KR101830892B1 - 살모넬라, 병원성 대장균 o157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 bsp10 및 이를 함유하는 조성물 - Google Patents
살모넬라, 병원성 대장균 o157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 bsp10 및 이를 함유하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 마이오비리대(Myoviridae)에 속하는 박테리오파지 BSP10 (KACC97026P), 이를 포함하는 세균 사멸용 조성물 및 세균사멸용 미생물 제제에 관한 것으로서, 본 발명의 파지는 다수의 살모넬라균에 감염능력이 있으며, 병원성이 높은 대장균인 O157 균 및 이질균에 대한 감염능력을 동시에 보인다.
본 발명은 생물학적 조절제 역할을 수행할 수 있는데, 식품산업과 농축산업에 병원성 미생물 오염으로 인한 경제적 손실을 절감할 수 있으며, 기존 항생제에 대한 내성 여부와 상관없이 살모넬라균, 병원성 대장균 O157 및 이질균을 동시에 사멸시킬 수 있다.
본 발명의 파지는 살모넬라균, 병원성 대장균 O157 및 이질균의 감염에 대한 질환 치료용으로 사용할 수 있는데, 특히 항생제 내성을 갖는 살모넬라균, 독성이 강한 대장균 O157 및 이질균에 사용시 기존 항생제로 제거할 수 없었던 항생제 내성균을 사멸시킬 수 있으며, 항생제와는 달리 병원성이 없는 유용한 대장균에는 영향을 미치지 않는다는 독특한 특성을 가져 기존 항생제의 대체물로 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명은 생물학적 조절제 역할을 수행할 수 있는데, 식품산업과 농축산업에 병원성 미생물 오염으로 인한 경제적 손실을 절감할 수 있으며, 기존 항생제에 대한 내성 여부와 상관없이 살모넬라균, 병원성 대장균 O157 및 이질균을 동시에 사멸시킬 수 있다.
본 발명의 파지는 살모넬라균, 병원성 대장균 O157 및 이질균의 감염에 대한 질환 치료용으로 사용할 수 있는데, 특히 항생제 내성을 갖는 살모넬라균, 독성이 강한 대장균 O157 및 이질균에 사용시 기존 항생제로 제거할 수 없었던 항생제 내성균을 사멸시킬 수 있으며, 항생제와는 달리 병원성이 없는 유용한 대장균에는 영향을 미치지 않는다는 독특한 특성을 가져 기존 항생제의 대체물로 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 박테리오파지 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 살모넬라, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 대해 동시에 감수성(사멸능)을 나타내고, 비병원성 대장균에는 감수성(사멸능)을 나타내지 않는 박테리오파지 BSP10 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
식물바이러스와 동물바이러스 발견 후, 1915년 트워트가 포도상구균의 용균현상을 관찰하였고, 1917년 파스퇴르 연구소의 헤렐르가 적리균에서도 같은 현상을 관찰하게 되면서, 이것이 세균에 감연하는 바이러스(세균바이러스)에 의한 것임을 알아내었다. 이후, 세균에 감염하는 바이러스는 “세균(Bacteria)”을 “먹는다(Phage)”의 의미에서 박테리오파지(bacteriophage)로 명명하였으며, 간단히 “파지”로 불리고 있다.
파지는 크게 용균파지와 용원성파지로 분류하며, 용균 사이클만 반복하는 것을 용균(virulent) 파지, 용원 사이클만 반복하는 것을 약독성(temperate) 파지로 정의한다.
약독성 파지는 숙주세균의 유전자에 파지의 유전자 정보를 넣어, 파지의 모양은 사라지지만 숙주세균이 파괴되지도 않으며, 이런 상태는 숙주세균이 좋은 환경조건에 있는 한 지속되는데, 숙주세균의 환경이 악화되면 숙주세균의 유전자에 있던 일부의 파지 유전자는 용균 사이클로 바뀌어 새로운 파지를 만들며, 결국 숙주세균을 용균시켜 숙주세포 밖으로 방출된다.
용균 사이클에 있는 파지의 경우, 세균 감염 약 30분 후에 100~200개의 새로운 파지를 만들어 세균의 막을 파괴하며 밖으로 나와 세포를 용균시키는데, 세균의 증식속도보다 파지의 증식속도가 훨씬 높으므로, 세균의 증식을 제어하기 위한 중요한 방법이 될 수 있다.
