CN113583971A - 一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体RDP‑SA‑21003，保藏编号为CGMCC No.22494，对全基因进行测序后发现，不具有毒力基因和溶原性基因；本发明得到的噬菌体对宿主菌BS20078的裂解效率均在98.7％以上，单独使用时，对沙门氏菌的裂解能力相对较强，裂解谱较宽；而且噬菌体RDP‑SA‑21003对引起鸡气囊炎、腹膜炎的大肠杆菌具有裂解能力。

Description

一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体及其应用。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella pullorum)属于肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌，是沙门氏菌病的病原体。广泛存在于自然界中，迄今为止已经发现1000株左右。大多数脊椎动物体内均可分离到沙门氏菌，其主要寄生于人类和动物的肠道内。菌体大小为(0.6-0.9)×(1-3)μm，一般无芽孢，也无荚膜，多数有鞭毛，抗原结构和生化特性相对复杂。

沙门氏菌种类繁多，根据细菌表面的抗原所定义的抗原特性，已经描述了超过2500个肠道沙门氏菌血清型。由鸡白痢沙门氏菌造成的家禽感染是家禽养殖危害最大的细菌性疾病之一，能够引起家禽高发病率和死亡率。除此之外，肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等都是家禽易感的沙门氏菌。沙门氏菌极易在养殖场中进行水平传播和垂直传播，所以净化家禽特别是种禽养殖中的沙门氏菌病能极大地提高养殖效益。

沙门氏菌属中有人类致病菌、兽类致病菌以及人兽致病菌。感染沙门氏菌后，一般会出现胃肠炎症、发热、腹泻以及败血症等临床症状。当前，世界范围内的食物中毒问题中就有沙门氏菌引起的食物中毒。沙门氏菌可以不通过宿主以直接或间接的方式在动物之间、人与动物、人与人之间传播，而其主要的传播途径就是消化道。动物在感染了沙门氏菌后，繁殖力会受到影响，生长受阻，甚至会病状加重，死亡率升高。

由于抗生素的不合理使用，引起了细菌多重耐药性、药物残留、食品安全、环境菌群不平衡等问题，严重威胁人类及动物的健康。因此，寻找新型抗菌药物及治疗方案已成为当前的研究重点。

在畜牧养殖等方面，使用抗生素免疫造成免疫失败，兽药残留问题威胁着人类的身体健康。面对这样的挑战，噬菌体疗法已广泛应用于医学、畜牧兽医、食品卫生等各个领域中致病菌的防控。在农作物种植方面，研究者尝试将噬菌体用于马铃薯、柑橘，商业化的噬菌体制剂在农作物中大规模使用。在食品工业中，其表面细菌生物膜形成是食品工厂的主要问题之一，而形成生物膜的细菌对恶劣的环境条件、抗生素和消毒剂具有很高的抵抗力，噬菌体有着良好的治疗效果。

噬菌体具有特异性强、毒副作用小等特点，展现了良好的杀菌作用，同时具有良好的生物安全性，在防控细菌感染方面具有巨大的潜力。

特点优势：(1)特异性强。噬菌体具有独特的杀菌机制和高度的宿主专一性，是广谱抗生素无法比拟的优势，以致病菌为宿主筛选的噬菌体，不会对人及动物体内的其他正常菌群造成威胁。(2)相较于抗生素，噬菌体不易产生耐药性。噬菌体具有很强的降解生物被膜的能力，而生物被膜增强了细菌对抗生素的抗性，可使用噬菌体消除生物被膜来裂解多重耐药菌。(3)安全性高。噬菌体由核酸和蛋白质组成，降解为氨基酸和核酸，分布广且易分离筛选，与抗生素不同，噬菌体是人和动物正常的共生体，摄入噬菌体是一种自然过程。大多数研究表明噬菌体治疗细菌性感染有很强的安全性。(4)噬菌体个体微小且增殖能力强。一个噬菌体感染一个细菌后，可产生100个左右的子代噬菌体，渗透药物无法穿透的区域，通过一种“自动给药”的现象来确定剂量，避免在治疗部位重复使用噬菌体，单次给药就可达到理想效果。(5)噬菌体分布广泛。噬菌体存在自然界的各个角落，包括土壤、河流、污水，凡是有细菌的场所就有相应噬菌体的存在。在健康人体和动物体内(胃肠道、口腔等)的正常菌群中也广泛存在。(6)易筛选易获得。筛选纯化新噬菌体周期短，几周或几个月。通过人工培养细菌，扩增并过滤除菌，纯化制备高价噬菌体即可获得。综上，噬菌体作为抗菌剂具有特异性强、安全性强、不易产生耐药性等优势。

噬菌体治疗细菌性疾病具有很多优势。例如起效快、2-4h就能杀死病原菌，缓解症状，改善养殖动物的精神状态；对养殖动物安全，噬菌体特异性强，只能杀死相对应的病原菌，对动物肠道有益微生物不会有副作用，因此不会破坏肠道菌群，而抗生素在杀灭病原菌的同时，会导致微生态失衡，引起机会性感染甚至更严重的全身性感染；环境友好，噬菌体是宿主依赖性的，只有在宿主存在时才会发生作用，随着宿主的死亡而死亡，不会在体内残留；防止细菌耐药性，噬菌体作用机制与抗生素不同，治疗效果不受细菌耐药性的影响，基本没有副作用，长期以来，噬菌体在人体、动物、食品中的应用已经有了悠久历史，具有良好的治疗效果。

本发明在于相应国家全面禁抗的号令，解决细菌耐药性，抗生素滥用的问题，从禽粪便中分离纯化出一株裂性沙门氏菌噬菌体，为禽沙门氏菌的防治提供更多的可能性。

发明内容

本发明的目的在于提供一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体及其应用，旨在解决养殖场禽类因感染沙门氏菌，发病急而治疗不及时，且因致病菌耐药性而导致用药无效等问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体，透过电镜观察，该沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003头部为多面体立体对称，包裹着核酸，直径65-40nm，有一个长30nm的尾，颈部连着头部和尾部，为有尾病毒目短尾病毒科。经基因测序发现，不具有毒力基因和溶原基因，该噬菌体于2021年06月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.22494。

进一步地，该噬菌体具有较广谱的杀灭沙门氏菌的能力，同时对大肠杆菌也有一定的裂解能力。

进一步地，该噬菌体对引起鸡气囊炎、腹膜炎的大肠杆菌具有裂解能力。

本发明的第二个目的是提供该沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003在制备预防和或治疗大肠杆菌引起的疾病的药物中的用途。

本发明的第三个目的是提供沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003在制备预防和或治疗沙门氏菌引起的疾病的药物中的用途。

本发明的第四个目的是提供沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003在制备预防和或治疗沙门氏菌引起的疾病的饲料中的用途。

本发明的第五个目的是提供一种用于防治沙门氏菌的杀菌组合物，包括有效量的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003。

本发明的第六个目的是提供一种用于防治沙门氏菌的杀菌组合物，还包括用于抗沙门氏菌的抗生素。

本发明的第七个目的是提供一种预防和或治疗沙门氏菌引起的疾病的添加剂，其有效成分包括沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003。

本发明的第八个目的是提供一种清洁剂或消毒剂，其成分包括沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003。

本发明的有益效果体现在：

(1)本发明发现并分离了一株禽沙门氏菌，并以该沙门氏菌为宿主分离得到了噬菌体RDP-SA-21003，该噬菌体RDP-SA-21003对养殖环境中禽沙门氏菌具有强裂解效用，为工业化生产噬菌体用于养殖环境中禽沙门氏菌的防治提供了良好的噬菌体来源；

(2)在本发明中，噬菌体RDP-SA-21003经60℃处理60min，效价仅下降一个数量级，对温度有较好的耐受性；在pH6-9的条件下，37℃培养1h后，其效价仅下降1个数量级，效价仍保持在10¹¹pfu/mL以上，对酸碱也有较好的耐受性；在稀释10⁷倍，对病原菌仍有较好的裂解效果。

(3)本发明得到的噬菌体对宿主菌BS20078的裂解效率均在98.7％以上，单独使用时，对沙门氏菌的裂解能力相对较强，裂解谱较宽；而且噬菌体RDP-SA-21003对引起鸡气囊炎、腹膜炎的大肠杆菌具有裂解能力，此特性显示这株噬菌体具有很重要的研究价值，如全基因组测序统计分析，以研究相关裂解基因，对噬菌体裂解能力相关的分子改造具有重要的意义；

(4)本发明沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003可作为应用于环境消毒的各种产品的有效成分，例如包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、医疗设施、养殖业设施、公共及私人设施或其他环境表面进行消毒去污，可有效控制目标细菌的生长及活性。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等；所述含水性载体包括但不限于磷酸盐缓冲液、LB培养基、氯游离水等。

(6)本发明的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003(Salmonella pullorum phage RDP-SA-21003)，可以有效杀灭鸡肉表面的沙门氏菌并防治鸡肉在保存过程中沙门氏菌的污染，可作为食品防护的各种产品的有效成分。本发明包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与合成组分联合使用等形式对由沙门氏菌侵染所导致的食品腐坏进行预防，尤其适用于熟食或不宜灭菌的食品；所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于食品除菌剂、食品消毒剂、食品防腐剂等；本发明中合成组分包括但不限于苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙等。

(7)本发明的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003(Salmonella pullorum phage RDP-SA-21003)，可用于制备组合物，试剂，或试剂盒；可应用于沙门氏菌的快速检测，其包括但不限于以试纸、试剂盒等形式对目标样本中的沙门氏菌进行检测，或对临床样本中的目标致病菌进行筛选，可有效确保检测的灵敏度；

(8)本发明的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003可以单独或混合使用，用作为生物杀菌剂，饲料添加剂，或因沙门氏菌引起的细菌感染的治疗药物、保健品及医疗器械；沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003可应用于治疗或预防由沙门氏菌引起的感染性疾病；可被沙门氏菌感染的寄主包括人类、家畜(猪、牛、羊等)、家禽(鸡、鸭、鹅等)，以及各种兽类、鱼类、鼠类等；

(9)本发明的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003可以应用于工业生产，可由宿主菌特异性扩增，可应用标准病毒纯化方法高度纯化，具有极好的推广前景。本领域技术人员可以根据本发明的记载及本领域常识将本发明所述沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003或其组合物制备成应用于医疗，检测，消毒及食品防护等方面的各种产品加以工业应用。产品形式可包括但不限于以载体携带、浓缩注射或药剂浸泡等形式施用于被防治的寄主体表、口部、直肠、胸膜内部等部位；作为实施方案之一，所述载体携带形式包括但不限于口服含水性载体、口服无水性载体、乳膏制剂等；浓缩注射形式包括但不限于疫苗注射、胸膜腔注射、经脉注射等；药剂浸泡形式包括但不限于气雾剂、漂洗剂等。

附图说明

本发明上述的以及其它的特征、性质和优势将通过下面结合附图和实施例的描述而变的更加明显：

图1为本发明噬菌体RDP-SA-21003的电镜图；

图2为本发明噬菌体RDP-SA-21003的热稳定性试验示意图；

图3为本发明噬菌体RDP-SA-21003酸碱稳定性示意图；

图4为本发明噬菌体RDP-SA-21003的遗传稳定性试验示意图；

图5为本发明噬菌体RDP-SA-21003一步生长曲线示意图；

图6为本发明噬菌体RDP-SA-21003复溶稳定性试验示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明使用从青岛一养殖场病禽肝脏中分离得到的沙门氏菌BS20078，并通过实验确定了BS20078的致病性和耐药性，以BS-20078为宿主，从环境中分离得到一株沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003，并通过全基因组序列确定了RDP-SA-21003的基因型。

实施例1致病性沙门氏菌BS20078的分离及其鉴定

从发病养殖场采样，无菌操作取病禽肝脏，在选择性培养基(SS琼脂)上划线，37℃培养18-24h后，在培养基上形成圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑湿润的红色菌落，挑取典型菌落继续划线纯化3次，然后挑取单菌落接种于5mL LB肉汤中，37℃200rpm振荡培养8h，得到均匀浑浊的细菌悬浮液。再通过16sRNA分子鉴定和血清型鉴定，确定为致病性沙门氏菌，将其中一株命名为BS20078，保存于-80℃冰箱。

实施例2噬菌体RDP-SA-21003的分离及鉴定

粪便处理：从养殖场采取粪便，称取5g鸡粪便加入10mL无菌水中浸泡过夜，然后将过夜后的浸出液10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm滤器，将滤出液备用。

