KR20240058627A - 크로노박터 사카자키에 대해 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물, 식품 보존용 첨가제 및 식품 - Google Patents
크로노박터 사카자키에 대해 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물, 식품 보존용 첨가제 및 식품 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 크로노박터 사카자키에 대해 특이적으로 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지, 및 이를 포함하는 항균 조성물, 식품 보존용 첨가제 및 식품에 관한 것이다.
본 발명의 신규 박테리오파지는 크로노박터 사카자키에 대한 특이성이 매우 높고 용균 활성이 우수하며, 신속하고 지속적인 항균 활성을 나타내고, 온도 및 pH에 대한 안정성이 우수하다. 따라서 본 발명의 박테리오파지는 크로노박터 사카자키에 대한 항균 조성물에 효과적으로 적용될 수 있으며, 특히 분유 등의 식품에서 크로노박터 사카자키의 생장 및 번식을 방지하기 위한 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 신규 박테리오파지는 크로노박터 사카자키에 대한 특이성이 매우 높고 용균 활성이 우수하며, 신속하고 지속적인 항균 활성을 나타내고, 온도 및 pH에 대한 안정성이 우수하다. 따라서 본 발명의 박테리오파지는 크로노박터 사카자키에 대한 항균 조성물에 효과적으로 적용될 수 있으며, 특히 분유 등의 식품에서 크로노박터 사카자키의 생장 및 번식을 방지하기 위한 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물, 식품 보존용 첨가제 및 식품에 관한 것으로, 보다 상세하게는 크로노박터 사카자키에 대해 특이적으로 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지, 및 이를 포함하는 항균 조성물, 식품 보존용 첨가제 및 식품에 관한 것이다.
크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii)는 장내세균과에 속하는 그람 음성의 간균이며 포자를 형성하지 않는 통성혐기성균으로서, 토양이나 물 등의 다양한 환경과 육류, 채소류, 유제품에 이르기까지 광범위한 식품군에서 검출되고 있다. 크로노박터 사카자키는 모든 연령대에서 질환을 일으킬 수 있는데, 주로 면역력이 약한 신생아나 6개월 미만의 영유아에게서 뇌수막염, 장염, 패혈증 등을 유발하여 2~50%의 치사율을 나타낸다고 보고되고 있다. 크로노박터 사카자키는 1950년 미국에서 분유 식중독 사고가 발생하여 이슈가 된 이후 오늘날까지도 전세계적으로 문제가 되고 있다.
크로노박터 사카자키와 같은 병원균 제어를 위한 일반적인 기술로는 항생제를 이용하여 병원균을 사멸시키는 방법이 있다. 그러나, 항생제의 경우 '슈퍼박테리아(superbacteria)'와 같은 내성균 출현 문제로 인하여 장기적인 효과를 나타내기 어렵기 때문에 항생제를 대체할 수 있는 항균 소재에 대한 연구가 필요하였다.
항생제의 대안으로서, 천연 항균 소재를 이용하는 기술이 개발된 바 있다. 예를 들어, 대한민국 공개특허공보 제10-2017-0115820호에서는 크로노박터 등의 식중독균에 항균 활성을 나타내는 물질로서 천연 발효 소재인 케피어를 기재하고 있다. 그러나, 천연 소재를 이용하는 경우 다양한 온도 및 pH 조건에서 안정적인 항균 활성을 확보하기 어렵고 식품의 관능적인 특성 보존에 불리하다는 한계점이 있었다.
한편, 상기 항생제, 천연 소재 등 기존의 항균 물질을 대체할 수 있는 물질로서 박테리오파지를 이용하는 기술이 주목받고 있다. 박테리오파지는 세균을 숙주로 하는 바이러스로서 숙주균에 결합하여 사멸을 유도하는 항균성 물질이다. 특히, 박테리오파지는 특정 범주의 균을 사멸시키고 그 이외의 균에는 영향을 주지 않는 특성을 갖는다. 일 예로서, 대한민국 공개특허 제10-2018-0100533호에서는 녹농균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖는 박테리오파지를 기재하고 있다. 이러한 균 특이적 특성으로 인하여, 박테리오파지를 이용하면 목적하는 병원균만을 사멸시키고 유익균은 사멸시키지 않는 장점이 있다. 또한, 박테리오파지는 2006년부터 미국식품의약품국(FDA)에 의해 일반적으로 안전하다고 간주되는 물질(generally recognized as safe, GRAS)로 인정받은 안전한 생물소재로서, 식품 첨가물로도 사용이 가능하다.