이러한 파지는 발견된 1910년부터 1930년대에 걸쳐서 파지의 숙주특이성 문제 및 파지의 치료목적으로의 제조에 있어 숙주세균의 내독소, 외독소 문제 등 그 당시 과학적으로 풀지 못하는 문제가 있어 이용에 제한이 있었다. 이즈음인 1929년 플래밍이 발견한 페니실린 및 1943년 워크스만이 발견한 스트렙토마이신은 파지와 대조적으로 항균범위가 넓어 하나의 약으로 복수의 감염증에 효과를 나타냈으며, 처음에는 내성균 문제도 없었기 때문에 화학요법제로 널리 사용되게 되었다.
이와 같은 항생제의 발견에 의해, 효과가 불확실한 파지요법은 점점 사라지게 되었는데, 파지의 숙주에 대한 감수성으로 인해 임상에 적용시 감염성이 다른 다양한 파지주가 필요한 점, 동물의 생체 내에서는 파지의 용균작용이 일어나기 어려운 점, 파지내성균이 동일 세균집단에 존재하는 점 등의 이유로 1950년대에 WHO에 의해 파지요법이 무효 선언되었고, 동구권과 구소련연방에서만이 명맥이 근근이 유지되어 왔다.
한편, 1980년대에 들어와 파지요법에 대한 생각이 바뀌게 되는데, 1982년 영국의 연구자그룹인 스미스와 휴긴스는 뇌막염 치료 모델실험으로 마우스를 이용하여 다음과 같이 실험하였다 (Smith HW, Huggins MB, J. Gen. Microbiol, 1982, Feb;128(2); 307-18). 즉, 마우스의 피하 근육 내에 균을 주사하고 반대쪽의 피하에는 균의 특이적인 용균파지를 주사한 결과, 파지를 주사하지 않은 대조군은 100% 폐사한 것에 비해 파지를 주사한 실험군의 경우 100% 생존하였으며, 항생제 (스트렙토마이신 등)의 효과보다도 우월한 결과를 확인한 것이다.
특히, 더 놀라운 것은 파지를 직접 뇌 내에 주사한 경우와 근육주사한 경우 모두에서 파지가 뇌에서 회수가 됨으로써, 근육 주사한 파지가 혈류를 통해 뇌 조직으로 이동하여 혈액뇌관문 (blood-brain barrier)을 통과한다는 사실을 확인할 수 있었던 것이다.
그 후, 송아지의 대장균성 설사증, 어류의 다양한 질병, 반코마이신 내성 장구균 패혈증, 결핵균, 닭의 파라티푸스 및 대장균 O157:H7 등 다양한 질병에 대한 성공적인 예방 및 치료사례가 보고되었으며, 파지를 직접 사용하는 방법뿐 아니라, 파지가 숙주세균의 세포벽을 특이적으로 파괴하는데 작용하는 리신 (lysin)을 이용하여, 탄저, 폐렴구균 등에 대한 특이적인 항생제 개발도 이루어지고 있는 실정이다.
또한, 최근 들어 항생제의 남용과 불필요한 처방으로 인해 기존 항생제에 내성을 나타내는 '슈퍼박테리아'가 발생하고 있고, 항생제 개발이 내성균의 출현 속도를 따라잡지 못하고 있는 현 시점에서 항생제 내성균의 심각성이 큰 문제로 대두되고 있는데, 파지는 이에 대한 효과적인 대안이 될 수 있다.
본 발명에서는 살모넬라, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내어 호스트 사멸 스펙트럼이 넓고, 비병원성 대장균 MG1655에 대해서는 감수성을 나타내지 않아, 장내 미생물 균총을 훼손시키지 않는 박테리오파지를 새롭게 발견하고, 이를 제공하고자 한다.
본 발명은 살모넬라, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내는 반면, 비병원성 대장균 MG1655에 대해서는 숙주감수성을 나타내지 않는 박테리오파지 BSP10 (KACC97026P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 살모넬라, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내는 반면, 비병원성 대장균 MG1655에 대해서는 숙주감수성을 나타내지 않는 박테리오파지 BSP10 (KACC97026P)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세균사멸용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 조성물은 액상, 고체상 및 분말상 중 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 살모넬라, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내는 반면, 비병원성 대장균 MG1655에 대해서는 숙주감수성을 나타내지 않는 박테리오파지 BSP10 (KACC97026P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 살모넬라, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내는 반면, 비병원성 대장균 MG1655에 대해서는 숙주감수성을 나타내지 않는 박테리오파지 BSP10 (KACC97026P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 살모넬라, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내는 반면, 비병원성 대장균 MG1655에 대해서는 숙주감수성을 나타내지 않는 박테리오파지 BSP10 (KACC97026P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 살모넬라, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내는 반면, 비병원성 대장균 MG1655에 대해서는 숙주감수성을 나타내지 않는 박테리오파지 BSP10 (KACC97026P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 사료를 제공한다.
