WO2023224236A1 - 면역 회피 효능이 강화된 박테리오파지 - Google Patents

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WO2023224236A1
WO2023224236A1 PCT/KR2023/003591 KR2023003591W WO2023224236A1 WO 2023224236 A1 WO2023224236 A1 WO 2023224236A1 KR 2023003591 W KR2023003591 W KR 2023003591W WO 2023224236 A1 WO2023224236 A1 WO 2023224236A1
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WO
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bacteriophage
self
peptide
efficacy
present
Prior art date
Application number
PCT/KR2023/003591
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English (en)
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남윤성
조성덕
레김후엔창
유정식
Original Assignee
한국과학기술원
대한민국(질병관리청 국립보건연구원장)
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Publication date
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to bacteriophages with enhanced immune evasion efficacy.
  • Resistant bacteria are emerging widely due to misuse of antibiotics. Antibiotic resistance is considered one of the greatest medical problems facing humanity, with the World Health Organization defining it as a serious threat to public health. In response to this, research and development on new antibiotics are underway, but the current situation is that it is difficult to keep up with the speed of resistance development.
  • Bacteriophages are known to be safe in the human body because they do not infect human cells, and have the advantage of being able to kill resistant bacteria regardless of antibiotic resistance, so many attempts have been made to apply bacteriophages to the treatment of infectious bacteria.
  • the present invention includes a peptide with enhanced immune evasion that induces self-recognition of macrophages in the capsid on the surface of the bacteriophage, so that it can avoid the phagocytic action of macrophages, resulting in an immune evasion property that significantly increases circulation time in the blood.
  • the purpose is to provide strengthened bacteriophages.
  • Another object of the present invention is to provide pharmaceutical compositions, antibacterial compositions, food additives, and feed additives for preventing or treating bacterial infections using immune-evading bacteriophages.
  • the present invention can provide a bacteriophage containing a self-peptide represented by SEQ ID NO: 1 (GNYTCEVTELTREGETIIELK) in the capsid.
  • it may further include an efficacy enhancing sequence represented by SEQ ID NO: 3 (SLRPHSSN).
  • SLRPHSSN efficacy enhancing sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • the bacteriophage may be lytic.
  • the bacteriophage consists of T7, T3 ⁇ -phage, Phage C1, H-19B, ⁇ FC3208, ⁇ N315, ⁇ 13, ⁇ Mu50A, ⁇ ETA, PVL, PV83, T12, CS112, 315.2, and M30. may be selected from the military.
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for preventing or treating infections caused by bacteria, including the above-described bacteriophage.
  • the bacteria are E. coli , Shigella sonnei, Salmonella typhimurium , Corynebacterium diphtheria , and Clostridium botulinum ( It may be selected from the group consisting of Clostridium botulinum , Staphylococcus aureus , Streptococcus pyogenes , and Vibrio cholera .
  • the infection may be one or more infections selected from the group consisting of enteritis, dysentery, diphtheria, acute fever, scarlet fever, cholera, and food poisoning.
  • the present invention can provide an antibacterial method in subjects other than humans, comprising administering the pharmaceutical composition to subjects other than humans.
  • the present invention can provide an anti-bacterial composition containing the above-described bacteriophage.
  • the present invention can provide an antibacterial food additive and feed additive containing the antibacterial composition.
  • the present invention can provide a bacteriophage that expresses an improved immune evasion peptide by adding a predetermined amino acid to the terminal portion of the immune evasion peptide developed through existing research in order to control the immune evasion efficacy. Through this, the ability to evade immune cells increases and circulation time in the blood increases, allowing more bacteria to be killed in the body.
  • the present invention can provide an excellent immune evasion effect by further improving the activity and stability of immune-evading bacteriophages by adding amino acids. By maintaining the same structure even when the bacteriophage according to the present invention proliferates, the enhanced immune evasion effect can also be maintained.
  • Figure 1 shows the T7 bacteriophage 10B capsid sequence into which the sequence encoding the self-peptide according to the present invention is inserted.
  • FIG. 2 shows the DNA sequencing results of T7 bacteriophage containing the self-peptide according to the present invention in the T7 bacteriophage 10B capsid.
  • FIG. 3 shows the results of DNA sequencing of T7 bacteriophage containing a self-peptide with an efficacy-enhancing sequence according to the present invention contained in the T7 bacteriophage 10B capsid.
  • Figure 4 is an image showing the phagocytosis avoidance effect of T7 bacteriophage on J774a.1 macrophages of the self-peptide to which an efficacy enhancing sequence was added according to Experimental Example 2 of the present invention, observed under a fluorescence microscope.
  • Figure 5 is a flow cytometric analysis result related to the phagocytosis avoidance effect of the self-peptide to which an efficacy enhancing sequence was added according to Experimental Example 2 of the present invention on J774a.1 macrophages of T7 bacteriophage.
  • Figure 6 is a graph showing the survival rate of bacteriophages in the blood according to the introduction of efficacy enhancing sequences according to Experimental Example 3 of the present invention.
  • the number of surviving phages in the blood collected from mice each injected with T7 bacteriophages was measured by plaque formation assay. It shows the result of the decision.
  • Figure 7 shows the measurement of biodistribution of Cy5.5 fluorescently labeled bacteriophage in a mouse animal model according to Experimental Example 4 of the present invention.
  • Figure 8 is a graph showing the results of evaluating the therapeutic efficacy of self-peptide T7 bacteriophage according to the introduction of efficacy enhancing sequences according to Experimental Example 5 of the present invention.
  • first, second, A, B (a), and (b) may be used. These terms are only used to distinguish the component from other components, and the nature, sequence, or order of the component is not limited by the term.
  • units used without special mention in this specification are based on weight, and as an example, the unit of % or ratio means weight % or weight ratio, and weight % refers to the amount of any one component of the entire composition unless otherwise defined. It refers to the weight percent occupied in the composition.
  • the numerical range used in this specification includes the lower limit and upper limit and all values within the range, increments logically derived from the shape and width of the defined range, all double-defined values, and the upper limit of the numerical range defined in different forms. and all possible combinations of the lower bounds. Unless otherwise specified in the specification of the present invention, values outside the numerical range that may occur due to experimental error or rounding of values are also included in the defined numerical range.
  • the term "substantially does not include” in this specification means that other elements, materials, or processes not listed together with the specified elements, materials, or processes may be permitted to at least one basic and novel technical idea of the invention. It means that it can exist in an amount or degree that does not have a significant effect.