따라서, 크로노박터 사카자키에 특이적 사멸능을 갖는 박테리오파지를 개발하는 경우, 내성균 출현 및 안전성 우려의 문제 없이 크로노박터 사카자키에 대해 항균성이 요구되는 다양한 분야에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 목적은 크로노박터 사카자키에 대해 특이적으로 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 박테리오파지를 포함하는 항균 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파지를 포함하는 식품 보존용 첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 식품 보존용 첨가제를 포함하는 식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii)에 대해 사멸능을 갖는 기탁번호 KCTC15074BP의 박테리오파지를 제공한다.
본 발명에서, 상기 박테리오파지는 시포비리대 과(Siphoviridae)에 속하는 것이다.
본 발명에서, 상기 박테리오파지의 유전체는 49,076bp로 구성될 수 있다.
본 발명에서, 상기 박테리오파지는 0.1 이하의 다중감염도(MOI)로 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한, 상기 박테리오파지를 포함하는 항균 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 항균 조성물은 방부제, 살균제, 소독제, 세척제, 항생제 또는 보존제일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 박테리오파지를 포함하는 식품 보존용 첨가제를 제공한다.
본 발명에서, 상기 식품 보존용 첨가제는 액상, 반고체상 또는 분말상의 제형을 가질 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 식품 보존용 첨가제를 포함하는 식품을 제공한다.
본 발명에서, 상기 식품은 분유 또는 이유식일 수 있다.
본 발명의 신규 박테리오파지는 크로노박터 사카자키에 대한 특이성이 매우 높고 용균 활성이 우수하며, 신속하고 지속적인 항균 활성을 나타내고, 온도 및 pH에 대한 안정성이 우수하다. 따라서, 본 발명의 박테리오파지는 크로노박터 사카자키에 대한 항균 조성물에 효과적으로 적용될 수 있으며, 특히 분유 등의 식품에서 크로노박터 사카자키의 생장 및 번식을 방지하기 위한 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 박테리오파지 SG01의 투과전자현미경(TEM) 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 규명한 박테리오파지 SG01의 유전체 지도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 규명한 박테리오파지 SG01의 계통수를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 SG01의 크로노박터 사카자키성장 억제 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 SG01에 대해 -18 내지 80℃ 범위에서 생존율을 측정한 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 SG01에 대해 pH 3 내지 12 범위에서 생존율을 측정한 결과 그래프이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 SG01의 생물막 감소율을 측정한 결과 그래프이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 SG01의 생물막 저해율을 측정한 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 SG01의 분유 내 크로노박터 사카자키 성장 억제 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 규명한 박테리오파지 SG01의 유전체 지도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 규명한 박테리오파지 SG01의 계통수를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 SG01의 크로노박터 사카자키성장 억제 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 SG01에 대해 -18 내지 80℃ 범위에서 생존율을 측정한 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 SG01에 대해 pH 3 내지 12 범위에서 생존율을 측정한 결과 그래프이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 SG01의 생물막 감소율을 측정한 결과 그래프이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 SG01의 생물막 저해율을 측정한 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 박테리오파지 SG01의 분유 내 크로노박터 사카자키 성장 억제 활성을 측정한 결과 그래프이다.
이하, 본 발명의 구체적인 구현 형태에 대해서 보다 상세히 설명한다. 다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii)에 대해 특이적으로 사멸능을 갖는 박테리오파지에 관한 것이다.
박테리오파지(bacteriophage)는 세균을 숙주로 하는 바이러스로서 "파지(phage)"로 약칭될 수 있다. 박테리오파지는 용균성 생활사(lytic cycle) 및/또는 용원성 생활사(lysogenic cycle)에 의해 숙주균을 사멸시킨다. 예를 들어 용균성 생활사에 따르면, 박테리오파지는 균을 감염시킨 후 균 세포 내부에서 증식하고, 증식 후 숙주균의 세포벽을 파괴하면서 방출되어 균을 사멸시킬 수 있다. 한 종류의 박테리오파지는 특정 범주의 숙주균에 대해서만 사멸능을 가지므로, 사멸 대상이 되는 균의 종류에 따라 박테리오파지를 선택하거나 신규한 박테리오파지를 발굴하여 사용할 수 있다.
