KR101663791B1

KR101663791B1 - 생체분자를 타겟팅하는 하이브리드 나노구조체

Info

Publication number: KR101663791B1
Application number: KR1020140027209A
Authority: KR
Inventors: 남윤성; 오미화; 유정헌; 김인수
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2014-03-07
Filing date: 2014-03-07
Publication date: 2016-10-10
Also published as: KR20150105043A

Abstract

본 발명은 생체분자를 타겟팅 하는 하이브리드 나노구조체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 기능성 물질에 결합하는 능력이 있는 펩타이드와 생체분자에 결합능력이 있는 펩타이드가 탠덤사슬(tandem sequence)로 연결된 다성분 펩타이드가 캡시드(capsid) 단백질에 발현되어 있는 재조합 박테리오파지에 기능성 물질이 결합되어 있는 생체분자 특이적 하이브리드 나노구조체에 관한 것이다.
본 발명의 다중성분 펩타이드가 캡시드 단백질에 발현되는 재조합 박테리오파지는 펩타이드를 표면에 동시 발현시킬 수 있기 때문에 타겟팅을 위한 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드 등을 나노구조체 표면에 부착시키기 위한 추가적인 합성, 타겟팅 개수의 일관성 유지를 위한 조건 제어 등 별도의 작업 없이 나노구조체의 제작이 가능한 장점이 있다. 또한, 별도의 나노구조체 제조법이 필요하지 않기 때문에 단순한 혼합 공정만으로도 다양한 기능성 물질이 결합된 하이브리드형 나노구조체의 제조가 가능하며, 이러한 표준화된 나노구조체의 제조법의 개발은 의·약학 분야를 비롯하여 다양한 분야에의 활용할 수 있다.

Description

생체분자를 타겟팅하는 하이브리드 나노구조체 {Specific organic molecule -targeting Hybrid Nanostructures}

본 발명은 생체분자를 타겟팅 하는 하이브리드 나노구조체에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 기능성 물질에 결합하는 능력이 있는 펩타이드와 생체분자에 결합능력이 있는 펩타이드가 탠덤사슬(tandem sequence)로 연결된 다성분 펩타이드가 캡시드(capsid) 단백질에 발현되어 있는 재조합 박테리오파지에 기능성 물질이 결합되어 있는 생체분자 특이적 하이브리드 나노구조체에 관한 것이다.

파지 디스플레이(Phage display)는 1985년 George P, Smith에 의해 개발된 기술로 박테리오파지(bacteriophage)를 이용하여 약 10¹⁰수준의 다양한 펩타이드를 박테리오파지 표면에 손쉽게 발현할 수 있으며, 바이오패닝(biopanning)이라는 반복적인 결합-분리-증폭 과정을 통해 표적물질에 결합력이 높은 펩타이드 서열을 발굴하는 시스템이다.

파지 디스플레이는 신약 개발 분야에서 약효 증진 또는 타겟 특이성을 가진 펩타이드의 발굴 등에 광범위하게 적용되거나, 단일클론항체(monoclonal antibody) 개발에 많이 이용되고 있다. 현재까지 파지 디스플레이에 의해 개발된 단일클론항체 의약품에는 휴미라(HUMIRA; adalimumab, Cambridge Antibody Technology (MedImmune)/Abbott Laboratory)과 벤리스타(Benlysta; belimumab, Human genome Science, Inc./GlaxoSmithKline), 펩타이드 의약품에는 칼비토(Kalbitor; ecallantide, Dyax)와 페기네사타이드(Humatide^TM/Omontys; peginesatide, Takeda/Affymax) 등이 있다.

파지 디스플레이 기법은 특정한 세포에 선택적으로 강한 결합력을 갖는 펩타이드인 세포 결합성 펩타이드를 찾는 데에도 활용될 수 있다. 파지 디스플레이 기법을 이용하여 발견된 세포 결합성 펩타이드는 전립선암 특이적 펩타이드(CNVSDKSC, DPRATPGS, FRPNRAQDYNTN, DTDSHVNL, DTPYDLTG, DVVYALSDD, IAGLATPGWSHWLAL, 등)(Prostate . 2001, 47, 239; Clin Cancer Res . 2005, 11, 139; Protein Eng Des Sel . 2010, 23, 423; Neoplasia . 2006, 8, 772), 난소암 특이적 펩타이드(SVSVGMKPSPRP)( Biotechnology letters . 2011, 33, 1729), 비소세포페암 특이적 펩타이드(EHMALTYPFRPP)(Cancer Lett . 2009, 281, 64), 유방암 특이적 펩타이드(VPWMEPAYQRFL)(J Nucl Med . 2006, 47, 981; Clin Cancer Res . 2005, 11, 6705), 신경교종 특이적 펩타이드(VTWTPQAWFQWV, MCPKHPLGC)(J Controlled Release. 2008, 130, 140; Cancer Gene Ther . 2001, 8, 506), 위암 특이적 펩타이드(CTKNSYLMC)(J Mol Med ( Berl ). 2006, 84, 764), 갑상선암 특이적 펩타이드(EDYELMDLLAYL)(J Nucl Med . 2007, 48, 965), B 세포 림프종 특이적 펩타이드(SAKTAVSQRVWLPSHRGGEP, KSREHVNNSACPSKRITAA, CTLPHLKMC)(Exp Hematol . 2006, 34, 443; Int Immunopharmacol . 2008, 8, 852), 자궁암 특이적 펩타이드(CRLTGGKGVGC)(J Mol Recognit . 2005, 18, 175), 대장암 특이적 펩타이드(VHLGYAT, CPIEDRPMC, HEWSYLAPYPWF)(J Biomol Screen . 2007, 12, 429; Neoplasia. 2003,5, 437; Cancer Res . 2004, 64, 6247) 및 간암 특이적 펩타이드(TACHQHVRMVRP)(Biochem Biophys Res Commun . 2006, 342, 956) 등이 있다.

파지 디스플레이 기법은 세포 결합성 펩타이드 뿐만 아니라, 무기 재료에 대해 강한 접착력을 갖는 펩타이드인 무기 재료 특이성 펩타이드를 발굴하는 데에도 활용될 수 있다. 파지 디스플레이 기법으로 발견된 무기 재료 특이성 펩타이드는 금(Au) 결합성 펩타이드(VSGSSPDS, LKAHLPPSRLPS)(Nano Letters . 2005, 5, 1429; Science. 2006, 312, 885), 은(Ag) 결합성 펩타이드(AYSSGAPPMPPF, NPSSLFRYLPSD)(Nature Materials . 2002, 1, 169), 백금 (Pt) 결합성 펩타이드(TLHVSSY, CPTSTGQAC)(J Am Chem Soc . 2009, 131, 15998; Langmuir . 2007, 23, 7895), 티타늄(Ti) 결합성 펩타이드 (RKLPDAPGMHTW, ATWVSPY)(Langmuir . 2005, 21, 3090; J Mater Sci Mater Med . 2010, 21, 1103), 산화이리듐(IrO₂) 결합성 펩타이드(AGETQQAM)(Nature Nanotechnol . 2010, 5, 340), 탄소나노튜브(CNT) 결합성 펩타이드(HWKHPWGAWDTL, HHWHHWCMPHKT)(Nature Materials . 2003, 2, 196), 산화철(Fe₂O₃)결합성 펩타이드(LSTVQTISPSNH)(Environ Sci Technol . 2008, 42, 3821), 이산화규소(SiO₂)결합성 펩타이드(MSPHPHPRHHHT, RGRRRRLSCRLL, CHKKPSKSC)(J Nanosci Nanotechnol . 2002, 2, 95; Anal Chem . 2006, 78, 4872), 백금코발트(CoPt) 결합성 펩타이드(KTHEIHSPLLHK)(Advanced Functional Materials . 2005, 15, 1489), FePt, CoPt 결합성 펩타이드(HNKHLPSTQPLA, CNAGDHANC)(Science . 2004, 303, 213), 갈륨비소(GaAs) 결합성 펩타이드(AQNPSDNNTHTH)(Nature . 2000, 405, 665) 및 황화아연(ZnS), 황화카드뮴(CdS), 팔라듐황화물(PdS) 결합성 펩타이드(CNNPMHQNC, SLTPLTTSHLRS)(Science . 2004, 303, 213; Science . 2002, 296, 892) 등이 알려져 있다.

파지 디스플레이 기법은 세포 특이성 펩타이드나 무기 재료 특이성 펩타이드 이외에도 다양한 분자 및 물질에 대해 선택적으로 강하게 결합하는 펩타이드를 발굴하는 데에 활용될 수 있다. 예를 들면 포르피린(porphyrin) 특이성 펩타이드(HASYS)(Chem . Commun . 1999, 1765), 스트렙타비딘(streptavidin) 특이성 펩타이드(WDPYSHLLQHPQ)(Adv Mater . 2003, 15, 689), 독소루비신(doxorubicin) 특이성 펩타이드(VCDWWGWGIC)(Eur J Biochem . 1998, 251, 155), 파클리탁셀(paclitaxel) 특이성 펩타이드(KACGRTRVTS)(Bioconjug Chem . 2007, 18, 1981), demethylasterriquinone (DAQ) 특이성 펩타이드(GAPDH)(J Med Chem . 2007, 50, 3423), NK109(benzo[c]phenanthridine 유도체) 특이성 펩타이드(SGVMLGDPNSSRIP)(Biochem Pharmacol . 2005, 70, 37), clarithromycin 특이성 펩타이드(NSPAGISRELVDKLAAALE)(Acta Biochim Biophys Sin ( Shanghai ). 2006, 38, 342), methotrexate 특이성 펩타이드(SIFPLCNSGAL)(Bioorg Med Chem . 2008, 16, 7410), trimannoside 특이성 펩타이드(PSVGLFTH)(Bioorg Med Chem . 2009, 17, 195), 4-AAP (paracetamol) 특이성 펩타이드(CNPNNLSHC)(Biochem Biophys Res Commun. 2007, 358, 285) 등이 발견된 바 있다.