  • self-peptide may refer to a peptide that originally exists or is inherent in the body, or a peptide that can block a clearance signal by the immune function in the body. .
  • efficacy enhancing sequence refers to an amino acid sequence added to the N-terminus or C-terminus of a self-peptide, and may refer to a sequence added to increase the immune evasion efficacy of the self-peptide.
  • the present invention relates to bacteriophages applied to the treatment of bacterial infections that can replace antibiotics.
  • Bacteriophage is a virus that proliferates using bacteria as a host and can be used to eliminate bacteria that cause various infections in humans and non-human animals.
  • bacteriophages themselves are recognized as foreign substances in vivo, they can be eliminated (immnune clearance) by various immune systems of organisms, such as the reticuloendothelial system (RES).
  • RES reticuloendothelial system
  • the removal of viruses by phagocytosis of macrophages non-specifically removes microorganisms, so bacteriophages injected into the body can be removed in a short period of time.
  • the present invention is a technology for preventing bacteriophages from being removed by immune cells before they kill infectious bacteria in the body.
  • Self-peptide refers to a peptide that originally existed or was inherent in the body, or a peptide that can block clearance signals caused by immune function in the body.
  • the self-peptide is added to the capsid.
  • the bacteriophage it contains is not recognized as a foreign substance in the body and can avoid the body's immune response. In particular, it can avoid the phagocytic mechanism of macrophages, etc., and can circulate in the blood for a long period of time, so it can have an excellent bacterial killing effect in the treatment of infections caused by bacteria.
  • the present invention can provide a bacteriophage containing a self-peptide represented by SEQ ID NO: 1 (GNYTCEVTELTREGETIIELK) in the capsid.
  • the bacteriophage may further include an efficacy enhancing sequence represented by SEQ ID NO: 3 (SLRPHSSN).
  • the present invention can provide the effect of controlling the efficacy of a peptide by adding an efficacy enhancing sequence to the end of a self-peptide with immune evasion functionality. While existing methods of controlling the efficacy of peptides by introducing chemical bonds or unnatural amino acids require complex chemical reactions and separation and purification processes, efficacy enhancing sequences such as those of the present invention can be easily introduced into bacteriophage capsids using genetic engineering methods. There are possible advantages to this. In addition, the efficacy-enhancing sequence introduced through genetic engineering has the advantage of maintaining its effectiveness continuously because progeny bacteriophages produced by proliferation of bacteriophages also have the same efficacy-enhancing sequence.
  • the immune-evading self-peptide expressed on the capsid of bacteriophage interacts with various signal regulatory proteins of phagocytes to avoid removal by phagocytosis of phagocytes.
  • the self-peptide can be expressed by being linked to the C-terminal of the phage capsid, and is exposed to the outside from the capsid to interact with immune cells (self-peptide receptor interaction) to influence the action of immune cells. It is possible to prevent bacteriophages from being removed from.
  • the self-peptide contained in the capsid (coat protein) of a bacteriophage may be exposed to the outside of the capsid.
  • the capsid containing the self-peptide may preferably be a capsid that forms the head of a bacteriophage capsid, but is not limited thereto.
  • the self-peptide in the case of T7 bacteriophage, can be expressed by being linked to the C-terminus of 10B of the coat protein through recombinant between the T7 bacteriophage sequence and the immune evasion peptide.
  • the self-peptide cannot be expressed only in connection with the major capsid, which accounts for the majority of the proteins that make up the capsid, and T7 bacteriophage can be constructed to be expressed in the minor capsid.
  • the difference in the type of capsid connecting these self-peptides may only result in a difference in the degree of immune evasion of the bacteriophage constructed to have immune evasion, but does not change the effect desired in the present invention.
  • the self-peptide when constructing a bacteriophage so that the self-peptide is expressed in 10B, the capsid of the T7 bacteriophage, the self-peptide is expressed very uniformly in the 415 10Bs that form the head of the T7 bacteriophage and is exposed to the outside. It can be. This uniformity of expression allows for very efficient signal transduction for immune evasion and interaction with receptors on the surface of phagocytes.
  • the nucleic acid sequence of the immune-evading peptide to be recombined with the sequence of the bacteriophage is designed, and the nucleic acid sequence of the bacteriophage nucleic acid is designed to be immune-evading to the nucleic acid of the bacteriophage through a vector and restriction enzyme containing the same using techniques known in the art. Sequences encoding self-peptides can be recombined.
  • the bacteriophage may be lytic.
  • the bacteriophage attaches to the bacterial cell wall receptor and injects the bacteriophage DNA into the cell, thereby replicating the bacteriophage DNA, which can lead to the destruction of the bacteria.
  • the bacteriophage may specifically be one or more selected from, for example, T7, T3 ⁇ -phage, Phage C1, H-19B, ⁇ FC3208, ⁇ N315, ⁇ 13, ⁇ Mu50A, ⁇ ETA, PVL, PV83, T12, CS112, 315.2, and M30. there is.
  • bacteriophages are not harmful to humans or non-human animals. Lytic bacteriophages proliferate by lysing bacteria that are the host of the bacteriophage, so they can kill bacteria that cause infections. Additionally, as long as host bacteria exist, bacteriophages capable of expressing immune-evading peptides can continue to proliferate. Subsequent generation bacteriophages produced by self-propagation also contain immune-evading peptides in their capsids in the same way as the bacteriophages of the present invention, so they can retain the purposes and effects of the present invention.
  • the present invention also provides a capsid containing a self-peptide represented by SEQ ID NO: 1; And it is possible to provide a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of infections caused by bacteria using a bacteriophage containing an immune evasion efficacy enhancing sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the bacteriophage may be selected to be suitable for the type of bacterial infection to be treated or prevented.
  • the bacterial infection is one or more selected from enteritis, dysentery, diphtheria, acute fever, scarlet fever, cholera, and food poisoning, but is not limited thereto.
  • the bacteriophage that hosts the bacteria may be different.
  • the present invention can provide an antibacterial method in a subject comprising administering an effective amount of the pharmaceutical composition to the subject.
  • the present invention can provide a method for treating infections caused by bacteria, comprising administering an effective amount of the pharmaceutical composition to an individual.
  • the subject may be a human and/or a non-human animal.
  • the pharmaceutical composition can be administered orally or by injection, and the administration method is not necessarily limited thereto.
  • the bacteriophage is administered in different ways, such as intravascular administration and intraperitoneal administration, there is an immune evasion effect and treatment of infectious diseases is possible.