한편, 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii)는 분유류와 곡류 조제식 등에 존재하는 식중독 원인균으로서, 영유아 식품, 특히 분유에 오염돼 영유아에게 뇌수막염과 같은 심각한 질병을 일으키거나, 심한 경우 사망에 이르게 할 수 있는 치명적인 병원균이다.
본 발명에서는 크로노박터 사카자키에 대해 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지로서 박테리오파지 SG01(이하, "파지 SG01"이라 함)을 제공한다.
상기 파지 SG01은 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture)에 기탁번호 KCTC15074BP(기탁일자: 2022년 9월 2일)로 기탁되어 있다.
본 발명에서 사용되는 박테리오파지는 시포비리대(Siphoviridae) 과에 속하는 것으로, 크로노박터 사카자키에 대해 특이적인 사멸능을 나타낼 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 박테리오파지는 Cronobacter sakazakii ATCC 29544, Cronobacter sakazakii NTCT 2949, Cronobacter sakazakii ATCC 29004, Cronobacter sakazakii ATCC BAA-894, Cronobacter sakazakii ES15, Cronobacter sakazakii ATCC 51329, Cronobacter sakazakii isolates 1, Cronobacter sakazakii isolates 2, Cronobacter sakazakii isolates 5 및 Cronobacter sakazakii isolates 6으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 균주에 대해 사멸능을 나타낼 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 파지 SG01을 36개의 다양한 균주에 감염시킬 시 크로노박터 사카자키만을 특이적으로 감염시키며, 다른 균주들에 대해서는 감염을 일으키지 않는다는 것을 확인하였다.
본 발명에서 사용되는 박테리오파지는 크로노박터 사카자키에 대해 신속하고 장기간 지속적인 항균 활성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 파지 SG01을 처리했을 때 크로노박터 사카자키의 성장을 1시간 내에 급격하게 저해하는 것을 확인하였으며, 특히 MOI 0.01 조건으로 파지 수를 낮게 처리한 경우 최대 20시간까지 항균 효과가 지속되는 것을 확인하였다.
본 발명의 박테리오파지는 열 안정성 및 pH 안정성이 우수하여 다양한 온도 및 pH 조건에서 적용이 가능하다. 구체적으로, 파지 SG01은 -18 내지 70℃의 온도 범위 및 4 내지 12의 pH 범위에서 생존이 가능하며, 특히 -18 내지 50℃의 온도 범위 및 6 내지 11의 pH 범위에서는 파지의 생존율이 온도 및 pH의 영향을 거의 받지 않는다. 이와 같이, 본 발명의 박테리오파지는 온도 및 pH에 대한 안정성이 높으므로 후처리 및 가공이 필요한 용도에도 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 박테리오파지는 크로노박터 사카자키가 유발하는 생물막을 효과적으로 제어할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 박테리오파지를 크로노박터 사카자키에 의해 형성된 생물막에 처리하는 경우 생물막이 제거되는 효과를 나타낼 수 있을 뿐만 아니라, 크로노박터 사카자키에 의한 생물막 형성을 방지하는 저해 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 박테리오파지가 세균 사멸을 위해 사용되는 경우, 다중감염도(multiplicity of infection, MOI) 조건에 따라 파지의 항균 활성을 조절할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 파지 SG01의 MOI는 0.1 이하, 바람직하게는 0.001 내지 0.05일 수 있으며, 이 경우 크로노박터 사카자키에 대해 소량으로 장기간의 항균 효과를 발휘할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 박테리오파지는 크로노박터 사카자키를 특이적으로 사멸시킬 수 있으며, 신속하고 지속적인 항균 활성을 나타낼 수 있고, 온도 및 pH에 대해 안정성이 우수하며, 생물막에 대해서도 제거 및 저해 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 박테리오파지는 크로노박터 사카자키의 사멸을 유도하거나 이에 의한 감염을 방지하기 위한 다양한 용도에 효과적으로 사용될 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 또한, 크로노박터 사카자키에 대해 사멸능을 갖는 박테리오파지를 포함하는 항균 조성물을 제공한다.
