물 또는 키트에 관한 것이다.
병원성 박테리아나 바이러스, 유전적 영향들로 인해 발생하는 질병들에 대해 이들을 조기에 검출하기 위한 기술에 대한 연구들이 진행이 되고 있는데, 특정 단백질, 즉 표면 마커나 특정 항원를 목적으로 검출하는 방법 (Biosensors ＆ bioelectronics, vol. 34, pp. 12-24, Apr 15 2012; ACS nano, vol. 7, pp. 4967-4976, Jun 25 2013), 병원성 박테리아에 대한 배양을 통해 검출하는 방법 (Nature reviews Gastroenterology ＆ hepatology, vol. 9, pp. 312-322, Mar 27 2012), DNA를 초점으로 목적 부위의 primer를 제작해 PCR 방식을 통해 검출하거나 (Science, vol. 314, pp. 1464-1467, Dec 1 2006; Nature nanotechnology, vol. 8, pp. 369-375, May 5 2013) bead 또는 particle들에 부착하여 검출하는 방법 (Biosensors ＆ bioelectronics, vol. 29, pp. 46-52, Nov 15 2011) 등이 그것이다.
하지만 표면 마커나 항원을 목적으로 한 검출 방법은 항원에 대한 항체나 물질에 대해 생산되어 있지 않을 경우 시간적, 비용적인 면에서 제한적이고 (The Medical clinics of North America, vol. 96, pp. 1067-1078, Nov 2012), 배양을 통한 검출 방법 또한 대상 및 시간적인 면에서 상당 부분 제한을 받게 된다 (Nature nanotechnology, vol. 8, pp. 369-375, May 5 2013).
DNA를 기반으로 하는 검출 방법은 대상에 관계없이 대부분의 경우에서 사용할 수 있는 방법으로써 효용성이 높다고 할 수가 있는데, 현재 DNA를 검출하는 방법은 그 방식이, 수십여 개의 단일가닥 올리고 primer를 제작한 후, 이들의 상보적인 결합 방식을 통해 PCR을 수행하거나 (Science, vol. 314, pp. 1464-1467, Dec 1 2006; Nature nanotechnology, vol. 8, pp. 369-375, May 5 2013) particle 결합으로 검출 (Biosensors ＆ bioelectronics, vol. 29, pp. 46-52, Nov 15 2011)을 하게 된다. 이러한 DNA 검지 방식에서 문제점은 검출하는 DNA가 단일 가닥이거나 단일 가닥으로 조작을 했을 경우에만 감지가 가능하다는 점, (Nature nanotechnology, vol. 8, pp. 369-375, May 5 2013) 실제로 상보적인 염기들 간의 결합에서 이들은 어느 정도의 고온에서 특이적으로 결합을 하게 되는데, (Nature nanotechnology, vol. 8, pp. 369-375, May 5 2013) 온도가 충분히 높지 않거나 샘플이 결합이 진행되는 최적의 상태에 있지 않을 경우 비특이적 결합으로 상이한 결과를 도출할 수도 있다는 점이 그것이다. (Nucleic acids research, vol. 40, pp. W205-W208, Jul 2012)
Nature nanotechnology, vol. 8, pp. 369-375, May 5 2013
본 발명의 목적은 각종 질환을 쉽고 간단하게 검출하고 진단할 수 있는 조성물 또는 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명의 일 관점은 질환 유발 유전자에 결합하는 dTALE(designed Transcription Activator-Like Effector)을 포함하는, 질환 검출 또는 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 관점은 또한 질환 유발 유전자에 결합하는 dTALE(designed Transcription Activator-Like Effector)을 포함하는, 질환 검출 또는 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 조작하고자 하는 목적 유전자 내 특정 염기 서열부분의 유전자를 잘라내거나 새로운 유전자를 도입하는 용도로만 사용되었던 TALEN(Transcription Activator-like Effector Nuclease) 중 TALE(Transcription Activator-like Effector)만을 이용하여 개체 내 질환의 발병 유무를 간편하게 알 수 있도록 한다는 장점이 있다.
본원발명의 조성물 또는 키트를 이용하면 특히 이중가닥 상태의 DNA도 검출할 수 있다는 장점이 있다. 종래 타겟 DNA의 검출을 위해 사용되었던 PCR은 프라이머가 단일 가닥의 DNA에만 결합할 수 있어서 이중 가닥 DNA에 어떠한 쇼크(예컨대 열이나 산)를 가하여 이를 단일 가닥으로 변형시킨 후에만 이용할 수 있다는 단점이 있었으나, 본원발명의 조성물 또는 키트를 이용하면 자연적인 이중가닥 상태 그대로의 DNA와 결합할 수 있다는 장점이 있다.
뿐만 아니라 이와 같은 결합력을 바탕으로 각종 질환에서 비정상적인 유전자와 정확하고 빠르게 결합할 수 있어서, 이러한 질환을 쉽고 간단히 진단하거나 검출할 수 있게 되었다. 특히, 검출 대상 질환에 특이적인 이상 유전자와 결합할 수 있도록 TALE을 디자인하여 키트에 심은 후, 이를 상업적으로 판매하면, 질환의 자가 진단이 쉽고 간편하게 가능할 뿐 아니라, 경제적이라는 장점도 있다.
도 1은 표적 부위가 어떠한 DNA 형태를 가지더라도 이에 제한 없이 표적 부위 서열에 결합할 수 있는 dTALE을 디자인하여 표적 DNA를 검출할 수 있음을 도식화한 개념도이다.
도 2 내지 4는 본원발명 TALE 도메인의 예시적인 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 T7 박테리오파지 유전자 서열에서 StuI 제한 부위와 BamHI 제한 부위를 중심으로 TALE 센서를 제작하고 (실시예 1), 목적했던 유전자 서열을 검출하는 과정(실험예 1)에 대한 전체 모식도를 표현한 것이다.
도 6는 TALE 도메인과 tagging 부위를 TALE C 말단 부위 이후에 연결한 구조를 디자인한 도면이다.