制备混合菌悬液：取0.2mL菌悬液和0.1mL滤出液加入5mL LB肉汤中，37℃，200rpm振荡培养过夜，然后10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm滤器，将滤出液备用。

噬菌体分离：采用双平板法进行噬菌体的分离，取混合菌悬液滤出液0.1mL和沙门氏菌菌悬液0.2mL混合均匀后，37℃水浴10min，然后铺双平板，放于37℃培养箱培养6-8h后，观察结果。如果有噬菌体，那么平板上有透明斑。挑取透明斑于1mL生理盐水中37℃水浴30min后，取0.1mL浸出液和0.2mL菌悬液37℃水浴10min，铺双平板，37℃培养箱培养4-6h纯化，照此步骤纯化3次，得到一种噬菌体，并将其命名为RDP-SA-21003。

RDP-SA-21003在双平板形成的噬菌斑直径在2mm-4mm。

将噬菌体增殖液与60％的甘油按照1：1的比例混合后，于液氮中保存。

实施例3噬菌体的形态观察

取20μL含噬菌体粗制颗粒的液体滴于铜网上，自然沉淀15min，并用滤纸从侧面吸去多余液体，加一滴2％的磷钨酸(PTA)于铜网上对噬菌体染色10min，然后用滤纸从侧面吸去染色液，待样品干燥后用电子显微镜观察噬菌体形态，如图1所示。

由图1可知，噬菌体RDP-SA-21003有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约60nm，有一个长约30nm的尾，颈部连着头部和尾部。根据国际病毒分类学组织病毒分类第九次报告，可将该噬菌体归类为有尾病毒目短尾病毒科。

实施例4噬菌体基因组测序

通过对单株噬菌体的富集培养后，在4℃条件下8000g离心15分钟，加入10％PEG8000和0.5M NaCl静置过夜，再加入等量氯仿混匀，静置分层后5000g下离心10min，去处氯仿层和PEG层后，加入限制性核酸内切酶消化处理，并采用梯度密度氯化铯条件下悬浮噬菌体，后期采用TM缓冲液透析3次，每次30min，一部分送华大基因生物测序公司进行全基因组测序。测序方法如下：

采用Illumina TruSeqTMNano DNA Sample Prep Kit方法构建文库；具体步骤为：

1)以1μg DNA起始量建库；

2)Covaris M220超声打断DNA到300-500bp；

3)补平3’端加A、连接index接头(TruSeqTMNano DNA Sample Prep Kit)；

4)文库富集，PCR扩增8个cycles；

5)2％琼脂糖胶回收目的条带(Certified Low Range Ultra Agarose)；

6)TBS380(Picogreen)定量，按数据比例混合上机；

7)cBot固相载体上进行桥式PCR扩增，生成clusters；

8)Illumina Hiseq测序平台，进行2×150bp测序。

该噬菌体基因组全长为39740bp，不具有毒力基因和溶原基因。

实施例5噬菌体热稳定性试验

将噬菌体原液分装到50毫升灭菌离心管中，分别在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃和90℃的条件下孵育30min和60min，然后用生理盐水10倍梯度稀释后，铺双平板测定其效价。结果如图2所示。

由图2可知，随温度的升高和时间的延长，噬菌体效价逐渐下降，在60℃条件下处理30min和60min，噬菌体效价仅下降1个数量级，仍维持在10¹⁰pfu/mL以上，说明该噬菌体具有较好的耐高温性能。

实施例6噬菌体pH稳定性的测定

用稀盐酸和稀NaOH溶液调节生理盐水的酸碱度，配成pH值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的缓冲液，再用配置好的缓冲溶液将噬菌体稀释成1*10¹²pfu/mL，将稀释液在37℃下，水浴1h，用生理盐水10倍比稀释后铺双平板测定效价。37℃倒置培养4-6h后统计结果。结果如图3所示。

由图3可知，在pH5-9的条件下，37℃培养1h后，其效价仅基本不变，效价仍保持在10¹¹pfu/mL以上，说明RDP-SA-21003有较好的耐酸碱性能。

实施例7：稳定性遗传实验

将RDP-SA-21003连续传代29次，每代培养基中加入等量的RDP-SA-21003和BS20078，每代培养时间6h，然后铺双平板，测定其效价；结果如图4所示。

由图4可知，将RDP-SA-21003连续传29代后，测定其效价，其效价稳定在10¹¹pfu/mL以上，说明该噬菌体具有较好的遗传稳定性，适合工业化生产。

实施例8噬菌体生长曲线的绘制

取对数生长期的沙门氏菌菌悬液，按照最佳感染复数的比例接种沙门氏菌BS20078和噬菌体RDP-SA-21003，在37℃的条件下，水浴10min，然后常温下12000r/min离心5min，弃上清液，除去未吸附在宿主上的游离噬菌体，如此用LB肉汤培养基洗涤两次。再将沉淀重悬于37℃的LB肉汤培养基中，迅速置于37℃200r/min的摇床中振荡培养并计时。定时取样测定其效价，以时间为横坐标，噬菌体效价对数值为纵坐标，绘制生长曲线，得出噬菌体的潜伏期、裂解期，并计算出平均裂解量。平均裂解量＝暴发末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度。结果如图5所示。

由图5可知，噬菌体感染宿主菌后的20min内效价没有明显变化，表明其潜伏期约20min，感染后30-90min内噬菌体的滴度明显上升，之后趋于稳定，表明噬菌体裂解期约为60min。通过计算，噬菌体裂解量约为245PFU/感染细胞，表明噬菌体RDP-SA-21003具有潜伏期短、裂解力强和高复制的特点。

实施例9RTD实验

在平板上划分区域，将一滴宿主菌(约100μL)滴加到区域中心处，晾干，将不同稀释度的一滴噬菌体液滴加到宿主菌的斑点上，晾干，37℃培养16-24h。根据宿主菌生长状况，凡是不能连片生长的，称为CL浓度(CL浓度是可以完全性裂解环境中宿主菌的浓度，可以用于指导生产实践的稀释方案)。结果发现RDP-SA-21003在稀释10⁷倍后对宿主菌仍有较好的裂解效果。

实施例10最佳感染复数的测定

按照感染复数为100、10、1、0.1、0.01的比例将噬菌体增殖液和宿主加入LB肉汤中，并且确保培养体系的总体积相同。于37℃200rpm振荡培养8h后，常温下12000r/min离心5min，取上清液铺双平板测定其效价。结果由表1所示。

表1最佳感染复数试验

由表1可知，当感染复数为0.1时，培养8h后，增殖液较为清澈，效价最高，说明RDP-SA-21003的最佳感染复数为0.1。

实施例11沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003对部分沙门氏菌及大肠杆菌的裂解谱实验

分别取沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003，大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20031、沙门氏菌噬菌体RDP-SA-20032原液，采用滴定法测定噬菌体裂解谱，分别取16株实验室分离到的沙门氏菌、大肠杆菌，制成菌悬液，并经过生化鉴定及血清学鉴定，确定血清型，备用。

取上述各沙门氏菌菌悬液200ul与半固体琼脂混合后倒入琼脂板中，冷却，凝固后，取10ul沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003滴于平板上，自然干燥后，37℃培养6-8h，观察结果。

取上述各大肠杆菌菌悬液200ul与半固体琼脂混合后倒入琼脂板中凝固后，分别取10ul沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003、大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20031、沙门氏菌噬菌体RDP-SA-20032滴于平板中不同位置，自然干燥后，37℃培养6-8h，观察结果。结果如表2所示。

表2裂解谱对比试验

注1：++为透亮+为一般透亮--为不裂解。

注2：其中作为对比的大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20031，沙门氏菌噬菌体RDP-SA-20032均已公开，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No.21406，CGMCC No.21994。

由表2可知，沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003对于沙门氏菌裂解率可达到75％，对于大肠杆菌的裂解率可达到50％，作为对比大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20031对于大肠杆菌的裂解率达到62.5％，而沙门氏菌噬菌体RDP-SA-20032对于大肠杆菌的裂解率为0％，说明沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003不但对沙门氏菌具有高裂解率，对于大肠杆菌也有很好的裂解作用且与大肠杆菌噬菌体RDP-EC-20031的裂解率接近，而沙门氏菌噬菌体RDP-SA-20032对大肠杆菌无裂解作用。

实施例12：噬菌体RDP-SA-21003对于鸡沙门氏菌及大肠杆菌的治疗效果

选取14日龄健康小鸡250只，设置沙门氏菌攻毒组和大肠杆菌攻毒组，各选取100只分别进行攻毒，攻毒成功后，各选取其中50只分别进行饲喂沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003连续饲喂3天，各组剩余50只分别作为阳性对照，未攻毒的50只作为阴性对照，每天观察死亡情况并记录。结果如表3所示。

表3

结果显示，经过饲喂沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003的两组死亡率较低，说明噬菌体RDP-SA-21003对于大肠杆菌病和沙门氏菌病均具有治疗作用。

实施例13噬菌体的工业化生产工艺

1.种子制备

(1)宿主种子制备：无菌环境下挑取单菌落接种于5mL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养4-6h，将培养后的宿主菌以5％的接种量接种于100mL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养4-6h，再以5％的接种量接种于1000mL的LB液体培养基，37℃，150rpm培养4-6h，培养好的宿主菌种子置于4℃冰箱备用。

(2)噬菌体种子制备:将保存的噬菌体种子适当稀释后，取200μL与200μL宿主菌置于上层培养基中，倒双层平板，37℃，培8-12h，选取噬菌斑呈现云雾状的平板，用5mL的LB液体培养基洗下上层培养基，然后12000rpm，10min离心，过0.22μm的滤膜，收集清液。

清液与宿主分别以2％的比例接种于5mL的LB培养基，37℃，200rpm培养4-8h(培养至增殖液变澄清或者出现絮状物为止)，将培养好的噬菌体和宿主各以2％的接种量同时接种于100mL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养4-8h，再将培养好的噬菌体和宿主各以2％的接种量同时接种于1000mL的LB液体培养基，37℃，200rpm培养4-8h，培养好的噬菌体种子置于4℃冰箱备用。

2.噬菌体增殖：

将制备好的宿主菌以3％的比例接种于种子发酵罐中，培养3-4h后，OD600值在0.7-0.9，将宿主菌通过移种管道接种于发酵罐，接种量为5％，宿主在种子罐中培养3-4h，OD在0.7-0.9时以5％的接种量接入噬菌体，培养6-8h，待溶氧反升，pH趋于稳定，结束增值。

注：发酵罐参数：种子罐200-300rpm，37℃，通气1:0.6-0.8vvm。发酵罐：120-150pm，37℃，通气1：0.6-0.8vvm。

培养基成分：酵母浸粉2.5％，甘油0.3％，氯化钠0.8％，磷酸二氢钾0.2％，磷酸氢二钾0.2％，氯化钙20ppm，氯化镁20ppm。

3.噬菌体后处理工艺

(1)离心：将增殖完成的噬菌体，用管式离心机离心，14000rpm，流速≤30L/H，去除未裂解的宿主和细菌碎片等。

(2)采用400nm的中空纤维膜进一步过滤除菌。

(3)采用100KD的卷式膜进行浓缩。

(4)过滤除菌：浓缩后的噬菌体采用三级过滤(聚丙烯0.45μm，双层聚丙烯0.2μm，聚醚砜0.22μm)除菌。

4、噬菌体低温喷雾干燥

将过滤除菌后的噬菌体液体(效价3.3*10¹¹pfu/ml)加入载体并搅拌均匀，载体：8％多空淀粉，2％聚乙烯吡咯烷酮，1％乳糖，0.5％改性壳聚糖，0.2％维生素C。然后进行温喷雾干燥，参数：进风口温度150℃，出风口温度75℃。

缓冲液溶解后，铺双平板，37℃培养，噬菌体效价可达到10¹¹pfu/g，且，由图6可以看出，噬菌体喷干粉复溶后4℃放置72小时效价仍稳定，表明该噬菌体可以耐受较高的温度，可以采用常规喷雾干燥塔进行生产，提高生产效率，降低生产成本。

应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较由代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，以本发明所明确公开的或根据文件的书面描述毫无异议的得到的，均应认为是本专利所要保护的范围。