본 명세서 사용되는 용어, "항균 조성물"은 균을 죽이거나 균의 성장을 억제할 수 있는 제제를 의미하며, 방부제, 살균제, 소독제, 세척제, 항생제, 보존제 등의 항균제를 총칭하는 것일 수 있다. 또한, 상기 항균 조성물은 균 자체 뿐만 아니라 균에 의해 형성되는 생물막을 감소시키거나 생물막 형성을 방지하는 제제, 즉 항생물막제를 포함하는 의미로 해석된다. 본 발명의 박테리오파지를 포함하는 항균 조성물의 제형은 액상, 반고체상 또는 분말상일 수 있다.
본 발명의 파지 SG01을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물은 종래 항균 조성물에 비하여 크로노박터 사카자키에 대한 특이성이 매우 높아 유익균은 죽이지 않고 특정 병원균만을 사멸시킬 수 있으며, 약물 내성을 유도하지 않아 지속적인 효과를 나타낼 수 있다. 또한, 열 안정성 및 pH 안정성이 우수하여 다양한 온도 및 pH 조건에서 적용이 가능하다.
상기 항균 조성물은 항균 조성물의 품질 저하를 감소시키는데 충분한 유효량의 첨가제를 포함하는 것일 수 있다.
상기 첨가제는 방부제, 안정화제, 부형제, 또는 동결보호제 등일 수 있으며 항생제의 품질 저하를 감소시킬 수 있는 것이면 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들이 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 항균 조성물은 크로노박터 사카자키에 대해 항균 활성이 요구되는 다양한 용도로 사용될 수 있다. 특히 크로노박터 사카자키가 만 6세 이하의 아동, 즉 영유아에 감염될 경우 심각한 영향을 미칠 수 있기 때문에, 본 발명을 이용하면 분유, 이유식 등 영유아용 식품이나 젖병, 분유용 스푼, 젖병 세척솔 등 영유아용 제품에서 유의적인 항균 효과를 발휘할 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 또한, 크로노박터 사카자키에 대해 사멸능을 갖는 박테리오파지를 포함하는 식품 보존용 첨가제 및 이를 포함하는 식품을 제공한다.
본 발명의 박테리오파지를 포함하는 식품 보존용 첨가제를 식품에 적용함으로써, 식품 내 크로노박터 사카자키의 생장 및 번식을 방지하여 식품의 안전성 및 저장성을 향상시킬 수 있고, 식품 내 크로노박터 사카자키에 의한 감염성 질병을 예방할 수 있다.
본 발명의 식품 보존용 첨가제는 상기 박테리오파지 외에도 식품에 사용 가능한 첨가제, 예를 들어 pH 조절제, 안정화제, 알긴산, 비타민, 풍미제, 착색제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 식품 보존용 첨가제를 적용할 수 있는 식품으로는 각종 식품류, 예를 들어, 유제품, 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류, 건강보조식품, 조미식품, 소스류, 과자류, 유가공품, 절임 식품, 음료, 천연조미료, 비타민 복합제, 주류 및 그 밖의 가공식품류가 포함된다. 본 발명의 박테리오파지를 포함하는 식품 보존용 첨가제 또는 이를 포함하는 식품의 제형은 액상, 반고체상 또는 분말상일 수 있다.
특히, 크로노박터 사카자키가 영유아에게 큰 영향을 미친다는 점을 고려할 때, 본 발명의 박테리오파지를 식품 보존용 첨가제로 이용하여 분유, 이유식과 같은 영유아용 식품에서 크로노박터 사카자키의 생장 및 번식을 억제함으로써, 영유아에게 치명적인 크로노박터 사카자키 감염증 발생을 방지하는 효과를 나타낼 수 있다.
실시예
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위하여 일부 실험방법과 구성을 나타낸 것으로, 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 제한되는 것은 아니다.
실험 방법
실험에서, 숙주균으로는 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii) ATCC 29544를 이용하였으며, 배양배지로는 TSB broth (MB-T1053; MB cell, Seoul, Korea), 0.4% (w/v) molten TSA 및 1.5% (w/v) TSA 배지(MB- T1052, MB cell)를 이용하였다.
파지 역가(phage titer)는 0.5% (w/v) molten TSA 및 1.5% (w/v) TSA 배지를 각각 상부층 및 하부층으로 하는 이중층 한천 플레이트(double-layer agar plate)를 이용하여 측정하였다.