도 7은 TALE 발현 벡터를 대장균에 도입하여 목적했던 TALE 단백질을 합성, 정제한 후 전기영동한 결과이다.
도 8은 정제한 TALE 도메인 단백질과 tagging 단백질 부위를 이용하여 QD를 부착한 것을 나타낸 모식도이다.
도 9는 전체 10-3b T7 bacteriophage 서열을 잘라내어 실제 TALE 센서와 결합 반응을 진행하는 부위를 분리해내는 것을 도식화한 도면이다.
도 10은 잘라낸 10-3b T7 bacteriophage 서열을 전기영동을 통해 확인한 결과이다.
도 11은 도 8에서 도식하였던 정제한 TALE 도메인 단백질과 tagging 단백질 부위를 이용하여 QD를 부착한 것과 도 9에서 잘라낸 10-3b T7 bacteriophage 서열과의 결합 여부를 확인함에 따라, 표적 DNA 부위를 검출할 수 있음을 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명에서 제작한 TALE-QD 센서를 활용하여 T7 fragments를 검출한 결과를 확인한 결과이다.
본 명세서에서 “질환”이란 해당 질환의 발명 원인이 되는 특정 유전자 서열이 밝혀진 질환을 제한 없이 포함한다.
본 명세서에서 “유발 유전자”는 해당 질환의 발생 또는 이를 악화시키는 것으로 당업계에 알려진 유전자 서열을 의미한다.
본 명세서에서 상기 “유전자” 서열은 DNA 가닥(strand)을 하나 이상 포함하는 서열을 모두 포함하는 것으로 구체적으로 에이즈와 같은 DNA-RNA 하이브리드 복합체 서열 역시 포함할 수 있다. 아울러 상기 DNA 서열은 단일 또는 이중가닥 서열을 모두 포함하는 것이며, 환상 상태의 DNA나 부유 상태의 자유 DNA를 모두 포함하는 것으로, 도 1에서 이를 모식화하여 표현하였다.
본 명세서에서 “TALE (Transcription Activator-Like Effector)”은 다양한 종류의 식물 세포가 크산토모나스(Xanthomonas) 종의 병원성 박테리아에 의해 감염되었을 때 분비하는 단백질을 의미하며, 이러한 단백질은 숙주 식물 내 프로모터 부위에 결합하여 박테리아의 감염을 도와주는 식물 유전자의 발현을 활성화시키거나 감염을 방해하는 식물 유전자의 발현을 저해할 수 있다(Current opinion in plant biology, vol. 13, pp. 394-401, Aug 2010; Science, vol. 326, pp. 1501, Dec 11 2009). 구체적으로, 본 명세서에서 “TALE 도메인”은 둘 이상의 TALE 반복 유닛, 더 구체적으로 2개 이상 30개 이하의 TALE 반복 유닛을 포함할 수 있다. 상기 TALE 도메인이 2개 미만의 TALE 반복 유닛을 포함하는 경우 타겟 유전자를 검출하기 위한 의미 있는 구조로 디자인하기 하기 어렵다는 단점이 있으며, 30개를 초과하는 TALE 반복 유닛을 포함하는 경우 전체 TALE 도메인의 크기가 지나치게 커지고 나노 구조체 등으로 검출하기가 어렵다는 단점이 있다. 이와 같은 관점에서 상기 TALE 도메인은 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 TALE 반복 유닛을 포함할 수 있거나, 29개 이하, 28개 이하, 27개 이하, 26개 이하, 25개 이하, 24개 이하, 23개 이하, 22개 이하, 21개 이하 또는 20개 이하의 TALE 반복 유닛을 포함할 수 있다. 예컨대, 본 명세서에서 상기 TALE 도메인은 도 2와 같은 구조를 가질 수 있다.
아울러 본 명세서에서 상기 TALE 도메인을 예컨대 핵 내로 이동시켜 특정 질환을 진단하기 위해서는 상기 N-term에 NLS(Nuclear Localization Signal) 도메인을 추가하여 결합할 수 있다. 다만, 이는 상기 검출 대상이 혈액 또는 소변일 경우에는 필요치 않을 것이다. 예컨대, 핵 내로 이동시키기 위한 TALE 도메인의 구조는 도 3과 같이 예시할 수 있다.
또한, 본 명세서의 TALE 도메인은 이를 검출해 내기 위해 당업계에 널리 알려진 도메인을 추가할 수 있는데, 이를 예시하면 도 4와 같다.
본 명세서에서 상기 TALE 반복 유닛은 34개의 아미노산을 가지며, 12번과 13번째 아미노산 서열(아래 표 1에서 굵게 표시한 아미노산 서열)에 따라 DNA 염기에 특이적으로 결합할 수 있다(Science, vol. 326, pp. 1509-1512, Dec 11 2009; Science, vol. 335, pp. 720-723, Feb 10 2012). 본 명세서에서는 예컨대 다음 표 1과 같은 아미노산 서열을 가지는 TALE 반복 유닛이 각각의 DNA 염기에 특이적으로 결합할 수 있다.
