KR101187367B1

KR101187367B1 - 크로노박터 사카자키에 대해 생육 억제능을 나타내는 신규의 박테리오파지

Info

Publication number: KR101187367B1
Application number: KR1020100126989A
Authority: KR
Inventors: 박종현; 이영덕
Original assignee: 가천대학교 산학협력단
Priority date: 2010-12-13
Filing date: 2010-12-13
Publication date: 2012-10-02
Also published as: KR20120065718A

Abstract

본 발명은 신규의 박테리오파지 2949-1 (KCCM 11140P)에 관한 것으로, 치사율이 높은 병원성 미생물 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 높은 생육 억제능을 나타내기 때문에 의약품, 동물 의약품 및 조제 분유 등의 식품에 항생제 대용으로 사용할 수 있다.

Description

크로노박터 사카자키에 대해 생육 억제능을 나타내는 신규의 박테리오파지{Novel bacteriophage with growth inhibition activity against Cronobacter sakazakii}

본 발명은 신규의 박테리오파지에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 치사율이 높은 병원성 미생물인 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 생육 억제능을 나타내는 신규의 박테리오파지에 관한 것이다.

식품에 의해 기인되는 질병은 매년 전 세계적으로 매우 심각하고 주요한 사망의 원인 중 하나이다. GMP, HACCP 등 현대의 발전된 식품 제조 및 관리 기술을 도입하여도, 식중독 등의 식품 매개 질병은 계속하여 증가하고 있는 추세이다.

한국에서의 주된 식중독 세균으로는 병원성 이 콜라이 (E. coil), 노로바이러스 (norovirus), 살모넬라 (Salmonella), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 등이 있는데. 이들 병원성 세균을 제거하는 방법으로는 열처리나 화학적 살균소독제 등이 사용되어 왔다. 하지만, 식품에서는 그 효과가 크지 않고, 소비자는 가능하면 최소의 가공을 원하기 때문에, 새로운 천연 식품보존 및 살균제의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 이에 따라, 천연 항균제, 박테리오 파지, 엔도리신 (endolysin) 등이 새롭게 개발되고 있다. 그 중 박테리오파지 (bacteriophage)는 세균만을 감염시키는 선택성을 갖고, 식품 및 자연환경 속에 아주 많이 분포하고 있기 때문에 유력한 식중독 세균 제어 방법이 될 수 있다.

박테리오파지는 세균에 감염하는 바이러스로,“세균 (Bacteria)”을 “먹는다 (Phage)"는 의미인데, 간단히 “파지”로도 불리고 있다. 파지는 세균의 약 1/10 크기를 갖는데, 전자현미경으로 관찰할 수밖에 없으나, 파지가 균을 용균시키면 세균 집락에 플라크로 불리는 투명한 반점이 형성되기 때문에 파지의 존재를 간접적으로나마 확인할 수 있다.

파지는 용균 사이클만 반복하는 용균 (virulent) 파지, 용원 사이클만 반복하는 약독성 (temperate) 파지로 분류되는데, 약독성 파지 (temperate phage)는 숙주 세균의 유전체에 삽입되어 파지의 모양은 사라지지만 숙주세균이 파괴되지도 않는다. 이러한 상태는 숙주 세균이 좋은 환경 조건에 있는 한 계속되는데, 숙주 세균의 환경이 악화되면, 숙주 세균의 유전자에 있던 파지 유전자는 파지 입자를 만든 후, 용균 사이클로 변환되어 숙주세균을 용균시키고 숙주세포 밖으로 탈출한다. 파지는 세균에 비해 증식 속도가 훨씬 우세하기 때문에, 최초 발견 당시부터 세균의 증식을 억제할 수 있는 중요 후보 중 하나로 고려되었으나, 페니실린 및 스트렙토마이신으로 대표되는 화학요법제의 개발로 인해 그 활용이 제한되었다.

그러나, 화학요법제의 남용 및 그에 따른 항생제 내성 균주의 출현 등으로 인해 1980년도 이후 파지의 활용성은 다시 주목받았는데, 실제적으로 살모넬라 (Salmonella), 캠필로박터 (Campylobacter), 스타필로코쿠스 아우레우스 (S. aureus) 및 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii) 등의 제어를 위하여 박테리오파지가 활용되었다. 더 나아가 최근에는 미국 FDA에서 닭고기 등의 즉석섭취 식품에 대해 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes) 파지의 실용화가 승인 (www.ebifoodsafety.com)되었고, 이 콜라이 (E. coli) 와 살모넬라 (Salmonella) 제어용 파지 제품이 승인되어 활용되고 있는 실정이다.

