CN116144611A - 一种噬菌体组合物及其应用 - Google Patents

一种噬菌体组合物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116144611A
CN116144611A CN202310016970.XA CN202310016970A CN116144611A CN 116144611 A CN116144611 A CN 116144611A CN 202310016970 A CN202310016970 A CN 202310016970A CN 116144611 A CN116144611 A CN 116144611A
Authority
CN
China
Prior art keywords
phage
salmonella
pll1
formulation
infection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310016970.XA
Other languages
English (en)
Inventor
郝桂娟
孙淑红
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Agricultural University
Original Assignee
Shandong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Agricultural University filed Critical Shandong Agricultural University
Priority to CN202310016970.XA priority Critical patent/CN116144611A/zh
Publication of CN116144611A publication Critical patent/CN116144611A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/52—Adding ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • A23L5/20—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification
    • A23L5/28—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification using microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10111—Myoviridae
    • C12N2795/10121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开了一种噬菌体组合物及其应用，属于生物技术领域。本发明的噬菌体组合物，由保藏编号为CCTCC M 20222004的噬菌体PLL1和保藏编号为CCTCC M 20222003的噬菌体F118P13组成。本发明的噬菌体组合物由烈性噬菌体和具有导致流产感染能力的噬菌体组成，其能显著降低抗噬菌体突变率，并且不易被机体免疫系统清除，可用于易变异的病原细菌感染的预防和治疗。

Description

一种噬菌体组合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种噬菌体组合物及其应用。
背景技术
随着抗生素的使用，细菌耐药性正在不断增强，已成为全球严峻的公共卫生问题。而现阶段减抗的推进，使研发新型抗菌药物以防控多重耐药病原菌感染成为当前亟待解决的重大难题。目前，噬菌体制剂作为一种新型抗菌药物，因研究历史悠久、成本低、可随宿主增殖等特点而不断被接纳，已在波兰、俄罗斯、美国等多个国家成为合法药物，其杀菌作用显著，具有良好的减抗替抗作用。研究表明，烈性噬菌体通过吸附于宿主表面的受体进入裂解循环，从宿主细胞内裂解细菌并产生子代噬菌体。当前，细菌抵御烈性噬菌体侵染的机制研究比较清楚，如细菌通过阻断噬菌体吸附、DNA注入、DNA复制等对噬菌体产生抗性。但也有些噬菌体通过大量吸附造成宿主细胞壁损伤来杀死细菌，这种自外裂解方式并不产生子代噬菌体，反而伴随部分噬菌体失活，是噬菌体流产感染的一种。然而，由于噬菌体具有高度的特异性，宿主范围窄，单一噬菌体疗法往往仅对某一型或几型的宿主细菌有效，而对其他菌株裂解效果很弱或无治疗作用。因此，常常将两种以上不同的噬菌体配伍制成噬菌体鸡尾酒制剂，以拓宽裂解菌株范围或降低抗噬菌体突变率，从而增强噬菌体制剂应用范围和效果。