序列表

<110> 瑞科盟（青岛）生物工程有限公司

<120> 一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39740

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

ttgatattaa agttccagcc tttagcttgg acctgacgat tgacacgatg caggatacgt 60

tgagcgttag agacgtcagc gtttccttcg tcaagctgta ggactgctgg ttcgccaata 120

gctgctaaca tatcgttgat ggcgtctaag tcatcgttag cattcagtgg aatgtattga 180

gccataagtc tcctctcact ttaagcaaaa aacccctcaa gcacccgaag gcacccaagg 240

ggtttcaatt agttgttgga ctcagccagt ttagcggccc tgttcgcagc acgagtacgc 300

gcagctttct gttgaggagt tagagtctcc tcttcaggtt cggccgctac tgtagcgacg 360

ttaggttggc taaaggtgct tacgccgctg ggctgaaaac cagtgcgcca gccgcttcag 420

gacgcagacc accgtgaccc atagcgtatt taccaacaat caggtcaccc tgagcatcga 480

cgtcacggtc acgttccagc gccaagtcac gcagcttcac agtacccaca gcagaacggt 540

gagagaacag acccacaacg ttgtccatag caactttaac gtcgccagta gcagttgccg 600

ggaatgcgtg tttctgaccg gaagcgatag agatgccatc agcaccacga gtctcaccag 660

cgccaccctg taccagatgc ggaacttcaa caacaacgaa gcccatcacg ttacggatgt 720

taccagtctc tgggtcaatc agcgcagcat agttagcagc gttcggcatc agagccgcga 780

ggattgcaga gtagttgtcc ggcgtggtgt agaagtaacg gtcgccagca ggaacgtagt 840

tggaggtcag cttcgcacga gcaatggtca gttgaccaat gattgcttca cccagtttag 900

caggggtatc gaggtcagct ttcttaccaa cttccagtac ggacgcagta cccagaccag 960

cgatgttctc gttggatgca gccgggaggt tacacaggat agccatttca gccagaaccg 1020

caccatcagc agcgatagcc agagcttcac ccaactggtt ggagtattcg cctgccacgt 1080

catagtggtt catcgcatct tcaatgtcga aaatcatcac atcggcagtc agcagaccgt 1140

caatggtaat cactttctcg gtatgtttga tacctttacg cttatcggac agtcgctcac 1200

ccggagccag atacacacca gaggtgcgac ccatgaccgg gaactgagca gacttaccgt 1260

tctgaattgt tcggacaata tgcttgtcag cagttacaga gcggcgagtg aatgcggtca 1320

ggacttcacc agcaaagacc ttcaggaaca acgctagagc gtcggaactg gatttgcctt 1380

taccttggtc tgtaccaatt ttctgacccg gaacgtttgc catatgataa ttctcctatt 1440

caattgaaag ataaagttta ttacttactg tatgcccaat ccgtatggac tgaagtaatg 1500

gggaaacctt tgagtctttc tcttggtctc cctatagtga tagtttagtc ctacaggctt 1560

gaggcagcta ccttagcgcg aacttccatc gtgtacttag cgtcacgcag gtatcgcggg 1620

tcactcatag ccttaatcat gtcagccttg gagctgaatg cttcggtctg aggagcctta 1680

ggtgcgacca caggtttagc ctgagtggtt atggtacgct ggggtttaac acccacagct 1740

ttacaaagag tcttgccagc cagattcagc agagccttgg tagtcgcaat gtccttacga 1800

acgatagcag cttccagtgc ctcacgagtt gacgggtcgt tggactcaag gtgtgacagg 1860

atgcgattaa actgttccgc accaccagca tagcgaacca caccagcagc atactgttca 1920

gccagagctt cctgcccacg tacaaacgaa tctacgaaac gcttggtgta acctgcttcc 1980

tgcaacttag cgtaggatgc gtcagacagc ttacagtcct tggcgtattc agccttgata 2040

gcggtaattt catcagcagt gaccttgcct gcttctacag cagaagacac catgtcatcg 2100

aatgcagctt cgttttcatc cagagcggtg acactttcgg tcagctcttt cggtgcatca 2160

cccagttcga tgaactcagg ctgctcacca tctgtctcag actcttcgtc atctgactcg 2220

tggtcttctt caccttcagt ctcttcgacg ttctcgtctt cttcggtcgc ctcctcgttt 2280

tcggcttcca gttgattgaa ggtaatagca tcatcgccat cacgaacagc tacgtcctgt 2340

tcaagcatag acttctggtg ttcgttcagg tcctcaacgg aaccagtgat tgcattagag 2400

ctaacgccga actcggcata aactgattga gacattgagt cattctcctt taagtcgtta 2460

ataggtaaac acctacttgc agtgtgggac taacggctac catatggtcg gcttagtcgc 2520

tcttactttc ggtgttccta tagtgatagt ttaggcttga gccatgtcct cgccagctcc 2580

ctgacctaca gcagcaccca tgttagcacc agcagcagac gcaccgttga ccacagctcc 2640

ttgagcggat tgttcagcaa tacgttgcat cttctcgtcc tgagtaagca gaagaccagc 2700

agtgtcaatg cctaaggcat tcagcagtcg cagcttaagg gtcggcaagt tgatgtcagg 2760

gtcctgagag agctgctgaa gaccagtcat catgttaacc gcctgagtta gcttctccaa 2820

gtcctgacca cgacctaacg cttccagacc agtggagaca gtaggctcta ccgcttcttt 2880

cggaaggtca ggaatcattc cagcagactg aagttggttc atcagcacac ggacgatagg 2940

taactgaagc tcttgtgact gcactgagta cacgccacct aaggtcgcct ccagttcgcc 3000

agcaacataa cgaatctctt cagcagtgac tcgctcggca ttacgctgaa cagcgctatt 3060

aagaaggaag gcccagccta aacgttgctc gatagcgtca gccaccgact tggcaatcgt 3120

aaagtcctga cctttcgtca gttgcaggaa gttgatgtcc tcgacgcgac cagccacgaa 3180

ctcacctgta gccgccttgt tcagacgacg aggttgcgtg ataccgttcg ggttaacgag 3240

gcccaccacc ttggaggcta ccttagccat tttggtgata gcttctgtaa tcgtctccag 3300

cgagttcagg tctcccagat actcctcgca ataagaacga ccatagtctt caccgtccag 3360

tcgaaccatt cgtaccggga tgtatggaca tgcagtcagt gggtaggaac catcggtccc 3420

tgctacctca atgccttcca cttcctcgta gcgcagatac tcgtcgtcct gacggtagat 3480

gtgcgtatac acttccagct cggtgtcagg ctcatagtcg tctgcgttga gttgggactt 3540

aacgtcttcc ggtagagcac taaacgctac cttgtcgaga gtcacaatct gcaagatgtt 3600

accgaaagca tcacgttgaa caacgtagga cactaagcgg tacattcgca taggactgta 3660

agtaccctgt tcaggctctg gaatgtagag cagacagtta cctgagacga taagctgctt 3720

cagggcctcg aacaatggga cacggaaact gttagtctcc atgtaggcca tcaacacacg 3780

ctcgaccata gccagccctt cgtcaacacg ggcagccgcc tctgagtcct gactcaaggt 3840

cttggcctca tattctgaga ctgttagtcg catccacggt gactgaggaa ataatgccaa 3900

catcagcttt gcagccaagt tgttcaaaca gcgagcaccc acagcttgcc acggcgtcac 3960

gtattccgta gatgagttgt cggactcctt aggaaatagc gatgggatgg tcacggcagc 4020

gcagttctgt gcgcgggtct cgtaaggctg tcgtccgttc ttcaatctat cataaactga 4080

cttcgcgcct tcagcagcaa atccttcacg ttcagccatc tacgtgcctc catgttttac 4140

cttggcgaac acgcaaaact gtagacttgc taacgcctag ctcacgagcc agtgttgtac 4200

aacctacggt tgacttgcgg atttctcgaa caaggtcttc tgttaaaacc gataaccctt 4260

ggtcttcacc tctagccatt ttggttttat tgatgcgacc acgctttgag gcgtcctgca 4320

tgttatcacg ctgagttcct aactctaagt ggtttacgtt gaaacacgct ggattatcac 4380

acttatgacg gacgagcatt ccgtctggta ttggcccatg cgcatcggcg taagcgagtc 4440

ggtgcatata cactaactta ccgtctatac gcttctgccc atatcctgct gaggatttgg 4500

cccacttcca ctcgatgcac ccggtcaaat agagatgccc ccaccagagg tacgagagac 4560

ctgaaggcta cgcttaccgg aacgcttaac tttcttctcg tcagatgcag tcacttcggt 4620

atccacatct tcaattttgt cgttcggtac ttccactggt gctgccggtg ctgcaggcgc 4680

tggggtctga gcctcaacaa ccttaggtgc atcgttagct ccaagaccaa ctgtccctaa 4740

cgcacctttt actactttct tgaaagcctt actgattgat ttacccacga ttaatctcct 4800

tgttcgtgct aacgcacttg gttgttacga tgtctaccga cccagaaaca tgcttgacac 4860

gagaatacca gccaagaccc caacgcttgc actcttcgtc tatgatgtgt ctgacagtct 4920

caagaacctt gcgggaggac tgcgagtcac gacgaatagc gacgattgaa aggtcaagac 4980

cgggagtcgg tcggtgccaa gatgcggtag ccagcatgta gagatacgct actggttgac 5040

ctgagacatc gtagattgtg tactcttcac cgtcgaactc gtcagccata cggtaagtat 5100

gagccttgaa gtcctcgaat gacttgaagt tagactgccc gtcttcccag aggcgacaag 5160

cgcacatgtg gcgaccttcg tgtgagttga gatatggtag cattgtctta ccccatgttg 5220

acgccagagg ctcgcatagc gcggctaact gacgatttat ctttaggtgc agactccttc 5280

ttgaccttca ggtctttgat acctttggtc tcgttggtgt ccacatcaga ttcagccccg 5340

atgtcaactg acgcaacttc ctcactcaga ggcgctggtt caggtgctcg ttcaagtgct 5400

tggaccgaag gcttcggagt gctaatcttt ggactgaaac acatagtccc tcctacagtt 5460

aatcgaactg aacggtatct ttcagctcac gacgcgtagc aaccgcagag tcgagagtgt 5520

cagagcaata ctggagaccc ttgatgaacc cggcaatgaa cgcatcgctg tagccctgct 5580

gcttgaggag actgatagcg cccatcttct cagcgtagct tgcgttgaac aatacgtgca 5640

ggaactggat ggcagactgg gagatgttag ggacatcgag tctttcttcc tgtaactgct 5700

taacaacgtt ttcaatagca ttaatagcca tcttgaatct cctctttaag ttaagactaa 5760

agtctatctt atagtcatat cttaggtcct aaagtcccta tagtgatagt ttagtgtttc 5820

acctatggat gactgttggg ttgataggat atgactatcg gttagactca gtgtttagga 5880

cggttgttcg acccgaacca cttgtacatg cagtaaaggg ccagaagtcc ggcccagtaa 5940

attacatgga tggtgtccac aggatgacct ccttggactt agggtcatag tcagaggctc 6000

gacaaatacg agcgacctga gcttggacca gaagttcctc ctcggtcatc ccagctttag 6060

cagccagagt caccatgcag tcccacaacg tcatgtcttc acgcttcgga tacttcttcc 6120

attcggtctt aatctggcct ttgttcttgc cagtcttaag ctcacggctc tcctgcacga 6180

agtagtacgg ctcgtcaagg aacgcacgag tggtgtcctc acccattccc ggaatgccac 6240

cgtagccatc tgtagtatca cccttgatgg tctgctccat gtgccagtag tctgcctcgg 6300

cagtcgtatg actcagaatt tcaccagtgg ttaaccagaa gaactcacag ttcgggatgg 6360

tcttgaagtc cttatcacag gacaccagca ccgcatgatc acatccgaca atctgaggtc 6420

gggtccctat gatacccata cagtcatcac cctcaagcgt aggacgcagg aagctgttga 6480

accgtgggtc agccatcact tcggctacga acttcttgta acctacaggc ttgcgagaac 6540

ctttacggtt ggccttatag gtaggcagga cgtccttacg ccagttgtaa tcgtcagtga 6600

agcacatcac aatcttagcg tctttccacg ccttgcgctt cttaacgatt tcagagatgg 6660

tgttctcaag gatacgacga gccttggcat ggtcgcagat aagggtataa atatcatcac 6720