제조예 1: 파지 SG01의 정제, 증식 및 스톡 제조
환경시료(하수)로부터 박테리오파지(이하, "파지"라 함)를 얻고 이중층 한천 검사법(double-layer agar assay) 및 용균반 검사법(plaque assay)을 통해 정제하였다. 하나의 용균반을 인산완충식염수(PBS)에 재부유(resuspend)시킨 후 15,000 x g로 1분 동안 4℃에서 원심분리하고, 기공 크기가 0.22㎛인 멸균 WhatmanTM PVDF 멤브레인 필터로 여과하였다. 상기 여과 공정을 5회 반복하였다.
분리된 파지를 증식시키기 위해, 크로노박터 사카자키 ATCC 29544를 숙주로 하여 파지를 LB broth에서 배양하였다. 구체적으로, 크로노박터 사카자키 ATCC 29544를 1% subinoculation한 다음 37℃에서 1.5시간 동안 배양시켰다. 그 후, 37℃에서 4시간 동안 호기성 조건에서 파지를 배양시켰다. 샘플을 15,000 x g로 10분 동안 4℃에서 원심분리하고, 기공 크기가 0.45㎛인 멸균 WhatmanTM PVDF 멤브레인 필터로 상층액을 여과하였다. 상기 단계를 세가지 부피 조건(배양균 3, 50 및 300mL)에 대해 연속적으로 수행하여 충분한 양의 파지 용해물(lysate)을 수득하였다.
더 높은 역가의 파지 스톡(stock)을 수득하기 위하여, 정제된 파지 용해물을 30,000 x g로 30분 동안 4℃에서 원심분리하여 펠렛(pellet)을 얻었다. 이에 대해, 이중층 한천 검사법을 이용하여 파지 농도(PFU/mL)를 측정하였다. 정제된 파지를 증폭시켜 1010 PFU/mL 이상의 역가를 갖는 용해물을 수득하고 사용시까지 4℃에서 보관하였으며, 장기간 보관 시 -80℃에서 35% 글리세롤에 보관하였다.
상기 방법에 따라 분리 정제된 파지를 "파지 SG01"이라 명명하였으며, 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Culture)에 기탁하고 2022년 9월 2일로 기탁번호 KCTC15074BP를 부여받았다.
실험예 1: 파지 SG01의 투과전자현미경(TEM) 분석
파지 SG01에 대해, 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 형태 특성을 분석하였다.
포름바르/카본(formvar/carbon) 코팅된 200메쉬의 copper grid를 방전가공장치(electrical discharge machine, US/91000, USA)로 전처리하였다. 상기 copper grid에 파지를 로딩한 후, 2%(v/v)의 우라닐 아세테이트(uranyl acetate, pH 4.5)로 네거티브 염색하였다. 상기 샘플을 에너지 여과형 Libra 120 투과전자현미경(energy-filtering Libra 120 transmission electron microscope, Carl Zeiss, Germany)으로 분석하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1의 TEM 이미지를 참조하면, 파지 SG01은 20면체의 머리와 수축성이 없는 유연성 꼬리를 갖는 것을 확인할 수 있다. 구체적으로, 상기 파지의 머리는 입경이 0.66±0.05㎛ 인 20면체 형상이며, 꼬리의 길이는 1.63±0.07㎛이고, 너비는 0.12±0.01㎛였다. 상기 결과로부터, 파지 SG01은 시포비리대(Sipoviridae) 과로 분류되는 것을 알 수 있었다.
파지 SG01은 다른 크로노박터 사카자키 파지(예를 들어 파지 CS01)와 크로노박터 사카자키에 대한 항균 활성이 있다는 점에서 유사하나, 모폴로지를 분석한 결과, 유연성이 없는 신축성 꼬리를 가져 미오비리대(Myoviridae) 과로 분류되는 CS01 파지와 달리 SG01 파지는 수축성이 없는 유연성 꼬리를 갖는 시포비리대(Sipoviridae) 과에 속한다는 점에서 차이가 있음을 확인하였다.