沙门菌属于肠杆菌科，位列食源性病原菌第一位，据统计，我国大约70～80％的食源性疾病由沙门菌感染引起。沙门菌为胞内寄生菌，当前已有2600多个血清型；其中，人畜共患的鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌是我国主要流行的血清型。已知禽类是沙门菌最主要的宿主，这类沙门菌不但在鸡群中水平传播，还能垂直传播给下一代，给雏鸡造成较高的死亡率，严重降低雏鸡生长性能；成年鸡感染后虽无明显症状，但却能以持留菌形式长久存在动物体内，在动物和环境中广泛传播耐药基因，带来严峻的公共卫生安全问题。在我国食源性沙门菌感染病例中，鼠伤寒沙门菌位居首位，其主要通过污染的食物或水经粪口传播，在肠道内增殖，粘附于肠黏膜上皮细胞，进而侵入固有层，引起的症状轻至肠炎，重至败血症和全身系统性播散引起的内脏损害。
当前，已有很多将不同裂解能力的噬菌体组合，但主要聚焦在拓宽裂解菌株范围上，且对配伍噬菌体的受体、裂解特性等了解不够深入。但流产感染的噬菌体在噬菌体制剂应用中的潜力如何仍是空白；此外，如何配伍噬菌体以降低抗噬菌体突变率，这对临床泛耐药细菌或超级病原菌的防控具有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种噬菌体组合物及其应用。本发明的噬菌体组合物由烈性噬菌体和可导致流产感染的噬菌体组成，其能显著降低抗噬菌体突变率，并且不易被机体免疫系统清除，可用于易变异的病原细菌感染的预防和治疗。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种噬菌体组合物，由保藏编号为CCTCC M 20222004的噬菌体PLL1和保藏编号为CCTCC M 20222003的噬菌体F118P13组成。
优选的，上述噬菌体组合物中，各噬菌体的效价分别单独的为108-109PFU/ml。
本发明的第二方面，提供一种噬菌体鸡尾酒制剂，以上述噬菌体组合物为活性成分。
优选的，所述噬菌体鸡尾酒制剂中，噬菌体PLL1和噬菌体F118P13的剂量均大于或等于106PFU/ml。
进一步的，所述噬菌体鸡尾酒制剂中还包括药学上可接受的辅料。
所述药学上可接受的辅料包括分散剂、稳定剂、填料和溶剂中的一种或几种。
优选的，所述噬菌体鸡尾酒制剂的剂型为液体制剂、冻干制剂或口服固体制剂。经喷雾、注射或口服等方式用于预防或治疗鼠伤寒沙门菌在鸡群中的感染，或用于改善鸡群养殖环境、降低蛋壳表面鼠伤寒沙门菌含量。
需要说明的是，本发明的噬菌体鸡尾酒制剂，可以以上述噬菌体组合物作为唯一活性成分。还可以含有除本发明的噬菌体以外的其他噬菌体，其与本发明的噬菌体复配使用可以得到与之相当或者更好的防治鼠伤寒沙门菌的效果。
本发明的第三方面，提供上述噬菌体组合物或噬菌体鸡尾酒制剂在如下(1)-(3)任一项中的应用：
(1)降低病原体的抗噬菌体突变率；
(2)制备抑制或杀灭沙门氏菌的产品；
(3)制备预防和/或治疗沙门氏菌感染的药物。
上述应用中，优选的，所述沙门氏菌为鼠伤寒沙门菌或肠炎沙门菌。
本发明的第四方面，提供含有上述噬菌体组合物的饲料添加剂、饮用水添加剂或环境杀菌剂。
本发明的有益效果：
(1)本发明的噬菌体组合物中，噬菌体PLL1和噬菌体F118P13的基因组上均不携带毒力基因和耐药基因，不破坏机体正常肠道菌群，使用安全。
(2)噬菌体PLL1和噬菌体F118P13组合使用，可显著降低抗噬菌体突变率，特别是针对容易变异的病原细菌或超级耐药细菌，具有增强噬菌体治疗效果的优势。将烈性噬菌体PLL1与噬菌体F118P13配伍制成的沙门菌噬菌体鸡尾酒制剂，可从细胞外和细胞内高效裂解鼠伤寒沙门菌，显著降低其抗噬菌体突变率，增加体内噬菌体存留时间，使其不易被机体免疫系统清除；降低鼠伤寒沙门菌体内定植水平，缓解脏器损伤；调节雏鸡肠道菌群健康，是一种安全、高效、特异性强的噬菌体制剂。该噬菌体制剂可成为一种新型环保的、预防和治疗鸡群鼠伤寒沙门菌感染的替代策略。