cccaatctgt ctcgtcctca gcagcagcca tagatgaaaa cactaagtag tcaccatcta 6780

acacaagagc tattttcttt tcgctcacag gcagcctccg tgttggttca ggaactttgt 6840

gccagaagcg gtaatctccc acgcaccgtt gttgcgccca tccatagaca ggcagcttag 6900

atgtccacga ctcgcagcct cagccacaag tgcagcgttg ttgcgcacat agtttgactg 6960

gaaggtcttc gggcaggact taagggccgc taggacccgt aagtattcac tcattgcttg 7020

aaccccactc gtatacgttt agtaatatcc atcaatgaca ctctttccac gttggtccaa 7080

tcttaccttc ggtatcaagg acacatttaa agttatagaa ctcacccacc ttacgcatag 7140

caagctgagc aatcttgacg acttcttcgg caatctcctg agtacgacat gcaatctgca 7200

attcgtcgtg cacccatgcc atgtacgcga agtctccttc ccagccgtgt acatacccgg 7260

cctcttcaag catacgttca gtctcaacaa tccagtgttt acagaccact gcaccatcac 7320

cttgtagtaa ggcgttaagt gctgagtgcg gtgaccggat gtgaatgcgg cgaccgtcca 7380

gacctttcaa ccatcgacgt ttccacttca cgatgttctc accatctacc cacttagagt 7440

ctgagattaa cgtattactc acagcttccc tgaggtcctt gatggctggt gtaccctcaa 7500

tgaatttctt catgagagct gaaccttcct tcttaccacc gccgactatc agtccaatct 7560

tagctgcccc tgcaccatac aggaacgcat agatgaacgt cttagagttg ttacggaaag 7620

cctcatggtc gtggttagac ttatcgcgtg ggacgttagg tgctaaccca gcgtttactg 7680

cgttggccca gtggatgtca ccttcgacca cagtctgcgc ataggcacca ccatcaaacg 7740

gagcagctcg gttccccaga cagcgaagct caagaccaga agcatctaca cccacttgaa 7800

tccaagggtc tggcttaccg tccttcttgt tccacgctgc accgaaagca ccacggcagg 7860

tctcaccata tggagcaccg ttagccggga cttgagccat gtttggtgaa ctatgggtcg 7920

cacgtccggt tactgccccg catgggttga ttgaaccgtg catacgtccg tctggaccta 7980

caagtttcaa ccatgcgttc ttaccttcag ccgcctgacc gatgcgcttc tggactacca 8040

gatactcacg gaccagctct acgcaagcct gagcctctgc gtctggtaac ttaacgtgtt 8100

ctaacgtctc gtcatcgact acaggtttcc ctgtgtcagt gaagtccaca ggctcccagc 8160

cacgctccat cagaactttc gctaagtggt ctccgcttcc aggattaaac tcaacgtaag 8220

tgattggcgt gaatggtgct ccttccatcg tgtctcgtga gtcgaactcg caaggcttca 8280

gacctaagcg ttgagctttg ttcttcggct tcttgaatac tgacccgacc ttaggataca 8340

cgactctcgg atacttcgga aggtcctttc ctgtccgtgg atgcttgaag aactccttgc 8400

ctccttttgg tgcgtaccag ctaccgaaag tcgaacgcag cttgtccaga agctctgcac 8460

gtttgacggt gagttcacga tataagcctt cgaccatctc ggtgttcatc ggatagccat 8520

tacgttcaat cttcgcacag gtccacgcag catcatgttc cagacgcaac gcataaatct 8580

ggtcgaaagc gaactgttca gactggaagt aatacttgtc agtcaggaac ttcttgaaca 8640

acgccagtgt gaccacaacg tcttgaacgt tatagtcaag catctcctga gacgggaaca 8700

accattcgtc cccagcctta tattcgatac cttcagcctt gcacttggca acgtaatcgt 8760

gtttgtactc acctttcatc tcaccgagac gataacccca agcctcaaga gactgacgac 8820

ccatcatatt aggcggcaga cgaccagctt tcaccgcgct catgtctgag aacttaatgt 8880

ttggatacat caagcgacca agtaccaagg tatcaataat tcgaccctta ttcacattta 8940

ggttcttacc aaagtatttc ttcttcagta ttttcaaggc tggtatatca tagttcacac 9000

cattgtgcag aaccagcata ccgtcagtgg atgccataat agattctatg cggtctatgt 9060

actctttgaa tccacctgtc agcccagtca taggggcaac accatatttc tcagtagcct 9120

gagttccagc gttaatgata acaccacaat ggaactgtga cacagtgtct agtagaccgt 9180

cagtctctat atctgtgcca tagaatgagt tgagattaaa cattatattt ctccaagtac 9240

gttatagcag ccctaagcac ggctaccttg tcaccgaact taccaagtgc gctattacat 9300

gtaccacata gcaatcccct aacaatacct gagtcatggc aatggtcaac gtgggctaca 9360

ttattcttac tctcaataga cccatgcttg aagataatgt ctgagcatat agcgcatctg 9420

cccttttgac tatcgaacat agtgtcatat tcctcaagtg tgagaccata ggctttctta 9480

agccaagact tacgggcaga taggcgatgc gcctcaccgg cctctgtacc tttgtttcga 9540

tgatatcgcg acctattatc ctcacgaaca caagatatgc accacccatt tgtcttcctg 9600

aactcagtgg actcctttgt agagccacat ctactgcaag tcctcatatt gcttctcctt 9660

tagttataag tctaatcata aaggccactc gctgtgaatg accttgagtc tagacctaga 9720

agtctgtacg caagaagtgg tacataaact tccggttagc tttcttccat gccttagagt 9780

cgaacctttg gtctcccaga atgttagaca ggcaggttgc ttcatcgctc caccatttgt 9840

acatgaaccg atggtagcga gctttaagtt ttcttagcaa tgtactcctc cttagaagtc 9900

ggtatcttcc cacgagccgc tatcctcttc tccgctgctg ccagtgaagc taattggttc 9960

aagccacccg gtcgtcttgt tgtattcgag gtatcctgcc actccagtgt cacccgtaaa 10020

acgacacttg agcagacgaa gttgaacaat attaggagta tcaccttgct ggtttcgctc 10080

aagggcaata atagtatcag acagttgacg gagagcacca gaaccacgta ggtcagtgat 10140

tgaaacaggt cgtccttctt catgcgattt acctttctcc gggttcttca ggtggcatat 10200

gaccacgaca accacaccct tcgtcttcgc aaacttcttg agacgagtca tgatgcggtc 10260

aatggtctta cgttcatctg agttatcttc catgccagac acaacgattg agatgtggtc 10320

cagcagtatg acgtcacagt cgagaccgtc caccatgtat gctaacttag cgaacaaggt 10380

gtcttcctct gactctgcga atgaatcgta caggtggaac ttatcgtctc cgaacagctt 10440

gtcataccat tcgtcaaacc gtccatcctc taatatggct tgcttcagtt ccttgctctg 10500

tcgtagacgg acgttattgt ccagacccat aaggtcctga actgtttcct ctacagcctc 10560

ttcaagcata gccataccca cacgcttacc tcctctgccc cactctaaga ggagctgacg 10620

gacgaaggta gacttaccca tgcctgaccc tgaagtcacc atgataagct caccagctcg 10680

cgcacctaat gtcatcgcgt tgagtgttgt gcatgacgag aacatgagac cttcagtctc 10740

tgccttaagc attgcctccc gtgtgcggtc cttcagactt gccgctgata ccacaccagc 10800

cggtacgaaa ggtttagcgt tccagatagc atcggtgatg gccttgaagt ccttcgcctg 10860

aagtgcagcg ttggcgtctt tgtacccgtt gatgaacgca accttaaccc gacctgctgg 10920

taagactggt gctgcatcct caatggcctg acgacccggt tcatccatgt cgaacatcaa 10980

gattatctct tcgaactggt cgagatactc aaggttcgca gccatagctt tcttcgcaga 11040

cttggagcct aacggaagcg agaccacagg atacttaccg tcctgcacct gagccacaga 11100

cagagcgtct atctcaccct cggtgatgac tatcttctta ccaccgttcc agagctgaga 11160

gccaaacagc atgtcagact tgacgctacc gatagccgtg aagttcttct cagcgtctcg 11220

gactttctgc cctaccttgg tcccggacct gtcgtaataa tccgccacct gaaccatctt 11280

gccacccatg ttacccaccc agtagctgta cttcttgcat atctccatgc ttagactacg 11340

ggctggtagt gggacatatc gtccagcgtt ctcaccgaac gttaacagat tgctcacttg 11400

ctttctacct cctgagggtg tgtatccctc ggtcaactcc atgtctcctt tcttccatgc 11460

gactgaaggg tcacatgcaa aacaaaattg atggccgtct gagtaaacac cattggcatc 11520

cgaggaccca cagtctggac actgggtgtg atacagaaat acactctcgt cgccttggtc 11580

atcgtatgac attggtcact ccttaatcac aaatgcgaac aaagggacag gactaattgt 11640

cccaccccta aggtgatagt ttaggctttg aagaactgag ccagctggtc agctttggtg 11700

tcagcttgac gagccttcat gccagcttcc agtgacgcga tggtcagctt gtcagccaga 11760

gcagcagcat cagccgcacc atcagcagtc ttcttttcta cctttcgttc cataaccgca 11820

tcacgacgat aaccacgcac caccagacga ccaagaaatt cgataagttt aatcactgag 11880

ttgttctcct ttggaattta ttaaccgtgg tcggaagtga ccagttcgtt ggtagtcaac 11940

cagcgttgca agtcgaaact tggacacgcc ttcggtgcta tgtcatggtg tgctttgatt 12000

tctgcctgag gatacaggac cttcaggtca tccagcttgt tgcgaaggga gttcatctgg 12060

gctggagtga agttagcttc aaactgaccc ttagcgttga ccccacctac aaggcagacg 12120

cctacggacc gtgagttcca atccttaacg tgtgacccta cgacattgac cggtcgaccc 12180

tcttccacag tgccatcacg cttgatgata aagtggtagc caattgccag ccagccctgt 12240

tgtttatgcc acatctcaat ggtctcacga ccaatgtcca tagtcggcgg tgtcgctgaa 12300

cagtggacga agattgcgtc tgtagcttga cgtggtttga attgtacctt actccccatc 12360

gtacaccacc agctctacag ctactaggtt cagatgtcgt tggaaacggt tagcatccgt 12420

ggtgtgcatc tggagcaact tatggttgaa gacgtgagag ttgctaatct tcacgtacac 12480

ttcgtcaggc ttaccgtgga cgatgaacgt ctgacctaca ccaatcttgt tgatggtcag 12540

gacttcacgt ttaacggtaa caggtgggac gcttgaggct ggcaggactt gaggtttatc 12600

ctctaagatt tcctcaagat attcatttaa aacccatgcc ccccacattc cgtcaggctg 12660

agtgttataa cctttcgctc cgtgcttgaa gagtccacgc tcggaggatt ccaccagagt 12720

catttctaac cccggatgcg ggtctttctt acattttgta acgatagtgc ctgcaggcca 12780

ccctgcgcgc atagccttaa gtctatattt ctgagtcatc acttaactcc tttcttcttg 12840

ggaatgagta taccagaagg cagacgtaca gtcgcctctc tcagccactc aaccgggatg 12900

aacttatcgg catacttata gccgttcttt tcgcaccatg cgccatacgt ggtcggagac 12960

cctttgtata acttggagcg ggaactggag aacacgaacc gaatgtctaa ctctgggtgc 13020

tgttctcgta ccagaaggtg cttcttacgg tcatcactat cgaagatacc tttggtctcc 13080

acgatgatac cgttaggaag gataaaatct ggtgtgtact tgtggtcgga agccggaatc 13140

acatagttga tataatggct ttcgtactcc gctttgacgc cgttctgttc cagccactgc 13200

tggtttttgg cttcaagtcc agagcggtag gcacccacag agtgcccccg ttttgcagac 13260

cattgggcca ttagaagtcg taatcgccac cagagttaga gtcgtcacca ccttcggaac 13320

catcgtcacc aaagtcatca gactcgaagt caccatcggt tgacgctttg tagccagtac 13380

cgaggtcttc atcatcaccc cagccaccat ctccaccagc gccatcacct ttccattcct 13440

tcagttctac cagaaggcag gactcaagct ggagcttaat gcttgcacca gtcgcagcgt 13500

tccacttgaa cggcaggact ttaaacttga ccttcagctt tgagccagcg ccaatattcg 13560