실험예 2: 파지 SG01의 DNA 분석
유전학적 서열 분석 및 생물학적 정보 분석
파지 SG01의 DNA를 추출하고, RAST (https://rast.nmpdr.org/), GeneMarkS (http://exon.gatech.edu/GeneMark/genemarks.cgi) 및 FgenesV(trained Pattern Markov chain-based viral gene prediction software) 프로그램을 이용하여 파지 유전체의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)을 규명하였다. 알려지지 않은 ORF는 BLASTP를 이용한 non-overlapping protein NCBI database (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) 및 기존의 다른 박테리오파지의 동종 ORF를 ORF 추론에 참고하였다.
상기 분석 결과를 기반으로, Genescene software (DNAstar, Madison, WI)를 이용하여 유전체 지도(genome map)을 작성하여 도 2에 나타내었다. 파지의 유전체 서열은 GenBank에 접근번호 OP120783으로 등록하였다.
분석 결과, 파지 SG01의 유전체는 49,076bp로 구성되는 것으로 추론되었다. 또한, 이 중 GC 함량은 50.01%이고, 암호화 ORF 개수는 60개인 것으로 나타났다.
ORF 확인 결과, 상기 파지에는 용원성 모듈 유전자(lysogeny module genes)나 독성 유전자(toxic genes)가 없는 것으로 확인되었으며, 이를 통해 파지의 안전성을 확인할 수 있었다.
상기 파지의 계통학적 확인을 위해, Molecular Evolutionary Genetics Analysis 11(MEGA 11) software를 이용하여 부트스트랩(bootstrap)을 2,000번 반복한 인접 결합법(neighbor-joining method)으로 터미네이즈 라지 서브유닛(terminase large subunit)에 기반한 계통학적 분석을 수행하고, 계통수(phylogenetic tree)를 도 3에 나타내었다.
계통학적 분석 결과, 파지 SG01의 터미네이즈 라지 서브유닛은 다른 크로노박터 사카자키 파지인 파지 ESP2949-1 및 CS01의 터미네이즈 라지 서브유닛과 유사하였으며, 이를 통해 파지 SG01은 크로노박터 사카자키 파지 과에 속한다는 것을 확인하였다.
실험예 3: 파지 SG01의 항균능 측정
크로노박터 사카자키에 파지 SG01를 첨가 후 흡광도를 측정하여 파지 SG01의 항균능을 평가하였다.
크로노박터 사카자키 ATCC 29544를 TSB 배지에서 1.5시간 동안 배양시켰다. 그 후, 배양물에 각각 다중감염도(multiplicity of infection, MOI) 0.01, 0.1 및 1 조건으로 파지 SG01의 감염을 수행하였다. 24시간 동안 숙주를 성장시키면서, 분광기를 이용하여 1시간 간격으로 600nm에서의 흡광도를 측정하여 크로노박터 사카자키 성장 억제 활성을 확인하였다.
도 4는 파지 SG01의 존재 하에서 크로노박터 사카자키 성장 억제 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 4를 참조하면, 파지를 처리하지 않은 음성 대조군의 경우 균이 빠르게 증식하는 반면, 파지를 첨가한 경우 MOI 값 1, 0.1 및 0.01 조건에서 1시간 내에 숙주균 세포의 성장을 급격하게 저해하는 결과가 나타났다. 또한, 이러한 성장 저해가 MOI 값 1 조건에서는 6시간 동안, 0.1 조건에서는 10시간 동안, 0.01 조건에서는 20시간 동안 지속되는 결과를 나타냈다.
상기 결과로부터, 파지 SG01이 크로노박터 사카자키에 대해 신속하고 장기간 지속적인 항균능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4: 파지 SG01의 숙주균 감염범위 확인(host range determination)
표 1의 균에 대해 점적검사법(spot test)을 수행하여, 파지 SG01의 숙주균 감염 범위를 확인하였다.
십진 희석한 파지 용해물 10μL을 총 36개 균주의 론(lawn)에 점적한 후 37℃에서 24시간 동안 배양시켰다. 크로노박터 사카자키 균주 및 몇몇 그람-양성 및 그람-음성 균주에 대해 파지의 용균반 형성 효율을 측정하고 그 결과를 아래 표 1에 나타내었다. 평판효율(efficiency of plating, EOP)은 아래 식에 따라 계산하였으며, EOP 기준으로 + + 는 0.1 내지 1, + 는 0.1 미만을 나타내고, - 는 파지에 대한 감수성이 없는 것을 의미한다.
표 1의 결과를 참조하면, 파지 SG01은 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii)를 특이적으로 감염시켰으며, 다른 균주들에 대해서는 감염을 일으키지 않았다.