附图说明
图1：噬菌体PLL1与噬菌体F118P13在鼠伤寒沙门菌ST149与肠炎沙门菌SE3377上产生的噬菌斑图(A)；(B)噬菌体PLL1与噬菌体F118P13的电镜图。
图2：噬菌体PLL1与噬菌体F118P13的生物学特性。(A)抗噬菌体突变率；(B)噬菌体F118P13的体外裂解能力；(C)噬菌体PLL1的体外裂解能力；(D)单一噬菌体与混合噬菌体制剂的体外裂解能力比较；(E)噬菌体PLL1的一步生长曲线。
图3：噬菌体F118P13对鼠伤寒沙门菌ST149的自外裂解机制。(A)噬菌体F118P13在鼠伤寒沙门菌ST149中的增殖曲线；(B)鼠伤寒沙门菌ST149的细菌数；(C)被噬菌体F118P13裂解的鼠伤寒沙门菌ST149透射电镜图。
图4：噬菌体PLL1与噬菌体F118P13的组合物提高鼠伤寒沙门菌感染雏鸡的存活能力。(A)雏鸡存活率；(B)沙门菌在肝、脾、法氏囊及盲肠内容物中的载菌量。
图5：噬菌体PLL1与噬菌体F118P13的组合物可显著提高小鼠抗鼠伤寒沙门菌感染的能力。(A)小鼠存活率；(B)不同脏器中沙门菌载量；(C)体内噬菌体滴度变化；(D)血清中IL-6相对水平；(E)血清中IL-10相对水平；(F)CD4+T细胞在噬菌体治疗中的比例变化；(G)粒细胞；(H)吞噬细胞。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如前所述，鼠伤寒沙门菌是我国人畜共患沙门菌中流行最广的血清型之一，可导致猪、鸡、鸭等多种动物和人患病。但是，随着细菌耐药性的增强及不断变异，许多超级耐药细菌带来严峻治疗困境。噬菌体能够特异性侵染细菌并抑制病菌增殖，目前已有许多关于沙门菌烈性噬菌体的相关报道。但临床上常常面临可分离得到的噬菌体少，或单一噬菌体治疗效果差，多数噬菌体混合制剂主要针对宿主谱问题将不同烈性噬菌体混合，而如何配伍降低临床中抗噬菌体突变率产生仍待解决。
有鉴于此，本发明从养殖场周边污水样品中分离得到一株烈性噬菌体PLL1与一株可导致流产感染的噬菌体F118P13，其中：
噬菌体PLL1为肌尾噬菌体，呈正多面体头部，具有收缩性尾巴，烈性长尾噬菌体F118P13尾部细长，不具收缩性。
噬菌体PLL1和噬菌体F118P13均可裂解鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌和鸡白痢沙门菌等，但两者裂解鼠伤寒沙门菌的作用方式不同：
噬菌体PLL1通过裂解循环增殖并从细胞内部裂解沙门菌，可在鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌产生清晰半透明的小噬菌斑，通过烈性循环产生子代噬菌体，进而通过內溶素和裂解酶从细胞内部裂解鼠伤寒沙门菌，在低浓度条件下即可对鼠伤寒沙门菌产生抑制作用；而噬菌体F118P13在高滴度条件下显著裂解鼠伤寒沙门菌并在其双层平板上产生透明圈，但无单个噬菌斑及子代噬菌体产生，该噬菌体吸附到细胞极性一端，导致细胞膜膨胀、细胞质局部外漏而死亡，同时伴随噬菌体自身的失活，即从细胞外部通过自外裂解方式杀灭鼠伤寒沙门菌，但噬菌体并不能增殖且伴随自身失活，因而在鼠伤寒沙门菌双层平板上无单个噬菌斑产生。
本发明评估了可导致流产感染特征的噬菌体F118P13协同烈性噬菌体PLL1的应用潜力，多重耐药鼠伤寒沙门菌ST149对烈性噬菌体PLL1的抗噬菌体突变率约为10-2，对噬菌体F118P13的抗噬菌体突变率约为10-2，但在两株噬菌体组合情况下，其抗噬菌体突变率显著降低到约10-5。由此可知，噬菌体F118P13和噬菌体PLL1组合使用，能够显著降低病原菌的抗噬菌体突变率，具有协同增效作用。
基于此，将烈性噬菌体与具有流产感染特征的噬菌体配伍制成噬菌体鸡尾酒制剂，可显著降低抗噬菌体突变率，特别是针对临床中容易变异的病原细菌如鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌等，具有增强噬菌体治疗效果的显著优势。
本发明制备的裂解鼠伤寒沙门菌噬菌体鸡尾酒制剂与现有报道的沙门菌噬菌体混合制剂相比，其显著的优点在于：本发明的噬菌体F118P13可导致细菌流产感染，从细胞外部裂解宿主细菌，辅助烈性噬菌体PLL1抑制沙门菌生长，可显著降低易变异的沙门菌对噬菌体产生的抗性突变率。