한편, 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)는 영?유아에게 치명적인 영향을 주는 급성 기회 감염균으로 주로 생후 1개월 이내의 신생아, 조산아, 저체중아 및 유아에게서 수막염 (neonatal meningitis), 패혈증 (bacteremia), 신생아 괴사성 장염 (necrotizing enterocolitis) 등의 병을 일으키는 것으로 알려져 있다. 매우 드물게 감염되기는 하지만, 일단 감염되면 치사율이 33-80% 이상에 이르기 때문에 매우 치명적인 세균으로 간주된다.

크로노박터 (Cronobacter)는 원래 엔테로박터 사카자키 (Enterobacter sakazakii)로 명명되어 오다가 이버슨 (Iversen) 등에 의하여 크로노박터 (Cronobacter)로 개명하도록 제안되었다. 국제기구인 International Commission for Microbiological Specification for Food (ICMSF)에서는 크로노박터 (Cronobacter)를 “Severe hazard for restricted population, life threatening or substantial chronic sequelae or long duration”, 즉 한정된 사람들에게 매우 위험하며 만성 혹은 장기간 생명을 위협한다고 보고하였으며, FAO/WHO는 영유아용 분말식품에 대한 위해 조사를 하도록 권고하고 있다.

그러나, 크로노박터 (Cronobacter)는 건조, 열, 자외선, 삼투압, 저영양 상태 및 살균소독제 등에 저항성을 보이기 때문에, 억제 및 제어가 생각보다 만만하지는 않다.

따라서, 대안의 개발이 요구되고 있는데, 최근 그 활용이 새롭게 주목받고 있는 박테리오파지도 유력한 하나의 대안이 될 수 있다.

이에 본 발명은 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 생육 억제능을 보이는 새로운 박테리오파지를 분리하여 제공하는데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 생육 억제능을 나타내는 박테리오파지 ESP 2949-1 (KCCM 11140P)를 분리하여 제공한다.

본 발명자들은 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 생육 억제능을 나타내는 신규의 박테리오파지 ESP 2949-1를 분리하고, 2010년 12월 7일 한국미생물보존센터 (KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM 11140P를 부여받았는데, 본 발명의 신규 박테리오파지 ESP 2949-1 (KCCM 11140P)는 투과전자현미경을 통한 형태학적 특성의 분석 결과, 미오비리대 (Myoviridae) 과 (family)에 속하는 것으로 확인되었다.

한편, 본 발명은 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 생육 억제능을 나타내는 박테리오파지 ESP 2949-1 (KCCM 11140P)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii) 사멸용 조성물을 제공한다.

본 발명에 의한 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii) 사멸용 제제는 통상적인 미생물 제제 제조방법으로 제제화할 수 있다. 인체에 투여하는 경우는 약제학적으로 허용하는 범위 내에서, 가축 또는 어류에 투여하는 경우는 수의학에서 허용하는 범위 내에서, 제제화하고, 그에 따라 투여경로를 정할 수 있다.

상기 본 발명의 미생물 제제는 유효성분인 본 발명의 박테리오파지 ESP 2949-1 (KCCM 11140P) 외에 활성 유지 등의 필요에 따라, 담체, 기타 보조제 등을 포함할 수 있는데, 상기 담체는 생리식염수, 증류수, 사료, 박테리아용 배지 (예, Luria broth등) 등이 될 수 있으며, 보조제는 pH 교정 등의 목적으로 완충액 등을 첨가하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 미생물 제제는 분말제, 과립제, 정제 등의 고체상 제제, 현탁제 또는 주사액제 등의 액상 제제 및 크림, 로션, 젤, 페이스트 등의 반 고체상 제제 등으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 미생물 제제는 경구, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 경피, 비측 내, 흡입 또는 직장 등의 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 미생물 제제 투여량은 투여 대상에서 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)의 사멸 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 제형의 종류 및 투여대상의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 경로, 투여 시간 및 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

한편, 본 발명은 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 생육 억제능을 나타내는 박테리오파지 ESP 2949-1 (KCCM 11140P)을 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물을 제공한다. 이때, 상기 식품은 일 예로 분유일 수 있다.