구체적으로, 상기 파지는 ATCC 29544, NTCT 2949, ATCC 29004, ATCC BAA-894, ES15, ATCC 51329, isolates 1, isolates 2, isolates 5 및 isolates 6의 10가지 균주를 포함하는 넓은 범위의 크로노박터 사카자키에 대해 활성이 있으며, 실험된 모든 크로노박터 사카자키 중 약 63%를 용해할 수 있는 것으로 나타났다.
따라서, 파지 SG01은 크로노박터 사카자키를 선택적으로 용해할 수 있어 크로노박터 사카자키의 제어가 필요한 식품 산업에 유용하게 사용될 것으로 기대할 수 있다.
실험예 5: 파지 SG01의 열 안정성 및 pH 안정성 측정
-18에서 80℃에 이르는 온도 범위 및 3 내지 12의 pH 범위에서, 파지 SG01의 생존율을 측정하여 안정성을 평가하였다.
열 안정성 측정을 위하여, PBS 버퍼 990μL 및 파지 SG01 10μL의 혼합용액을 -18, 4, 25, 37, 50, 60, 70 및 80℃의 온도에서 30분 동안 배양시켰으며 남은 파지를 플레이팅으로 산출한 실험결과를 도 5에 나타내었다.
또한, pH 안정성 측정을 위하여 pH 버퍼 990μL 및 파지 SG01 10μL의 혼합용액을 pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 및 12의 버퍼에서 30분 배양시켰으며 남은 파지를 플레이팅으로 산출한 실험 결과를 도 6에 나타내었다.
도 5의 열 안정성 시험 결과를 참조하면, -18 내지 70℃의 온도 범위에서 파지가 완전히 사멸하지 않고 생존하는 것을 확인하였다. 특히, -18, 4, 25 및 37℃에서 30분 배양한 결과 파지의 생존율이 거의 영향을 받지 않았으며, 50℃까지 대부분의 파지가 높은 생존성을 보이는 것으로 확인되었다.
도 6의 pH 안정성 시험 결과에 따르면, 파지는 4 내지 11의 pH 범위에서 생존하였으며, 특히 6 내지 11의 pH 범위에서 30분간 배양 후에도 매우 안정적으로 생존하였다.
이로부터 파지 SG01은 열 안정성 및 pH 안정성이 요구되는 식품 및 식품 제조업에 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 6: 파지 SG01의 생물막 제어능 분석
파지 SG01 처리군에 대해 크로노박터 사카자키의 생물막 감소율(biofilm reduction) 및 생물막 저해율(biofilm inhibition)을 측정하여 파지 SG01의 생물막 제어능을 평가하였다.
생물막 감소율 측정을 위하여, 크로노박터 사카자키 ATCC 51329를 96-well plate에서 48시간 동안 배양시켜 생물막을 형성하였다. 배양물에 파지 SG01를 MOI 0.01 조건으로 첨가한 다음 6, 12 및 24시간 후 분광기를 이용하여 600nm에서의 흡광도를 측정하였다. 측정 결과를 이용하여 각 시간대별 생물막 감소율을 계산한 결과를 도 7a에 나타내었다.
또한, 생물막 저해율 측정을 위하여, 크로노박터 사카자키 ATCC 51329에 파지를 MOI 0.01 조건으로 첨가한 혼합용액을 96-well plate에서 각각 6, 12 및 24시간 동안 배양시킨 후 분광기를 이용하여 각 시간대별 600nm에서의 흡광도를 측정하였다. 측정 결과를 이용하여 각 시간대별 생물막 저해율을 계산한 결과를 도 7b에 나타내었다.
도 7a를 참조하면, 생물막이 형성된 샘플에 파지를 처리한 결과 6, 12 및 24시간 후 생물막 감소율은 각각 약 60, 65 및 80% 정도로 나타난 반면, 대조군의 경우 생물막 감소율이 약 40% 정도로 낮은 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 7b를 참조하면, 파지를 처리한 샘플에서 생물막 형성량을 확인하여 생물막 저해율을 계산한 결과 6, 12 및 24시간 후 생물막 저해율은 각각 약 90, 65 및 60% 정도로 나타난 반면, 대조군의 경우 생물막 저해율이 10% 미만으로 확인되었다.