  • the dosage of bacteriophage is not limited, but an appropriate dosage can be determined by measuring the number of phagocytes in the blood. Preferably, it is 10 to 100 times the number of phagocytes, but is not limited thereto.
  • the present invention can provide an anti-bacterial composition by utilizing a bacteriophage containing an immune-evading self-peptide in the capsid.
  • 'antibacterial' may mean the ability to reduce, prevent, suppress, or eliminate the growth or survival of bacteria.
  • the antibacterial composition of the present invention can be usefully used in humans and non-human animals.
  • antibacterial targets include E. coli , Shigella sonnei , Salmonella typhimurium , Corynebacterium diphtheria , Clostridium botulinum , and Staphylococcus aureus. At least one selected from the group consisting of Staphylococcus aureus , Streptococcus pyogenes , and Vibrio cholera , but is not limited thereto.
  • the antibacterial composition may be in the form of food, food additives, feed, or feed additives.
  • a health functional food for preventing infections caused by bacteria can be provided by using a bacteriophage containing a self-peptide in the capsid.
  • Health functional foods containing the bacteriophage according to the present invention as an active ingredient are not particularly limited, but include, for example, various foods, beverages, gums, teas, vitamin complexes, health supplements, powders, granules, tablets, etc. It can be used in capsule or beverage form.
  • the active ingredient may generally be included in 0.001 to 15% by weight of the total food weight, specifically 0.01 to 1% by weight, and in the case of beverage compositions, 0.001 to 1 g, specifically 0.01 to 0.1 g based on 100 ml. However, this is only an example and is not limited to the above numerical range.
  • the health functional food according to the present invention may contain food additives such as natural carbohydrates and various flavoring agents that are foodologically acceptable as additional ingredients.
  • natural carbohydrates include common sugars such as monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, and polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • the flavoring agent may include thaumatin, rebaudioside A, glycyrrhizin, saccharin, and aspartame.
  • the health functional food according to the present invention contains various nutrients, vitamins, minerals, flavoring agents such as synthetic and natural flavors, colorants and thickening agents, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, and protective agents. It may contain colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated beverages, etc.
  • the health functional food according to the present invention may contain pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice drinks, vegetable drinks, etc. These ingredients can be used independently or in combination.
  • the manufacturing method of the health functional food is not particularly limited, and generally known food manufacturing methods can be introduced and used, and can also be modified and used as necessary.
  • the antibacterial composition according to the invention when used as a feed additive, it may be used in the form of a solid or liquid preparation or an alternative thereof.
  • solid preparations include powders, pastes, boluses, capsules, pellets, tablets, dusts, and granules that can be wetted, spray dried, or freeze dried.
  • liquid preparations include, but are not limited to, aqueous, organic or aqueous-organic solutions, suspensions, and emulsions.
  • the feed additive may be used by mixing with feed or administering it to drinking water.
  • an efficacy enhancing sequence (8 amino acids (SLRPHSSN sequence) was added to the C-terminus of the immune evasion self peptide (GNYTCEVTELTREGETIIELK) to introduce an increased length peptide into the bacteriophage capsid.
  • T7 phage capsid In order to express in T7 phage capsid a sequence in which the potency enhancing sequence SLRPHSSN is added to the C-terminus of the self-peptide, two single-stranded DNA sequences represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 shown in Table 2 below were designed and Examples. It was used as 2.
  • SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 shown in Table 2 below were designed and Examples. It was used as 2.
  • self-C8 T7 the T7 bacteriophage expressing the self-peptide containing the efficacy enhancing sequence according to Example 2 is referred to as self-C8 T7.
  • the insert DNA was prepared by raising the temperature of the single-stranded DNA pair above to 94°C and then slowly lowering the temperature to 16°C to induce complementary binding.
  • T7Select415-1b vector DNA was digested with restriction enzymes EcoRI and HindIII, subjected to 0.5% agarose gel electrophoresis, and purified.
  • the vector DNA and the insert DNA were ligated using T4 DNA ligase to express the self-peptide at the C-terminus of the T7 phage 10B capsid protein.
  • J774a.1 cells 5 ⁇ 10 5 J774a.1 cells were cultured in a 6-well plate in a CO 2 incubator. Fluorescently (Cy5.5) labeled wild type (WT) and T7 bacteriophages (Self-C0, Self-C8) introduced with immune evasion self-peptide were co-cultured with J774a.1 for 1 hour. T7 bacteriophages consumed by macrophages were quantitatively compared using fluorescence microscopy and flow cytometry, and the results are shown in Figures 4 and 5.
  • a mouse animal model was used to evaluate whether the bacteriophage to which the efficacy enhancing sequence was added survived longer in the body's blood.
  • Wild-type phage (WT) bacteriophage with self-peptide introduction
  • T7 bacteriophage expressed with efficacy-enhancing sequences were injected into the vein of 6- week -old Balb/c male mice for 15, 30, and 60 minutes. Later, blood was collected from each mouse and collected in a tube containing 10% heparin. The number of T7 bacteriophages surviving in the collected blood was evaluated by plaque formation assay.
  • bacteriophages with added efficacy-enhancing sequences can circulate in the blood for a longer period of time and kill more infectious bacteria than bacteriophages with only existing self-peptides introduced, which may mean that the treatment effect for infectious diseases can be more effective.
  • a mouse animal model was used to evaluate whether bacteriophages with added efficacy enhancing sequences circulate longer in the body than bacteriophages with self-peptide introduction.
  • Six-week-old Balb/c male mice were prepared and intravenously injected with Cy5.5-labeled wild-type, self-peptide-introduced bacteriophage and T7 bacteriophage additionally expressed up to an efficacy-enhancing sequence. After injection, 15 minutes, 30 minutes, 60 minutes, 2 hours, 4 hours, 8 hours, and 24 hours later, the whole body of each mouse was photographed with the IVIS Lumina It has been done.
  • mice Balb/c male mice were infected with E. coli BL21 by intraperitoneal injection. After infection, the wild type and T7 bacteriophage into which the self-peptide according to Example 1 and the efficacy enhancing sequence according to Example 2 were introduced were administered intravenously. A comparison was also made between a group of healthy mice (No E.coli (healthy control)) that were not infected with E. coli and a group (PBS (buffer control)) that was injected only with PBS buffer after infection with E. coli and not injected with bacteriophage. evaluated. The control and experimental groups consisted of 3 mice each. Afterwards, the physical symptoms of the mice were scored to evaluate the treatment efficacy.