또한, 본 발명은 살모넬라, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내는 반면, 비병원성 대장균 MG1655에 대해서는 숙주감수성을 나타내지 않는 박테리오파지 BSP10 (KACC97026P)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세균사멸용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 조성물은 액상, 고체상 및 분말상 중 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 살모넬라, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내는 반면, 비병원성 대장균 MG1655에 대해서는 숙주감수성을 나타내지 않는 박테리오파지 BSP10 (KACC97026P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 살모넬라, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내는 반면, 비병원성 대장균 MG1655에 대해서는 숙주감수성을 나타내지 않는 박테리오파지 BSP10 (KACC97026P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 살모넬라, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내는 반면, 비병원성 대장균 MG1655에 대해서는 숙주감수성을 나타내지 않는 박테리오파지 BSP10 (KACC97026P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 살모넬라, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내는 반면, 비병원성 대장균 MG1655에 대해서는 숙주감수성을 나타내지 않는 박테리오파지 BSP10 (KACC97026P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 사료를 제공한다.
본 발명의 박테리오파지 BSP10은 기존에 살모넬라 및 병원성 대장균만을 제어하는 박테리오파지와 달리, 살모넬라, 병원성 대장균 O157 및 이질균까지 제어할 수 있는 특징을 가지기 때문에, 더욱 넓은 범위의 숙주를 효과적으로 억제할 수 있는 생물학적 조절제로써 활용될 수 있다.
아울러, 본 발명의 박테리오파지 BSP10은 기존에 보고된 넓은 숙주 범위를 갖는 박테리오파지의 일반적 특징과 달리, 병원성이 없는 대장균 균주는 감염시키지 않는 특징을 갖는다. 대장균 균주를 넓게 감염시키는 박테리오파지는 인체에 들어가 몸에 이로운 대장균까지 감염시켜 사멸시키게 되어 전체적인 장내 미생물 균총의 손상을 유발하는데, 본 발명의 박테리오파지는 대장균 중에서 생명에 치명적인 영향을 주는 O157 균주만을 특정하게 사멸시키는 특징이 있다.
본 발명의 박테리오파지 BSP10은 기존 항생제에 대한 내성 여부와 상관없이 살모넬라균, 병원성 대장균 O157 및 이질균의 세 가지 병원균을 특이적으로 동시에 사멸시킬 수 있으므로, 이들 병원균의 감염에 대한 치료용 또는 예방용으로 사용할 수 있다.
정리하자면, 본 발명은 항생제 내성을 갖는 살모넬라균, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 사용 시 기존 항생제로 제거할 수 없었던 항생제 내성균을 사멸시킬 수 있으며, 기존에 보고된 박테리오파지 조성물 및 항생제와는 달리, 병원성이 없는 대장균에는 영향을 미치지 않으므로, 기존의 박테리오파지 조성물 및 항생제의 대체물로 유용하게 활용될 수 있다.
이러한 활용은 향후 축산업 및 어업에서, 축산물 및 수산물의 항생제 잔류 문제를 해결할 수 있어 항생제 사용 절감을 유도할 수 있으며, 새로운 항생제 내성균의 출현 가능성을 낮출 수 있다.
또한, 본 발명은 병원성이 없는 대장균에는 감염하지 않는 본 발명의 특성으로 인해, 실제 사용 시 환경 안전성을 높이는데 기여할 수 있고, 적은 양으로도 충분한 병원균 사멸 효과를 나타내기 때문에, 생산비용을 절감할 수 있는 장점도 있다.
도 1은 에너지 여과 투과 전자현미경(Energy-Filtering Transmission Electron Microscope)을 통해 본 발명 박테리오파지 BSP10을 관찰한 사진이다.
도 2는 본 발명 박테리오파지 BSP10의 용균활성능을 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명 박테리오파지 BSP10의 용균활성능을 측정한 결과이다.
본 발명은 마이오비리대(Myoviridae)에 속하는 박테리오파지 및 이를 포함하는 세균 사멸용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 살모넬라균, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 동시 감염능력이 있어 이들을 사멸시킬 수 있는 마이오비리대에 속하는 신규의 박테리오파지이다.
본 발명의 파지는 공원 분수대 물로부터 분리한 것인데, 살모넬라균, 병원성 대장균 O157 및 이질균의 감염으로 인한 질병 치료와 항생제 내성 세균을 제어할 수 있는 생물학적 조절제로 사용할 수 있다. 또한, 항생제 사용 절감을 유도할 수 있고, 식품 산업에서도 병원성 미생물로 인한 경제적 손실을 절감할 수 있는 방안이 될 수 있다.