Nucleotide bound 아미노산 서열 서열번호
A LTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHG 1
T, mC LTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHG 2
G LTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHG 3
C LTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHG 4
본 명세서에서 “dTALE (Transcription Activator-Like Effector)”은 임의의 정해진 DNA 서열에 특이적으로 결합할 수 있도록 디자인한 TALE을 의미한다. 구체적으로 본 명세서의 dTALE은 당업계에 알려진 질환 유발 유전자에 결합할 수 있도록 디자인할 수 있는데, 이러한 디자인 방법은 당업계에 알려진 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 본 명세서에서는 구체적으로 PLoS One, vol. 6, issue 5, e19722. May 19, 2011에서 제시한 방법을 사용하였다. 구체적으로 본 명세서에서 상기 TALE은 아미노산 서열 정보를 바탕으로 아미노산 합성을 진행하여 연결하는 방법 또는 아미노산 서열을 전사할 수 있도록 구성한 DNA의 서열 정보를 가진 플라스미드 벡터를 디자인하고 이를 표적 DNA 서열 정보와 연결하여 발현시키는 방법(Michael R. Green ＆ Joseph Sambrook. Molecular Cloning, 4th Edition. 2012;PNAS, vol. 96 no. 18, pp. 10068-10073, August 31 1999; Chem Soc Rev. Vol. 41, pp. 7001-15, November 7 2012.) 등 당업계에 알려진 방법이라면 제한 없이 사용하여 얻어질 수 있으며, 상업적으로 구매할 수 있는 TALEN 키트를 이용하여 얻어질 수도 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 더 구체적으로 본 명세서에서 상기 dTALE은 상업적으로 구매한 TALEN 키트에서 타겟 유전자와 결합할 수 있는 TALE을 제조하고 TALEN으로부터 이를 분리한 후 단백질로 발현시켜 얻어질 수 있다. 상기 TALE의 제조, 이의 분리 및 단백질로의 발현은 당업계에 알려져 있는 방법이라면 제한없이 사용할 수 있다.
본 발명의 일 관점은 질환 유발 유전자에 결합하는 dTALE(designed Transcription Activator-Like Effector) 도메인을 포함하는, 질환 검출 또는 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 관점은 질환 유발 유전자에 결합하는 dTALE(designed Transcription Activator-Like Effector) 도메인을 포함하는, 질환 검출 또는 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 TALE 반복 유닛의 특이적인 결합력에 의해 질환 유발 유전자의 유무를 간편하게 알아낼 수 있다는 장점이 있다.
상기 질환 유발 유전자는 정상인과 질환자의 유전자를 비교하여 변화를 보이는 유전자를 의미하는 것으로 당업계에 알려진 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 구체적으로 본원발명에서 상기 질환 유발 유전자는 자궁경부암을 유발시키는 것으로 알려진 HPV (Human Papillomavirus) 중 HPV16 E6 유전자(구체적으로 HPV16 E6-1 유전자, HPV16 E6-2 유전자 및/또는 HPV16 E6-3 유전자), 전립선암을 유발하는 것으로 알려진 과다 메틸화 부위 (ICMT-HES3 유전자 및/또는 TBR1 유전자), 췌장암을 유발하는 것으로 알려진 BNC1의 메틸화 부위 (BNC1-1 유전자 및/또는 BNC1-2 유전자), 대장암을 유발하는 것으로 알려진 APC 유전자 부위(NM_000038.5), 조류독감 바이러스의 일 예시인 H7N9 또는 H5N1 바이러스의 유전자(더 구체적으로 NA(neuraminidase) 유전자), 수족구병을 유발하는 콕사키 A5 바이러스에서의 VP1 유전자 (Coxsackievirue A5 isolate PUMCH5454Jun07 VP1 유전자) 또는 에이즈를 유발하는 HIV의 gag 유전자 (HIV-1 isolate P6B_acute_A1 gag protein (gag) 유전자)부위일 수 있다. 본 명세서의 구체적인 실시예에서는 상기 각각의 유전자에서 질환 유발 서열로 알려져 있는 특정 시퀀스의 검출을 목표로 하여 실시예의 표 2에서 제시한 아미노산 구조를 가지는 20개의 각각의 TALE 반복 유닛을 포함하는 dTALE (designed Transcription Activator-Like Effector) 도메인을 제작하였다.
본 발명의 일 관점인 조성물 또는 키트에 있어서, 상기 조성물 또는 키트는 2개 이상 30개 미만의 TALE 반복 유닛을 포함할 수 있다. 상기 조성물 또는 키트가 2개 미만의 TALE 반복 유닛을 포함하는 경우 타겟 유전자를 검출하기 위한 의미 있는 구조로 디자인하기 하기 어렵다는 단점이 있으며, 30개를 초과하는 TALE 반복 유닛을 포함하는 경우 이러한 복합체의 크기가 지나치게 커지고 나노 구조체 등으로 검출하기가 어렵다는 단점이 있다. 이와 같은 관점에서 상기 조성물 또는 키트는 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 TALE 반복 유닛을 포함할 수 있거나, 29개 이하, 28개 이하, 27개 이하, 26개 이하, 25개 이하, 24개 이하, 23개 이하, 22개 이하, 21개 이하 또는 20개 이하의 TALE 반복 유닛을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 관점인 조성물 또는 키트에 있어서, 상기 조성물 또는 키트는 태그(Tag)를 더 포함하고, 상기 dTALE 도메인 유닛 및 태그가 조성물 또는 키트 내에서 복합체 형태로 존재하며, dTALE 도메인 유닛과 유전자가 결합하는 부위 이외의 부위에서 상기 태그와 dTALE가 결합할 수 있다. 본 명세서에서 상기 태그는 타겟 DNA와 결합한 dTALE 도메인의 검출을 쉽게 하기 위한 것으로, dTALE 도메인의 아미노산과 결합할 수 있는 것으로 당업계에 알려진 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대, 상기 태그는 HIS 태그, CYS 태그, GST 태그 또는 바이오틴 바인딩(biotin binding) 태그일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 상기바이오틴화 태그는 아비딘, 스트렙타비딘, 또는 아미노산 서열 LAAIPGAGLIGTH을 갖는 바이오틴 결합 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 일 관점인 조성물 또는 키트에 있어서, 상기 조성물 또는 키트는 탐지 가능한 표지물질(detectable labeling agent)을 더 포함하고, 상기 탐지 가능한 표지물질은 상기 복합체 내 태그와 결합할 수 있다. 본원발명 조성물 또는 키트는 상기 탐지 가능한 표지 물질이 타겟 DNA와 결합한 dTALE 도메인과 복합체를 이루는 태그에 결합하여 이를 쉽게 탐지할 수 있으므로 타겟 DNA의 유무를 빠르고 간편하게 알 수 있다는 장점이 있다.