  • PBS buffer control
  • mice treated with PBS rapidly worsened in 8 hours and the worsening symptoms were maintained until 48 hours. It was confirmed that when treated with wild-type bacteriophage, symptoms improved rapidly compared to PBS. Mice administered with self-peptide-introduced bacteriophages (Self-C0, Self-C8) had less severe symptoms compared to wild type (WT) and PBS, and recovered completely at a rapid rate. Moreover, the self-peptide bacteriophage (Self-C8) into which the efficacy-enhancing sequence according to Example 2 was introduced recovered to normal more quickly than the bacteriophage into which only the self-peptide was introduced (Self-C0).
  • Self-C0 self-peptide-introduced bacteriophages
  • Sequence information for Sequence Listing 1 to Sequence Listing 4 is submitted in the form of a separate file.

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Abstract

본 발명은 캡시드에 면역 회피성 펩티드 및 효능 강화 서열을 포함하는 박테리오파지 및 이의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로 상기 면역 회피성 펩티드 및 효능 강화 서열을 포함한 박테리오파지는 체내 면역 작용을 회피함으로써, 오랜 기간 혈액을 따라 순환될 수 있어 세균에 의한 감염증 예방 또는 치료 효과를 제공하며, 기존 항생제에 내성을 가진 다제내성균의 효과적인 치료제로서 활용될 수 있다.

Description

면역 회피 효능이 강화된 박테리오파지
본 발명은 면역 회피 효능이 강화된 박테리오파지에 관한 것이다.
항생제의 오남용으로 내성을 가진 박테리아가 광범위하게 출현하고 있다. 항생제 내성은 세계보건기구에서 공공 보건의 심각한 위협으로 규정하고 있을 정도로 인류가 직면한 최대 의학 문제 중 하나로 손꼽힌다. 이에 대응해 신규 항생제에 대한 연구와 개발이 진행되고 있으나, 내성 발생 속도를 따라가기 어려운 것이 현 실정이다.
기존 항생제의 대체제로 박테리아를 숙주로 삼는 바이러스인 박테리오파지를 이용하고자 하는 연구가 주목받고 있다. 박테리오파지는 사람 세포에는 감염하지 않기 때문에 인체에는 안정하다고 알려져 있으며, 항생제 내성과는 무관하게 내성균을 사멸할 수 있는 장점이 있어 박테리오파지를 감염균 치료에 적용하고자 하는 여러 시도들이 이루어져 왔다.
그러나 포유류 체내 면역으로 인해 박테리오파지가 매우 빠르게 제거되는 문제때문에 실용화하기에는 부족하고, 박테리오파지를 외부 물질로 인지한 체내 면역세포가 박테리오파지가 감염균을 사멸하기 이전에 빠르게 제거되어 감염균 치료효과가 매우 떨어지는 문제가 있다. 따라서 체내 면역세포에 의한 박테리오파지의 제거는 박테리오파지 치료제 개발에 있어 필수적으로 해결되어야 할 문제이다.
한편, 박테리오파지가 면역 세포에 의해 제거되는 것을 지연시켜 체내 존속 시간을 증대하기 위하여 펩티드 기반 약물의 활성, 생체 내 지속성 및 안정성을 향상시켜 치료 효능을 증대하고자 하는 다양한 연구가 진행되고 있다. 대표적인 예로서, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)과 같은 고분자를 펩티드 말단에 공유결합에 의해 연결된 중합체를 제조하는 방법이 있다.
또한 펩티드의 아미노산 간에 화학적 교차-연결(cross-linking)을 하거나 비천연(non-natural) 아미노산을 도입하여 활성을 높은 구조를 유도하거나 분해효소에 의한 분해를 억제하는 방법이 개발되었다.
그러나 이러한 펩티드의 화학적으로 변형하는 방법은 박테리오파지의 표면 캡시드에 도입하기 쉽지 않다. 또한 화학적 변형이 도입된 박테리오파지가 증식하여 생성된 박테리오파지의 경우 화학적 변형이 되어 있지 않기 때문에 면역 회피 특성은 지속되지 않는 한계가 있다.
본 발명은 박테리오파지 표면의 캡시드에 대식세포의 자가 인식을 유도하는 면역 회피성이 강화된 펩티드를 포함함으로써, 대식세포의 식세포 작용을 회피할 수 있어, 혈액 내 순환 시간이 현저히 증가된 면역 회피 특성이 강화된 박테리오파지를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 면역 회피성 박테리오파지를 활용한 세균성 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 항균 조성물, 식품 첨가제 및 사료 첨가제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상술한 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 캡시드(capsid)에 서열번호 1(GNYTCEVTELTREGETIIELK)로 표시되는 자가-펩티드(self-peptide)를 포함하는 박테리오파지를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 서열번호 3(SLRPHSSN)로 표시되는 효능 강화 서열을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 박테리오파지는 용균성(lytic)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 박테리오파지는 T7, T3 β-phage, Phage C1, H-19B, ΦFC3208, ΦN315, Φ13, ΦMu50A, ΦETA, PVL, PV83, T12, CS112, 315.2, 및 M30로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한 본 발명은 상술한 박테리오파지를 포함하는, 세균에 의해 유발되는 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세균은 대장균(E. coli), 시겔라소네이균(Shigella sonnei) 및 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium), 코네리박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 클로스트리듐 보툴리누스(Clostridium botulinum), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 화농연쇄상구균(Streptococcus pyogenes) 및 콜레라균(Vibrio cholera)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 감염증은 장염, 세균성 이질, 디프테리아(diphtheria), 급성발열, 성홍열, 콜레라 및 식중독으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 감염증일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 개체 내 항균 방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 상술한 박테리오파지를 포함하는 항균(anti-bacterial) 조성물을 제공할 수 있다.
아울러 본 발명은 상기 항균 조성물을 포함하는 항균용 식품 첨가제 및 사료 첨가제를 제공할 수 있다.
본 발명은 면역 회피 효능을 조절하기 위해서 기존 연구를 통해 개발한 면역 회피성 펩티드의 말단 부분에 소정의 아미노산을 추가함에 따라 개량된 면역 회피성 펩티드를 발현하는 박테리오파지를 제공할 수 있다. 이를 통해 면역세포에 대한 회피능이 증대되어 혈액 내 순환시간이 증가함에 따라, 체내에서 더 많은 박테리아를 사멸할 수 있다.