본 발명의 박테리오파지 BSP10은 하기와 같은 방법으로 분리 및 동정되었다. 먼저, 박테리아는 걸러내지만 박테리오파지는 통과시킬 수 있는 구멍 크기를 가진 필터로 공원 분수물을 여과한 후, 액체 배지와 혼합하여 혼합액체배지를 제조하였다.
이 혼합액체배지에 살모넬라균를 접종하여 37℃에서 배양하고, 배양액을 원심분리한 후 상등액을 수득하였다. 수득한 상등액을 다시 위와 동일한 필터로 여과하여 여과액을 취하였다. 이 여과액을 살모넬라균 배양액과 혼합한 다음, 아가 농도가 낮은 액체 아가 배지와 함께 섞고, 고형 아가 배지 플레이트에 부었다.
이 플레이트를 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 후, 플레이트 상에 나타난 투명한 플라그(plaque)를 개별로 분리하였다. 이후, 이것을 살모넬라균 배양액에 넣어 배양하고, 배양액이 맑아지는 것을 확인하였다.
맑아진 배양액을 원심분리하고 상등액만을 상기에서 사용한 필터로 여과시켜, 박테리아는 제거되고 박테리오파지만을 포함하는 여과액을 취하였다. 이렇게 얻은 여과액을 상기 '아가 배지를 이용한 플라그의 재분리'를 3회 이상 반복수행하여 각각의 순수한 박테리오파지를 분리하였다.
이후, 상기에서 분리한 박테리오파지 중 여러 숙주균주에 감염능을 나타내는 파지를 선별하고, 전자현미경을 통한 형태관찰 및 볼티모어 분류법에 의해 분류, 동정하였다.
그 결과, 본 발명의 살모넬라균, 병원성 대장균 O157 및 이질균을 동시에 감염하는 박테리오파지 BSP10을 선별하였는데, 형태 관찰 결과, 파지가 수축성이 있는 긴 꼬리(a long contractile tail)를 갖는 복합형의 마이오비리대(Myoviridae)에 속하는 것으로 동정되었고, 이중 나선 DNA (double-stranded DNA)를 갖는 것으로 확인되어 볼티모어 분류법에 의해 제1형 바이러스로 분류되었다.
본 발명의 마이오비리대에 속하는 박테리오파지 BSP10은 사람 및 가축 등에 식중독, 장티푸스, 살모넬라증 등 질병을 일으키는 대표적인 박테리아인 살모넬라(Salmonella)와 대장균 (Escherichia coli) 균 중 HUS(hemolytic uremic syndrom)같은 치명적인 병을 일으키는 O157 균주뿐 아니라, 매우 적은 양으로도 1~5세의 영유아에서 높은 감염률을 나타내는 이질균에 대해 동시적인 숙주 감수성을 가져 이들을 사멸시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 박테리오파지 BSP10은 동물에게 감염되는 사람을 숙주로 하는 살모넬라 타이피(Salmonella typhi), 파라타이피(Salmonella paratyphi) 외에 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium)에도 감수성을 보이므로, 사람외 동물에게도 적용 가능하다.
더 나아가, 본 발명의 박테리오파지 BSP10은 일반 대장균 균주 (예 MG1655)은 감염시키지 않지만, 사람에게 특히 치명적인 병원성 대장균 O157균주만을 감염시키는데 중요한 특징을 갖는다. 기존에 발견된 것으로, 대장균 균주를 넓게 감염시키는 박테리오파지는 몸에 들어가 이로운 대장균까지 감염시켜서 사멸시키는 데에 반해, 본 발명의 박테리오파지는 대장균 중에서 생명에 치명적인 영향을 주는 O157균주만을 특정하게 사멸시킬 수 있다.
본 발명의 박테리오파지는 살모넬라균, 병원성 대장균 O157 및 이질균으로 감염된 부분에 직접 투여하거나, 적절한 형태의 미생물 조성물로 제조되어 투여됨으로써 살모넬라균, 병원성 대장균 O157 및 이질균의 사멸을 위한 용도로 사용할 수 있다.
본 발명은 박테리오파지 BSP10을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세균 사멸용 미생물 제제를 제공하는데, 본 발명에 의한 세균 사멸용 제제는 통상적인 미생물 제제 제조방법으로 제제화할 수 있다. 제형이 특별한 것으로 한정되지는 않으나, 인체에 투여하는 경우는 약제학적으로 허용하는 범위 내에서, 가축 또는 어류에 투여하는 경우는 수의학에서 허용하는 범위 내에서 제제화하고, 그에 따라 투여경로를 정할 수 있다.