이렇게 파지 디스플레이 기법을 통해 발견된 특정한 분자나 물질에 특이적으로 결합하는 펩타이드는 다양하게 활용되고 있으며, 특히 본 발명에서 중요하게 다루는 응용분야인 세포 표적형 나노구조체의 개발에도 적용된 바 있다. 최근에 파지 디스플레이로 발굴한 펩타이드를 표적형 나노전달체에 이용한 연구를 살펴보면, atherosclerotic plaque-homing peptide (CRKRLDRNC; AP peptide)와 형광분자인 Cy5.5를 glycol chitosan nanoparticle (CNP)에 결합시켜 동맥경화성 병변을 검출하는 이미징 프로브(probe)로 연구한 사례가 있다 (J. Cell . Mol . Med . 2008, 12, 2003; J. Controlled Release. 2008, 128, 217). 또한, brain-homing peptide (TGNYKALHPHNG)를 poly(ethyleneglycol)-poly(lactide-co-glycolic acid) nanoparticles (PEG-PLGA NP)에 결합시켜 혈액뇌장벽(blood-brain barrier, BBB)를 표적으로 한 나노전달체에 대한 연구 사례도 있다 (Biomaterials . 2011, 32, 4943). 이렇게 파지 디스플레이 기법에 의한 표적펩타이드의 발굴은 바이오패닝에 의해 최적화된 펩타이드 시스템으로 표적 세포에 대한 높은 결합성과 특이성으로 효과적인 타겟팅이 가능하다. 예를 들어 표적형 나노전달체에 많이 이용되는 RGD 펩타이드와 엽산(folic acid)의 경우, 특이성이 떨어지기 때문에 제한된 타겟팅 효과 밖에 없는 반면, 파지 디스플레이 기법으로 발견된 세포 특이성 펩타이드를 활용하면 나노전달체의 세포 타겟팅 효과를 매우 뛰어나게 향상시킬 수 있다는 것이 보고된 바 있다 (Bioconjugate Chem . 2013, 24, 85). 다만, 파지 디스플레이를 통해 발굴한 펩타이드를 활용하는 방법에 있어서, 기존의 많은 연구들은 발굴한 펩타이드를 합성하여 나노전달체 표면에 화학적으로 결합하는 방식으로 이루어져왔다. 이렇게 펩타이드를 합성하여 이용하는 방법은 펩타이드 합성을 위한 비용이 비싸며, 나노전달체 표면에 결합시키는 타겟팅 성분의 개수를 제어하는 데 어려움이 있다.

그에 반해, 표적펩타이드를 캡시드 표면에 발현하고 있는 파지 자체를 타겟팅에 활용하는 방법은 합성펩타이드를 이용한 표적형 나노전달체에 비해, 파지 디스플레이를 통해 검출한 다양한 표적펩타이드를 활용할 수 있기 때문에 타겟팅 측면에서 효율적이다. 또한, 원하는 길이와 양의 펩타이드를 간단한 유전자 조작을 통해 파지 표면에 발현시킬 수 있기 때문에 표적펩타이드를 경제적인 비용으로 생산할 수 있다는 장점이 있다. 최근 들어, 합성펩타이드를 대체한 표적형 나노전달체 연구의 일환으로 파지 디스플레이와 나노기술이 결합된 분자 수준의 이미징(molecular imaging), 진단(diagnosis) 및 약물전달(drug or gene delivery)과 같은 의약학 분야에 다양하게 적용할 수 있는 융합기술에 대한 연구가 진행되고 있다. 파지 디스플레이와 나노기술이 융합된 기존의 이미징 기술은 표적펩타이드를 캡시드 단백질에 발현시킨 파지의 표면에 이미징 제제를 화학적으로 결합하여 표적 기관을 검출하는 방법이 주로 이용되어 왔다. 파지를 이미징 제제로 이용한 연구들을 살펴보면, 타겟팅이 가능하도록 유전자 변형한 파지에 형광물질(예, AlexFluor 680)을 결합하거나 방사능 동위원소(예, ¹¹¹In-labeleddiethylatedtriaminepentaaceticacid(DTPA))가 표지(label)된 물질, 또는 자성 나노입자와 결합시켜 형광현미경, SPECT/CT, MRI 등을 이용한 in vivo 표적 이미징 연구가 진행되었다. 구체적인 예를 들면, Deutscher 연구팀(University of Missouri, USA)은 ¹¹¹In-DTPA-streptavidin과 바이오틴일화(biotinylated) M13 파지를 이용한 파지 프로브를 개발하여 단일광자 단층촬영(SPECT/CT)으로 생체 내 표적암세포 검출에 대한 연구를 진행하였다 (Nucl Med Biol . 2009, 36, 789). Petrenko 연구팀(Auburn University, USA)은 파지 유래 펩타이드 기반 약물전달 시스템으로 표적펩타이드가 발현된 M13 파지의 p8 단백질과 지질층의 표적형 나노입자 형성에 대한 연구를 진행하였다 (Nanomedicine . 2009, 5, 83). Belcher 연구팀(Massachusetts Institute of Technology, USA)은 M13 파지의 p8에 단층 탄소나노튜브(SWNT)를 결합시켜 2차 근적외선 영역(second near-infrared window light) (phage probe)(Nano Letters . 2012, 123, 1176). M13 p8 MRI를 이용한 in vivo 표적 이미징 연구를 진행하였다 (Nature Nanotechnol . 2012, 7, 677). 상기의 연구에서 보여주듯이 세포 타겟팅과 이미징에 관한 초기 연구는 이미징 물질을 파지에 결합시키기 위해 화학적인 방법을 이용하였다 (Nucl Med Biol . 2009, 36, 789; Nanomedicine. 2009, 5, 83). 이러한 방법은 타겟팅 성분의 개수 및 위치를 정확하게 제어하기 어려우며 재현성이 보장된 제작에 어려움이 있다. 최근에는 M13 파지의 p8 유전자 조작을 통한 M13 파지 기반 나노구조체 제작에 대한 연구가 활발해지면서, p3에 세포 타겟팅을 위한 펩타이드를 발현시키고 p8 부분에 이미징 물질의 결합을 위한 펩타이드를 발현시켜 타겟 세포 이미징에 활용하는 연구가 진행되었다 (Nano Letters . 2012, 12, 1176; Nature Nanotechnol . 2012, 7, 677). 이러한 방법은 여러 차례의 클로닝 과정을 거쳐야 하는 절차상 번거로움이 발생한다.

이에 본 발명자들은 기존의 고분자, 지질, 단백질에 기반한 나노전달체와 무기입자에 기반한 나노전달체, 그리고 파지를 기반으로 한 나노구조체들의 문제점으로 제기되어 왔던 비효율적인 세포 타겟팅 문제를 해결하고, 표준화된 최적의 나노구조체 제조법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 기능성 물질 결합능력이 있는 펩타이드와 생체분자에 결합능력이 있는 펩타이드가 탠덤사슬로 연결되어 캡시드 단백질에 발현되는 재조합 박테리오파지를 이용하는 경우, 타겟팅을 위한 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드 등을 나노구조체 표면에 부착시키기 위한 추가적인 합성, 타겟팅 개수의 일관성 유지를 위한 조건 제어 등 별도의 작업 없이 나노구조체의 제조가 가능한 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 서로 다른 기능을 가지는 두개 이상의 펩타이드가 탠덤사슬 형태로 연결된 다성분 펩타이드를 발현하는 재조합 박테리오파지 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 박테리오파지에 기능성 물질이 결합되어 있는 하이브리드 나노구조체 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기능성 물질 결합능력이 있는 펩타이드 및 생체분자에 결합능력이 있는 펩타이드가 탠덤사슬로 연결된 다성분 펩타이드가 캡시드 단백질에 발현되어 있는 재조합 박테리오파지에 기능성 물질이 결합되어 있는 하이브리드 나노구조체를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 하이브리드 나노구조체에 기반한 분자 진단용 체외진단 바이오센서에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 상기 하이브리드 나노구조체에 기반한 세포 표적 약물전달체 및 세포 이미징용 나노전달체에 관한 것이다.

본 발명의 다성분 펩타이드가 캡시드 단백질에 발현되는 재조합 박테리오파지는 한차례의 유전자 변형을 통해 타겟팅 펩타이드를 표면에 동시 발현시킬 수 있기 때문에 각각의 펩타이드를 개별적으로 발현시키는 방법에서 발생하는 여러 차례 반복되는 클로닝 과정의 번거로움을 해결할 수 있다. 또한 타겟팅을 위한 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드 등을 나노구조체 표면에 부착시키기 위한 추가적인 합성, 타겟팅 개수의 일관성 유지를 위한 조건 제어 등 별도의 작업 없이 나노구조체의 제작이 가능한 장점이 있다. 또한 발현 펩타이드의 종류에 따른 별도의 나노구조체 제조법이 필요하지 않기 때문에 단순한 혼합 공정만으로도 다양한 기능성 물질이 결합된 하이브리드형 나노구조체의 제조가 가능하며, 이러한 표준화된 나노구조체의 제조법 개발을 통한 의약학 분야를 비롯하여 다양한 분야에의 활용도 및 기여도가 크다고 할 수 있다.

도 1은 탠덤사슬 형태로 연결된 다성분 펩타이드가 캡시드 단백질에 발현되는 재조합 박테리오파지 T7을 이용한 세포 타겟팅 및 이미징을 나타난 모식도이다.
도 2는 탠덤사슬 형태로 연결된 다성분 펩타이드를 제작하기 위한 일예로, 벡터에 삽입되는 다성분 펩타이드의 구조 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 탠덤사슬 형태로 연결된 다성분 펩타이드가 캡시드 단백질에 발현되는 재조합 박테리오파지 T7 제작과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 재조합 박테리오파지 T7과 금 나노입자의 결합능력(A)을 확인한 결과 및 재조합 박테리오파지와 결합한 금 나노입자의 흡광도(B)를 나타낸 결과이다.
도 5는 투과전자현미경을 이용하여 재조합 박테리오파지 T7과 금 나노입자의 결합능력을 확인한 결과이다.
도 6은 (A) 금나노입자 결합능력이 있는 펩타이드 발현 T7 파지(Au-파지), (B) PC3암세포 표면 수용체에 결합능력이 있는 펩타이드 발현 T7 파지(PC3-파지) 및 (C) 금 나노입자와 PC3 암세포 표면 수용체 결합능력을 갖는 펩타이드를 동시에 발현하는 T7 파지(Au-PC3-파지)의 암세포 타켓팅 및 이미징을 암시야 현미경을 이용하여 관찰한 결과이다.
도 7은 유도결합 플라즈마 질량분석법(ICP-MS)을 통한 금나노입자 결합능력이 있는 펩타이드 발현 T7 파지(Au-파지), PC3암세포 표면 수용체 결합능력이 있는 펩타이드 발현 T7 파지(PC3-파지) 및 금 나노입자와 PC3 암세포 표면 수용체 결합능력을 갖는 펩타이드를 동시에 발현하는 T7 파지(Au-PC3-파지)내 흡수된 금 나노입자를 정량적으로 측정한 결과이다.
도 8은 바이오틴화된 형광표지자를 이용한 재조합 박테리오파지 T7(ZnS-Stav-파지)의 형광표시(labeling)정도를 측정한 결과이다.
도 9는 스트렙타비딘이 결합된 ZnS-Stav-파지를 나노구조체로 이용한 암세포 타겟팅과 이미징을 확인하기 위해 T7 나노구조체에 형광을 표지한 후 암세포 타켓팅을 형광세기 측정을 통해 확인한 결과이다.
도 10은 ZnS-Stav-파지의 ZnS 결합성 펩타이드를 이용하여 양자점 특이적 결합능력을 확인한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 기능성 물질 결합능력이 있는 펩타이드 및 생체분자에 결합능력이 있는 펩타이드가 탠덤사슬로 연결된 다성분 펩타이드가 캡시드단백질에 발현되어 있는 재조합 박테리오파지에 기능성 물질이 결합되어 있는 생체분자 특이적 하이브리드 나노구조체에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 기능성 물질은 무기 나노입자, 탄소기반 나노구조체, 유기나노입자, 소분자 화합물 및 형광물질로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 무기 나노입자는 주로 금속 나노입자, 양자점과 같은 반도체 나노입자, 자성나노입자를 포함한다. 금속 나노입자는 금, 백금과 은, 티타늄, 알루미늄, 구리, 아연, 주석, 바륨, 이리듐 등과 그들의 산화물을 포함하며, 인듐, 팔라듐, 크롬, 망간, 코발드 등의 희토류를 포함하고, 입자의 크기는 50 nm 이하인 것을 특징으로 한다. 반도체 나노입자는 양자점을 포함하며, 양자점은 50 nm 이하 크기의 금속체로서 구조적으로 일정한 점(dot) 형태를 갖는 물질 군으로, 나노사이즈의 반도체에 갇혀 있는 상태, 즉 전자를 3차원의 공간에 가둘 수 있는 나노구조의 물질을 말한다. 이러한 양자점은 구성물(MX)이 M은 Zn, Cd, Hg, Sn, Pb, Al, Ga, In, X는 S, Se, Te, N, P, As, Sb, Si, Ge 의 조합으로 이루어진 것들을 포함한다. 입자크기는 50 nm 이하를 포함한다. 또한, 자성나노입자의 종류는 산화철(Fe2O3, Fe3O4), 규소철(CoFe2O4, MnFe2O4), 합금(FePt, CoPt) 등을 포함하며, 입자의 크기는 50 nm 이하인 것을 포함한다.