박테리오파지 ESP 2949-1 (KCCM 11140P)는 대상 식품의 상태에 따라 액상, 반 고체상 또는 고체상 등의 제형으로 식품에 첨가될 수 있는데, 항 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)의 효과 유지 등을 위해 필요에 따라, 담체 및 기타 보조제 등을 포함할 수 있다. 담체는 생리식염수, 증류수, 사료, 박테리아용 배지 (예, Luria broth 등) 등이 될 수 있으며, 보조제는 pH 교정 등의 목적으로 완충액 등을 첨가하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 새롭게 분리한 신규의 박테리오파지 2949-1 (KCCM 11140P)는 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 높은 생육 억제능을 나타내기 때문에, 의약품이나 동물 의약품으로 제조되어 활용될 수 있고, 분유 등의 식품에 첨가하여 사용될 수도 있다.

도 1은 본 발명의 박테리오파지 ESP 2949-1의 플라크 형태를 보여준다.
도 2는 본 발명의 박테리오파지 ESP 2949-1의 투과전자현미경 사진이다. 우측 하단의 스케일 바는 100 nm이다.
도 3a는 본 발명 박테리오파지 ESP 2949-1에 의한 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)의 생육 억제 상태를 보여주는 그래프이다.
도 3b는 조제분유에서 본 발명 ESP 2949-1에 의한 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)의 생육 억제 상태를 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 들어 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

실시예 1: 박테리오파지 ESP 2949-1의 분리

경기도에 소재한 하수 종말 처리장으로부터 오수 시료를 채취하여 박테리오파지의 분리를 위한 시료로 사용하였다. 분리에 사용된 균주는 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii) ATCC 29544이고, 루리아 베르타니 브로스 (Luria Bertani broth)에 10mM CaCl₂를 첨가-LBC broth-하여 배양한 후 실험에 사용하였다. 채취한 오수 시료를 와트만지 (watman paper) No3로 여과 한 후 1% 클로로포름 (chloroform)을 첨가하고, 격렬하게 흔든 (vortexing) 후 8000rpm으로 10분 동안 원심분리하였다.

상등액을 채취하고, 이를 0.22 μm 막 필터 (membrane filter)로 제균한 후 제균액을 5× LBC 브로스에 1:4로 혼합하고, 37℃에서 200 rpm으로 24시간 배양하였다. 배양액을 8000 rpm으로 10분 동안 원심 분리한 후, 상등액을 0.22 μm 막 필터 (membrane filter)로 제균하여 제균액을 수득하고, 파지 분리를 위해 4℃에 보관하면서 플라크 어세이 (plaque assay)를 수행하였다.

제균액과 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii) ATCC 29544 배양액을 1:1로 혼합하고, 37℃에서 배양한 후 LBC 소프트 아가 (soft agar)에 분주하였다. LBC 아가에 분주한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하면서 박테리오파지에 의한 플라크 형성 유무를 확인하였다.

형성된 플라크는 형태, 크기, 혼탁 정도 등을 비교하여 분리하였으며, 플라크를 투스-피킹 (tooth-picking)하고, SM 버퍼에 현탁한 후 10진 희석하여 플라크 어세이를 수행하고, 싱글 플라크를 분리하였다. 확인된 싱글 플라크로부터 플레이트 용해물 (plate lysate), 액체 용해물 (liquid lysate)을 추출하고, 플라크를 통해 파지의 양을 확인한 후 이를 실험에 사용하였다. 플라크 어세이를 수행한 결과 투명한 원형의 플라크를 확인하였다.

실시예 2: 분리된 박테리오파지 ESP 2949-1의 형태학적 특성

실시예 1에서 분리된 박테리오파지를 2% 우라닐 아세테이트 (uranyl acetate)를 이용해 음성 염색 (negative staining)을 한 후 투과전자현미경을 이용하여 형태학적인 특성을 확인하였다. 투과전자현미경을 통한 형태학적 특성 분석 결과, 미오비리대 과 (Myoviridae family)에 속하는 것으로 확인되었다.

실시예 3: 분리된 박테리오파지 ESP 2949-1의 숙주 감수성

본 발명자들이 확보하고 있는 다양한 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii) 분리주들을 대상으로 하여, 본 발명에서 새롭게 분리한 박테리오파지 ESP 2949-1와 본 발명자들이 이미 보유하고 있는 다른 병원성 파지에 의한 숙주 감수성을 비교 및 분석하였다.