본 발명의 세균 사멸용 미생물 제제는 유효성분인 본 발명의 박테리오파지 BSP10 외에 필요에 따라 담체, 기타 보조제 등을 포함할 수 있는데, 상기 담체는 생리식염수, 증류수, 사료, 박테리아용 배지(예, Luria broth 등) 등이 될 수 있으며, 보조제는 pH 교정 등의 목적으로 완충액 등을 첨가하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 세균 사멸용 미생물 제제는 액상, 반 고체상 또는 고체상으로, 제제 형태는 분말제, 과립제, 정제 등의 고체상 제제, 현탁제 또는 주사액제 등의 액상 제제 및 크림, 로션, 젤, 페이스트 등의 반 고체상 제제 등으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 세균 사멸용 미생물 제제는 경구, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 경피, 비측 내, 흡입 또는 직장 등의 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명의 세균 사멸용 미생물 제제의 투여량은 투여대상에서 살모넬라균, 병원성 대장균 O157 및 이질균을 사멸시키는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 제형의 종류 및 투여대상의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 경로, 투여 시간 및 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
상기와 같이 본 발명의 박테리오파지는 살모넬라균, 병원성 대장균 O157 및 이질균을 대하여 감염능을 나타냄으로써 기존 박테리오파지의 숙주 특이성으로 인한 단점인 제한적인 사용범위를 넓혀, 좀 더 넓은 범위의 숙주를 효과적으로 억제할 수 있는 생물학적 조절제로서 활용될 수 있다.
한편, 본 발명의 박테리오파지 또는 이를 포함한 세균 사멸용 조성물은 기존 항생제에 대한 내성 여부와 상관없이 살모넬라균, 병원성 대장균 O157 및 이질균을 사멸시킬 수 있으므로, 살모넬라균, 병원성 대장균 O157 및 이질균의 감염에 의한 질환 치료용으로 사용할 수 있고, 특히 항생제 내성을 갖는 살모넬라균, 병원성 대장균 및 이질균에 사용 시 기존 항생제로 제거할 수 없었던 항생제 내성균을 사멸시킬 수 있으므로, 기존 항생제 대체물로 유용하게 활용될 수 있다.
또한, 항생제 내성을 가진 살모넬라균, 병원성 대장균 O157 및 이질균으로 인한 의료 문제의 해결에 이용될 수 있고, 새로운 개념의 항생제 내성균 제어 방법 개발을 통해 의료안전을 향상시킬 수 있다.
또한, 축산업 및 어업에서 축산물 및 수산물의 항생제 잔류 문제 등을 해결할 수 있는 대안으로서 제공될 수 있다. 특히, 축산 분야에서 문제가 되는 각종 세균성 질병을 제어할 수 있는 파지 제제를 개발하여 항생제를 대체하게 되면, 항생제 내성균 문제의 해결과 더불어 국내 소비자에게 우리 축산물의 안전성에 대한 신뢰를 보장할 수 있을 뿐만 아니라, 우리 축산물의 수출을 증대시킴으로써 국내 축산물의 부가가치를 향상시키고, 국내 축산업 전반을 활성화시킬 수 있을 것이다. 또한, 새로운 축산 식품 안전 소재의 개발도 가능할 것이다. 더 나아가서는 항생제 사용 절감 유도할 수 있으며, 이에 따라 새로운 항생제 내성균의 출현 가능성을 낮출 수 있고, 환경 안전성을 높이는데 기여할 수 있다.
또한, 식품업계에서도 식품의 가공, 보관 과정에 박테리오파지를 처리함으로써 식품의 병원성 세균으로 인한 오염을 막고, 부패를 일으키는 세균을 사멸시켜, 식품의 부패로 인한 악취를 없애고, 유통기한을 늘릴 수 있는 등의 경제적으로도 많은 이익을 가져올 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[
실시예
1: 본 발명의 박테리오파지
BSP10의
분리 및 동정]
(1) 본 발명 박테리오파지의 분리
살모넬라 및 대장균에 대한 감수성이 있는 박테리오파지를 분리하기 위해, 서울시 어린이 대공원 분수물을 취하고 이로부터 박테리오파지 분리실험을 수행하였다.
상기 분수대 물을 여과하되, 박테리아는 걸러내지만 박테리오파지는 통과시킬 수 있는 구멍 크기인 0.22 μm 막필터를 사용하여 상기 분수대 물을 여과시켰다. 생성된 여과액에 2배 농축된 액체 배지(LB broth; NaCl 1%, Yeast Extract 0.5%, Tryptone 1%, Micro Agar 1.5%)를 첨가하였고, 박테리아{살모넬라 타이피뮤리움 (S. typhimurium)} 배양액과 혼합하였다.