상기 탄소기반 나노구조체는 그래핀(graphene)과 탄소나노튜브를 포함한다. 그래핀은 탄소원자들이 2차원 상에서 sp ²결합에 의한 벌집모양의 배열을 이루면서 탄소원자 한 층으로 되어 있는 2차원 평면 형태의 얇은 막 구조를 가지는 물질로, 구조적, 화학적으로 매우 안정한 특징을 가지고 있다. 본 발명에서는 표면적이 8.0 m²/g 내지 100 m²/g 인 그래핀을 포함한다. 또한, 탄소나노튜브는 하나의 탄소가 다른 탄소원자와 육각형 벌집무늬로 결합되어 튜브형태를 이루고 있는 물질로 튜브의 직경이 나노미터 수준인 것을 말한다. 나노튜브는 형태에 따라 단층나노튜브(single walled nanotube, SWNT) 및 다층나노튜브(muti-walled nanotube, MWNT)를 포함한다.

상기 유기 나노입자는 고분자, 지질, 단백질 등을 기반으로 만들어진 나노입자를 말하며, 입자크기는 50 nm 이하인 것을 포함한다. 고분자 나노입자는 아래의 내용을 포함한다. 천연 고분자로써, 음이온성 고분자인 hyaluronic acid, alginic acid, pectin, carrageenan, chondroitin sulfate, dextran sulfate, dextran sulfate 등, 양이온성 고분자인 chitosan, poly(lysine) 등, 양친매성 고분자인 collagen(and gelatin), carboxymethyl chitin, fibrin 등, 중성 고분자는 dextran, agarose, pullulan 등을 포함한다. 합성고분자로써, 상전이 고분자는 poly acrylamide, poly (acrylic acid), poly (methacrylic acid), poly (diethylaminoethyl methacrylate), poly (dimethylamino ethyl methacrylate) 등을 포함한다. 양친성 불록 공중합체는 poly(ethylene oxide)-b-poly(L-lysine), poly(ethylene oxide)-b-poly(aspartate), poly(ethylene oxide)-b-poly(aspartate), poly(ethylene oxide)-b-poly(β-benzyl-L-aspartate), poly(ethylene oxide)-b-poly(propylene oxide), poly(ε-caprolactone), poly(ethylene oxide)-b-oligo(methacrylate) 등을 포함한다. 온도감응성 고분자는 poly(N-isopropylacrylamide)(PNIPAM) 및 poly(organophosphazene) derivatives 등을 포함한다. 생체적합성 고분자로는 poly(D,L-lactic acid-co-glycolic acid)를 포함한다. 위의 천연고분자와 합성 고분자의 복합체도 범주 내에 포함된다. 또한, 금속 나노입자, 양자점, 자성나노입자와 같은 무기 나노입자를 함유하고 있는 고분자 나노입자등도 유기나노입자의 범주 내에 해당한다.

상기 소분자 화합물은 분자량 800 Da 이하의 유기화합물로서, 효소기질(enzyme substrate), 생물학적 과정의 조절자(regulator)로 작용하는 물질, 항암제를 비롯한 합성의약품, 포르피린 유도체 등을 포함한다. 합성의약품은 화학합성으로만 만들어진 것을 비롯하여, 식물유래(알칼로이드 등), 동물 유래(성호르몬, 스테로이드 호르몬), 혹은 미생물 유래의 천연물질도 포함한다.

본 발명에 있어서, 생체분자는 고형암세포, 순환종양세포(circulating tumor cells, CTCs) 표지자(biomarkers), 자가면역질환, 감염성 질환(infectious disease) 인자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 아니며, 바람직하게는 전립선암 세포인 PC3의 세포 표면 수용체에 결합성이 있는 펩타이드를 사용하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명에서는 IAGLATPGWSHWLAL(서열번호 3)의 아미노산 서열로 표시되는 PC3에 결합능을 가지는 펩타이드를 사용하였다.

상기 고형암세포는 간암, 폐암, 위암, 대장암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 전립선암, 피부암, 유방암, 갑상선암, 림프종 등을 포함한다. 순환종양세포 표지자는 CK-19(keratin 19), HER2 (human epidermal growth factor receptor 2), VEGF (vascular endothelial growth factor), HIF-1α (hypoxia-inducible factor), pFAK (phosphorylated-focal adhesion kinase), EpCAM (epithelial cell adhesion molecule), hMAM (human mammaglobin) 등을 포함한다. 자가면역질환은 인슐린 의존형 당뇨병(insulin-dependent diabetes mellitus), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 자가면역성 용혈성 빈혈(Autoimmune hemolytic anemia), 크론 병(Crohns disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 강직성 척추염(Ankylosing spondylitis), 전신 홍반성 루푸스(Systemic Lupus Erythematosus) 등을 포함한다. 감염성 질환은 세균류(bacteria), 바이러스(virus)와 같은 미생물에 의해 발병되는 질환으로 급성패혈증과 같은 전신성 질환을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 탠텀사슬은 분자량이 작은 아미노산과 중성 또는 약음성의 아미노산이 2 내지 5개가 연결된 펩타이드 연결기로 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 탠덤사슬로 발현하기 위해 사용할 수 있는 펩타이드 연결기는 분자량이 작은 아미노산과 중성 또는 약음성의 아미노산을 사용할 수 있으며 발현시킨 펩타이드와 상호작용이 없는 것을 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어 분자량이 작은 글라이신(G)의 개수를 다르게 하여 연결기로 사용할 수 있다. 또한 세린(S)을 펩타이드 연결기로 사용할 수 있으며, S가 연속으로 나열된 형태 (예. SSS) 또는 세린(S)과 글라이신(G)이 혼합되어 있는 형태(예, GGGS, SSGG)도 연결기로 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에서는 글라이신이 4개 연결된 GGGG 연결기를 사용하였다.

본 발명에 있어서, 나노구조체의 기반이 되는 박테리오파지는 Podoviridae (P22, T7, phi29), Myoviridae (T4), Siphoviridae (Lambda), Microviridae (phiX174), Leviridae (MS2)를 포함하나, 이에 한정된 것은 아니며, 본 발명에서는 T7을 사용하였다.

본 발명의 일 양태에서는 기능성 물질에 해당하는 무기 나노입자와 결합능 있는 펩타이드 및 생체분자에 결합능력이 있는 펩타이드가 탠덤사슬로 연결된 다성분 펩타이드가 발현되는 재조합 박테리오파지를 제조하기 위하여, 금 나노입자 결합능력이 있는 펩타이드 MHGKTQATSGTIQS(서열번호 2)와 전립선 암세포(PC3) 표면 수용체에 결합능력이 있는 펩타이드 IAGLATPGWSHWLAL(서열번호 3)의 사이를 GGGG 연결기(linker)를 이용하여, 금 나노입자와 암세포 표면 수용체에 결합능을 가지는 다성분 펩타이드가 발현되는 재조합 박테리오파지를 제조하였다.

기능성 물질 중 무기 나노입자의 다른 예로써, ZnS 쉘을 갖는 양자점을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명에서는 ZnS에 결합능력이 있는 펩타이드 LRRSSEAHNSIV(서열번호 10)와 스트렙타비딘에 결합능력이 있는 펩타이드 SHLLQHPQ(서열번호 11)의 사이를 GGG 연결기(linker)를 이용하여 양자점과 스트렙타비딘에 결합능력을 가지는 펩타이드가 탠덤사슬 형태로 연결된 다성분 펩타이드(서열번호 9)가 발현되는 재조합 박테리오파지를 제조하였다.

본 발명의 일 양태에서는 세포 타겟팅과 이미징이 동시에 가능한 박테리오파지 기반 나노구조체를 개발하기 위해 이미징을 위한 무기 입자와 결합성이 있는 펩타이드와, 세포의 표면 수용체에 결합성이 있는 펩타이드를 탠덤사슬로 발현시킨 일명 다성분 펩타이드를 박테리오파지의 표면 415개 캡시드에 발현시킨 것으로, 본 발명의 일 양태로 사용한 415개의 캡시드에 발현된 펩타이드는 금 나노입자 결합성과 암세포 표면 수용체에 대한 결합성을 갖는 염기서열을 일렬로 발현하고 있기 때문에 수십 개의 금 나노입자가 표면에 결합된 클러스터 형태의 T7 나노전달체 제작이 가능하며 이를 타겟 암세포에 넣어 주면 타겟팅과 이미징이 동시에 가능하다 (도 1).