우선 -80℃에서 보관하던 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii) 분리주들을 DFI 아가에 평판 획선한 후 37℃에서 24시간 배양하고, 초록색 단독 집락을 취해 TSB에 접종한 후 배양하고, 이를 LBC 브로스에 접종한 후 재배양하였다. 이 후, 병원성 파지들에 의한 호스트 감수성을 스팟 어세이 (spot assay)를 통해 확인하였다. (표 1)

호스트＼파지	ES-I	ES-2	ESSI-2	EI-1	KCES-3	KCES-4	ESP 2949-1
KYU10	X	X	X	X	X	X	O
KYU12	X	X	X	X	X	X	O
KYU18	X	X	X	X	X	X	O
KYU19	X	X	X	X	X	X	O
KYU26	X	X	X	X	X	X	O
KYU35	X	X	X	X	X	X	O
KYU39	X	O	O	O	X	X	O
KYU53	X	X	X	X	X	X	O
KYU57	X	X	X	X	X	X	O
KYU64	X	X	X	X	X	X	O
KYU70	X	X	X	X	X	X	O
KYU79	X	X	X	X	X	X	O
KYU80	X	X	X	X	X	X	O
KYU81	X	X	X	X	X	X	O
KYU89	X	X	X	X	X	X	O
KYU91	X	O	O	O	X	X	O
KYU96	X	X	X	X	X	X	O
KYU111	X	X	X	X	X	X	O
KYU114	X	X	X	X	X	X	O
KYU115	X	X	X	X	X	X	O
KYU116	X	X	X	X	X	X	O
KYU117	X	X	X	X	X	X	O
KYU123	X	X	X	X	X	X	O

다양한 식품으로부터 분리된 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)들에 대한 호스트 감수성을 비교한 결과, 기존에 보유하고 있던 병원성 파지인 ES-I, ES-2, ESSI-2, EI-1, KCES3, KCES4들은 분리주들의 용해 (lysis)를 유발하지 못하였으나, 새롭게 분리된 ESP 2949-1은 이들 분리주들을 감염시켜 용해시킨 후 플라크를 형성시키는 것으로 확인되었다.

이는 기존의 병원성 파지들이 감염시키지 못했던 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)를 본 발명의 파지 ESP 2949-1이 감염시켜 사멸시킬 수 있는 것을 의미한다.

실시예 4: 크로노박터 사카자키 ( Cronobacter sakazakii )의 생육 억제 효과 확인

본 발명에서 새롭게 분리된 박테리오파지 ESP 2949-1이 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)의 생육을 억제하는지 확인하고자 하였다.

먼저, 본 발명에서 분리된 ESP 2949-1을 LBC 브로스에 접종한 후 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii) ATCC 29544를 접종하고, 37℃에서 200 rpm으로 배양하면서 시간마다 흡광도를 측정하여 생육 정도를 관찰하였다.

그 결과 (도 3a), 시간이 흐름에 따라 본 발명의 박테리오파지 ESP 2949-1을 접종하지 않은 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)의 경우, 흡광도 값이 지속적으로 증가하나, 박테리오파지 ESP 2949-1와 함께 배양하였을 경우, 흡광도 값이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 실제 식품 모델에서도 본 발명의 박테리오파지 ESP 2949-1이 활성을 유지하는지 확인하고자 하였다. 이를 위해 권장 제조 방법에 따라 분유를 조제한 후, 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii) ATCC 29544를 약 3 log CFU/mL로 접종하였다. 그리고, 박테리오파지 ESP 2949-1를 약 6 log PFU/mL로 접종한 후, 시간이 지남에 따라 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)의 생육 정도를 관찰하였다.

그 결과 (도 3b), 본 발명의 박테리오파지 ESP 2949-1을 감염시키지 않았을 경우, 시간이 지남에 따라 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)가 계속 증가하는 양상을 나타내었으나, ESP 2949-1 함께 배양하였을 경우에는 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)가 증가하지 않는 양상을 나타내었다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11140P

20101207

Claims

크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 생육 억제능을 나타내는 박테리오파지 ESP 2949-1 (KCCM 11140P)
크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 생육 억제능을 나타내는 박테리오파지 ESP 2949-1 (KCCM 11140P)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii) 사멸용 조성물
크로노박터 사카자키 (Cronobacter sakazakii)에 대해 생육 억제능을 나타내는 박테리오파지 ESP 2949-1 (KCCM 11140P)을 함유하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물
제3항에 있어서,
상기 식품은,
분유인 것을 특징으로 하는 식품 조성물