ggacgtcacg gattaactta gcatcggtgt cgtagaaccg taatacaata ggctctgact 13620

taccatcctt caggtaagac gcgaagcatt taaacttcag ggtaacagta ccatcaccat 13680

tctcaatcca cggcatgtcg ccttctcgtg gttcaatagg cttcttgcca cgctgaacct 13740

gaggtgggtt cttctcgtgg tctgcgagtg ctttcgcata cgagtcatcg tgaatcttct 13800

gtaagacatc aatcatctta cggaccttcg ggttgctcag gtcgaatgtc aggttaacct 13860

tatgctcacc acgctcattg aacttggtgt ctgctttgtt cagccatgcg taaggctcaa 13920

cgataccagc tacaggagtg gtgaaagttt tcagttgctc tttagccatc ggtgtaaatc 13980

tcctaattta aagttacgaa ctggacgtct gtcctacagt gatagtttag gtctcaggac 14040

ggattagtcc gaccacaaac ccagcgtact catactcttg ggacttcagg gtggcctctt 14100

caagagactt tgcgtacacc ggaacctcga aggactgaac gcgcccctca agctccacga 14160

tgtatttctt ctctacgtca gtcatagacc acgctccttc cataagttgt agagctgaag 14220

gtaatctacg ttacctgtct cttcaaattt acgctcgcac cactcactcg gagtcataac 14280

acttagtcta ctcatctgtg cactcctcgt caccaattcc catgagcact gttaggcgct 14340

tgtgagattt gcctgttact atacgaccta cctgcgccct gctcaggcca tatcgtcctg 14400

ccagttggta ctgtgagtaa tccccagatg catactctgc aatcatttgg gaaactactt 14460

cgtcaggtaa tgtgccgtaa ttgtcataca ctccatgtaa gtgctgcatc tccatgttgc 14520

aatcactggg tccgtacatt aagttgacta ggcgattatc tttcttatct ccgttaagat 14580

ggagaatctg catacctagc ggacgttgtt ttctgaatgc agttaacact gcctcatgag 14640

catacatacc gctaaacacc ccgtccctgt aacgcgccag tatattgtag cccctcccac 14700

cattagacca cttaactggc ttgtggttgt cacttctacg taggtttcca aaggaggata 14760

cttcgtagcg gtcatctgta ggaaacacag cccaagtctc ccgcaactta ggtgccatct 14820

cttccagctt atttaaatac cactgtgcct tcttaaggtc ttgtagtgaa gttcctttgt 14880

gattacttcg ccacaaatac ttaagcacat tccctttaag aaacccctcc atctcctccg 14940

gagaaagctg ggcctctagt gactctatgc attctaagtg cgaggaagta tagtgtgatg 15000

ggtggtttac catatcagcc attgaccgcc tccttcacga actcaacgaa cagacgaacg 15060

cgaggccatt tagtgtagac cacaggtacg ttggttgcac gcttctggcg agcctcttca 15120

gcttttccag gagtaatcag ggcgaagact gtaggtgaca gcttaacggc cttccctaag 15180

tagcccagct tctcgttgcg cttaatgcaa gcgaacgggt tgttggacag gtggaaggta 15240

ctggtataac gattgaacat taagttctta aacatgtcgg cctccttagg tcgaatttat 15300

ggttgtccta tagtgatagc ttagggtcag gattgtggcc cagacgatag cttgctagca 15360

taaagcaaag aaacccagca gtccgaagac cactgggttg acgtttagtt aaatcttaac 15420

ggttgggttg tcttcggttc cacgccagca cttgaagtta gggtgacgaa gggagccatc 15480

agggaaccgc tccatgaaga gaacttcaca ttgccaccct tcatacggac ttactacatg 15540

ctgttgaact gtactatcta tgtatgattc cgagctatcg atgtcgagca tctggtcctt 15600

gcagttttca aagaccttag ctgtgaactc gtccttctgt tcttcagtca gaccacaggc 15660

attcaccacc atgccatcct caagtagaac ctcgaagccg acgaccttac cttcgttcgc 15720

cttacccgga gtcccccaca ctaggccgca cacggtcccg tcgatggtct cctcaggctt 15780

cattttccac atgcctgact tcttgccacg cttgtattta ccaagcgggt ccttgactac 15840

cagaccctca tgtccttcca gacgcttctg ttcgtacagg gagttgagtg actcaaggtc 15900

atagaccgtt tgtgactcag acagaaccca gtcgatttcc gggaagtatt tctggagtag 15960

agggacgata gcttctgcct tcaggcgagt gacgctatgg ataggacctt cggctttcgg 16020

gtctgctatg gttgtcatat caacaacacc atataccaca acctgaagtc gtgaccgttc 16080

gacccagaac gggaccttct tgccacggcc cggataacat tcagcgaact cctcgttgct 16140

aggcttcagc cacttcgttc ggatgagacc ggaagacgtg ttgaagtcta caccttttac 16200

catcacctcg ccgtcaatca tcaggcccac tccttcgtag ccagcttgac gcaggaacca 16260

gctccaggca tcttgggtcc acgcattacc taactcagag ttcatccact caagtgctgg 16320

aagtggttta gactcacggc ttaaccaata agtctccccc tctcgcagca ccagaaggtt 16380

caaccgtaca ccatcgtact tcacttcagc ttcaagcgac ccggctgctt ccagtgcctt 16440

cttaatgcca gactcagagt aatctacagc gcggtgtggg ttagttttaa tagttgtcat 16500

tttgttatct ccatgtgtcg agttggttag cgagacagtt aaggaatcct gttgcagtgt 16560

tgtacagtac gttttcatcg cggtgtgcga aggtcttaag cgcgaagatg ttaccagcgc 16620

tgtcctcgac ttgaagtctc atgcactctt tccgtagatg cgcctcgtac caatcccgct 16680

gtatcacgca gaagtctaac tgatagagtc ggttacacgc tgctttgaaa gcgtttaggt 16740

tgccactgta aagtcggccc atagcgttat cctcctttca acctatagaa atgtgtctcg 16800

cttattccga acagttcttt tgcctcctta tacttgaggc ccaccatcat agcctcagca 16860

tacttcctct caggtctgta ctgtctacca cgttcgacct tatcgttcat attatcttgt 16920

ggtgtaccca acaataaatg tgaaggatta caacaaagtc tgttgtcgca agtatgcctt 16980

accaataagc ctttaggtat aggcccgtag gtgtccatgt aggcgaatct atgagaccct 17040

attggtcttc cgtttatcgt aaactgcccg tatccattag taaatcttga ggcagtccat 17100

tcccaacatt ctccagactt gtccacttta ttccagaatc tatcactgac agaaatgacg 17160

cttctcactg cgatccctcc ttactttatt caacttgcga cctttagttg cctcggagtc 17220

atgagcgtta cggcccttcg gaatgtaacc ttcagtcttc tgacgttcac ggatgcgctc 17280

gaagttgata gtgttctgat acatgtggtt aaatctccag tagtttacgt tagtagtaat 17340

ggttaatcat ggaggccacg actttgagtc atgaccttta gtctaatcct atagtgatag 17400

tttaggttaa cctcttctgc gttggattaa agtgaatact gcgagtgctc caagccacag 17460

ggccagtaac tgtaggtctg tcatttggtt gccgcctctt taagtacttg ctcgtgcgtc 17520

tgctccacct tcttaaccag ccacttgaac gggacgttaa gctgttttga catcttggta 17580

gggatgaccg tggtcttcac cagacccttg ccgttatgtt ctgttacggt cacgatttga 17640

gtcccaccat taacgccagt ctgcttgtgt gcaaatttca taactctctc tcctgttaag 17700

cgaatgcaaa gtctgaagac aagatgtctt cgatattcag tttacctttc ttcggaagct 17760

caggcaactt gtcgcgctgg ctctcgtgaa gctggtattc aaactgctcg tagaagtcaa 17820

gcagcacatc gttgtcgcgg taggtctcga ccatcgtctc acggacgcca cggaacagat 17880

actcagcgtc agccgggatg gtcccgaagc tatcgtgaat cactgcgaat gacatcacgc 17940

catacttgcg gtgcgtgtgg actacagtct tgcggaggtg gctaccatct tgtgagtgga 18000

cgaagttcgg gctaatgcct gactcctgct tgtgcttgtc cagctctttc ttcgtgcctt 18060

tgttgaccgt aggctgaagg ttgaatgacc ctaagaacat caggttcaga cgagtggtat 18120

ccttcttgcg gtattcctgc cagaccggga aaccatcagg tgtgacccag tgtaccggaa 18180

ggcacggctt caggatttcg ccagtcttct tgtccttcac ttcagcagcc agcagcttgg 18240

cagcaccttg aagccacttc atagcgtcaa ccgcagcaac tacggtcaca ctcacagctt 18300

cccaaatcat cttagccatg aagcgagacg cttggcttgg ttcagtgaac atagcgccgg 18360

accctgagtc aatcgctggc atcactatgt cctcgtaaac ttggtctgcg aagccatact 18420

ctttcgaccc gtaggccaga gtcatgaccg aacgcttagt gaccttgcgt gacataccat 18480

aggtcagcca ctgacgggcc agctctcgtg tccccagctt gagacgctcg gtaatctcac 18540

cagttttctt gtcctcgtga gttaccatct cgttgtccgt accgttaaca agcaggtctt 18600

taagcacctc ctcgatgcgg tcagacacta tgcggtatat gtcttggacc ttaccggatg 18660

gtgtcaggtt tactgcatgt ccaccgatgt ggtcacgaag catcgcgctg aagtgctgaa 18720

tcccagagca ggacccatcg aacgctatcg gcagcgagca ggagtaagac aagccatggt 18780

gcattacgcc agcatactcg aagcagaacg ctaggaagca gaacggagag tctaacttac 18840

cccaccactc aatactatcc atcggtgcct tagcagtagc cataatgttg acgtggttgt 18900

cttccaccca cttgatgcgc tcctcgaagg tgactttatc gacacccgcg cagtttgcac 18960

cgtgtacctt tagccatttg aaaccatcag caccaatagg cttgcctact gccagagtca 19020

ggagaccctt ctgcatgtcg ttaccctgag ggttgaacat cgggacagcg tacacgcgac 19080

cgcgccagtc catgttgtac gggaaccaga tggccttgaa ctgagagaac ttgttcgctt 19140

ggttaacgat aaagctcagt gacaacctgc gtgattgtct ggccttctcc cggcgataga 19200

taccagcagc agcctttttc catgccttta gctcctcctc ggtctcaccc gcatagtcct 19260

caggcttcag tggttccatc tgagggatgt catcaatagg cgtgttgttt agcttctcga 19320

ccatgttcac cacgtccaga accttcttgt taactttcca aggtgtattc tggatgatgt 19380

tcacagcgtc atagacttca ggcatgtaca cgtcttcgta acgtgctacc gcagacttag 19440

accctaatcg aatcaacggt aacggtctgc gacctttagc ccagtaacca ccgcctacga 19500

cacccgtcca cggcttaggt ggaacgacgc aaggttgata gactggcgca atacccgcaa 19560

ggctgaatcc acgttgtgcc atcttcttga cccagaagtc tgacaggtgg accatctcaa 19620

catcagccgc tgcattgcca gcaccataac gcttaagctc gaccagttgt gtagactgta 19680

tgacaatctc aagcatcttg atgccaacgt gtaccgcctc ggtcggactc caagttcccc 19740

acgcatcttc cagttgacct tgctccagca tggaggcctc aaccgcttgc atgtaggctt 19800

tcttatagga taccccggct cgcttgttca ggttctcagc tatcgccttc ttgaagtgct 19860

cctgctcctt gtcacgaatg cgaccgaagc gtatttcatc ctcaagtgtg cgacctatcg 19920

cggaggccat cggtgtaatc ggtatccctt caggcttgac cagcttggag aggatgacct 19980

tcagtatgat aaccgcagca gactcacagt agatgcgcag agagcggtcc ttaacggcct 20040

tctcttcagt gctcaacatg gtgaacgcta cgctcggacg agaggttgac agcttaccgt 20100

ctggaccttc gtgccactcc ttgacggctt gcacaatctt aaggaccaga gtctgcatca 20160

aaggcttggc gacctgattg tctgccagtt ccccgcgctc agtctggcgc tcaaggttct 20220

tgatgaaacg tcgctctcct tcagtgtatg cctcgtgctc aagttgtagc tgcttgactg 20280