본 발명의 일 실시예에서는 무기입자에 결합성이 있는 펩타이드와 세포 표면 수용체에 결합성이 있는 펩타이드가 연결된 다성분 펩타이드(서열번호 1)를 박테이로파지에서 발현시키기 위해, 금 나노입자 결합성 펩타이드 MHGKTQATSGTIQS(서열번호 2)과 전립선 암세포(PC3) 표면 수용체에 결합성을 가지는 펩타이드 IAGLATPGWSHWLAL(서열번호 3)의 사이를 GGGG 연결기(linker)를 이용하여, 암세포 표면 수용체에 결합성을 가지는 펩타이드 서열이 C-말단(C-terminal) 쪽에 발현하도록 염기서열(서열번호 4)을 합성하였다 (도 2).

본 발명의 '박테리오파지(bacteriophage)'는 세균을 숙주세포로 하는 바이러스 일군의 총칭으로 세균바이러스 또는 단순히 파지(phage)로 불리며, 일반적으로 박테리오파지는 유전물질과 그를 둘러싼 단백질 캡시드로 이루어져 있다. 숙주가 되는 세균의 종류와 파지는 서로 특이적이며, 대장균 살모넬라균 콜레라균 결핵균 고초균 디프테리아균 적리균 포도상구균 방선균 등 많은 세균에 각각 특유한 파지가 알려져 있고, 대부분은 로마 문자나 그리스 문자와 숫자의 번호로 명명하고 있다. 대장균을 숙주로 하는 파지에는 T1에서 T7까지의 T계 파지 외에, λ나 ψ 80을 비롯하여 ψ X 174, M 13, f d, Qβ, MS2 등이 알려져 있으며, 또, 살모넬라균을 숙주로 하는 P22와 대장균과 적리균을 숙주로 하는 P l 또는 고초균을 숙주로 하는 SP 8, SP 10 등이 잘 알려져 있고, 본 발명에서는 바람직하게 박테리오파지 T7을 이용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

박테리오파지 중에서 T계의 파지를 사용하거나 용원성 파지인 λ를 모델재료로, 박테리오파지의 캡시드 단백질에 외래 펩타이드와 단백질을 삽입, 융합시켜 파지 표면에 외래 단백질을 발현되도록 하는 기술인 '파지 디스플레이'가 연구되고 있으며, 고정된 파지의 표면에 발현되는 융합단백질에 어떤 리간드가 결합하는지를 발견하면 검사에 이용할 수 있다.

본 발명에서는 도 3의 방법으로 다성분 펩타이드를 발현하는 재조합 박테리오파지를 제조하였으며, 재조합 박테리오파지 T7의 효율을 확인하기 위해, 플라크 분석법(plaque assay)을 수행하여 재조합 박테리오파지 T7의 역가(titer)를 계산한 결과, 2 x 10⁸pfu/㎖ 값을 보이는 것을 확인하였다. 또한, 클로닝의 성공 여부를 확인하기 위해 배양된 플라그를 채취해 배양한 다음 클로닝된 다성분 펩타이드의 염기서열을 을 확인한 결과, 다성분 펩타이드(MHGKTQATSGTIQSGGGGIAGLATPGWSHWLAL)가 발현되도록 재조합된 박테리오파지 T7은 165 bp의 크기를 보이는 것을 확인하였으며, 염기서열분석을 통해 다성분 펩타이드를 코딩하는 염기서열로 박테리오파지 T7이 클로닝된 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 하이브리드 나노구조체는 약 55 nm의 지름을 갖는 박테리오파지의 표면에 기능성 물질이 결합하는 형태를 갖는 것으로, 재조합 박테리오파지에서 발현하는 다성분 펩타이드의 기능성 물질 결합성 펩타이드의 종류에 따라, 다양한 나노구조체를 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 박테리오파지와 기능성 물질이 결합되어 있는 하이브리드 나노구조체는 서로 다른 캡시드 단백질에 서로 다른 기능을 갖는 펩타이드를 개별적으로 발현시키는 것보다, 훨씬 용이하게 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 발현되는 펩타이드의 개수도 최대로 활용할 수 있다. 또한, 본 발명의 재조합 박테리오파지는 손쉬운 유전자 조작으로 파지의 표면의 표적 펩타이드 발현을 제어하는 것이 가능하기 때문에, 기존의 고분자, 지질, 단백질 기반 나노전달체와 무기입자 기반 나노전달체에서 주로 이용하는 방법인 세포 타겟팅을 위한 단백질, 펩타이드, 뉴클레오타이드 등을 표면에 부착시키기 위한 추가적인 유기합성이 전혀 필요하지 않으며, 표면에 부착하는 타겟팅 성분의 개수를 일관되게 유지할 수 있고, 완벽한 단분산성 입자크기를 갖는 특징을 지닌다. 파지 디스플레이에 의한 표적 펩타이드의 캡시드 표면 발현은 타겟팅 효율성뿐만 아니라 원하는 길이와 개수의 펩타이드를 경제적으로 생산할 수 있으며, 이처럼 유전자 조작을 통한 표면 발현 펩타이드의 종류 및 길이의 다양성이 확보된 다성분 펩타이드가 발현되는 재조합 박테리오파지는 기존의 파지 기반 나노구조체처럼 파지 표면에 기능성 물질을 붙이기 위한 별도의 제조 방법 및 조건 설정 등의 작업 없이 단순히 박테리오파지와 기능성 또는 물질을 물리적으로 혼합해 주는 상온상압 및 수용액에서의 간편한 자기조립 공정으로 하이브리드형 나노구조체의 생산이 가능하다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상기 하이브리드 나노구조체를 유효성분으로 함유하는 세포 표적 약물 전달체 조성물 및 세포 이미징용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서, 금 나노입자와 PC3 암세포 표면 수용체에 결합능력을 가지는 펩타이드가 탠덤 사슬 형태로 연결된 다성분 펩타이드(MHGKTQATSGTIQSGGGGIAGLATPGWSHWLAL)를 캡시드 단백질에 발현하는 재조합 박테리오파지 T7(Au-PC3-파지)의 금 나노입자 특이적 결합능력을 확인하기 위해 유전자 변형을 하지 않은 박테리오파지 T7(WT-파지)과 금 나노입자 결합능력이 있는 펩타이드(MHGKTQATSGTIQ) 발현하는 박테리오파지 T7(Au-파지), PC3 암세포 표면 수용체에 결합능력이 있는 펩타이드(IAGLATPGWSHWLAL)를 발현하는 박테리오파지 T7(PC3-파지)와의 비교실험을 수행하였으며, 각각의 박테리오파지와 금 나노입자를 혼합하여 원심분리를 한 결과, 박테리오파지 T7가 포함되어 있는 혼합물(Au-파지, Au-PC3-파지)에서 빨간 침전물을 보이는 것을 확인하였으며(도 4A), UV 흡광광도계(UV-Vis spectrophotometers, UV-1800, Shimadzu)로 빛 흡수 스펙트럼(light-absorption spectrum)을 측정한 결과, Au-PC3-파지와 Au-파지에서 금 나노입자 흡광도의 증가 및 흡수 스펙트럼이 오른쪽으로 이동한 것을 확인하여(도 4B), 본 발명의 재조합 박테리오파지와 금 나노입자와의 결합능력을 확인할 수 있었다.

또한, 금 나노입자가 결합하여 형성된 박테리오파지 T7 나노구조체의 이미지를 투과전자현미경(transmission electron microscopy)을 통해 확인한 결과, 본 발명의 재조합 박테리오파지(Au-PC3-파지)에서만 금 나노입자가 결합된 박테리오파지 T7 나노구조체를 형성함을 관찰할 수 있었다 (도 5).

본 발명의 재조합 박테리오파지를 포함하는 나노구조체의 암세포 타겟팅 및 이미징 정도를 확인하기 위해, 금 나노입자가 결합된 재조합 박테리오파지 T7 나노구조체와 전립선암 세포주인 PC3를 이용하여 암시야 현미경(dark filed microscope)을 통해 관찰한 결과, Au-PC3-파지에 금 나노입자가 결합된 재조합 박테리오파지 T7 나노구조체에서만 PC3 세포와 특이적인 결합을 하는 것을 확인하였으며(도 6), Au-PC3-파지에 금 나노입자가 결합된 재조합 박테리오파지 T7 나노구조체의 세포 특이적 결합능력을 정량적으로 측정한 결과, 표 4 및 도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 제조된 다결합 펩타이드를 발현하는 재조합 박테리오파지 T7(Au-PC3-파지)와 금 나노입자가 결합된 경우에, 검출된 금 원소의 농도와 세포 하나당 흡수된 금 나노입자의 개수가 다른 박테리오파지 T7(Au-파지, PC3-파지)에 비해 높은 것을 확인하였다.

본 발명에서는 금 나노입자와 세포 표면 수용체 이외에도 다양한 기능성 물질 및 생체분자에 결합능이 있는 다성분 폅타이드를 발현하는 재조합 박테리오파지의 제조가 가능한 것을 확인하기 위해, ZnS에 결합능력이 있는 펩타이드 LRRSSEAHNSIV(서열번호 10)와 스트렙타비딘에 결합능력이 있는 펩타이드 SHLLQHPQ(서열번호 11)의 사이를 GGG 연결기(linker)를 이용하여 ZnS 쉘을 갖는 양자점과 스트렙타비딘에 결합능력을 가지는 펩타이드가 탠덤사슬 형태로 연결된 다성분 펩타이드가 발현되는 재조합 박테리오파지(ZnS-Stav-파지)를 제조하였다.

본 발명의 방법으로 제조된 ZnS-Stav-파지에 스트렙타비딘 및 biotin-FITC을 결합시켜 형광 발현정도를 측정한 결과, 스트렙타비딘이 결합된 파지(ZnS-Stav-파지/Stav)에 biotin-FITC를 처리한 군은 단위면적당 광자의 개수가 높게 측정되는 것을 확인하였으며(도 8), C-말단기에 발현된 스트렙타비딘 결합능력을 가지는 펩타이드를 이용하여 바이오틴화된 다양한 형광표지자를 박테리오파지에 부착하여 형광표지된 T7 나노구조체를 제작 가능함을 확인하였다. 또한, 세포 표면에 결합된 RGD-biotin 펩타이드와 ZnS-Stav-파지/Stav를 결합시킨 군의 형광세기가 다른 군들에 비해 높게 나타나는 것을 확인하여(도 9), ZnS-Stav-파지의 암세포 타겟팅 및 이미징이 가능한 것을 확인하였으며, ZnS-Stav-파지가 양자점에도 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다 (도 10).