또한 본 발명은 아미노산 추가에 따라 면역 회피성 박테리오파지의 활성 및 안정성을 한층 더 향상시켜 뛰어난 면역 회피 효과를 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 박테리오파지는 증식하더라도 동일한 구조를 유지함으로써, 증대된 면역 회피 효과 역시 유지될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 자가-펩티드를 코딩하는 서열이 삽입되는 T7 박테리오파지 10B 캡시드 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 자가-펩티드가 T7 박테리오파지 10B 캡시드에 포함된 T7 박테리오파지의 DNA 시퀀싱 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 효능 강화 서열이 추가된 자가-펩티드가 T7 박테리오파지 10B 캡시드에 포함된 T7 박테리오파지의 DNA 시퀀싱 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명 실험예 2에 따라 효능 강화 서열이 추가된 자가-펩티드가 T7 박테리오파지의 J774a.1 대식세포에 대한 식작용 회피 효과를 형광 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 5는 본 발명 실험예 2에 따라 효능 강화 서열이 추가된 자가-펩티드가 T7 박테리오파지의 J774a.1 대식세포에 대한 식작용 회피 효과와 관련된 유세포분석 결과이다.
도 6은 본 발명 실험예 3에 따라 효능 강화 서열 도입에 따른 박테리오파자의 혈액 내 생존율을 나타낸 그래프로서, T7 박테리오파지를 각각 주사한 마우스로부터 채취한 혈액 내 생존하고 있는 파지 수를 플라크형성 어세이로 결정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명 실험예 4에 따라 Cy5.5 형광 표지된 박테리오파지의 마우스 동물 모델의 생체 내 분포(biodistribution)을 측정한 것이다.
도 8은 본 발명 실험예 5에 따라 효능 강화 서열 도입에 따른 자가-펩티드 T7 박테리오파지의 치료 효능을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명에 따른 면역 회피성 기능성 자가-펩티드를 포함하는 박테리오파지에 대하여 상세히 설명한다.
본 명세서에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
또한 본 발명의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제1, 제2, A, B (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미하고, 중량%는 달리 정의되지 않는 한 전체 조성물 중 어느 하나의 성분이 조성물 내에서 차지하는 중량%를 의미한다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 수치 범위는 하한치와 상한치와 그 범위 내에서의 모든 값, 정의되는 범위의 형태와 폭에서 논리적으로 유도되는 증분, 이중 한정된 모든 값 및 서로 다른 형태로 한정된 수치 범위의 상한 및 하한의 모든 가능한 조합을 포함한다. 본 발명의 명세서에서 특별한 정의가 없는 한 실험 오차 또는 값의 반올림으로 인해 발생할 가능성이 있는 수치범위 외의 값 역시 정의된 수치범위에 포함된다.
또한, 본 명세서의 용어, "포함한다"는 "구비한다", "함유한다", "가진다" 또는 "특징으로 한다" 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다.
또한, 본 명세서의 용어, "실질적으로~ 포함하지 않는다"는 특정된 요소, 재료 또는 공정과 함께 열거되어 있지 않은 다른 요소, 재료 또는 공정이 발명의 적어도 하나의 기본적이고 신규한 기술적 사상에 허용할 수 없을 만큼의 현저한 영향을 미치지 않는 양 또는 정도로 존재할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명 명세서에서 "자가-펩티드 (self-peptide)"는 생체 내에서 원래부터 존재하거나 내재되어 있던 펩티드, 혹은 생체 내의 면역 작용에 의해 제거(clearance) 신호를 막아 줄 수 있는 펩티드를 의미할 수 있다.
본 발명 명세서에서 "효능 강화 서열"은 자가-펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 추가된 아미노산 서열로서, 자가-펩티드의 면역 회피 효능을 증대하고자 추가된 서열을 의미할 수 있다.
본 발명은 항생제를 대체할 수 있는 세균 감염증 치료에 적용되는 박테리오파지에 관한 것이다. 박테리오파지는 세균(bacteria)를 숙주로 이용해 증식하는 바이러스로서 인간 및 인간 외의 동물에서 다양한 감염증을 일으키는 세균들을 제거하는데 이용할 수 있다. 그러나 박테리오파지 자체도 생체 내에서 생체 외부 물질로 인식되기 때문에 세망내피계(reticuloendothelial system (RES)) 등 생물의 다양한 면역 체계에 의하여 제거(immnune clearance)될 수 있다. 특히, 대식세포(macrophage)의 식균작용(phagocytosis)에 의한 바이러스의 제거는 비특이적으로 미생물을 제거하기 때문에 생체 내로 주입된 박테리오파지는 단기간에 제거될 수 있다.
이에 본 발명은 박테리오파지가 체내에서 감염균을 사멸하기 전에 면역세포에 의해 제거되는 것을 방지하기 위한 기술이다.
자가-펩티드(self-peptide)는 생체 내에서 원래부터 존재하거나 내재되어 있던 펩티드, 혹은 생체 내의 면역 작용에 의한 제거(clearance) 신호를 막아 줄 수 있는 펩티드를 의미하는 것으로, 캡시드에 자가-펩티드를 포함하는 박테리오파지는 생체 내에서 외부 물질로 인식되지 않아 체내 면역작용을 회피할 수 있다. 특히, 대식세포 등에 의한 식세포 작용 기전을 회피할 수 있어 오랜 기간 혈액 내에서 순환될 수 있기 때문에 세균에 의한 감염증 치료에서 세균 사멸효과가 우수하게 나타날 수 있다.