상기 박테리아와의 혼합액을 12시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 다음 15,000rpm의 속도로 원심 분리하고, 상등액을 다시 0.22 μm 막필터로 여과시켰다. 수득한 여과액 0.1 mL과 12시간 이상 배양한 박테리아(살모넬라) 현탁액 (0.1 mL)을 혼합하였다. 이 혼합액을 아가 농도가 낮은 아가(0.4%) 배지와 함께 섞고, 1.5% 아가 배지를 포함하는 플레이트에 부었다. 상기 플레이트는 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다.
배양 결과, 목적하는 박테리오파지가 플레이트 상에 나타나, 독립되고 투명한 플라그(plaque)가 관찰되었다. 이 플라그 영역을 파이펫 팁을 이용하여 분리해낸 다음, 새로운 박테리아 배양액에 넣어 37℃에서 배양하였는데, 배양액이 맑아지는 것을 관찰할 수 있었다. 이후, 배양액을 원심분리하고, 상등액만을 취해 0.22 μm 막필터를 통해 여과시켰다. 이와 같은 과정을 통해 용해물에 남아있는 모든 박테리아를 제거하고, 여과액만을 취할 수 있었다. 상기 여과액은 박테리오파지만을 포함한다.
이렇게 얻은 박테리오파지 용액을 가지고, 아가 배지 상에서 다르게 희석한 후, 주입하여 플라그의 재분리를 3회 수행하였고, 이를 통해 순수한 박테리오파지 10종을 얻을 수 있었다.
(2) 박테리오파지
BSP10의
형태 관찰 및 분류
상기에서 획득한 10종의 박테리오파지들 중에서 살모넬라균, 병원성 대장균 및 이질균 모두를 동시에 감염시키는 파지 1종을 선별해 내었고, 그 중에서 박테리오파지 BSP10이라고 명명한 파지를 가지고 전자현미경 사진을 분석하였다. 전자현미경은 에너지 여과 투과 전자현미경(Energy-Filtering Transmission Electron Microscope)을 사용하였다.
관찰하고자 하는 박테리오파지 샘플을 탄소를 입힌 구리 그리드(grid)에 올리고, 2% 액상 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 음성 염색을 하였다. 염색된 시료를 80kV의 전압으로 에너지 여과 투과 전자현미경(LIBRA 120, Carl Zeiss)을 이용하여 관찰하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 관찰된 박테리오파지는 모양으로 분류하는 기준으로 보았을 때, 수축성이 있는 긴 꼬리(a long contractile tail)를 갖고, 시스(sheath)가 있으므로, 복합형의 마이오비리데 (Myoviridae)에 속하는 것으로 분류되었다. 도 1은 에너지 여과 투과 전자현미경(Energy-Filtering Transmission Electron Microscope)을 통해 본 발명의 파지를 관찰한 사진이다.
또한, 본 발명의 박테리오파지는 유전정보가 이중가닥 DNA로 되어 있고, 제한효소처리로 유전자가 잘려지기 때문에, 볼티모어 분류법(Baltimore classification)에 따라, 이중가닥 DNA 유전체를 가진 제1형 바이러스로 분류되었다.
본 발명자들은 위와 같은 방법으로 얻어진 마이오비리데 속 박테리오파지 BSP10을 미생물기탁기관인 농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원정보센터(KACC)에 2015년 8월 20일자로 기탁하여 수탁번호 KACC 97026P을 부여받았다.
[
실시예
2: 본 발명 박테리오파지
BSP10의
숙주별 감수성 (susceptibility) 확인]
숙주별 감수성은 연속 희석 적하법(serial dilution dropping method)을 사용하여 확인하였다(Adams, M.H. 1959. Bacteriophage, pp27-34. Interscience Publishers Inc., New York).
2시간 배양한 박테리아 배양액과 0.4%의 아가 배지를 섞은 후, 아가 플레이트 상에 부어서 37℃에서 15분간 건조하였다. 그 위에 희석배수별로 희석된 박테리오파지 BSP10을 떨어뜨리고 상온에서 말린 후 37℃에서 10시간 이상 정치 배양시켰다.
균주가 파지에 대해 감수성을 갖는 경우, 플레이트 상에 투명한 영역, 플라그(plaque)가 보이게 되며, 이는 박테리아 세포가 완전하게 용해되어 사멸된 결과이다. 만약, 감수성이 약한 경우는 뿌옇게 영역이 생기거나 독립적인 볼드 스팟이 나타난다.