在腹腔注射感染鼠伤寒沙门菌的雏鸡模型中，灌服3次该噬菌体混合制剂108PFU/只，10天内可显著提高雏鸡存活率，降低肝、脾、法氏囊及盲肠内沙门菌定植水平，调节沙门菌感染导致的肠道菌群紊乱，缓解脏器病变程度。在小鼠模型中，该噬菌体混合制剂可显著提高鼠伤寒沙门菌感染小鼠的存活率，降低肝、脾、胸腺、肾脏中沙门菌载量，缓解脏器病变程度，降低炎症反应，在巨噬细胞和粒细胞等机体免疫系统参与下逐渐清楚体内沙门菌，且具有流产感染特征的噬菌体F118P13在体内发挥主要作用，其体内存留时间更久。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1：烈性沙门菌噬菌体PLL1和噬菌体F118P13的分离与培养
取从养殖场采集的离心过滤的污水10mL，加入浓缩2倍的LB液体培养基10mL，之后按1％体积比加入禽源鼠伤寒沙门菌分离株ST149(晏玲。广东省种禽场沙门菌流行病学调查及分子分型研究，硕士学位论文，2019。)和肠炎沙门菌SE3377(购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，原编号CVCC3377)，37℃震荡培养8～10h，10,000rpm/min离心2min，取上清用0.22μm滤膜过滤得到无菌的噬菌体富集液。用SM缓冲液按10倍梯度倍比稀释，分别点板10μL于含宿主鼠伤寒沙门菌ST149和肠炎沙门菌SE3377的双层琼脂平板上，37℃恒温培养6～12h，观察噬菌斑形成情况。挑取单个噬菌斑于SM缓冲液中，振荡混匀后倍比稀释，取各稀释梯度10μL点板于双层琼脂平板上，如此重复4次后，得到噬菌斑形态一致的噬菌体PLL1和F118P13(图1A)。
采用平板滴板法测定噬菌体宿主谱，结果如表1所示。
表1：噬菌体PLL1与噬菌体F118P13对不同沙门菌的裂解能力
Figure SMS_1
Figure SMS_2
注：++表示具有裂解能力，-表示无裂解能力
结果表明，两株噬菌体均可裂解鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌与鸡白痢沙门菌等；但通过比较不同稀释梯度的噬菌体在不同宿主菌上形成噬斑数的情况，发现噬菌体PLL1在鼠伤寒沙门菌ST149和肠炎沙门菌SE3377噬菌斑数一致，但噬菌体F118P13仅在肠炎沙门菌双层板上产生清晰透明的噬菌斑，不能在鼠伤寒沙门菌双层板上产生噬菌斑，仅在噬菌体滴度高于107PFU/mL条件下裂解鼠伤寒沙门菌而产生透明的裂解圈。
取富集纯化的噬菌体采用负染方法进行染色，于Hitachi H7650透射电镜下观察噬菌体的形态，结果显示噬菌体PLL1具有收缩性尾巴(图1B左)，而噬菌体F118P13尾巴较长且不具收缩性(图1B右)。
实施例2：噬菌体PLL1和噬菌体F118P13的生物学特性测定
1、抗噬菌体突变率测定：
向900μL含108CFU/mL鼠伤寒沙门菌ST149的LB液体中分别加入100μL噬菌体PLL1和噬菌体F118P13单一噬菌体富集液或噬菌体混合制剂(噬菌体PLL1和噬菌体F118P13按体积比1:1比例混合)至终浓度均为108PFU/mL，以不加噬菌体为阴性对照。将各组样品置于37℃100rpm振荡培养1.5h，随后裂解液用含109PFU/mL相应噬菌体的SM缓冲液进行梯度稀释与涂布LB平板，通过比较抗噬菌体突变株在总细菌数目中的比例来计算抗噬菌体突变率。
结果表明，鼠伤寒沙门菌对噬菌体PLL1和噬菌体F118P13单一噬菌体的抗性突变率均为10-2，但对两者混合后的噬菌体鸡尾酒制剂的抗性突变率显著降至10-5，表明该噬菌体鸡尾酒制剂可显著降低抗噬菌体突变率(图2A)。
2、噬菌体体外裂解能力测定：
向培养至稳定期的108CFU/mL的鼠伤寒沙门菌ST149中按感染复数(MOI)分别为10、1、10-1、10-2比例加入噬菌体，每隔1h用酶标仪测定OD600，至培养6h结束。
结果显示，噬菌体PLL1可以在上述各MOI条件下显著抑制鼠伤寒沙门菌生长(图2B)，而噬菌体F118P13仅在MOI为1和10的条件下显著抑制ST149生长(图2C)，噬菌体混合制剂则比任何单一噬菌体抑菌能力更优(图2D)。
3、噬菌体PLL1的一步生长曲线