본 발명의 다른 양태에서, 기능성 물질 중 소분자 화합물에 결합능이 있는 재조합 박테리오파지를 제조하기 위해, 본 발명에서는 포르피린 결합능력이 있는 펩타이드 HASYS(서열번호 15)와 금나노입자 결합능력이 있는 펩타이드 VSGSSPDS(서열번호 16)의 사이를 GGG 연결기를 이용하여 포르피린과 금나노입자에 결합능을 가지는 다성분 펩타이드(서열번호 14)가 발현되는 재조합 박테리오파지를 제조하였으며, 양자점에 결합능력이 있는 펩타이드 LRRSSEAHNSIV(서열번호 20)와 PC3 암세포 표면 수용체에 결합능력이 있는 펩타이드 IAGLATPGWSHWLAL(서열번호 21)의 사이를 GGGG 연결기를 이용하여 양자점과 PC3 암세포 표면 수용체에 결합능을 가지는 다성분 펩타이드(서열번호 19)가 발현되는 재조합 박테리오파지를 제조하였다. 이 밖에도 EPLQLKM(서열번호 24)의 아미노산 서열로 표시되는 그래핀에 결합능력을 가지는 펩타이드 또는 DSPHTELP(서열번호 25)의 아미노산 서열로 표시되는 단층나노튜브에 결합능력을 가지는 펩타이드 등을 사용하여 탄소기반 나노구조체를 제조할 수 있다.

즉, 본 발명에서는 다양한 기능성 물질 및 생체분자에 결합능력이 있는 펩타이드가 탠덤사슬로 연결된 다성분 펩타이드가 캡시드 단백질에 발현되어 있는 재조합 박테리오파지가 제조가능한 것을 확인하였으며, 어느 하나의 펩타이드 서열에 한정되는 것이 아닌, 기능성 물질 및 생체분자에 결합능이 있는 다양한 펩타이드 서열을 이용하여 용도에 따라 제조가 가능한 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 재조합 박테리오파지에 기능성 물질이 결합되어 있는 나노구조체는 약 55 nm의 균일한 나노크기의 제작이 가능하여 입자크기 제어를 위한 별도의 조치가 필요하지 않으며, 유전자 변형을 통해 415개의 타겟팅 펩타이드를 표면에 동시 발현시킬 수 있기 때문에 타겟팅 및 이미징이 동시에 가능하다.

세포 표적 진단-치료 나노전달체로 쓰일 경우, 탠덤사슬 형태로 연결된 펩타이드를 캡시드 단백질에 발현(무기 나노입자, 세포 표적 결합 수용체)하는 박테리오파지 내부에 약물을 봉입하거나 또는 박테리오파지 표면 단백질에 약물을 결합(conjugation)시켜 세포 표적 진단-치료 나노전달체로 이용할 수 있다. 기능성 물질에 결합능력이 있는 박테리오파지 나노구조체의 경우, 각각, CT, MRI, optical imaging을 통해 표적 세포로 나노구조체가 전달된 것을 확인할 수 있다.

순환종양세포 표지자에 결합능력이 있는 펩타이드를 기능성 물질과 결합능력이 있는 펩타이드와 함께 발현시킨 나노구조체의 경우, 표적 질병 진단시약으로 활용도가 매우 높다. 이는 체내(in vivo), 체외(in vitro) 진단을 모두 포함하며, in vitro의 경우 수집된 혈액샘플을 이용하여 손쉽게 in vitro 진단이 가능하다. 금나노입자의 경우 CT, 암시야 현미경, 간단하게는 UV 분석을 통해 표적물질 검출이 용이하게 이루어질 수 있으며, 양자점의 경우 형광 현미경, 형광강도 분석 등을 통해 표적 물질 검출이 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

다중성분 펩타이드 ( multicomponent peptide )를 발현하는 재조합 박테리오파 지 T7 제작

1-1 : 금 나노입자와 암세포 표면 수용체에 결합능을 갖는 DNA 염기서열 합성

무기 나노입자에 결합능력이 있는 펩타이드와 세포 표면 수용체에 결합능력이 있는 펩타이드가 탠덤사슬 형태로 연결된 다성분 펩타이드(서열번호 1)를 박테리오파지에서 발현시키기 위해, 금 나노입자 결합능력이 있는 펩타이드 MHGKTQATSGTIQS(서열번호 2)와 전립선 암세포(PC3) 표면 수용체에 결합능력이 있는 펩타이드 IAGLATPGWSHWLAL(서열번호 3)의 사이를 GGGG 연결기(linker)를 이용하여, 암세포 표면 수용체에 결합능력을 가지는 펩타이드 서열이 C-말단(C-terminal) 쪽에 발현하도록 염기서열(서열번호 4)을 합성하였다 (도 2).

[서열번호 1] N-MHGKTQATSGTIQSGGGGIAGLATPGWSHWLAL-C

1-2 : 박테리오파지 T7에 합성된 DNA 염기서열의 도입

다성분 펩타이드를 발현하는 재조합 박테리오파지를 제작하기 위해, 실시예 1-1에서 합성한 다성분 펩타이드를 코딩하는 염기서열을 박테리오파지 T7에 도입하여 클로닝하였으며, T7 Select　415-1 Cloning Kit(Novagen, Catalog No.70015-3)을 이용하여, Novagen T7 Select　시스템 매뉴얼을 참조로 하여 실험을 수행하였다.

클로닝에 사용한 T7 Select　415-1 벡터는 벡터의 양쪽 끝이 EcoR I과 Hind III로 잘려져 있는 predigested vector 형태로, 양쪽 말단이 각각 5′-AATT, 5′-AGCT로 노출되어 있다 (Novagen T7 Select　시스템 매뉴얼).

클로닝에 사용할 이중가닥 DNA를 제작하기 위해 각각 5'말단에 EcoR I (5′-AATT)과 Hind III (5′-AGCT)를 포함하도록 제조된 프라이머(서열번호 5 및 6)를 이용하였다.

[서열번호 5]

5'-AATT CA ATG CAT GGC AAA ACC CAG GCG ACC AGC GGC ACC ATT CAG AGC GGCGGCGGCGGCATTGCGGGCCTGGCGACCCCGGGCTGGAGCCATTGGCTGGCGCTG-3'

[서열번호 6]

5'-AGCT CAG CGC CAG CCA ATG GCT CCA GCC CGG GGT CGC CAG GCC CGC AAT GCCGCCGCCGCCGCTCTGAATGGTGCCGCTGGTCGCCTGGGTTTTGCCATGCATTG-3'

상기 프라이머 50 pmole/㎖ 농도가 되도록 증류수에 희석하여 준비한 뒤, thermal cycler(T100^TM Thermal Cycler, BIO-RAD)를 이용하여 94 ℃에서 3분 동안 어낼링(annealing)시킨 다음, 표 1의 조건으로 라이게이션을 수행하였으며, T4 DNA 라이게이션 키트(Invitrogen, 미국)을 사용하였다.

라이게이션 조성 및 조건

성분	volume (㎕)
insert (0.05 pmole/㎕)	1
T7Select415-1Vector(0.05pmole/㎕)	1
5X DNA ligase buffer	1
100 mM DTT	0.5
deionized water	1
T4 DNA ligase (1 U/㎕)	0.5
total volume	5
T100™ Thermal Cycler를 이용하여 16℃에서 16시간 incubation

라이게이션이 완료된 5 ㎕의 반응물은 인비트로 패키징(in vitro packaging)을 위해 25 ㎕ T7 Select　패키징 엑스트렉트(T7 Select　Packaging Extract)에 첨가하여 파이펫 팁 끝으로 약하게 혼합하였으며, T100^TM Thermal Cycler를 이용하여 22 ℃에서 2시간 동안 반응시킨 다음, 반응물의 30 ㎕를 270 μL의 멸균된 LB 배지에 첨가하였다.

1-3 : 다성분 펩타이드를 발현하는 박테리오파지 T7 효율 확인

다성분 펩타이드를 코딩하는 염기서열로 클로닝된 재조합 박테리오파지 T7의 효율을 확인하기 위해, 플라크 분석법(plaque assay)을 수행하였다.

숙주세포로는 대장균(E.coli BL21)을 사용하였으며, 대장균을 M9LB 배지(1ｇ bacto tryptone, 0.5ｇ yeast extract, 1ｇ NaCl, 5 ㎖ 20X M9 Salts, 2 ㎖ 20 % glucose, 0.1 ㎖ 1 M MgSO₄/100 ㎖ deionized water)에서 37 ℃, 210 rpm 조건으로 OD₆₀₀값이 0.6 내지 0.8이 될 때까지 진탕배양기(JSSI-300CL, 제이오텍)를 이용해서 배양하였다. 실시예 1-2의 인비트로 패키징(in vitro packaging)이 완료된 반응물 300 ㎕ 중 100 ㎕를 900 ㎕의 멸균된 LB 배지에 10배로 희석한 뒤에 연속희석(serial dilution)으로 10² 내지 10⁸ 희석된 반응물을 준비하였으며, 희석된 반응물 100 ㎕을 각각 250 ㎕의 대장균이 들어있는 둥근바닥 튜브에 넣고 혼합하였다. 그 다음, 3 ㎖ low melting agarose(45 내지 50 ℃)를 튜브에 넣고 37 ℃에서 방치해놓은 LB 아가 플레이트(agar plate)에 기포가 생기지 않게 부은 후 아가로스가 굳을 때까지 상온에서 방치하였다. 아가로스가 완전하게 굳은 다음, 투명한 플라그(plaque)가 형성될 때까지 37 ℃에서 3 내지 5시간 동안 배양하였으며, 형성된 플라그 개수를 측정하여 유전자 변형 박테리오파지 T7의 역가(titer)를 계산한 결과, 2 × 10⁸pfu/㎖ 값을 보이는 것을 확인하였다.

또한, 클로닝의 성공 여부를 확인하기 위해 배양된 플라그 20개를 1 ㎖ 파이펫 팁을 이용하여 각각 하나씩 채취한 뒤, OD₆₀₀값이 0.6 내지 0.8이 될 때까지 배양한 대장균이 포함되어 있는 LB 배양액 1.5 ㎖이 들어있는 둥근 바닥 튜브에 각각 넣고 37 ℃, 210 rpm 조건으로 2 내지 4시간 동안 진탕배양기(JSSI-300CL, 제이오텍)를 이용해서 배양하였다.

박테리오파지 T7의 증폭에 의해 배양액에서 숙주세포인 BL21의 용해가 이루어져 흰색의 가는 잔해물이 관찰되면, 1.5 ㎖의 배양액을 6000 ×ｇ, 4 ℃ 조건에서 10분 동안 원심분리(Supra 22K, 한일과학) 후 상등액을 취하여 표 2 및 표 3의 조건으로 PCR을 수행하여 클로닝된 다성분 펩타이드의 염기서열을 확인하였다.