구체적으로 본 발명은 캡시드(capsid)에 서열번호 1(GNYTCEVTELTREGETIIELK)로 표시되는 자가-펩티드(self-peptide)를 포함하는 박테리오파지를 제공할 수 있다. 바람직한 일 예로서, 박테리오파지는 서열번호 3(SLRPHSSN)으로 표시되는 효능 강화 서열을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 면역 회피 기능성의 자가-펩티드의 말단에 효능 강화 서열을 추가함으로써 펩티드의 효능을 조절할 수 있는 효과를 제공할 수 있다. 화학결합이나 비천연 아미노산을 도입하여 펩티드의 효능을 조절하는 기존의 방법들은 복잡한 화학 반응 및 분리정제의 과정을 필요로 하는 반면, 본 발명과 같은 효능 강화 서열은 유전공학적 방법으로 손쉽게 박테리오파지 캡시드에 도입이 가능한 장점이 있다. 또한 유전공학적으로 도입된 효능 강화 서열은 박테리오파지가 증식하여 생성되는 자손 박테리오파지도 동일한 효능 강화 서열을 가지기 때문에 효과가 지속적으로 유지되는 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 박테리오파지의 캡시드에 발현된 면역 회피성 자가-펩티드가 식세포의 다양한 신호조절단백질(signal regulatory protein)과 상호작용하여 식세포의 식균작용에 의한 제거를 회피할 수 있다. 구체적으로, 상기 자가-펩티드는 파지 캡시드의 C-말단(C-terminal)에 연결되어 발현될 수 있고, 캡시드에서 외부로 노출되어 면역세포와 상호작용(self-peptide receptor interaction)하여 면역세포의 작용으로부터 박테리오파지가 제거되지 않도록 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 박테리오파지의 캡시드(capsid, coat protein)에 포함된 자가-펩티드는 캡시드 외부로 노출될 수 있다. 자가-펩티드가 포함된 캡시드는 박테리오파지 캡시드 중 머리(head)를 이루는 캡시드가 바람직할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, T7 박테리오파지의 경우 T7 박테리오파지 서열과 면역 회피성 펩티드의 재조합(recombinant)을 통해 자가-펩티드가 외피 단백질(coat protein) 중 10B의 C-말단에 연결되어 발현될 수 있다. 자가-펩티드는 캡시드를 이루는 단백질 중 다수를 차지하는 메이저 캡시드에만 연결되어 발현될 수 있는 것은 아니며, 마이너 캡시드에 발현되도록 T7 박테리오파지를 구축(construction)할 수 있다. 이러한 자가-펩티드를 연결하는 캡시드의 종류 차이는 면역 회피성을 가지도록 구축된 박테리오파지(constructed bacteriophage)의 면역 회피성 정도에 차이가 있을 수 있을 뿐 본 발명에서 목적하는 효과가 달라지는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, T7 박테리오파지의 캡시드인 10B에서 자가-펩티드가 발현되도록 박테리오파지를 구축하는 경우 T7 박테리오파지의 헤드를 형성하는 415개의 10B에 자가-펩티드가 매우 균일하게 발현되어 외부로 노출될 수 있다. 이러한 발현의 균일성은 면역 회피를 위한 신호 전달 및 식세포 표면의 수용체와 일어나는 상호작용을 매우 효율적으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 박테리오파지의 서열과 재조합하려는 면역 회피성 펩티드의 핵산 서열을 디자인하고, 당업계에 공지된 기술을 활용하여 이를 포함하는 벡터 및 제한효소를 통해 박테리오파지의 핵산에 면역 회피성 자가-펩티드를 코딩하는 서열을 재조합 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 박테리오파지는 용균성(lytic)일 수 있다. 즉, 박테리오파지는 세균 세포벽 수용체에 부착되어 세포 내부로 박테리오파지 DNA를 주입함으로써, 박테리오파지의 DNA가 복제되고, 이는 세균을 파괴하기에 이를 수 있다. 박테리오파지는 구체적으로 예를 들면, T7, T3 β-phage, Phage C1, H-19B, ΦFC3208, ΦN315, Φ13, ΦMu50A, ΦETA, PVL, PV83, T12, CS112, 315.2, 및 M30 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서 상술한 박테리오파지 외에도 인간 또는 인간외 동물에 유해한 박테리오파지가 아니라면 특별히 제한되지 않는다. 용균성 박테리오파지는 박테리오파지의 숙주인 세균을 용균시켜 증식하므로 감염증을 유발하는 세균을 사멸시킬 수 있다. 또한 숙주인 세균이 존재하는 한, 면역 회피성 펩티드가 발현될 수 있는 박테리오파지가 계속 증식할 수 있다. 자가 증식으로 생성된 후세대 박테리오파지도 본 발명의 박테리오파지와 동일하게 캡시드에 면역 회피성 펩티드를 포함하고 있어 본 발명의 목적 및 효과를 그대로 가질 수 있다.
또한 본 발명은 캡시드에 서열번호 1로 표시되는 자가-펩티드; 및 서열번호 3으로 표시되는 면역 회피 효능 강화 서열을 포함하는 박테리오파지를 활용하여 세균에 의한 감염증의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 박테리오파지를 포함한 약학적 조성물은 치료 또는 예방 대상인 세균 감염증의 종류에 적합하도록 박테리오파지를 선택할 수 있다. 세균 감염증은 장염, 세균성 이질, 디프테리아(diphtheria), 급성발열, 성홍열, 콜레라 및 식중독에서 선택되는 하나 이상이나 이에 제한되는 것은 아니다. 치료 또는 예방 대상의 세균 감염증을 유발하는 세균의 종류에 따라 해당 세균을 숙주로 하는 박테리오파지를 달리할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 약학적 조성물 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 항균 방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 약학적 조성물 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 세균에 의해 유발되는 감염증 치료 방법을 제공할 수 있다.
상기 개체는 인간 및/또는 인간을 제외한 동물일 수 있다. 상기 약학적 조성물을 경구로 투여하거나 주사로 투여할 수 있고, 투여 방법은 이에 반드시 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 혈관 투여 및 복강 투여로 각각 상이한 방법으로 박테리오파지를 투여하여도 면역 회피 작용 효과가 있고, 감염증의 치료가 가능하다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 박테리오파지의 투여량은 제한되지 않으나 혈액 내 식세포 수를 측정하여 적합한 투여량을 결정할 수 있다. 바람직하게는 식세포 수 대비 10 내지 100배이나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 캡시드에 면역 회피성 자가-펩티드를 포함하는 박테리오파지를 활용하여 항균(anti-bacterial) 조성물을 제공할 수 있다.
이때 '항균'은 세균의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제 또는 제거하는 능력을 의미할 수 있다. 본 발명의 항균 조성물은 인간 및 인간을 제외한 동물에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에서 항균 대상은 대장균(E.coli), 시겔라소네이균(Shigella sonnei) 및 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium), 코네리박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 클로스트리듐 보툴리누스(Clostridium botulinum), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 화농연쇄상구균(Streptococcus pyogenes) 및 콜레라균(Vibrio cholera)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항균 조성물은 식품, 식품 첨가제, 사료 또는 사료첨가제 형태일 수 있다.
일 예로서, 캡시드에 자가-펩티드를 포함하는 박테리오파지를 활용하여 세균에 의한 감염증 예방용 건강기능성 식품을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 건강기능성 식품으로는 특별히 제한되는 것은 아니나 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
상기 유효성분은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.001 내지 15중량%, 구체적으로 0.01 내지 1중량%로 포함될 수 있으며, 음료 조성물의 경우 100 ㎖를 기준으로 0.001 내지 1 g, 구체적으로 0.01 내지 0.1 g의 비율로 포함될 수 있으나 이는 일 예일 뿐 상기 수치범위에 제한받지 않는다.