본 명세서에서 상기 탐지 가능한 표지물질은 상기 태그와 결합할 수 있는 것으로 당업계에 알려진 것이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 구체적으로 양자점, 자성비드 나노입자, 금 나노입자, 형광염료, 형광 단백질, 나노인광체 또는 실리콘 나노입자일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 양자점은 양친성 물질을 포함하는 물질을 이용하여 표면을 친수성으로 변화시킨 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 양친성 물질은 MHPC, DPPE-PEG2000, Ni-NTA 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 금 나노 입자는 나노미터 규모의 지름을 가지는 금의 입자로, 형상과 크기는 특별히 제한되지 않으며 이 분야에서 통상적으로 사용되는 형상과 크기이면 적당하다. 예를 들어 금 나노입자는 구형일 수 있고, 금 나노입자의 크기는 평균 약 2 nm 내지 약 15nm의 범위에 있을 수 있다. 상기 금 나노입자의 크기는 나노입자의 형상에 따라 적절히 정의할 수 있는데, 예를 들어 금 나노입자가 구형이면 그 지름이 크기가 되며, 금 나노입자가 비구형이면 가장 긴 축의 치수(dimension)로 정의할 수 있다. 아울러 상기 형광물질은 본 발명에 따른 타겟 유전자를 검출하였음을 빛을 통하여 확인할 수 있도록 하는 물질을 의미한다. 예를 들어, 시아닌(Cyanine) 형광분자, 로다민(Rodamine) 형광분자, 알렉사(Alexa) 형광분자, FITC(fluorescein isothiocyanate) 형광분자, FAM(5-carboxy fluorescein) 형광분자, 텍사스 레드(Texas Red) 형광분자 및 플루오레세인(fluorescein)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점인 조성물 또는 키트에 있어서, 상기 질환은 암, 조류독감, 수족구병 또는 에이즈일 수 있고, 상기 암은 췌장암, 대장암, 자궁경부암 또는 전립선암 일 수 있다. 그러나 본 명세서에서 상기 질환이 상기 언급한 질환에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 상기 질환은 정상인과 질환자의 유전자를 비교하여 변화를 보이는 유전자가 알려져 있는 질환이라면 모두 포함하는 것이다.
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[ 실시예 1]
T7 박테리오파지 내 서열 검출을 위한 TALE 도메인(dTALE) 준비
실시예 1의 진행을 위한 T7 박테리오파지 유전자 서열에서 StuI 제한 부위와 BamHI 제한 부위를 중심으로 TALE 센서를 제작 (실시예 1) 및 목적했던 유전자 서열을 검출하는 과정(실험예 1)에 대한 전체 모식도를 도 5에서 제시하였다.
[ 실시예 1-1] 목적 TALEN 합성
EZ-TAL Assembly Kit-CMV-TALEN (System Biosciences #SBI-GE100A-1, USA)을 이용하여 T7 박테리오파지 서열 중 단일 제한 부위인 StuI (NEB #R0187S)에 의해 잘리는 부위(TGGACGCAAAGGCCTCAAGG) 및 BamHI(NEB #R3136S)에 의해 잘리는 부위(GCTCGGGGATCCGAATTCT) 각각의 서열을 타겟으로 하여 TALEN을 제작하였다 (Biological procedures online, vol. 15, pp. 3, Jan 14 2013 및 PLoS One, vol. 6, issue 5, e19722. May 19, 2011). 구체적으로, 20개 유닛 중, 1번 유닛과 20번 유닛은 TALEN backbone vector에서 포함하고 있으므로, 2번 TALE 반복 유닛부터 19번 유닛까지 총 18개 유닛에 대해 이를 3개의 튜브로 나눠서 합성을 진행하였다. 상기 18개의 유닛 중 6개 유닛씩 순서대로 1, 2, 3번 튜브에 넣은 다음에 제한 효소와 라이게이션 효소를 넣어 우선적으로 6개의 유닛마다 조합한 뒤, 이들을 대상으로 PCR을 수행(초기 denature 95도 2분→denature 95도 20초→annealing 61도 20초→extension 72도 30초→extension 72도 3분을 한 사이클로 35사이클)하여 증폭시킨 샘플을 얻었고, 최종적으로 각각 6개 유닛으로 구성된 3개 군에 제한 효소와 라이게이션 효소를 처리하고 이를 조합시켜 최종적으로 18개 유닛을 연결해 주었다. 그 다음에 18개 유닛을 TALEN backbone vector에 도입시켜 최종적으로 20개의 유닛을 가지는 dTALE 도메인을 완성시켰다.
[ 실시예 1-2] Nuclease 제거
상기 합성한 TALEN vector 중 NLS (Nuclear Localization Sequence), TALE N-terminal과 C-terminal 부위를 포함하도록 SacI (Takara #1078A) 및 BsaXI (NEB #R0609S)으로 잘라 Quick blunting kit (NEB #E1201S)를 사용하여 Blunting 처리하였고, HindIII (NEB # R0104L)로 잘라낸 뒤 blunting, AP 처리를 한 pET-21b 플라스미드(Novagen #69741-3, Novagen, 독일)에 삽입하였다. 목적 단백질 정제 및 마커 역할을 위해 TALE 도메인의 C-말단 뒷부분에 바이오틴(Biotin)과 His-tag 부분를 삽입한 결과 도 6과 같은 구조가 얻어졌다. TALE C 말단 이후에 연결하는 tagging 부위는 Not I 제한 부위와 Xho I 제한 부위를 포함하여 주문 제작 (Bioneer Co.)하였으며, 제작한 바이오틴(TTA AAT GAT ATA TTT GAG GCA CAA AAA ATT GAA TGG CAT) 및 His tag 부위(CAT CAC CAT CAC CAT CAC) 역시 TALE 도메인 부위를 삽입한 pET-21b plasmid에 Not I (Takara #1166A), Xho I (Takara #1094A) 제한 효소를 처리하여 자른 뒤 삽입하여 최종적으로 TALE 단백질 발현 벡터를 만들었다.