T7SelectUP Primer

[서열번호 7] 5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'

T7SelectDOWN Prime

[서열번호 8] 5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'

PCR 조성

성분	volume (㎕)
원심분리 상층액	2
10 X PCR buffer (QIAGEN)	5
T7SelectUp primer (5 pmole/㎕)	1
T7SelectDown primer (5 pmole/㎕)	1
dNTP mix (10 mM each: dATP, dCTP, DGTP, DTTP)	1
HotStar Taqplus DNA polymerase (5 U/㎕) (cat no.203603)	0.5
deionized water	to 50 ㎕

PCR 반응 조건

단계		시간 (분)	온도 (℃)	비고
initial heat activation		5	95
3-step cycling	denaturation	0.5	94	35 cycle 반복
	annealing	0.5	55
	extension	1	72
final extension		10	72

PCR이 완료된 반응물 중 10 ㎕를 5 X DNA loading dye와 섞어 1 내지 2 % 아가로스 젤(agarose gel)에서 로딩하여, 증폭된 산물의 크기를 확인하였다.

그 결과, 다성분 펩타이드(MHGKTQATSGTIQSGGGGIAGLATPGWSHWLAL)가 발현되도록 재조합된 박테리오파지 T7은 165 bp의 크기를 보이는 것을 확인하였고, 클로닝 되지 않은 박테리오파지 T7은 86 bp의 크기를 보이는 것을 확인하였으며, 다성분 펩타이드가 제대로 발현하였는지 염기서열분석을 통해 확인한 결과, 다성분 펩타이드를 코딩하는 염기서열로 박테리오파지 T7이 클로닝된 것을 확인하였다.

재조합 박테리오파지 T7 의 금 나노입자 결합능 확인

2-1 : UV 흡광도 분석

금 나노입자와 PC3 암세포 표면 수용체에 결합능력을 갖는 펩타이드가 탠덤사슬 형태로 연결된 다성분 펩타이드(MHGKTQATSGTIQSGGGGIAGLATPGWSHWLAL)를 캡시드 단백질에 발현하는 재조합 박테리오파지 T7(Au-PC3-파지)의 금 나노입자 특이적 결합능력을 확인하기 위해 야생형 박테리오파지 T7(WT-파지)와 금 나노입자 결합능력이 있는 펩타이드(MHGKTQATSGTIQ)를 발현하는 박테리오파지 T7(Au-파지), PC3 암세포 표면 수용체에 결합능력이 있는 펩타이드(IAGLATPGWSHWLAL)를 발현하는 박테리오파지 T7(PC3-파지)를 이용하여 금 나노입자 특이적 결합능력을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

각각의 T7 파지 2 x 10⁹pfu/10 ㎕를 2.5 x 10¹²/50 ㎕의 금 나노입자(5 nm, cat no. 752568, 시그마알드리치)가 들어 있는 1.5 ㎖ eppendorf tube에 넣고 혼합한 뒤, 20분 동안 상온에서 배양한 다음, 5000 × ｇ, 4 ℃에서 5분 동안 원심분리 하였다. 원심분리 후 금 나노입자 결합능이 있는 박테리오파지 T7가 포함되어 있는 혼합물(Au-파지, Au-PC3-파지)에서 빨간 침전물을 보이는 것을 확인하였다 (도 4A).

상기의 침전물을 분리한 뒤에 침전물에 100 ㎕ PBS(10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, 156mM NaCl)을 첨가하여 재현탁 시킨 후, 재조합 박테리오파지 T7과 금 나노입자의 결합능을 확인하기 위해, UV 흡광광도계(UV-Vis spectrophotometers, UV-1800, Shimadzu)로 빛 흡수 스펙트럼(light-absorption spectrum)을 측정하였다.

그 결과, 도 4B에 나타난 바와 같이, Au-PC3-파지와 Au-파지에서 금 나노입자 흡광도의 증가 및 흡수 스펙트럼이 오른쪽으로 이동한 것을 관찰할 수 있었으며, 금 나노입자와 본 발명의 재조합 박테리오파지 T7의 결합을 확인하였다.

2-2 : 투과전자현미경 이미지 분석

금 나노입자가 결합하여 형성된 박테리오파지 T7 나노구조체의 이미지를 투과전자현미경(transmission electron microscopy) 을 통해 확인하였다.

각각의 T7 파지 2 x 10⁹pfu/10 ㎕를 2.5 x 10¹²/50 ㎕의 금 나노입자가 들어 있는 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 혼합한 뒤, 20분 동안 상온에서 배양한 다음, 10 ㎕를 200 메쉬 쿠퍼 TEM 그리드(200 mesh copper TEM grid; Ted pella)에 올려놓고 20분 동안 반응시켰다. 그 다음 TEM 그리드(grid)위에 남아있는 혼합액을 와트만 페이퍼(whatman paper)에 흡수시켜 제거하였으며, TEM 그리드에 20 ㎕의 증류수(deionized water)를 올린다음 와트만 페이퍼(whatman paper)에 흡수시켜 제거하는 과정을 세 번 반복하여 그리드에 비특이적으로 붙은 금 나노입자를 제거하였다. 그리드 위에 1 % 우라닐아세테이트(uranyl acetate) 용액 10 ㎕를 올려 30초 동안 염색한 뒤(negative staining), 와트만 페이퍼(whatman paper)에 흡수시켜 남은 용액을 제거한 다음, 완성된 grid 시편은 투과전자현미경(JEM-3011, JEOL Ltd)를 통해 관찰하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, Au-PC3-파지에서만 금 나노입자가 결합된 T7 나노구조체를 형성함을 관찰할 수 있었다.

금 나노입자가 결합된 재조합 박테리오파지 T7 나노구조체의 암세포 타겟팅과 이미징 확인

금 나노입자가 결합된 재조합 박테리오파지 T7 나노구조체와 암세포 타겟팅과 이미징을 확인하기 위해 전립선암 세포주인 PC3를 이용하여 암시야 현미경(dark filed microscope)을 통해 관찰하였다.

PC3 세포를 챔버 슬라이드(chamber slide; 4-well CultureSlides, BD Falcon)에 7.0 × 10⁴cells/well의 농도로 10 % 우태혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 들어 있는 DMEM 배양액 (Dulbeccos modified Eagles medium)에 준비하여, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 각각의 박테리오파지 T7(Au-파지, PC3-파지, Au-PC3-파지) 2 x 10⁹pfu/10 ㎕를 2.5 x 10¹²/50 ㎕의 금 나노입자가 들어 있는 1.5 ㎖ eppendorf tube에 넣고 혼합한 뒤, 20분 동안 상온에서 배양한 다음, 5000 × ｇ, 4 ℃에서 5분 동안 원심분리 하였다. 상기의 침전물을 분리한 뒤에 침전물에 100 ㎕ PBS(10mM Na₂HPO₄, 2mM KH₂PO₄, 156mM NaCl)을 첨가하여 재현탁 시킨 후, 400 ㎕ DMEM 배양액을 넣어 혼합하였다. 배양한 PC3 세포를 PBS 용액으로 세척한 다음, 상기 금 나노입자와 박테리오파지 T7이 포함된 혼합액을 처리하여 4시간 동안 배양한 다음, 혼합액을 제거하고, 세포를 PBS로 세 차례 세척하여 비특이적으로 결합한 박테리오파지 T7 나노구조체를 제거하였다. 세포에 1 % 포름알데히드(formaldehyde) 0.5㎖을 첨가하여 4℃에서 12 내지 14시간 동안 고정시킨 뒤, 용액을 제거하고 PBS용액으로 세 차례 세척한 다음, 마운팅(mounting)용액을 한 방울 떨어트려 커버글라스(cover grass)로 덮어 세포 샘플 시료 준비를 완료하였다.

준비된 샘플 시료는 암시야 현미경(dark filed microscope, Nikon)으로 관찰하여, Au-PC3-파지에 금 나노입자가 결합된 재조합 박테리오파지 T7 나노구조체에서만 PC3 세포와 특이적인 결합을 하는 것을 확인하였다 (도 6).

또한, Au-PC3-파지에 금 나노입자가 결합된 재조합 박테리오파지 T7 나노구조체의 세포 특이적 결합능을 정량적으로 측정하기 위해, 유도결합 플라즈마 질량분석법(ICP-MS)을 이용하였다.

PC3 세포를 6- well plate (6-well culture plate, BD Falcon)에 1.0 × 10⁶cells/well의 농도로 10% 우태혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 들어 있는 DMEM 배양액(Dulbeccos modified Eagles medium)에 준비하여 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다.

각각의 박테리오파지 T7(Au-파지, PC3-파지, Au-PC3-파지) 2 x 10¹⁰pfu/100 ㎕를 2.5 x 10¹³/500 ㎕의 금 나노입자가 들어 있는 혼합액을 20분 동안 상온에서 배양한 다음, 5000 × ｇ, 4 ℃에서 5분 동안 원심분리 하였다. 상기의 침전물을 분리한 뒤에 침전물에 200 ㎕ PBS(10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, 156 mM NaCl)을 첨가하여 재현탁 시킨 후, 800 ㎕ DMEM 배양액을 넣어 혼합하였다. 배양한 PC3 세포를 PBS 용액으로 세척한 다음, 상기 금 나노입자와 박테리오파지 T7이 포함된 혼합액을 처리하여 24시간 동안 배양한 다음, 혼합액을 제거하고, 세포를 PBS로 세 차례 세척하여 비특이적으로 결합한 박테리오파지 T7 나노구조체를 제거하였다. 세척한 세포에 trypsin/EDTA 200 ㎕를 넣고 37 ℃에서 2 내지 4분 동안 처리하여 각각의 세포를 배양 용기에서 분리하여 회수한 다음, 70 % 질산용액을 1 ㎖ 씩 첨가하여 세포막을 분해시킨 뒤, 유도결합 플라즈마 질량분석법을 이용하여 세포 내 흡수되는 금 원소의 농도를 분석하였다.

세포 하나 당 흡수된 금 나노입자의 개수(N _AuNP) 는 하기의 수학식 1로 계산하였다. N _total은 분석한 각각의 세포 전체에서 검출된 금원소의 전체 개수이며, N은 나노입자 하나 당 금원소의 평균 개수, NC _total은 처리한 세포의 전체 개수를 의미한다.

[수학식 1]

나노입자 하나 당 금원소의 평균 개수(N)은 약 3862개로 수학식 2를 이용하여 계산하였으며, 실험에서 사용된 금 나노입자의 평균 지름(D,nm)은 5 nm이며, 면심입방구조 금(face centered cubic, fcc)의 밀도(ρ)는 19.3 g/cm³이다. 금의 분자량(M)은 197 g/mole, 1몰에 해당하는 원자의 수 (N _A)는 6.02 x 10²³이다.

[수학식 2]

유도결합 플라즈마 질량분석법(ICP-MS)에 의해 분석된 각각의 샘플이 처리된 세포에서 검출된 금원소의 농도와 수학식 1 및 2로 계산된 세포 하나 당 흡수된 금 나노입자의 개수는 표 4에 나타내었다.