상기 결과로부터, 파지 SG01 처리 시 크로노박터 사카자키가 유발하는 생물막을 제어할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 7: 분유에서 파지 SG01의 항균능 측정
크로노박터 사카자키가 접종된 분유에 파지 SG01을 첨가한 후 균수를 측정하여파지 SG01의 항균능을 관찰하였다.
멸균된 분유 2.9mL에 크로노박터 사카자키를 0.1mL만큼 접종하여 분유 내 크로노박터 사카자키의 수를 106CFU/mL로 조정하였다. 그 후, 분유에 파지 SG01을 용액상(phage lysate) 및 분말상(phage powder)으로 각각 처리하였다.
용액상 파지로는 동결건조 전의 파지 용액 1mL를 이용하였고, 분말상 파지로는 PBS 버퍼 1mL에 파지 분말 0.1g을 첨가한 것을 사용하였다. 각 처리군에서 MOI 조건은 100으로 동일하게 설정하였다. 대조군으로는 1mL PBS 버퍼만을 처리한 것을 사용하였다.
이후 모든 실험군을 25℃에서 4시간 동안 배양하였으며, 1시간 간격으로 용액을 100μL만큼 덜어내어 십진 희석한 후 TSA 배지에 평판 도말하여 남은 크로노박터 사카자키의 수를 측정하고 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8을 참조하면, 파지를 처리하지 않은 대조군의 경우 균의 생장 및 번식이 지속되는 반면, 용액상 또는 분말상의 파지 SG01를 처리한 경우 2시간 내에 균의 성장이 급격하게 저해되며 지속적인 항균 활성이 나타나는 것을 확인할 수 있다. 또한, 파지 SG01은 분말화 후에도 용액상과 동일하게 항균 활성이 유지됨을 알 수 있었다.
상기 결과로부터, 파지 SG01를 분유에 첨가하였을 때 우수한 항균능을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.
이상 본 발명의 일부 구현 형태에 대해서 설명하였으나, 본 발명은 상술한 바와 같은 구현형태에 대해서만 한정되는 것이 아니라 본 발명의 요지를 벗어나지 않는 범위 내에서 수정 및 변형하여 실시할 수 있으며, 그러한 수정 및 변형이 가해진 형태 또한 본 발명의 기술적 사상에 속하는 것으로 이해되어야 한다.
Claims (10)
- 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii)에 대해 사멸능을 갖는 기탁번호 KCTC15074BP의 박테리오파지.
- 제 1 항에 있어서,
상기 박테리오파지가 시포비리대 과(Siphoviridae)에 속하는, 박테리오파지.
- 제 1 항에 있어서,
상기 박테리오파지의 유전체가 49,076bp로 구성된, 박테리오파지.
- 제 1 항에 있어서,
상기 박테리오파지가 0.1 이하의 다중감염도(MOI)로 사용되는, 박테리오파지.
- 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii)에 대해 사멸능을 갖는 기탁번호 KCTC15074BP의 박테리오파지를 포함하는, 항균 조성물.
- 제 5 항에 있어서,
상기 항균 조성물이 방부제, 살균제, 소독제, 세척제, 항생제 또는 보존제인, 항균 조성물.
- 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii)에 대해 사멸능을 갖는 기탁번호 KCTC15074BP의 박테리오파지를 포함하는, 식품 보존용 첨가제.
- 제 7 항에 있어서,
상기 식품 보존용 첨가제가 액상, 반고체상 또는 분말상의 제형을 갖는, 식품 보존용 첨가제.
- 제 7 항의 식품 보존용 첨가제를 포함하는 식품.
- 제 9 항에 있어서,
상기 식품이 분유 또는 이유식인, 식품.
Priority Applications (2)
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| KR1020220139546A KR20240058627A (ko) | 2022-10-26 | 2022-10-26 | 크로노박터 사카자키에 대해 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지 및 이를 포함하는 항균 조성물, 식품 보존용 첨가제 및 식품 |
| PCT/KR2023/000304 WO2024090679A1 (ko) | 2022-10-26 | 2023-01-06 | 크로노박터 사카자키에 대해 사멸능을 갖는 신규 박테리오파지, 캡슐화된 박테리오파지 분말의 제조방법, 박테리오파지 분말 및 이를 포함하는 조성물 |
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