[실시예 1-3] TALE 단백질(=TALE도메인)합성
상기 TALE 단백질 발현 벡터에 대해 박테리아 발현 시스템을 이용하여 TALE 단백질을 합성하였다. 앰피실린이 들어간 배지 3ml에 pET-TALE plasmid를 포함한 BL21 E. coli를 넣고 37℃에서 하루밤 두었다. 이후, 이를 앰피실린을 포함하는 배지 200ml로 옮겼고 여기에서 5시간 동안 더 배양한 뒤, 1M IPTG 140㎕를 넣고 20℃에서 하루밤 두었다. 이렇게 배양한 배지를 코니컬 튜브(conical tube)로 옮겨 원심분리하여 E. coli 세포를 모았고 20 mM Tris?Cl, 50 mM NaCl, pH 8.0 buffer 5ml로 펠렛을 풀고 얼음 위에 이들 용액을 방치한 상태에서 소니케이션(sonication)을 진행 하였다. 원심분리를 통해 E. coli 데브리스를 제거하고 상층액에 Ni-beads (Novagen, 독일)를 결합시켜 TALE 단백질을 회수하였으며 세척 및 희석을 진행하였다. TALE 단백질의 농축을 위해 10 kDa MWCO amicon ultra columns (Millipore, 독일)을 이용하였고, 최종적으로 타겟 유전자에 맞출 수 있는 기능화된 TALE 단백질을 획득했다. 도 7은 각각의 StuI-TALE, BamHI-TALE 단백질을 정제 획득한 뒤, Bradford assay 방법을 이용해 정량하고, Any kD™ Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Gel (Bio-rad, 일본, #456-9033)에 4㎍ 로딩하여 60V 3시간 전기영동한 후, gel을 Bio-Safe Coomassie Stain (Bio-rad, 일본, #161-0786) 용액으로 1분 염색한 뒤, 워싱 과정을 거쳐 밴드를 확인한 결과이다.
[실시예 1-4] TALE 센서합성
MHPC (1-Myristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine), DPPE-PEG2000(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(methoxy polyethylene glycol)-2000) 및 Ni-NTA (1,2-dioleoyl-snglycero-3-N-(5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid succinyl nickel salt)를 QDs (quantum dots)의 클로로포름 용액에 80%, 15%, 5% 비율로 첨가하였다. 80℃ 조건에서 상기 용액에 DI water 2ml을 넣은 뒤 1시간 동안 가열하여 클로로포름을 제거하였다. 그 후 단일 파티클 형태의 현탁액을 얻기 위해 물에 분산되어 있는 QD (MHPC, PEG, Ni-NTA로 표면 처리된)를 1시간 동안 sonication 하였다. 상기와 같이 제작된 QD와 His-tag이 달려 있는 TALE 단백질을 섞어 1시간 동안 incubation한 뒤 이를 이용하였다. 마찬가지로, 스트렙타비딘이 결합된 QD를 이용해 Biotin이 달려 있는 TALE 단백질을 섞어 1시간 동안 incubation한 뒤 이를 이용하였다. 도 8은 정제한 TALE 도메인 단백질과 tagging 단백질 부위를 이용하여 QD를 부착한 결과를 도식화한 도면이다.
[실험예 1]
타겟 T7 bacteriophage fragments 의 검출
도 9는 전체 10-3b T7 bacteriophage 서열을 잘라내어 실제 TALE 센서와 결합 반응을 진행하는 부위를 분리해내는 것을 도식화한 도면이다.
10-3b T7 bacteriophage (Novagen #70548-3)의 full sequence를 대상으로 PpuMI (NEB #R0506S) 제한 효소로 14978 - 22707 부위를 잘라낸 7730bp 크기의 프래그먼트에서 15481 부위를 자르는 StuI (NEB #R0187S) 부위와 20410 부위를 자르는 BamHI (NEB #R3136S) 부위를 각각 잘라내 프래그먼트(Fragment)를 준비했다.
도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, T7 bacteriophage의 목적 부위가 정확히 잘린 것을 확인할 수 있었다.
아울러, QDs와 합성을 완료한 TALE 센서를 T7 bacteriophage fragments에 결합시킨 뒤, 아가로즈 겔 전기영동을 수행했다. 그 결과 도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, TALE 센서 단독으로 내린 라인과 비교하여 TALE-QD-DNA 샘플 라인에서 DNA 밴드에 형광(BamHI-green QD, StuI-TALE-red QD)이 관찰되는 것을 확인할 수 있었는데, 이러한 결과를 바탕으로 TALE-QD 센서가 정상적으로 DNA 단편을 검출할 수 있다는 것을 알 수 있었다. 즉, TALE-QD 단독으로 내린 라인과 비교했을 때, 표적 DNA 부위를 포함한 DNA와 반응을 시킨 후 내린 라인은 형광을 나타내는 부위가 DNA 표적 밴드 부위에 있는 것을 확인할 수 있었으므로, TALE-QD 표적 프로브가 정상적으로 표적 DNA와 결합하고 또한 검출되었음을 확인할 수 있었다.
[실시예 2]
각종 질환 진단을 위한 TALE 도메인(dTALE) 준비
아래 표 2에서 제시한 바와 같이, 자궁경부암을 유발하는 것으로 알려진 Human Papillomavirus (HPV) 중 HPV16에서의 E6 유전자, 전립선암 환자들에서 과도한 메틸화가 발견되는 부위, 조류독감 바이러스 중 H7N9 유형 바이러스, 수족구병을 유발하는 콕사키 A5 바이러스에서 VP1 유전자 및 에이즈를 유발하는 HIV의 gag 유전자 각각에 대해 실시예 1과 동일한 방법으로, 각각의 TALE 도메인을 포함하는 센서를 제작하였다. 아래 표 2에서 제시한 아미노산 구조는 상기 TALE 반복 유닛을 구성하는 34개의 아미노산 중 12번째와 13번째 아미노산 만을 순서대로 나열한 것이다.