유도 결합 플라즈마 질량분석법에 의한 금 나노입자 정량 분석

	금 원소 농도 (ppm)	금 나노입자 개수
Au-파지 + 금 나노입자	8.3 ± 0.03	7.0 x 10¹²±6.7 x 10¹¹
PC3-파지 + 금 나노입자	8.1 ± 0.01	6.1 x 10¹²±3.6 x 10¹¹
Au-PC3-파지 + 금 나노입자	41.6 ± 1.20	3.3 x 10¹³±9.5 x 10¹¹

표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 제조된 다중결합 펩타이드를 발현하는 재조합 박테리오파지 T7(Au-PC3-파지)와 금 나노입자가 결합된 경우에, 검출된 금 원소의 농도와 세포 하나당 흡수된 의 개수가 다른 박테리오파지 T7에 비해(Au-파지, PC3-파지) 높은 것을 확인하였다 (표 4 및 도 7).

양자점 및 스트렙타비딘이 결합할 수 있는 다중 성분 펩타이드가 발현된 재조합 박테리오파지 T7 제작

양자점과 스트렙타비딘에 결합능력을 가지는 펩타이드가 탠덤사슬 형태로 연결된 다성분 펩타이드(서열번호 9)를 박테리오파지에서 발현시키기 위해 양자점에 결합능력이 있는 펩타이드 LRRSSEAHNSIV(서열번호 10)와 스트렙타비딘에 결합능력이 있는 펩타이드 SHLLQHPQ(서열번호 11)의 사이를 GGG 연결기(linker)를 이용하여, 염기서열을 합성하였다.

[서열번호 9] N-LRRSSEAHNSIVGGGSHLLQHPQ-C

클로닝에 사용할 이중가닥 DNA를 제작하기 위해 각각 5'말단에 EcoR I (5'-AATT)과 Hind III (5'-AGCT)를 포함하도록 제조된 프라이머(서열번호 12 및 13)를 이용하였다.

[서열번호 12] 5'-AATTCACTGCGCCGCAGCAGCGAAGCGCATAACAGCATTGTGGGCGGCGG

CAGCCATCTGCTGCAGCATCCGCAG-3'

[서열번호 13] 5'-AGCTCTGCGGATGCTGCAGCAGATGGCTGCCGCCGCCCACAATGCTGTT

ATGCGCTTCGCTGCTGCGGCGCAGTG-3'

위의 프라이머를 이용한 재조합 박테리오파지 클로닝은 실시예 1과 동일한 방법으로 진행하였으며, 그 결과, 다성분 펩타이드(LRRSSEAHNSIVGGGSHLLQHPQ)가 발현되도록 재조합된 박테리오파지 T7은 약 145 bp의 크기를 보이는 것을 확인하였으며, 다성분 펩타이드가 제대로 발현하였는지 염기서열 분석을 통해 확인한 결과, 다성분 펩타이드를 코딩하는 염기서열로 박테리오파지 T7(ZnS-Stav-파지)이 클로닝된 것을 확인하였다.

바이오틴화된 형광표지자를 이용한 재조합 박테리오파지 T7 ( ZnS - Stav -파지)의 형광표시(labeling)

ZnS-Stav-파지 C-말단기에 발현된 스트렙타비딘 결합능력을 가지는 펩타이드를 이용하여 바이오틴화된 다양한 형광표지자를 박테리오파지에 부착하여 형광표지된 T7 나노구조체를 제작 가능함을 확인하기 위해, 나일론 맴브레인을 이용하여 재조합 박테리오파지 T7(ZnS-Stav-파지)에 스트렙타비딘을 특이적으로 결합시킨 후에 바이오틴화(biotinylation) 되어있는 분자량이 약 332Da 정도 되는 형광표지자인 플루오레세인(biotin-FITC)을 결합하는 실험을 진행하였다.

가로 0.5 cm, 세로 5 cm로 자른 나일론 맴브레인(Millipore charged nylon membrane for nucleic acid blotting)에 1.2 X 10⁹ pfu의 파지를 10분 동안 처리하였다. 비특이적 결합성을 배제하기 위해 10 %의 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 처리하였으며, 600 ㎖의 비이온수에 반복 세척하였다. 파지의 5배 몰수에 해당하는 스트렙타비딘을 파지가 로딩(loading)된 나일론 멤브레인에 30분 동안 처리한 뒤, 600 ㎖의 비이온수에 반복 세척하였다. 뒤이어 최종 몰비가 1:10:5(파지:스트렙타비딘:플루오레세인)이 되도록 biotin-FITC를 ZnS-Stav-파지와 스트렙타비딘이 결합된(ZnS-Stav-파지/Stav) 나일론 멤브레인에 처리한다. 10분 동안 배양한 후 600 ㎖의 비이온수에 반복 세척한 뒤, 상온에서 건조시킨 후 Xenogen IVIS-lumina를 이용하여 형광을 측정하고 면적대비 형광의 세기(region of interest, ROI)를 측정하였다.

그 결과, biotin-FITC만 처리한 대조군과 ZnS-Stav-파지에 biotin-FITC를 처리한 군은 비슷한 수준의 형광의 세기를 보이는 반면, 스트렙타비딘이 결합된 파지(ZnS-Stav-파지/Stav)에 biotin-FITC를 처리한 군은 단위면적당 광자의 개수가 높게 측정되는 것을 확인하였으며(도 8), ZnS-Stav-파지의 C-말단기에 발현된 스트렙타비딘 결합능력을 가지는 펩타이드를 이용하여 바이오틴화된 다양한 형광표지자를 박테리오파지에 부착하여 형광표지된 T7 나노구조체를 제작할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

ZnS - Stav -파지의 스트렙타비딘의 결합능력을 이용한 암세포 타겟팅

실시예 4에서 제작한 스트렙타비딘이 결합된 ZnS-Stav-파지를 나노구조체로 이용한 암세포 타겟팅과 이미징을 확인하기 위해 T7 나노구조체에 형광을 표지한 후 암세포 타켓팅을 형광세기 측정을 통해 확인하였다.

6-1: ZnS - Stav -파지에 FITC ( fluorescein isothiocyanate ) 형광 표지

0.1 ㎖의 PBS (10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, 156 mM NaCl)와 1.2 ㎍의 FITC 혼합액에 1.25 x 10¹¹pfu/㎖의 ZnS-Stav-T7 파지 2.5 ㎖을 천천히 교반시키면서 첨가한 뒤, 상온에서 4시간 동안 반응시켰다. 파지에 결합하지 않은 FITC를 제거하기 위하여 투석 맴브레인(Spectra/Por Dialysis Membrane, cutoff 5 kDa)에 반응액을 넣고 상온에서 10 시간 동안 투석하였다.

6-2: T7 나노구조체를 이용한 인테그린(avβ3 integrin) 과발현 암세포 타겟팅

세포막의 인테그린(avβ3 integrin)과 결합하는 펩타이드 염기서열 아르기닌-글리신-아스파르트산(Arg-Gly-Asp, RGD)을 바이오티닐화하기 위해 2 ㎎/㎖의 RGD 펩타이드가 들어있는 PBS 용액에 2 ㎎/㎖의 바이오틴-말레이미드(biotin-maleimide)가 녹아 있는 dimethyl sulfoxide (DMSO) 용액을 천천히 첨가하여 상온에서 10시간 동안 반응 하였다. 투석 맴브레인(Spectra/Por Dialysis Membrane, cutoff 500 Da)에 반응액을 넣고 상온에서 10시간 동안 투석하여 결합되지 않은 물질들을 제거하였다.

FITC로 형광 표지된 ZnS-Stav-파지 1.2 X 10¹¹ pfu에 스트렙타비딘 4 ㎍을 넣고 상온에서 30분 동안 처리하여 결합을 유도하였다 (ZnS-Stav-파지/Stav). A549 세포를 96-well plate (96-well culture plate, BD Falcon)에 2.0 X 10⁴cells/well의 농도로 10 % 우태혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 들어 있는 RPMI 1640 배양액(Roswell Park Memorial Institute medium)에 준비하여 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고 200 ㎕의 PBS 용액으로 3회 세척한 뒤, 0.08 ㎎/㎖의 바이오티닐화 된 RGD (RGD-biotin) 펩타이드 3 ㎖을 넣고 4 ℃에서 30분간 배양하여 RGD-biotin 펩타이드가 세포 표면의 과발현된 인테그린(avβ3 integrin)에 결합되도록 하였다. 배양액을 제거하고 200 ㎕의 PBS 용액으로 3회 세척하여 결합되지 않은 RGD-biotin 펩타이드를 제거한 뒤, 스트렙타비딘을 결합시킨 FITC 형광 표지된 ZnS-Stav-파지(ZnS-Stav-파지/Stav)를 4.0 X 10⁹ pfu/well의 농도로 처리하여 4 ℃에서 30분 동안 배양하여 세포 표면에 결합된 RGD-biotin 펩타이드와 ZnS-Stav-파지/Stav의 결합을 유도하였다. 배양액을 제거하고 200 ㎕의 PBS 용액으로 3회 세척하여 결합되지 않은 ZnS-Stav-파지/Stav를 제거한 뒤, 1420 multilabel counter (PerkinElmer)를 이용하여 FITC 형광의 세기를 측정하였다.

그 결과, 세포 표면에 결합된 RGD-biotin 펩타이드와 ZnS-Stav-파지/Stav를 결합시킨 군의 형광세기가 다른 군들에 비해 높게 나타나는 것을 확인하였으며(도 9), 양자점에 결합능력이 있는 펩타이드와 스트렙타비딘에 결합능력이 있는 펩타이드로 구성된 다성분 펩타이드가 발현되는 ZnS-Stav-파지를 이용하여 암세포 타켓팅과 이미징이 가능한 것을 확인할 수 있었다.

ZnS - Stav -파지와 양자점 (아연/구리/인/황을 중심 물질로 하고 황화아연을 껍질로 한 양자점 )간의 결합능력 확인 실험

ZnS-Stav-파지의 ZnS 결합성 펩타이드를 이용하여 양자점 특이적 결합능력을 확인하였다. 가로 0.5 cm, 세로 5 cm의 나일론 맴브레인(Millipore charged nylon membrane for nucleic acid blotting)에 1.2 X 10⁹ pfu의 ZnS-Stav-파지를 처리하고, 비특이적 결합성을 배제하기 위해 10 %의 소혈청알부민 (bovine serum albumin)을 처리한 뒤, 10분 동안 배양한 후 600 ㎖의 비이온수에 반복 세척하였다. ZnS-Stav-파지가 로딩(loading)된 나일론 맴브레인 위에 물 분산된 12.5 μM의 양자점 7.2 ㎕를 10분, 20분, 30분, 60분, 120분 동안 각각 처리한 뒤, 600 ㎖의 비이온수에 반복 세척하였다. 상온에서 건조시킨 후 Xenogen IVIS-lumina를 이용하여 형광을 측정하고 면적대비 형광의 세기(region of interest, ROI)를 측정하였다 (도 10).