cgaggtcctg accgtagtgg tccgccagta cgttgaaggg ttcgattgca ttcgacacat 20340

cagagaagtc gtgcttgtca attgagatga cgctcatact taaagtcctt gttattagtc 20400

tttcacttaa agtctctttg gtctttcact tggagtctta gaccttgagt cctatagtga 20460

tagttaagtc agaattactt gcatatcagt gggttagcgt gaagatgact gaagtcaccg 20520

ttggtcgtgt gcttgatggt tgaccgctgg tctatcgcct tccagcctga gaccagaagt 20580

ttgccgtcgt cggtgattgg tcgtgtgcca tacggcagac acatcagctc agccttatgg 20640

ccctcggccc ggagtcttgc ttgtagtaca cggtcacgct cctgctgttg acgtgcggtg 20700

tgacttgagg tcccgtgacg gtagcctgta gctagcgctg aaagcagatt aatgtctgcg 20760

tcaagttcat ggaccaagtt gatgccataa gatttactca ttacagtttg ctccctaacg 20820

ttgcgatgtc ccagacgttt gcgaggttgc gcatgaatcg tccgttcggt tgtcttacag 20880

tccagcggcc cagtcgtaca tactggaagc ggtagacttt acgtgccttc atgatgtctt 20940

tcgtcaggac tgcgagtatt aacccgtagc cgatgaccag aagtgcccag cccattgttc 21000

acctgcctat atgttgtgag aaataatctt tgagaccact agatgtagtg gcctctcgtc 21060

tatcactcag ctattgcgtt cagcttgcct tgcagctcgt cttgatggtc tgcctgagtc 21120

caagacaccg ggtctgtgat tatcagtcgc ccgttgttat caaccatcac attagcgcgg 21180

tgcgtgtcga atgatgccag cccgtagaag aaactgttaa tcttcttagc agtctgcgca 21240

aggtccttga tatactgagc ctcgacgtgt gcaaactcag cccgtgcgtc ttggtccagc 21300

caccagctca gggcctcaga cggttgctcg aaatggtcta ttatctcgtt gaccacacgc 21360

cacgacacgt ttaagactcg ctgctcgtag gtctcaccat cccggcagta gtcaccgccg 21420

atgtcattca gtgagcggta cttatccata gcgaccatgt atgccctgct aaagcgcttg 21480

accagatgga tgaccggaag cccagccaga ccctcattct ctcggcagaa ggccgcatat 21540

gcagcgcctg agtcatcctt cttaaagcct accttgattg catatcccgg caggtcctca 21600

tgctcaaagg ctgctgcgaa atgtcccagt cctaacagct tgtagccatg ttcccgcgcc 21660

agtatctcaa aggctcccca gcgaggttga ccagctatgc cagcgctaga gtcctcaatc 21720

ttgtagcact cctcgcagat gatagcgtgg agctgagaca tcaggttatt catgattact 21780

ttatcgtgtt cgttcattac gtgtgtttcc ttcttgtggt taagtgacaa tcagtcaggc 21840

cacccgcatg gatgacctgt agtctggcac tcagtacccg cctgtcagtg ttatggtcag 21900

agcatggtgg ttagccgtgt agcaggcccc gcgcttcatc atctcgtagc atccatcata 21960

gaacgcctgt tcactgctat aagttatctg gtacatgttt atttatcctc agagtgtaag 22020

ctgtcgtgta tgcgcttgcg gccctcatag accgctttca ggtgacgcat agtcgcatca 22080

tggtgtaact gcccggtctc gaccataagc cgggcgttgt tgacatggtg ttgacagaga 22140

ccataagtta ccatcactcg caatcctcag cagccgcatg gtcgaacact acgctatcgc 22200

tggtgtcctc aagagtctct aaatattcat caacgatttg gtcaacgtta ttccacatgt 22260

caatgatgag ctgttcataa atgcgagctt ggcagatacg gctaacatcc ttcgtttcag 22320

ggataaggcc gctgtcctcg aaactaatat cgatgccgtc agccgccatc actgtaaaga 22380

tttcatgata gtaatgcggc gttgcatcga ctgcaacctc gtgaattgca tcacccgcgt 22440

cgcttgcatc ttgaatatct tcgtaagcaa ttcgctcttt aagcatttca aaagcgtgag 22500

actgaaggtc atagtatgcg ttagcgttac gttccatagt tatatcctct caattgttag 22560

tgactatcag tcagggcctt cagggatgac ccggcgtctt cactatccgg ttgttgccgt 22620

gtcgcgttga ctgaagctat taagccatag tctggaccta tagtcaatag gtaatttgaa 22680

ataatattga ttaagctatc gtcggcccca tagtgactaa gatgatatag tctttgacta 22740

acatgtctta gaccttaagt ctatatcttc gtgtctatta actgtaggtc tatgactgta 22800

ggctgtgagt gtcttatggt tgtgactgta ggttgtagga ctgtaggttg ttagactgta 22860

ggttgttaga ctgtaggttg ttagactgta ggttgttaga ctgtaggttg ttagactgta 22920

ggttgtagga cgtaatgtta tactataaca ctatacagat agagactcag agacaaccca 22980

tagtccctac ctaccgtcct tccctaagcc atagccttga cctatcgtca tgacttcggg 23040

tagaccttga gtcaatgacc tgaagtttag accgaaggtc tagggtaggt cctttggtct 23100

gactggaagt gaccctatgg gggagacttg aggctcttga actgtgagat gtggtctcaa 23160

acttttggtc caaaactcat cgtcactact gtaggcctca gccactgtag gtcaaggacc 23220

gtaggtcagg cgacactagg atagaccaat aagtaggatg accctaagtg agcttctctt 23280

aaggtgttac ctaaagtcct tgactacagt agctaaggtc agtagagtag cgtcagctat 23340

gaactgacct taggtccgtc tttcgtttat tgttaccatt acagcgttaa tgacactcag 23400

acaccagagt acatacgaga gtctcgaccc acccgaccca ctgacttcca gcagtaacgc 23460

cagcagcaag tagaacagca gcaagaaacc tgtatgtagc tctattggtc gccagagctt 23520

tgagaacagc tttggtcttt gccatatgct acatacctcc tgtatctatg gtcggtgact 23580

atctgtattg gagggattat gattaatatc accctccttc catcggtgca agccttaggt 23640

aagaactcgg agtctgcctc ctaaggtctt gcataaagtc tgcatatgta tattcactac 23700

agtaatacta taagtaacca ttggtctttc ctatagtgat agttaagtcc aaactccttg 23760

taaaacagta ggttagactg gtaataacta taggttacta accgcgtatt cattcagttt 23820

tcgcctatag ttattcatct agctagtgga acgtaacgta tgaccctagt cccagctcgt 23880

cgtccgtatc gtgagttacc cggaccccat tgtcccagaa ctcagtgtgg atggactcga 23940

agcctttccg tgggttctcc atctgttcct ccagccactc ctcagtgact tcacgttctc 24000

ctttgttggc atccttagcc atagcctcaa cgaagaactg cacaccgata gccagcgcat 24060

caagtcggtc atcgtgtgcc aaggctccac gttcacgaga gatgcgggtc atctggtaga 24120

agagagagta gatagggtta cgaacgccat ccttatcata ggctgtctgg tagtcttgga 24180

cgatagcagc agcgttgacg ataagtcggt gagaccccat gataggctcc agaacgtcac 24240

agatgcggag ttccttctgt cctttactct tcacttcagt tacagccgct ggatgggtac 24300

gggccgctac aggcttgaac aactcaaggt acataccatc accgaagtta ccctcaatga 24360

cgtattcgtt gaccttccac ttacgaccaa tcttagccag agcttccagc gtagagtcct 24420

catagccgcc acgcataccc cctacttcca tagcgaagat gtagccgttg agctggtaca 24480

gaaccacata cccggtctca tccttacctc gaccacttgg gtcaatgacc agaatcttct 24540

gggtgtacga actgaaggca gaacctacag tctgatacgt gtggtacgag tcacccatga 24600

gtccaacgtt aggaacgtcc tcacgcttgt tctgagggtt cggcaaccat tggtagacca 24660

ttgggctgga cgctgggtcc aagtccgcta cgataaggtc acgcagcttc agtgggtact 24720

tctcagcatc actaaggttc gggttaagca tgaactgtag ggcgaagcca gccttaccgt 24780

aggacagctc acgttcctta aggtcagtat cgtcgaatcg aacttcatca gttggacgcc 24840

agtagaagga ctcagggtcc tcttcaagat ctgcctgaag cataggagcc agacggtcgc 24900

cgtaagactg ccagtccttc ttatcgcgcg gatagcgagc aggccagata gtagtggtgt 24960

atccacgacc ttccagctca cgatacaggg tcatctcgtt ctgaggagta cccagataga 25020

tgattgtacc acccggcttc aggatagcgt cgaactcttt cacaagctct gacagacggt 25080

ctctcgcagc ctgagtagca gagttattag gaacctccac gtcatcggca atcaggatgt 25140

cagcacgact accagtcaac tgaccagtga taccaactga cttaaccgaa ggtgagtggt 25200

ctggcttggc tggcccaacg tcgaagctga taaccgcatc tcgctgtccc tgcttaggct 25260

tgagttcctg aagctgaggc atgaggtcga tgattcgctt gatgaagatg gagttagcat 25320

cggctcgttc ctttgaggcc gacacaatca tgaacttaaa gtctgggttg ttccatagtt 25380

tccagaccac gaaggcacat aggaggaacg acttacccac gcctcgaaaa gcctgaagga 25440

tgaatcggcg gttgccccca ttagatacct ttcgagcaat gtcaatctgg catcgggtag 25500

gggaaggaag tgataggtct ttccacagga caaagagaaa gaacacaaag tccgccttca 25560

tccgagaggt cagctcatta ttcctgtctt gcggcgttga ctgcattaag ggcctcctct 25620

tttgtatcaa aacgtccaag ccaccgggga tgaatcgcct tccatttacc agtctgttta 25680

cagaatgata cacctagtgg tggagcgtgg ttcctgttat tctccgcctt ggtcacagcc 25740

cttaggttct caatcctgtt gtccagacgg ttgcggttga tgtggtccac aaccagttca 25800

gatagaatgt cgaactcagg attgtgcatc ttgtaaatca agcggtggac caaatagttc 25860

tttccgttta tcttgaagcg cctgtagccg tggttagaga tgtgacccac ctccttccca 25920

cctttaagca gcttcccata ttcatatact aaatcactta gcaccctgca acctccttat 25980

ggtatcctgt aaagccttct cctttaagtc tgccttctgg gttatttcga taagacttct 26040

agaagttgac tcgtgtagtt cgactctacc attagggaag catcgactga catctgactc 26100

ggtgagacct gaggtgttga ctttgacgcg cagccgctta ttgtcagact gaaggtcagc 26160

aataatccta tcagtgctgc cttccagcga ggacatttcg tcctgaaacc gtttggacac 26220

tttgttgact tcagcttgaa cagcaagcct tgtatcttcc gatgccttaa gattcgaggt 26280

gtattctgca ttgaccttag cctcccactt attgttagcg gtgtggtagc caccagcaaa 26340

catcactgct gcaagtagcc acggagccgc tctctttaaa aattcgagca tagttgccct 26400

cctggtttat cagattttca cgtagagtct cctccactag ttagtgttaa ccataaaggc 26460

cactacatat agtggtaatg accttgagtc taacacttac tgtacaccat accctgtgtc 26520

attgtcctca gtagctgaga gcaccttatc gtactccctg ctcaacgcct ccatgtcagc 26580

taactgtttc tcatccacag acaccttgct gagtacaaag ttgtggcgag ctagcagctt 26640

ctcgatagcg ttgtaaagct gaggtgagcg ctttgtgtca tcccgcaggt cttgcagcat 26700

gagtcgagcg cgttcagtgt ccagcattaa caggaacttc tctaagtcca tctgcgtcat 26760

gtcttacctc cgctcttaat cgtcttgtaa attaggacgc caatctgcac cacggtgtac 26820

gcgatagcag cgacgtagaa ccattcgttg agtgttaacc caaagaagaa ccgactggca 26880

ccatcagccg cagcggtccc gacgataggc gaggctttta ggacctcatt cttgaagtcg 26940

aactcaatca taaaacctcc attattgacc ctccgtagag ggccatagtt atttagctag 27000

gtactgaccg gagaagttta tcacgtttcc gtctgtaatg gacgcccagc caacgacgtt 27060