TALE 도메인
명칭		 타겟팅
시퀀스		 TALE 반복 유닛의
아미노산 시퀀스		 타겟 유전자 질환명
TALEHPV1 TGATATAATATTAGAATGTG
(서열번호 5)		 NGNNNINGNINGNININGNINGNGNINNNININGNNNGNN
(서열번호 6)		 HPV16 E6-1 자궁경부암
(HPV16 E6)
TALEHPV2 TCCATATGCTGTATGTGATA
(서열번호 7)		 NGHDHDNINGNINGNNHDNGNNNGNINGNNNGNNNINGNI
(서열번호 8)		 HPV16 E6-2 자궁경부암
(HPV16 E6)
TALEprostate1 (methylated C form) TGCTGCCGGCCTCCCCCCAC
(서열번호 9)		 NGNNNGNGNNNGNGNNNNNGNGNGNGNGNGNGNGNGNING
(서열번호 10)		 ICMT-HES3 전립선암
(Prostate Cancer)
TALEprostate2 (methylated C form) TGGGGACTACACCTGTAAAG
(서열번호 11)		 NGNNNNNNNNNINGNGNINGNINGNGNGNNNGNINININN
(서열번호 12)		 TBR1 전립선암
(Prostate Cancer)
TALEpancreas1 (methylated C form) TCGCCGCCGCCCGCCGCGGA
(서열번호 13)		 NGHDNNNGNGNNHDNGNNHDNGNGNNHDNGNNHDNNNNNI
(서열번호 14)		 BNC1-1 췌장암
(Pancreas Cancer)
TALEpancreas2 (methylated C form) TCCCCGGGAGAGGCAAACAC
(서열번호 15)		 NGHDHDHDNGNNNNNNNINNNINNNNHDNININIHDNIHD
(서열번호 16)		 BNC1-2 췌장암
(Pancreas Cancer)
TALEcolon1 TCAGAGGGTCCAGGTTCTTC
(서열번호 17)		 NGHDNINNNINNNNNNNGHDHDNINNNNNGNGHDNGNGHD
(서열번호 18)		 APC (NM_000038.5) 대장암
(Colorectal Cancer)
TALEcolon2 TAAAAAGAAAAGATTGGAAC
(서열번호 19)		 NGNINININININNNININININNNINGNGNNNNNINIHD
(서열번호 20)		 APC (NM_000038.5) 대장암
(Colorectal Cancer)
TALEH7N9-1 TGCTTAGTTTGACTGGGTCA
(서열번호 21)		 NGNNHDNGNGNINNNGNGNGNNNIHDNGNNNNNNNGHDNI
(서열번호 22)		 Avian Influenza H7N9 조류독감
(H7N9)
TALEH7N9-2 TGGTTTAGCTTCGGGGCATC
(서열번호 23)		 NGNNNNNGNGNGNINNHDNGNGHDNNNNNNNNHDNINGHD
(서열번호 24)		 Avian Influenza H7N9 조류독감
(H7N9)
TALEH5N1-1 TTGGAATGCAGAACTTTCTT
(서열번호 25)		 NGNGNNNNNININGNNHDNINNNINIHDNGNGNGHDNGNG
(서열번호 26)		 neuraminidase (NA) gene (DQ643810.1) 조류독감
(H5N1)
TALEH5N1-2 TAAGGATTGGTTCCAAGGGG
(서열번호 27)		 NGNININNNNNINGNGNNNNNGNGHDHDNININNNNNNNN
(서열번호 28)		 neuraminidase (NA) gene (DQ643810.1) 조류독감
(H5N1)
TALEHFMD1 TACTGGACCACCTGGCGGCA
(서열번호 29)		 NGNIHDNGNNNNNIHDHDNIHDHDNGNNNNHDNNNNHDNI
(서열번호 30)		 Coxsackievirus A5 isolate PUMCH5454Jun07 VP1 gene 수족구병
(HFMD
CVA5VP1)
TALEHFMD2 TAACCCTCACTAAAGGGAGA
(서열번호 31)		 NGNINIHDHDHDNGHDNIHDNGNINININNNNNNNINNNI
(서열번호 32)		 Coxsackievirus A5 isolate PUMCH5454Jun07 VP1 gene 수족구병
(HFMD
CVA5VP1)
TALEHIV-1 TAGTTAGCCAGAGAGCTCCC
(서열번호 33)		 NGNINNNGNGNINNHDHDNINNNINNNINNHDNGHDHDHD
(서열번호 34)		 HIV-1 isolate P6B_acute_A1_1A gag protein (gag) gene 에이즈
(HIV gag)
TALEHIV-2 TAGCTCCCTGCTTGCCCATA
(서열번호 35)		 NGNINNHDNGHDHDHDNGNNHDNGNGNNHDHDHDNINGNI
(서열번호 36)		 HIV-1 isolate P6B_acute_A1_1A gag protein (gag) gene 에이즈
(HIV gag)
[ 실험예 2]
상기 실시예에서 제작한 TALE 센서를 이용하여, 샌드위치 타겟팅 방식의 검출 실험을 수행했다. 제작한 TALE 센서는 공통적으로 바이오틴 부위를 포함하고 있으므로, 각각의 질환마다 2종류 또는 3종류 이상으로 구성된 TALE 센서 중, 1종류를 스트렙타비딘이 코팅된 슬라이드 글라스를 활용해, 결합을 시켜 1차적으로 코팅했다. Washing 과정을 거쳐 결합하지 않은 TALE 센서를 씻어낸 후, 표적 부위를 포함하고 있는 용액 형태의 샘플들을 각각의 부위에 떨어뜨려 일정 시간 이상 놓아둔 후, 다시 washing 과정을 거쳐 결합하지 않은 샘플들을 씻어냈다. 이후, 슬라이드 글라스에 코팅하기 위해 활용한 TALE 센서를 제외한 나머지 센서를 떨어뜨려 일정 시간 반응시켰다. 이때 TALE 센서는, 공통적으로 포함하고 있는 바이오틴 부위 또는 HIS Tag 부위에 형광 신호를 나타낼 수 있는 QD를 부착한 센서이다. 이후, 마찬가지 과정으로 washing을 하여 결합하지 않은 TALE 센서를 씻어낸 후, 형광 관찰을 했다 (도 12-A). 그 결과 도 12-B로부터 알 수 있는 바와 같이, 결과적으로 표적 부위를 가진 샘플들을 떨어뜨린 부위에 형광이 관찰됨을 확인함에 따라 제작한 TALE 센서가 정상적인 기능을 하여 표적 부위를 검출할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다. 도 12-B 는 이들 TALE 센서를 바탕으로 표적을 검출한 결과를 보여주는 도면이다. 도 12-B에 의할 때, 녹색 형광을 보이는 부위가 모두 표적으로 계획하였던 유전자와 결합한 부분을 나타내므로, 본원발명에 의할 때, 특정 질환을 쉽게 검출 또는 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> COMPOSITION FOR DETECTION OR DIAGNOSIS OF DISEASES CONTAINING TRANSCRIPTION ACTIVATOR-LIKE EFFECTOR <130> 14P221IND_K06991 <160> 36 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TALE repeated unit for binding with Nucleotide A <400> 1 Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys 1 5 10 15 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 20 25 30 His Gly <210> 2 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TALE repeated unit for binding with Nucleotide T or mC <400> 2 Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys 1 5 10 15 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 20 25 30 His Gly <210> 3 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TALE repeated unit for binding with Nucleotide G <400> 3 Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys 1 5 10 15 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 20 25 30 His Gly <210> 4 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TALE repeated unit for binding