본 발명에 따른 건강기능성 식품은 필수 성분으로서 상기 자가-펩티드를 포함하는 박테리오파지를 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다. 상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A, 글리시르히진, 사카린, 아스파르탐 등을 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명에 따른 건강기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그 밖에 본 발명에 따른 건강기능성 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 건강기능성 식품의 제조방법은 특별히 제한되는 것은 아니며, 일반적으로 널리 알려진 식품의 제조방법을 도입하여 활용하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 변형하여 사용할 수도 있다.
본 발명에 따른 항균 조성물이 사료 첨가제로 사용되는 경우 고체 또는 액체 제조물 또는 이의 대안물의 형태로 사용될 수 있다. 고체 제조물의 예는 습윤 가능, 분무 건조, 또는 동결 건조될 수 있는 분말, 페이스트, 볼루스, 캡슐, 펠렛, 정제, 분진, 및 과립을 포함한다. 액체 제조물의 예는 수성, 유기 또는 수성-유기 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일 실시예로서, 사료 첨가제는 사료와 혼합되거나 음용수에 투여되어 사용될 수 있다.
이하 실시예를 통해 본 발명에 대하여 더욱 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 하나의 참조일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 여러 형태로 구현될 수 있다.
실험예 1. 면역 회피 효능이 증대된 T7 박테리오파지 클로닝
자기-펩티드의 면역 회피 효능을 증가시키고자, 면역 회피성 자가 펩티드(GNYTCEVTELTREGETIIELK)의 C-말단에 효능 강화 서열 (8개의 아미노산 (SLRPHSSN 서열))을 추가해 길이가 증가한 펩티드를 박테리오파지 캡시드에 도입하였다.
T7 박테리오파지의 캡시드 단백질 10B에 면역 회피성 펩티드를 발현시키기 위하여 Novagen사의 T7Select415-1b 클로닝 벡터를 사용하였다. 자가-펩티드 서열 GNYTCEVTELTREGETIIELK를 T7 파지 캡시드에 발현시키기 위해서 하기 표 1에 기재된 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 두 개의 단일 가닥 DNA 서열을 디자인하여 실시예 1로 사용하였다. 이하, 실시예 1에 따른 자가-펩티드가 발현된 T7 박테리오파지를 self-C0 T7 이라 한다.
[표 1]
Figure PCTKR2023003591-appb-img-000001
자가-펩티드의 C-말단에 효능 강화 서열 SLRPHSSN이 추가된 서열을 T7 파지 캡시드에 발현시키기 위해서 하기 표 2에 기재된 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 두 개의 단일 가닥 DNA 서열을 디자인하여 실시예 2로 사용하였다. 이하, 실시예 2에 따른 효능 강화 서열이 포함된 자가-펩티드가 발현된 T7 박테리오파지를 self-C8 T7 이라 한다.
[표 2]
Figure PCTKR2023003591-appb-img-000002
상기의 단일 가닥 DNA 한 쌍을 94 ℃까지 온도를 높인 다음 온도를 천천히 16 ℃까지 내려 상보결합을 유도하여 삽입 DNA를 제조하였다. T7Select415-1b 벡터 DNA를 제한효소 EcoRI과 HindIII로 절단하고, 0.5% 아가로즈젤 전기 영동을 실시한 후 정제하였다. 벡터 DNA와 삽입 DNA를 T4 DNA 리가아제를 사용하여 접합하여 T7 파지 10B 캡시드 단백질의 C-말단에 자가-펩티드가 발현되도록 하였다.
도 1에 도시된 바와 같이, DNA 시퀀싱을 통해서 캡시드의 염기서열을 분석하여, 자가-펩티드 및 효능 강화 서열이 추가된 자가-펩티드가 T7 박테리오파지의 메이저 캡시드인 10B 캡시드에 415개 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 면역 회피성 자가-펩티드가 도입된 T7 파지의 식작용(Phagocytosis) 회피 효과 평가(in vitro)
서열번호 1로 표시되는 면역 회피성 자가-펩티드 또는 서열번호 3으로 표시되는 면역 회피성 자가-펩티드가 도입된 T7 파지를 대식세포와 공배양하여 대식세포의 식작용으로 세포 내부로 유입되는 파지를 평가하였다.
6-웰플레이트에 J774a.1 세포 5×105 개를 CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 형광(Cy5.5) 표지된 야생형(WT) 및 면역 회피성 자가-펩티드가 도입된 T7 박테리오파지(Self-C0, Self-C8)를 J774a.1와 1시간 동안 공배양 하였다. 형광 현미경 및 유세포 분석을 통해 대식세포에 의해 잡아 먹힌 T7 박테리오파지를 정량적으로 비교하였고, 그 결과는 도 4와 도 5에 도시되었다.
in vitro에서 대식세포에 의한 식작용 회피 효과를 분석한 결과, 야생형과 비교해서 자가-펩티드가 도입된 T7 박테리오파지에 대한 식작용이 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 효능 강화 서열이 도입된 Self-C8 박테리오파지에 대한 식세포 작용은 WT 및 Self-C0에 비교해서 현저하게 감소하였다. 이러한 결과를 통해 효능 강화 서열의 도입으로 대식세포의 식작용을 보다 효과적으로 억제된다는 점을 확인할 수 있었다.
실험예 3. 면역 회피성 자가-펩티드가 도입된 T7 파지의 혈액순환 시간(blood circulation time) 비교 실험(in vivo)
자가-펩티드 도입된 박테리오파지와 비교하여, 효능 강화 서열이 추가된 박테리오파지가 체내 혈액 내에서 더 오랫동안 생존하는지를 마우스 동물모델을 이용해서 평가하였다. 야생형 파지 (WT), 자가-펩티드가 도입된 박테리오파지 및 효능 강화 서열이 추가되어 발현된 T7 박테리오파지 1×109 pfu를 6 주령 Balb/c 수컷 마우스 정맥에 주사하고, 15분, 30분, 60분 후에 각각의 마우스로부터 혈액을 채취하여 10% 헤파린이 포함된 튜브에 수집하였다. 수집한 혈액 내에 생존하고 있는 T7 박테리오파지의 수를 플라크 형성 어세이(plaque assay)로 평가하였다.