aaggtcccca ttcgcttcca catagcactc gactggaatc atgctcgacc cttgcacacc 27120

ccatgcagcg atgcgcgttt tcctgcgagg agccgttatt ggtagagatg tgtatggaac 27180

cgtcccatat cccttaataa gggctccgtt tactatcgac atcttaccat gcattaccca 27240

tgaaaagtcc ccagtgtctc cccagccatt cttaggtcca gtagttgacc caagggcgct 27300

aacctcagcc gacaccagac cgaataggtt actataccct agaacttttg acgcatcgaa 27360

ccctaggccg ccagcataat caacaccgta ctcaccattc tcatcggcta tcaggttccc 27420

atgaaccaga gagttacccc ccagcttgta accagacttt gtggcaccct ttgagaatcc 27480

gttacccagt gacacgttaa cagaggaagg gtctacgctg attccgccag atgtgttaga 27540

acactggtgc tccccgatgt taacaccaac gcagcgacca tcaatcacta gcgaatagta 27600

gttaccatat acgttcatag ccacgtagtt cccaatacgc aagttgctga tataaccagt 27660

attttcattt gagggaatga gcccccatga tgcgttgtag acctgaagag agcctatctc 27720

cacgttatcg atgttaaccc catcgtgagc gtcgtagatg ccgcccatag taacatctgt 27780

aaacttagag ttatcacgca gccctacctt aagtcttccg atgtagatat cagcagccgt 27840

tgcagcagag tcagacttaa tgataaacgc atcacctctt tgtccataac agtgggcgtc 27900

catcacatct aagttagtcc ccttaagggt cagaccgtgg tagccaccaa tcagttctac 27960

ctttccaaca taagctccgt caagaatctc aagaagcaag ctgtgagttc ctgggtagtt 28020

tggaccagtg aggttcgtat gactcaaggt tttaacgtta tctataaaaa catttgcctc 28080

tttaccaata ccatagcatt ggatagggtc gtcccattga ccgcctagaa gttcgtctga 28140

catcacacca ccacagtcaa cacctaggtt cactaactgg aacccaccag cctcagtctt 28200

cattggtcct ctgattatcg ttccagtacc agcaacaaag ctccgtgcat cggcagacag 28260

ctccgggacc cctccaccaa cgaacgttag gttcttctta gtgttacgag cgctgcggaa 28320

tgtaaggaag tcgtaggatt tccctctacc taataggaat cccgtaccgt ctgaactttc 28380

ggatacggcc ttctcaaggt cgccattata aggagcgtta tccactacca cccacttgtg 28440

gggtagactg aatcgttcag acagtccgcc aatcattgtg tacccatccg acttggacag 28500

gtctgaacgg attgttgaat cgatattgtt gttagcgatt atgtccttaa tcccgctaag 28560

tgatgcggca gcgtcctcgg cagatttctc agcagcttcc gcaaactgta cggcctgttc 28620

aaccgtctgg tctctaccct cctcggcgat atggatggcc tgaagctccg ccgttgtgag 28680

gtcggatgcg gtcaatactg agccatctct gaaatcaacc ataggctctg aagacgtttg 28740

gcgataaatc tgtatgacgt cgaacccaga ttgactggct agtatttcta atgtggttgc 28800

actaaggaag cggtaatcgt taccaaccac tagctcttta tttaaggtag catcaagaga 28860

gttgcttaaa gtaactttaa caaactcacg ggataagtag tcgaagttaa tcttatattg 28920

cgtgcttcca gttgggaatt tagtaagagt tccagacata tagtctcctt aagttgtgtt 28980

tagggcctgt gggagcgccc gtttcctata gtgatagttt agtccttgat gtgaatacct 29040

tgttcctcaa aggttccgag cagaagcctc tgtgtgattg ggtcgttcgg gaccagctca 29100

cggaaggtat tgtacatccc tgtcatgtag tcacgttcgt tcacacgtgt gtcagctttc 29160

aggtatccag ccaagttgta ggccgaagcc cccacgttag cggcgtatcc gaaagccgga 29220

acctgctcaa ggaagtttcc aaccacattc atcaccgggt cactcttcgc agcgccatag 29280

gtaatagcac gttcaggctt ctctgtaggc gaacggggta ggatagacga acggagcatc 29340

ttagtgtcct catacccagc gatgccaccc agaatgttag ctaccccaag tggaccacct 29400

agatgtgaac tacgggacag agccgcataa ccaatcatcg ttgggtcaag agcttgcttg 29460

aggtaatcac ggtctcgatc atcctgcata gcgtaagcct tgacgtgcac ctgagccatg 29520

tagtagatac cagctaggcc catagatatc acagtggaca aggcagcgtc catcgctcgg 29580

ttgttcttcg tggcgttgta gaaggttcgc atggttcgcc cattgatgga cttgatgacg 29640

aagttcttaa actgaaggac agtcttagcg aggggactat aagccttggc gtccatgttt 29700

gacagcttat gaggtcgtag taacgtttcg tcagcgatgg tgtcacccat acgccacagg 29760

tccatagccc ttgggtcctg actgaacgcc ttcttatcct tgatggtgta cttcccgtct 29820

ggaccacgag tcactgactc acggattagg gacttaatgc ccttccactg ctcgtcagat 29880

ataccagcgg tcttcagcca gcggtcatcg aacttacgct tactgccagt cagactatgt 29940

tccacgatgt cagacaggaa tccctgccgt ccagcatcta acaggtagtt ggtcgtaccg 30000

ttgaggactt tagttaacgg agagcgtact gcaagttcgc cagtgtaata cttggcagtc 30060

cccagagctg tagctgcccc acgacctagg tcgctatagg agcgcagacg gtcaatgaca 30120

tcctgtttag acgggcggat tgagtcatcc agttccttac cgaagaggac attatgcagg 30180

tccttaatct ctgagccact taccttcttg ttacggaagg ctaggtcacg gaacatcggg 30240

accccatgaa gcattgcacg aacgttacca cgagccagca taccaccaat ctccgttaag 30300

ttctgaacac ccatgtaggc attcttagcg aagaacgata ggtctgtcat tgtgcgcata 30360

acggtattga aggctgcatc gtcagcacca tcacgtcgag cacgaccagt tagaaccttc 30420

aaggtgtcac gtaaggtgga tacttcacct ttcaacttac cgtcatcccc agccttgttc 30480

atcatggtct caaccaagtc cttcatgtcc ttcgtggttt tacctgtacc agccatgata 30540

gcaatatcgc cattaactcg acggttgtag gccgggacaa tcttgtccat gtcccactca 30600

cgcaggttgt tgacactgaa ggtctgaccg ttaggtagga cgattgacat atcgctatcg 30660

aacaggttac gagcctcaag gaagctgttg ttctccagac caaccagacc gttgatgttc 30720

tcttccatta cggatgaacg ttcgaactgc tcggtgtgag agataccgta agccttatcg 30780

ttggcgtact tatcgaccgc agcagcaagt ccctctggag tcaacgtagg gtcagcctct 30840

aagagtgcct cgtccacgcg tttctttact tcaggtcgag acgcatagct ggtcaaccat 30900

gactttttga tggcctcctg caacgcctct ggactcccaa gctccttgat gtacagctcc 30960

ttcatctgtt tgctatacac atgagggacg taggttccct tgaagcggct acccggaaag 31020

atagactgag cgtctggccg accaaacata gctggattct ccatcatctc acgcttggcg 31080

tcaaactggt tcttcagtag gtcatagact ttcagctctc ccgtagtcag ttcagccttc 31140

aggtttccgc taccatcttc gatagccata gacacacgct ggtagatgtc ctgacggaat 31200

gcgccagagt ctcgccagaa tgctgtctgg aagtacgggt cttttagtgc ctcagtaacc 31260

gcatcgtcga tgtcgttgta gaaccgatgg tccacagcac gaagtctctc gaacacgtct 31320

gacgcagttg tcccgatttt acctgaggcc ccagactgca taccagtcgg tgagcgcact 31380

aagtcagcag ctactccacg aatctcaggg ttctcagacc gaagcagctt caggccaatc 31440

tcggtaagtc caccaaggtt cacaccagca gcggcacgtt ctggctcaat cacttcgtca 31500

aagacttgac gtgtcttagg gttcagaggg ttctcaccaa tcaggattga accatcttcc 31560

agtcgtacac tacccggctc gttaggaacg tcagcgaact taacgccttg atagctgaag 31620

gtctgctcac cttcctgaat agggagacga gacaggtcct gaccatcaac gttacgagcg 31680

gtctcacgag cttccagacg tgtagctggg ccagcaaact cattagtgtt gcgacctaag 31740

gctctgccta acccatcagc gatagcagtc ataccaccac cgaagagagc accaccaagg 31800

atagcttccg ccacatgagc atcaccacca gccactgagg tacgggccat ctcggacaca 31860

ccagccagtg ctccagattg agcagccacg gtgaacatct tattgaccag cttaccgcct 31920

ttaccaacct gtccagcgat aggaacgtag gtcagagggt ctacaccagc accaatcaca 31980

ccagcagcta actgagcacc agtcccggcc ttagccttct cttggtccaa cttctggttc 32040

tcaagcgcca agttgataag ctctgtaagg ttctgaggag agccaccagt aatgactccg 32100

taatactgag gcagaacccc agcgttacga atctggtcaa gctcttcacg agtccactta 32160

tggttgttcc atctggttgg gttgaacaca tcgccaatta catccagtga gtcctcagtc 32220

ttgccagctc ggatagccac gccgaccata gagttcttca cttcagcttc tgtagcagag 32280

ccaaaaccga accacgtaga gcggtcctct cgttcctgca tggtctctcc agtagcctta 32340

tagaacatct caccgaacga ttcgttggga gcttcaggtg cttgaccctc aatattcaga 32400

ccagcagcgg tcggaaggtt ctcacccaga gctactttag gtttagcctt gagtccttcc 32460

gtgagtgcgt caaatacgtt agcgcttact ggtggcgtct ttgggctgat accgttgagt 32520

gctcttgcgg cccccttctg gtagacttca gggttgtacc tagaaccagt ctcgtggtag 32580

ccgatagcct cagacagaga ggcgaggacg tcagggtctg ataggtcgag actttgagtt 32640

gcaggaatac cagtcgcaga tacaaccgag tcgatgtagg actgagtgtc gttctcgctc 32700

ggaggtgccc atctgttgat aatcttctct atagagtcat aaccttggcg accgtagctt 32760

tgaaggtttt tcgctaatgc tcgtacccca gattcaggac tgtcgaagat aacgaatgca 32820

ccatcatcgc ctatagcacc ttcccactgg tctttggact tacggatatt gcccggattt 32880

gcgttcctta caccacgtgt tgccatgtct ttctcctcaa tatatttcgt atggaaacga 32940

cgcttacccc gtataaggtg gaaagctcag atacttttaa tggactggag cgtatttccc 33000

taacagattc ctctgtcagt atagctcttc ctgctccact gcctcttgcc tgtcggcctc 33060

tggaaacctt atctgcaatg ttgtcagcct gcgttcctac ttcaaggtgt tcaggattta 33120

tgcatgatgg attatcacat ttatgcctaa caacatagcc atctggtatt ggccccttat 33180

ttagggagta ggagagacga tgtgccatat acttaaccct agccaccatt atccttccgt 33240

atccttctcc gtctaagtgg cctgtgaata ggatacagcc agactcttca gctactgaca 33300

gttctgccag tctctcactg gctgtcccgt tcttcattat gttactcctt accaattaat 33360

atgtttgcga taccctccag tgagacgtca ttgtacatcc caccgcgatt ctcgatgttg 33420

gcctcacgct ccgctcgacg cttatcacca gcagctttag tcccgacgat acgcgcccgc 33480

ttgttagcgt cacgttctgc ctgagcatat gcggcatcct gtgccttctg ctgttgttca 33540

cggtacagtt taccaaccag ttctttatcg tatcgaatgc gtagggttcc gttagcgctc 33600

tgcaggaaga ccgagccgtt ctgctcgact acagagagct gagagttcac tacccaagga 33660

ttagtcttga tgagctgctt gcgagctatg tcgataatgt ctcgacccac ctgccaagac 33720

tcagggttat ccccgaccat aagttgatgt ttggacacca tgcctatgga cttaccatcc 33780