with Nucleotide C <400> 4 Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys 1 5 10 15 Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Ala 20 25 30 His Gly <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> HPV16 E6-1 <400> 5 tgatataata ttagaatgtg 20 <210> 6 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TALE repeated unit for binding with sequence number 5 <400> 6 Asn Gly Asn Asn Asn Ile Asn Gly Asn Ile Asn Gly Asn Ile Asn Ile 1 5 10 15 Asn Gly Asn Ile Asn Gly Asn Gly Asn Ile Asn Asn Asn Ile Asn Ile 20 25 30 Asn Gly Asn Asn Asn Gly Asn Asn 35 40 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> HPV16 E6-2 <400> 7 tccatatgct gtatgtgata 20 <210> 8 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TALE repeated unit for binding with sequence number 7 <400> 8 Asn Gly His Asp His Asp Asn Ile Asn Gly Asn Ile Asn Gly Asn Asn 1 5 10 15 His Asp Asn Gly Asn Asn Asn Gly Asn Ile Asn Gly Asn Asn Asn Gly 20 25 30 Asn Asn Asn Ile Asn Gly Asn Ile 35 40 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> ICMT-HES3 <400> 9 tgctgccggc ctccccccac 20 <210> 10 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TALE repeated unit for binding with sequence number 9 <400> 10 Asn Gly Asn Asn Asn Gly Asn Gly Asn Asn Asn Gly Asn Gly Asn Asn 1 5 10 15 Asn Asn Asn Gly Asn Gly Asn Gly Asn Gly Asn Gly Asn Gly Asn Gly 20 25 30 Asn Gly Asn Gly Asn Ile Asn Gly 35 40 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> TBR1 <400> 11 tggggactac acctgtaaag 20 <210> 12 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TALE repeated unit for binding with sequence number 11 <400> 12 Asn Gly Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Ile Asn Gly Asn Gly 1 5 10 15 Asn Ile Asn Gly Asn Ile Asn Gly Asn Gly Asn Gly Asn Asn Asn Gly 20 25 30 Asn Ile Asn Ile Asn Ile Asn Asn 35 40 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> BNC1-1 <400> 13 tcgccgccgc ccgccgcgga 20 <210> 14 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TALE repeated unit for binding with sequence number 13 <400> 14 Asn Gly His Asp Asn Asn Asn Gly Asn Gly Asn Asn His Asp Asn Gly 1 5 10 15 Asn Asn His Asp Asn Gly Asn Gly Asn Asn His Asp Asn Gly Asn Asn 20 25 30 His Asp Asn Asn Asn Asn Asn Ile 35 40 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> BNC1-2 <400> 15 tccccgggag aggcaaacac 20 <210> 16 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TALE repeated unit for binding with sequence number 15 <400> 16 Asn Gly His Asp His Asp His Asp Asn Gly Asn Asn Asn Asn Asn Asn 1 5 10 15 Asn Ile Asn Asn Asn Ile Asn Asn Asn Asn His Asp Asn Ile Asn Ile 20 25 30 Asn Ile His Asp Asn Ile His Asp 35 40 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> APC (NM_000038.5) <400> 17 tcagagggtc caggttcttc 20 <210> 18 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TALE repeated unit for binding with sequence number 17 <400> 18 Asn Gly His Asp Asn Ile Asn Asn Asn Ile Asn Asn Asn Asn Asn Asn 1 5 10 15 Asn Gly His Asp His Asp Asn Ile Asn Asn Asn Asn Asn Gly Asn Gly 20 25 30 His Asp Asn Gly Asn Gly His Asp 35 40 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> APC (NM_000038.5) <400> 19 taaaaagaaa agattggaac 20 <210> 20 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TALE repeated unit for binding with sequence number 19 <400> 20 Asn Gly Asn Ile Asn Ile Asn Ile Asn Ile Asn Ile Asn Asn Asn Ile 1 5 10 15 Asn Ile Asn Ile Asn Ile Asn Asn Asn Ile Asn Gly Asn Gly Asn Asn 20 25 30 Asn Asn Asn Ile Asn Ile His Asp 35 40 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Avian Influenza H7N9 <400> 21 tgcttagttt gactgggtca 20 <210> 22 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TALE repeated unit for binding with sequence number 21 <400> 22 Asn Gly Asn Asn His Asp Asn Gly Asn Gly Asn Ile Asn Asn Asn Gly 1 5 10 15 Asn Gly Asn Gly Asn Asn Asn Ile His Asp Asn Gly Asn Asn Asn Asn 20 25 30 Asn Asn Asn Gly His Asp Asn Ile 35 40 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Avian Influenza H7N9 <400> 23 tggtttagct tcggggcatc 20 <210> 24 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TALE repeated unit for binding with sequence number 23 <400> 24 Asn Gly Asn Asn Asn Asn Asn Gly Asn Gly Asn Gly Asn Ile Asn Asn 1 5 10 15 His Asp Asn Gly Asn Gly His Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn 20 25 