다양한 종류의 살모넬라, 대장균, 병원성 대장균 및 이질균에 대해 본 발명 박테리오파지 BSP10을 적용하여 감수성 여부를 확인하여 보았다. 그 결과, 하기 표 1에서 볼 수 있듯이, 박테리오파지 BSP10은 병원성이 없는 대장균은 감염시키지 않는데 반해, 살모넬라, 독성이 강한 병원성 대장균 및 이질균을 폭넓게 용해시키는 것으로 나타나, 이들 세균에 대한 감수성(사멸능)을 확인할 수 있었다.
| 숙주 | BSP10 |
| Salmonella typhimurium SL1344 | + |
| Salmonella typhimurium UK1 | + |
| Salmonella typhimurium 14028s | + |
| Salmonella typhimurium LT2 | + |
| Salmonella typhimurium DT104 | + |
| Salmonella Paratyphi A IB 211 | I |
| Salmonella Paratyphi B IB 231 | + |
| Salmonella paratyphi C IB 216 | + |
| Salmonella dublin IB 2973 | + |
| Escherichia coli MG1655 | - |
| Escherichia coli O157:H7 ATCC 35150 | + |
| Escherichia coli O157:H7 ATCC 43888 | + |
| Escherichia coli O157:H7 ATCC 43890 | + |
| Escherichia coli O157:H7 ATCC 43894 | + |
| Escherichia coli O157:H7 ATCC 43895 | + |
| Escherichia coli O157:NM 3204-92 | + |
| Escherichia coli 0157:NM H-0482 | + |
| Shigella flexineri 5a M90T | + |
| Shigella flexineri BS176 | + |
주) + : phage infection (파지가 호스트에 DNA를 삽입 후 증식되어 나옴으로써 호스트를 사멸시키는 것), I : inhibition zone (파지가 증식되지는 않으나 외부에서 호스트를 일부 사멸시키는 것), - : no phage infection (파지 증식 및 호스트 사멸이 없는 것)
[
실시예
3: 본 발명 박테리오파지
BSP10의
용균
활성능
확인]
본 실시예에서는 살모넬라 균주에 대한 박테리오파지 BSP10의 용균활성능을 시험하고자 하였다.
박테리오파지 BSP10의 용균 활성 확인을 위해, 세 개의 실험군으로 나누어 실험을 실시하였다. 대조군(●)에서는 숙주균주인 살모넬라균(LT2(c))을 액체배지에서 배양하며 실험하였고, 실험군(▲, ■)에서는 숙주 균주인 살모넬라 (LT2(c))을 액체배지에서 2시간 배양 후 (흡광도=약 0.5), 각기 다른 양의 박테리오파지 BSP10을 각각 감염시켰다 (M.O.I=1 또는 0.1 / M.O.I=Multiplicity of infection).
감염 직후부터 일정 시간 간격으로 대조군과 실험군 모두의 흡광도를 측정하였으며, 세균의 생장 및 사멸 정도를 파악하였다. 실험 결과는 도 2와 같이 나타났는데, 많은 양 (M.O.I=1)을 첨가한 경우와 적은 양 (M.O.I=0.1)을 첨가한 경우에 있어, 세균 사멸능 측면에서 큰 차이가 나타나지 않았으며, 오히려 적은 양을 첨가한 경우에 세균 사멸능 측면에서 약간의 우수성을 나타내었다.
따라서, 본 발명의 박테리오파지는 적은 수로도 많은 양에 유사한 정도로 제어효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 도 2는 본 발명 박테리오파지 BSP10의 용균활성능을 측정한 결과이다.
[
실시예
4: 본 발명 박테리오파지
BSP10의
숙주 수용기 확인]
본 실시예에서는 본 발명 박테리오파지 BSP10의 숙주 수용기를 확인하고자 하였다. 실험을 위해, 기존 박테리오파지들의 수용기로 알려진 유전자가 일부 결여된 다양한 종류의 돌연변이 균주를 이용하여 BSP10에 대한 감수성을 확인해 보았다.
| phage |
LT2(c) |
ΔrfaC |
ΔompC |
ΔbtuB |
ΔrfbP |
ΔflgK |
ΔbtuB rfbP |
ΔflgK rfbP |
ΔbtuB rfbP flgK |
| BSP10 | + | - | + | + | - | + | - | - | - |
실험 결과, 상기 표 2에서 보듯이 O-항원을 전이(transfer)하는데 관여하는 유전자인 rfbP 유전자가 결여된 돌연변이 균주 모두에서 BSP10에 대한 감수성이 사라졌다. 이로 말미암아, 본 발명의 박테리오파지 BSP10이 숙주에 흡착하는 데에는 O-항원이 필요하다는 것을 확인할 수 있었다.