tgaccctcat cggtgaaagt cacggtgttt tcattcaacc acttctgggt attctgagtt 33840

gcagcgtcag cgttacctgt cctgtagtac catgagtccc atacttttcg tgcagtcatc 33900

ttcaattcag tcggtatccg tgatagttga gtctcctttg agtcattcgt cagctctctc 33960

cactccttgt ctgcctcact tcgcatctca cgcgataaac ttgcagcttg cttatcagct 34020

tcaatcagcg tctgagtgtc cagacctatc ttgtccatct gatcgaaagt cgtgaacaat 34080

tgggcctgct cagggtagag ggccgcgaag ctggaagggt cctgagtgta ggcgcgacga 34140

agagactcga agcgtttcat cttgtctggg tcgtactgcc cacggatgac cgcagcttgc 34200

cactcaccag cagcatcctg agtaagcgtc tggaaggcat tgcggaacgg accgttgtta 34260

gtgtcagctc ttaacaatgc caccttctga gcgtccttag cagcctcagg gatgtccatc 34320

tggtcaatct gctgcagctt ggcagacgca tagttgttca tgtctgaacg cttgaactca 34380

cctgtagcgt cagagaccgg aaggtcctca tagttggtgg acacgttgtc cccagccaga 34440

cgtcgctgat aaacttggtc gatgaccagt tgcttgttct gggtctggat taacttagtg 34500

ttctcctttg cctgttcagc agacttacgc ttgaccgctt ccagtaagct ggcttcggca 34560

ttaataagca tctgacgctg aggtgtgagt tcttcacccg gttgaagcag gttgttctgc 34620

tccttgagtt tctgaatctg ggccagaccg atggttgggt tatcctgaag aatcgcagac 34680

tgaacgccta acgccaagtc ttcctgatac ttagccacca gtttatactc agtaccttgg 34740

gcctcaacca tagcagcatt gaagacgtcg ggtcctacaa tctcttcgat ggtagcgtca 34800

acaccattaa gggtgatacg ctcgccacgg acttgccgta ggaagtttga tcctcctgac 34860

ttctggattg cgtcacgtac cgtctgggtg atgacctctc gtgctctctg gtccgaaggg 34920

atagcagcag tcgtcaatcc atcccgaagg taggccatga aggtctttcc agactcaggc 34980

gaacgcatca ggtccccatc gttaaggaac gagttcatct caatacgagt gttcaacatt 35040

gctgtctctt cagactgctt gctgaaatac ttattgaagg acccgtagat agcgatgttt 35100

cggtccgtga tgttatcgtt gaatcctcgc tggaagaact cgtcggtagg gttaatgccc 35160

gcctcttcag catatgactt agcggcatcc tgaagtcgct ggtggcgata ctcttccatg 35220

tcctgacgtg tacggaactc accgttctga atcttaacgt taatctcgtc atccaccgca 35280

aaggcagcgt tacgaccagt ctttactcta agtgcttcca tagcgtaagg gtcgtcctga 35340

tacagcaatg tgccgttctg gatagcctca cgtctctgct gaggtgtcaa cttacggata 35400

atctcgttgg accgctcgtc tgctctggcc ttcgcatcgt cagctctggc cttctcatcg 35460

tccttgaact gcttgtacaa tcctgtccca gactcaacga agttagtaaa cgcacgagcc 35520

agaccggagt cgccagttgg agcctgaacg ctggatgctt gatagttgac ggcgatagtt 35580

ttacccggcg ctctgccacg acccatagtc cgattagcca gagctgattc aatattacta 35640

gccattagtc ctcctcttag atatgacctg taggtgtacc tttagcatca ctcagaacca 35700

ccagatagtg actcaccaac ggcgtagccc tgcaccccgg cggtagcaac attaagtgca 35760

tgagccagtg ggttggtctt gatgatttta ccttgaccac ggatagcaga cttggtgttc 35820

tcaatgttgg cgatacggtt cccgaagata gccgcatagt cgcggttgta actttcggta 35880

atccctgctc tctccttgac tgtatctcct ttgacctgac gttcaatcct gtccatagag 35940

ttaccttcca gaccggactc agccaccgca gctcggacca taccctgatt gcggataccg 36000

ttgagcgtgg tctctgttag ttcagccatc tgctgctcct tcaggtctcg ctcctgcatc 36060

ttcaggtttg cgtcagagta gttcatctgc ttaatcattt cctgagcctg tcggttctga 36120

gcgtcaattg ctgctccttc agccttggcc tgttgggatg cggacatagt ggccccggct 36180

acagacagta cacccatgcc tatgctaatt ggctcgcaca cggttaacct ccttagagat 36240

tgtgaataat ttaaaacgct caccagttac cgggctgata gtccaatcat catggaactt 36300

agccccaagc aacttcaaga atttaatgtg agacttattg cctgaccaca cgtagttcca 36360

gatggtcccg tattggtcta acattaagtc cctgtactca gagatacgct ttatgaactc 36420

tcgcttctct ttaggtctca gcttatagac aagacccgaa gtcaagaacc atacgttatc 36480

cccttggttt ccaccatagg caaacacttc acctacactg ttcgttaaaa ccacagatga 36540

cggagataaa tgctcaagca gtctttcaga gagacccacg gttgacccgt agtttgcttt 36600

gcattcatta acatcatctg ccgaaagatg ccagagaaag tagtggacat ctggttcagt 36660

agctttacga atatacataa agtctcctat taaagtatta taaccttaag ggcctatagt 36720

ccctatagtg atagttaagg taaatctata ggcccttcaa taagttagac ggaacgagct 36780

ttcttagcgt atgacgcctc ccagccacac ccaacgattg acactggggt aggatagtcg 36840

gactctaagg ttagactcgt ggttaatgcg ttaccattca tagcaaagcg atactgtcca 36900

tccccaatgt tggtagtccc gatggtttgc tgaccaaggg tgtacccatt aaaggtgttc 36960

acgaactccc gctcaccgtt tctgacaatg agtctcagag caccagtgtc cttgtagttg 37020

acccaagccc gacgaagttg taggcgtcca gtgtcttcag actgagtgcc actctcgtct 37080

tcaatcttaa tcaggaaccg tgaaaacttg taggacatca gataagaccg tccgatgaac 37140

actgtgcgtc ctgaccaatc gccatttagt atagtcacag tagaggtact gttcaagtcc 37200

ccaaggtcca cataagcacc ctgactgtca atcagatagt accgaccggg agacggagcg 37260

tttccaccat aagcagaacc aatgtcaacc gtagtcttat aggtgtcagc gtcgtatgag 37320

ccaattggta ttaccataga caccttggag tcaatgtgta gtctatatgg ctctgacggg 37380

aagtcagttg cctccttgat gaacttaagg tgctcaaggt ccactccgcc ttggtgctga 37440

cgaacgatga acatggtaga gccaatagaa gcagacgcca gaatcttatc atctttaggg 37500

aactcccagt gtgaccaaga ggcttgaagc tgtacgccgt ccttaaacaa gaacttgtag 37560

atgtagattc ggttgtatgc acctgtagag ttgacgcaga tgtagttctc agtacctgta 37620

ccttgaatgt caaacacccc gttagggata taggacagta cgtgtccagt ggtatcatcg 37680

gcatccttca cgtcagacac atctgctaca gcgaagtatc gcttaatgct ggtgaatgac 37740

ccacgaggcg ctgagaagaa gactgagcgt cctacagcga acggtctggc attgtcacct 37800

agggcaaact ctgagcctac atcaagctgg atagacttcg aggtaaggac cccagagctt 37860

gtcatcacga actgaacctc atccgaccaa agtagtagct gctcgctaaa cggaacggca 37920

tacttaagga ttgagattcg agggtgactt acagctacgt caatagggtc atcgtcactc 37980

agtgtcgcca cactcttagg gaagaacgca aagtagctgg ctgaacggct catgattacg 38040

ttctctcctg acaagaaccc tagcctgttc ctgtagaaga atacatcgtt aatcgtagca 38100

tccacgaagc taggcatagg gtttgtgtca tcattaccag caccacgctt agaccagtcc 38160

agagtcttga actcaaagga gccatcagat tgtcgtacca gagcgtgtgg cattgtggtg 38220

ttatcgaacc cagtgacaac tcccggctcc actgtctcct tccacgtctt agtgttggag 38280

tcatacatca cgtagtattc atcggcgcta ctgtttgtct cgccttgaat cttaatgata 38340

tacccattag gagcggcaag aggtagttta gagattgtct gcacagtgtc taggactggg 38400

cttattagct ggttagcgta gccatcctcc gtctccactg agttaatgtc agtccctgag 38460

ggggcagtga ttaacaggaa gccagaccca aggtcgaacg tgaaggcagg gtaagaagca 38520

acaagaaggt ctctaagcgc cgcaccgata gcctgagcat caaccttagg agggtcattc 38580

gcggcatcat tacctgctgg caacttatgc gaaaccttaa cgcctccatt gattcctacc 38640

ttaagggtgc gaccatactg tccaccacgc aggttaatta aagctcgtgc tttgcgatta 38700

taaccagagt gtgccttctc gcttccacct ttgacgacaa ccttacggtt aacgacgaac 38760

gtatagtctg ccacggtaac gacacggatg tcatctcgtg ggttggagga cttaacgtaa 38820

tctaccgcac cggacactga gtattgatta ccactcaagt caactacctg aatgttggac 38880

ccattgaaca cgatgtaata ctgctcatgc tcgtcacggt taatcagatg gaacttaggg 38940

ttactcccaa cgtcgatgtt aagacgtctc ttgaagactg taggtgggcg cttctggagg 39000

ccatcactct cggatgacca gcagttaacc tgtgcctcgc cttggtctga gaacctcagt 39060

atatcaggct gctggctaat gccaccttta agatttttta tgctttgtgt gataagcggc 39120

atgtgtcctc cttaaatcat actcattagg acgtatcctt cagcgatgtc accaacgtca 39180

gcaatgtgga caaccttacg cgctacctgt tgtccagtat acccgttgtc ccactcattc 39240

aggataagcc aatcgccaac cttaaagtcc cggtcgttaa gtctcagctc tgctgtcttt 39300

agacctagct gtaccggacc aaagtgctgg cggtgaatct tcaggttgtg actagccatt 39360

agtccctccc gatgtcagac atcatgttgt atcgaccagt gtccatctcg tactccataa 39420

cctgctgata gagttctgct tcctgctcac gaaggtatag ctctgactct tggctaccga 39480

agaacttagc gttgaactca cggctagctt tagtgacgat gtagtccctg aagaccacag 39540

gcatctcgga gaatggcttc atctccacaa gctctaccgt gatagggtcg gtgaaagtgg 39600

ttgactgagt ggacaggtcg tacaggtatc cacccatgtt gctgtagtag ctggtggccc 39660

cagcggtcat tacgcgaagg tatgacggca ggaatcgaat cctattgtct tggacatcag 39720

gtgtcaggac agcagcttcg 39740

Claims (10)

1.一株可同时裂解大肠杆菌的沙门氏菌噬菌体，其特征在于，透过电镜观察，该沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003头部为多面体立体对称，包裹着核酸，直径65-40nm，有一个长30nm的尾，颈部连着头部和尾部，为有尾病毒目短尾病毒科，不具有毒力基因和溶原基因，保藏编号CGMCC No.22494。

2.如权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003，其特征在于，该噬菌体具有较广谱的杀灭沙门氏菌的能力，同时对大肠杆菌也有一定的裂解能力。

3.如权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003，其特征在于，该噬菌体对引起鸡气囊炎、腹膜炎的大肠杆菌具有裂解能力。

4.如权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003在制备预防和或治疗大肠杆菌引起的疾病的药物中的用途。

5.如权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003在制备预防和或治疗沙门氏菌引起的疾病的药物中的用途。

6.如权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003在制备预防和或治疗沙门氏菌引起的疾病的饲料中的用途。

7.一种用于防治沙门氏菌的杀菌组合物，其特征在于，包括有效量的如权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003。

8.如权利要求7所述的用于防治沙门氏菌的杀菌组合物，其特征在于，还包括用于抗沙门氏菌的抗生素。

9.一种预防和或治疗沙门氏菌引起的疾病的添加剂，其有效成分包括权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003。

10.一种清洁剂或消毒剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的沙门氏菌噬菌体RDP-SA-21003。

Images