그 결과, 양자점에 결합능력이 있는 펩타이드와 스트렙타비딘에 결합능력이 있는 펩타이드로 구성된 다성분 펩타이드가 발현되는 ZnS-Stav-파지가 양자점과 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.

포르피린과 금나노입자에 결합능력을 가지는 펩타이드를 탠덤사슬 형태로 발현하는 재조합 박테리오파지 T7 제작

포르피린과 금나노입자에 결합능력을 가지는 펩타이드가 탠덤사슬 형태로 연결된 다성분 펩타이드(서열번호 14)를 박테리오파지에서 발현시키기 위해, 포르피린 결합능력이 있는 펩타이드 HASYS(서열번호 15)와 금나노입자 결합능력이 있는 펩타이드 VSGSSPDS(서열번호 16)의 사이를 GGG 연결기(linker)를 이용하여 염기서열을 합성하였다.

[서열번호 14] N-HASYSGGGVSGSSPDS-C

클로닝에 사용할 이중가닥 DNA를 제작하기 위해 각각 5'말단에 EcoR I (5'-AATT)과 Hind III (5'-AGCT)를 포함하도록 제조된 프라이머(서열번호 17 및 18)를 이용하였다.

[서열번호 17] 5'-AATTCACATGCGAGCTATAGCGGCGGCGGCGTGAGCGGCAGCAG

CCCGGATAGC-3'

[서열번호 18] 5'-AGCTGCTATCCGGGCTGCTGCCGCTCACGCCGCCGCCGCTATA

GCTCGCATGTG-3'

위의 프라이머를 이용한 재조합 박테리오파지 클로닝은 실시예 1과 동일한 방법으로 진행하였으며, 그 결과, 다성분 펩타이드(HASYSGGGVSGSSPDS)가 발현되도록 재조합된 박테리오파지 T7(Por-Au-파지)은 약 125 bp의 크기를 보이는 것을 확인하였으며, 다성분 펩타이드가 제대로 발현하였는지 염기서열분석을 통해 확인한 결과, 다성분 펩타이드를 코딩하는 염기서열로 박테리오파지 T7이 클로닝된 것을 확인하였다.

Por-Au-파지에 금 나노입자가 결합하여 형성된 박테리오파지 T7 나노구조체의 이미지는 실시예 2-2와 동일하게 진행하여 투과전자현미경(transmission electron microscopy) 을 통해 확인하였다.

양자점과 PC3 암세포 표면 수용체에 결합능력을 가지는 펩타이드를 탠덤사슬 형태로 발현하는 재조합 박테리오파지 T7 제작

양자점과 PC3 암세포 표면 수용체에 결합능력을 가지는 펩타이드가 탠덤사슬 형태로 연결된 다성분 펩타이드(서열번호 19)를 박테리오파지에서 발현시키기 위해, 양자점에 결합능력이 있는 펩타이드 LRRSSEAHNSIV(서열번호 20)와 PC3 암세포 표면 수용체에 결합능력이 있는 펩타이드 IAGLATPGWSHWLAL(서열번호 21)의 사이를 GGGG 연결기(linker)를 이용하여 염기서열을 합성하였다.

[서열번호 19] N-LRRSSEAHNSIVGGGGIAGLATPGWSHWLAL-C

클로닝에 사용할 이중가닥 DNA를 제작하기 위해 각각 5'말단에 EcoR I (5'-AATT)과 Hind III (5'-AGCT)를 포함하도록 제조된 프라이머(서열번호 22 및 23)를 이용하였다.

[서열번호 22] 5'-AATTCACTGCGCCGCAGCAGCAGCGAAGCGCATAACAGCATTGTGG

CGGCGGCGGCATTGCGGGCCTGGCGACCCCGGGCTGGAGCCATTGGCTGGCGCTG-3'

[서열번호 23] 5'-AGCTCAGCGCCAGCCAATGGCTCCAGCCCGGGGTCGCCAGGCCCGCA

ATGCCGCCGCCGCCCACAATGCTGTTATGCGCTTCGCTGCTGCGGCGCAGTG-3'

위의 프라이머를 이용한 재조합 박테리오파지 클로닝은 실시예 1과 동일한 방법으로 진행하였으며, 그 결과, 다성분 펩타이드(LRRSSEAHNSIVGGGGIAGLATPGWSHWLAL)가 발현되도록 재조합된 박테리오파지 T7(ZnS-PC3-파지)은 약 175 bp의 크기를 보이는 것을 확인하였으며, 다성분 펩타이드가 제대로 발현하였는지 염기서열분석을 통해 확인한 결과, 다성분 펩타이드를 코딩하는 염기서열로 박테리오파지 T7이 클로닝된 것을 확인하였다.

ZnS-PC3-파지에 양자점이 결합하여 형성된 박테리오파지 T7 나노구조체의 이미지는 실시예 2-2와 동일하게 진행하여 투과전자현미경(transmission electron microscopy) 을 통해 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Specific organic molecule -targeting Hybrid Nanostructures <130> P13-B042 <160> 25 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> multicomponent peptide <400> 1 Met His Gly Lys Thr Gln Ala Thr Ser Gly Thr Ile Gln Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ile Ala Gly Leu Ala Thr Pro Gly Trp Ser His Trp Leu Ala 20 25 30 Leu <210> 2 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gold nanoparticle binding peptide <400> 2 Met His Gly Lys Thr Gln Ala Thr Ser Gly Thr Ile Gln Ser 1 5 10 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PC3 cell surface receptor binding peptide <400> 3 Ile Ala Gly Leu Ala Thr Pro Gly Trp Ser His Trp Leu Ala Leu 1 5 10 15 <210> 4 <211> 109 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> multicomponent peptid coding nucleotide <400> 4 aattcaatgc atggcaaaac ccaggcgacc agcggcacca ttcagagcgg cggcggcggc 60 attgcgggcc tggcgacccc gggctggagc cattggctgg cgctgagct 109 <210> 5 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoR I site primer <400> 5 aattcaatgc atggcaaaac ccaggcgacc agcggcacca ttcagagcgg cggcggcggc 60 attgcgggcc tggcgacccc gggctggagc cattggctgg cgctg 105 <210> 6 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hind IIII site primer <400> 6 agctcagcgc cagccaatgg ctccagcccg gggtcgccag gcccgcaatg ccgccgccgc 60 cgctctgaat ggtgccgctg gtcgcctggg ttttgccatg cattg 105 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7SelectUP Primer <400> 7 ggagctgtcg tattccagtc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7SelectDOWN Prime <400> 8 aacccctcaa gacccgttta 20 <210> 9 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> multicomponent peptide <400> 9 Leu Arg Arg Ser Ser Glu Ala His Asn Ser Ile Val Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 His Leu Leu Gln His Pro Gln 20 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> quantum dots binding peptide <400> 10 Leu Arg Arg Ser Ser Glu Ala His Asn Ser Ile Val 1 5 10 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> streptavidin binding peptide <400> 11 Ser His Leu Leu Gln His Pro Gln 1 5 <210> 12 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoR I site primer <400> 12 aattcactgc gccgcagcag cgaagcgcat aacagcattg tgggcggcgg cagccatctg 60 ctgcagcatc cgcag 75 <210> 13 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hind III site primer <400> 13 agctctgcgg atgctgcagc agatggctgc cgccgcccac aatgctgtta tgcgcttcgc 60 tgctgcggcg cagtg 75 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> multicomponent peptid <400> 14 His Ala Ser Tyr Ser Gly Gly Gly Val Ser Gly Ser Ser Pro Asp Ser 1 5 10 15 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> porphyrin binding peptide <400> 15 His Ala Ser Tyr Ser 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gold nanoparticle binding peptide <400> 16 Val Ser Gly Ser Ser Pro Asp Ser 1 5 <210> 17 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoR I site primer <400> 17 aattcacatg cgagctatag cggcggcggc gtgagcggca gcagcccgga tagc 54 <210> 18 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hind III site primer <400> 18 agctgctatc cgggctgctg ccgctcacgc cgccgccgct atagctcgca tgtg 54 <210> 19 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> multicomponent peptide <400> 19 Leu Arg Arg Ser Ser Glu Ala His Asn Ser Ile Val Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ile Ala Gly Leu Ala Thr Pro Gly Trp Ser His Trp Leu Ala Leu 20 25 30 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> quantum dots binding peptide <400> 20 Leu Arg Arg Ser Ser Glu Ala His Asn Ser Ile Val 1 5 10 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PC3 cell surface receptor binding peptide <400> 21 Ile Ala Gly Leu Ala Thr Pro Gly Trp Ser His Trp Leu Ala Leu 1 5 10 15 <210> 22 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoR I site primer <400> 22 aattcactgc gccgcagcag cagcgaagcg cataacagca ttgtggcggc ggcggcattg 60 cgggcctggc gaccccgggc tggagccatt ggctggcgct g 101 <210> 23 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hind III site primer <400> 23 agctcagcgc cagccaatgg ctccagcccg gggtcgccag gcccgcaatg ccgccgccgc 60 ccacaatgct gttatgcgct tcgctgctgc ggcgcagtg 99 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> graphene binding peptide <400> 24 Glu Pro Leu Gln Leu Lys Met 1 5 <210> 25 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nanotube binding peptide <400> 25 Asp Ser Pro His Thr Glu Leu Pro 1 5

Claims

서열번호 1, 9 및 19로 구성된 군에서 선택되는 다중성분 펩타이드 함유 캡시드(capsid) 단백질을 발현하는 재조합 박테리오파지에 금 나노입자, 포르피린 및 양자점으로 구성된 군에서 선택되는 물질이 결합되어 있는 암세포 특이적 하이브리드 나노복합체.
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제1항에 있어서, 상기 암세포는 고형암세포인 것을 특징으로 하는 암세포 특이적 하이브리드 나노복합체.
제1항에 있어서, 박테리오파지는 Podoviridae (P22, T7, phi29), Myoviridae (T4), Siphoviridae (Lambda), Microviridae (phiX174) 및 Leviridae (MS2)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암세포 특이적 하이브리드 나노복합체.
제1항에 있어서, 재조합 박테리오파지는 서열번호 1, 9 및 19로 구성된 군에서 선택되는 다중성분 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 박테리오파지에 도입시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 암세포 특이적 하이브리드 나노복합체.
제1항에 있어서, 40 내지 60nm의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는 하이브리드 나노복합체.
제1항 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 암세포 특이적 하이브리드 나노복합체를 유효성분으로 함유하는 세포 표적 약물 전달체 조성물.
제1항 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항의 암세포 특이적 하이브리드 나노복합체를 유효성분으로 함유하는 세포 이미징용 조성물.