[
제제예
1: 박테리오파지
BSP10을
포함하는 세균사멸용 조성물(미생물 제제)의 제조]
1) 액상 제제 1
상기 실시예와 동일한 방법으로 본 발명 박테리오파지 BSP10을 제조하였는데, BSP10을 살모넬라균 배양액에 감염시켜 수득한 상등액을 여과하여 여과액을 준비하였다. 박테리오파지의 pfu (plaque forming unit; 파지가 플라그를 형성하는 것을 수치화한 단위, 박테리아의 경우 cfu (colony forming unit)와 유사한 개념이다)를 계산하고, LB 배지에 5.0x109 pfu/ml 의 양으로 준비하여 세균사멸용 액상 제제를 제조하였다.
2) 액상제제 2
상기 제제예 1-1)의 여과액을 생리식염수 100 ml당 박테리오파지 BSP10이 5.0x1011pfu 이 되도록 혼합하여 세균사멸용 액상 제제를 제조하였다.
3) 분말형 제제
사료 10 g 당 박테리오파지 BSP10이 5.0x109pfu이 되도록 제재예 1-1)의 여과액을 첨가, 혼합, 건조 및 분말화하여 세균사멸용 분말형 제제를 제조하였다.
[
제제예
2: 박테리오파지
BSP10을
함유하는 식품 첨가제의 제조]
표고버섯 분말 50중량%, 새우 분말 30중량%, 다시마 분말 15 중량%, 상기 제제예 1에서 제조한 분말형 제제 5중량%를 혼합하여 조미료로 사용될 수 있는 식품 첨가제 300 g을 제조하였다.
[
제제예
3: 박테리오파지
BSP10을
함유하는 식품의 제조]
1) 우유 제조
시판 중인 S 제조의 우유 200 mL에 상기 제제예 1에서 제조한 분말형 제제 1%(w/v) 첨가하여 본 발명에 따른 우유 조성물을 제조하였다.
2) 바나나 쥬스 제조
바나나를 믹서에 넣고 갈아 바나나 원액 180 mL를 준비한 후, 상기 제제예 1에서 제조한 분말형 제제 1%(w/v) 첨가하여 본 발명에 따른 바나나 쥬스 조성물을 제조하였다.
[
제제예
4: 박테리오파지
BSP10을
함유하는 사료 첨가제 제조]
α-토코페롤 5.0중량%, 오징어간유 0.75중량%, 효모 93.25중량%, 상기 제제예 1에서 제조한 분말형 제제 1.0중량%를 혼합하여 사료 첨가제를 1 kg을 제조하였다.
[
제제예
5: 박테리오파지
BSP10을
함유하는 사료의 제조]
1) 산란계용 사료조성물 제조
상기 제제예 1에서 제조한 분말형 제제 1.0%(w/w)를 시판 산란계용 사료(디럭스 산란(제품명), 부국사료, 한국)에 첨가하여 산란계용 사료조성물 1 kg을 제조하였다.
2) 넙치 양식용 사료조성물 제조
어분 58중량%, 대두박 4중량%, 콘글루텐분 3중량%, 소맥분 28.7중량%, 오징어간유 4중량%, 비타민 혼합제 1.2중량% 및 미네랄 혼합제 1중량%를 포함한 기본 사료에 상기 제제예 1에서 제조한 분말형 제제 1.0중량%를 첨가하여 넙치 양식용 사료조성물 1 kg을 제조하였다.
Claims (7)
- 살모넬라, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내는 반면, 비병원성 대장균 MG1655에 대해서는 숙주감수성을 나타내지 않는 박테리오파지 BSP10 (KACC97026P).
- 살모넬라, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내는 반면, 비병원성 대장균 MG1655에 대해서는 숙주감수성을 나타내지 않는 박테리오파지 BSP10 (KACC97026P)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세균사멸용 조성물.
- 제2항에 있어서,
상기 조성물은,
액상, 고체상 및 분말상 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세균사멸용 조성물.
- 살모넬라, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내는 반면, 비병원성 대장균 MG1655에 대해서는 숙주감수성을 나타내지 않는 박테리오파지 BSP10 (KACC97026P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 첨가제.
- 살모넬라, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내는 반면, 비병원성 대장균 MG1655에 대해서는 숙주감수성을 나타내지 않는 박테리오파지 BSP10 (KACC97026P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품.
- 살모넬라, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내는 반면, 비병원성 대장균 MG1655에 대해서는 숙주감수성을 나타내지 않는 박테리오파지 BSP10 (KACC97026P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 첨가제.
- 살모넬라, 병원성 대장균 O157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내는 반면, 비병원성 대장균 MG1655에 대해서는 숙주감수성을 나타내지 않는 박테리오파지 BSP10 (KACC97026P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 사료.
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| KR20230022739A (ko) | 2021-08-09 | 2023-02-16 | 연세대학교 산학협력단 | 대장균 또는 시겔라속 균에 특이적 사멸능을 갖는 박테리오파지 및 이의 용도 |
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