30 His Asp Asn Ile Asn Gly His Asp 35 40 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> neuraminidase (NA) gene (DQ643810.1) <400> 25 ttggaatgca gaactttctt 20 <210> 26 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TALE repeated unit for binding with sequence number 25 <400> 26 Asn Gly Asn Gly Asn Asn Asn Asn Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asn Asn 1 5 10 15 His Asp Asn Ile Asn Asn Asn Ile Asn Ile His Asp Asn Gly Asn Gly 20 25 30 Asn Gly His Asp Asn Gly Asn Gly 35 40 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> neuraminidase (NA) gene (DQ643810.1) <400> 27 taaggattgg ttccaagggg 20 <210> 28 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TALE repeated unit for binding with sequence number 27 <400> 28 Asn Gly Asn Ile Asn Ile Asn Asn Asn Asn Asn Ile Asn Gly Asn Gly 1 5 10 15 Asn Asn Asn Asn Asn Gly Asn Gly His Asp His Asp Asn Ile Asn Ile 20 25 30 Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn 35 40 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Coxsackievirus A5 isolate PUMCH5454Jun07 VP1 <400> 29 tactggacca cctggcggca 20 <210> 30 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TALE repeated unit for binding with sequence number 29 <400> 30 Asn Gly Asn Ile His Asp Asn Gly Asn Asn Asn Asn Asn Ile His Asp 1 5 10 15 His Asp Asn Ile His Asp His Asp Asn Gly Asn Asn Asn Asn His Asp 20 25 30 Asn Asn Asn Asn His Asp Asn Ile 35 40 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Coxsackievirus A5 isolate PUMCH5454Jun07 VP1 <400> 31 taaccctcac taaagggaga 20 <210> 32 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TALE repeated unit for binding with sequence number 31 <400> 32 Asn Gly Asn Ile Asn Ile His Asp His Asp His Asp Asn Gly His Asp 1 5 10 15 Asn Ile His Asp Asn Gly Asn Ile Asn Ile Asn Ile Asn Asn Asn Asn 20 25 30 Asn Asn Asn Ile Asn Asn Asn Ile 35 40 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> HIV-1 isolate P6B_acute_A1_1A gag protein (gag) <400> 33 tagttagcca gagagctccc 20 <210> 34 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TALE repeated unit for binding with sequence number 33 <400> 34 Asn Gly Asn Ile Asn Asn Asn Gly Asn Gly Asn Ile Asn Asn His Asp 1 5 10 15 His Asp Asn Ile Asn Asn Asn Ile Asn Asn Asn Ile Asn Asn His Asp 20 25 30 Asn Gly His Asp His Asp His Asp 35 40 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> HIV-1 isolate P6B_acute_A1_1A gag protein(gag) <400> 35 tagctccctg cttgcccata 20 <210> 36 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TALE repeated unit for binding with sequence number 35 <400> 36 Asn Gly Asn Ile Asn Asn His Asp Asn Gly His Asp His Asp His Asp 1 5 10 15 Asn Gly Asn Asn His Asp Asn Gly Asn Gly Asn Asn His Asp His Asp 20 25 30 His Asp Asn Ile Asn Gly Asn Ile 35 40

Claims (17)

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  9. 질환 유발 유전자에 결합하는 dTALE(designed Transcription Activator-Like Effector) 도메인;
    상기 dTALE 도메인과 복합체 형태로 존재하는 태그(Tag); 및
    상기 복합체 내 태그와 결합하는 탐지 가능한 표지물질(detectable labeling agent)을 포함하는 2 이상의 TALE 센서를 포함하고,
    표적 유전자 부위를 포함하는 샘플을 상기 2 이상의 TALE 센서 사이에서 샌드위치 타겟팅 방식으로 반응시키는 것이며,
    상기 2 이상의 TALE 센서는 상기 태그로 HIS 태그 또는 바이오틴 바이딩(biotin binding) 태그를 포함하고 상기 탐지 가능한 표지 물질로 양자점을 포함하며, 상기 공통적으로 포함하고 있는 바이오틴 바인딩 태그 부위 또는 HIS 태그 부위에 상기 양자점을 부착한 것인, 질환 검출 또는 진단용 샌드위치 타겟팅 키트.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 dTALE 도메인은 2개 이상 30개 미만의 TALE 반복 유닛을 포함하는, 키트.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 질환은 암, 조류독감, 수족구병 또는 에이즈인, 키트.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 암은 췌장암, 대장암, 자궁경부암 또는 전립선암인, 키트.
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CN108949914B (zh) * 2018-07-06 2021-11-30 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 基于转录激活因子样效应物核酸酶的大肠杆菌o157:h7检测试剂盒及检测方法
CN110079583B (zh) * 2019-05-27 2023-10-27 重庆博艾迈迪森生物科技有限公司 一种核酸的免疫层析检测方法、检测试剂盒及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130149781A1 (en) * 2011-11-30 2013-06-13 Massachusetts Institute Of Technology Nucleotide-Specific Recognition Sequences For Designer TAL Effectors

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130149781A1 (en) * 2011-11-30 2013-06-13 Massachusetts Institute Of Technology Nucleotide-Specific Recognition Sequences For Designer TAL Effectors

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