평가 결과는 도 6에 도시되었다. 도 6에 도시된 바와 같이, 면역 회피성 자가-펩티드가 도입된 두 종(Self-C0-T7과 Self-C8-T7)의 T7 박테리오파지는 야생형과 비교하여 혈액 내에서 더 월등하게 오랜 시간 생존하였다. 박테리오파지를 혈액 내로 주사 후 15분부터 T7 박테리오파지의 생존율에서 현저한 차이를 나타내며 시간이 지나도 지속되는 것을 관찰할 수 있었다.
또한 효능 강화 서열이 추가된 자가-펩티드 발현 박테리오파지(Self-C8-T7)는 효능 강화 서열이 없는 박테리오파지(Self-C0-T7)와 비교하여 더 오랜 기간 동안 혈액 내에서 생존하였음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 면역 회피성 자가-펩티드가 도입된 T7 박테리오파지는 혈액에서 더 오랜 시간 동안 순환될 수 있고, 나아가, 효능 강화 서열이 추가된 자가-펩티드의 면역 회피 효능은 훨씬 더 우수함을 예상할 수 있다. 따라서 효능 강화 서열이 추가된 박테리오파지는 기존 자가-펩티드만 도입된 박테리오파지 보다도 더 오랜 기간 혈액에서 순환하여 감염균을 더 많이 사멸할 수 있고, 이는 감염증 치료 효과가 더 효과적으로 이루어질 수 있음을 의미할 수 있다.
실험예 4. 형광이 표지된 박테리오파지를 이용한 생체 내 분포(biodistribution) 측정
자가-펩티드 도입된 박테리오파지 보다 효능 강화 서열이 추가된 박테리오파지가 체내 더 오랫동안 순환하는지를 마우스 동물모델을 이용해서 평가하였다. 6 주령 Balb/c 수컷 마우스를 준비하여, Cy5.5가 표지된 야생형, 자가-펩티드 도입된 박테리오파지 및 효능 강화 서열까지 추가 발현된 T7 박테리오파지를 정맥 주사하였다. 주사 후, 15분, 30분, 60분, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간 후 각각의 마우스마다 IVIS Lumina Xenogen imaging system으로 전신을 촬영하여 형광을 측정하였고, 그 결과는 도 7에 도시되었다. 도 7에 도시된 바와 같이, 야생형(WT)과 비교하여 실시예 1과 2에 따라 자가-펩티드가 도입된 박테리오파지(Self-C0, Self-C8)가 체내에 더 오랜 기간 머무는 것을 확인하였다. 더욱이 효능 강화 서열이 추가된 자가-펩티드 박테리오파지(Self-C8)는 효능 강화 서열이 없는 자가-펩티드 박테리오파지(Self-C0) 보다 더 오랜 기간 체내에 머무는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 5. 마우스 감염모델에서 파지를 이용한 치료 효과 평가
balb/c 수컷 마우스에 E. coli BL21을 복강 주사로 마우스에 감염시켰다. 감염 후, 야생형과 실시예 1에 따른 자가-펩티드 및 실시예 2에 따른 효능 강화 서열이 도입된 T7 박테리오파지를 정맥 주사로 투여하였다. 대장균(E. coli)를 감염시키지 않은 건강한 마우스 (No E.coli (healthy control)) 그룹 및 대장균 감염 후, 박테리오파지를 주사하지 않고 PBS 버퍼만을 주사한 그룹(PBS (buffer control))도 진행하여 비교평가 하였다. 대조군 및 실험군은 각 마우스 3마리로 구성하였다. 이후 마우스의 신체 증상을 점수화하여 치료 효능을 평가하였다. 신체 증상 점수화는 [정상: 0], [활동감소 1], [혼수상태, 주름진 모피 및 꼽추: 2], [혼수상태, 주름진 모피 및 꼽추, 눈 주위 삼출물(exudates)로 감긴 눈: 3], [빈사상태: 4], [죽음: 5]으로 평가하였다.
도 8에 도시된 바와 같이, PBS를 처리한 마우스는 8시간만에 증상이 급격히 악화되어 48시간까지 악화된 증상이 유지되었다. 야생형 박테리오파지를 처리한 경우 PBS에 비교하여 증상이 빠르게 호전되는 것을 확인하였다. 자가 펩티드가 도입된 박테리오파지(Self-C0, Self-C8)를 투여한 마우스는 야생형(WT) 및 PBS에 비교해서 증상이 덜 악화하였으며, 빠른 속도로 완전히 회복하였다. 더욱이, 실시예 2에 따른 효능 강화 서열이 도입된 자가 펩티드 박테리오파지(Self-C8)는 자가-펩티드만 도입된 박테리오파지(Self-C0) 보다 더 빠르게 정상으로 회복하였다.
서열목록 1 내지 서열목록 4의 서열 정보는 별도의 파일 형태로 제출함.

Claims (11)

  1. 캡시드(capsid)에 서열번호 1(GNYTCEVTELTREGETIIELK)로 표시되는 자가-펩티드(self-peptide)를 포함하는 박테리오파지.
  2. 제 1항에 있어서,
    서열번호 3(SLRPHSSN)으로 표시되는 효능 강화 서열을 더 포함하는 박테리오파지.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 박테리오파지는 용균성(lytic)인 박테리오파지.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 박테리오파지는 T7, T3 β-phage, Phage C1, H-19B, ΦFC3208, ΦN315, Φ13, ΦMu50A, ΦETA, PVL, PV83, T12, CS112, 315.2, 및 M30로 이루어진 군에서 선택되는 박테리오파지.
  5. 제 1항 또는 제 2항의 박테리오파지를 포함하는, 세균에 의해 유발되는 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 세균은 대장균(E. coli), 시겔라소네이균(Shigella sonnei) 및 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium), 코네리박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 클로스트리듐 보툴리누스(Clostridium botulinum), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 화농연쇄상구균(Streptococcus pyogenes) 및 콜레라균(Vibrio cholera)으로 이루어진 군에서 선택되는, 약학적 조성물.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 감염증은 장염, 세균성 이질, 디프테리아(diphtheria), 급성발열, 성홍열, 콜레라 및 식중독으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 감염증인 약학적 조성물.
  8. 제 5항에 따른 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 개체 내 항균 방법.
  9. 제 1항 또는 제 2항의 박테리오파지를 포함하는 항균(anti-bacterial) 조성물.
  10. 제 9항에 따른 항균 조성물을 포함하는, 항균용 식품 첨가제.
  11. 제 9항에 따른 항균 조성물을 포함하는, 항균용 사료 첨가제.
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