鉴于噬菌体PLL1可以在上述各MOI条件下抑制鼠伤寒沙门菌ST149的增殖，因此选取MOI＝0.1条件加入噬菌体，混匀后置于37℃培养箱中静置孵育10min。之后，将该孵育液4℃条件下10,000rpm离心3min，弃上清，用4℃预冷的LB液体培养基洗涤沉淀细胞1遍，最后用等体积LB液体培养基重悬，混匀后置于37℃摇床180rpm培养120min。从0min开始，每隔10min取样500μL，样品加2-3滴氯仿，涡旋振荡1min后，10000rpm离心2min，取上清进行梯度稀释，每个浓度梯度取10μL点板于含ST149的双层平板，吹干后置于37℃培养箱内过夜培养。计算噬菌体滴度，并绘制噬菌体增殖曲线。结果显示，噬菌体PLL1可以不断增殖，2h内可以从102至109PFU/mL，裂解量为50PFU/cell(图2E)。
4、噬菌体F118P13对鼠伤寒沙门菌ST149的裂解机制
由于噬菌体F118P13仅在噬菌体滴度高于107PFU/mL条件下裂解鼠伤寒沙门菌而产生透明的裂解圈，裂解曲线显示仅MOI为1或10条件下有显著抑菌能力，因此选取MOI＝10条件下测定该噬菌体的增殖能力，初始细菌浓度108CFU/mL，初始噬菌体滴度109PFU/mL，于37℃180rpm振荡培养2h，每隔15min取样。样品加2-3滴氯仿涡旋振荡1min后，10,000rpm离心2min，取上清进行梯度稀释，每个浓度梯度取10μL点板于含SE3377的双层平板，吹干后置于37℃培养箱内过夜培养。计算噬菌体滴度，并绘制噬菌体增殖曲线。结果显示，噬菌体F118P13不能在鼠伤寒沙门菌ST149中增殖，反而伴随噬菌体滴度降低(图3A)；在感染15min后，活细菌数约下降2个数量级(图3B)。
噬菌体在裂解过程中使自身失活是噬菌体导致流产感染的基本特征之一，被感染的菌株通过一系列机制杀死自身被感染的细胞，从而抑制病毒增殖并为细胞群体提供免疫保护。因此，流产感染是噬菌体的一种特征，并非所有噬菌体都有流产感染的特性。为探究该噬菌体裂解鼠伤寒沙门菌的初步机制，使用透射电镜进一步观察被裂解菌株的形态。取上述培养2h后的细菌样品10mL，4℃12,000rpm离心5min，取沉淀细胞用预冷的生理盐水洗涤1遍，最后用预冷的生理盐水浓缩到100μL。取10μL样品滴于铜网上，自然沉淀2min，加2％的磷钨酸染色1min后，用滤纸从侧面吸去染料，自然干燥。使用Hitachi H7650透射电镜观察噬菌体的形态，加速电压为80kV。结果如图3C显示，细胞仅在细胞极性一端受损，不同于烈性噬菌体通过內溶素和裂解酶从细胞内多个部位裂解细菌。对该噬菌体尾钉蛋白(UMO77709.1)进行BLAST分析，结果与短尾噬菌体P22的尾丝蛋白序列一致性为80.4％，含糖苷水解酶活性结构域，且3个酶活催化位点保守(图3D)。以上结果提示，大量噬菌体F118P13吸附在细胞一端水解细胞胞外多糖结构，造成细胞损伤而死亡。
综上，噬菌体PLL1是一株烈性噬菌体，噬菌体F118P13是一株可导致流产感染的烈性噬菌体。将噬菌体PLL1和噬菌体F118P13进行生物保藏，保藏信息如下：
噬菌体PLL1的保藏编号为CCTCC M 20222004，生物材料的分类命名的拉丁文名称为Salmonella phage PLL1，保藏时间为2022年12月23日，保藏机构为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学。
噬菌体F118P13的保藏编号为CCTCC M 20222003，生物材料的分类命名的拉丁文名称为Salmonella phage F118P13，保藏时间为2022年12月23日，保藏机构为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学。
实施例3：噬菌体鸡尾酒制剂的制备
将噬菌体PLL1和噬菌体F118P13的富集液按体积比1:1混合，混合后的液体中，噬菌体PLL1和噬菌体F118P13的效价均为108PFU/mL，即制备得到噬菌体鸡尾酒制剂。
实施例4：噬菌体鸡尾酒制剂在雏鸡模型中的应用
将1日龄SPF雏鸡平均分成4组，分别为：阴性对照组、噬菌体对照组、攻毒组(ST149)和噬菌体治疗组(ST149+噬菌体)，每组12只。
1日龄时，攻毒组与噬菌体治疗组腹腔注射100μL1×108CFU/mL泛耐药鼠伤寒沙门菌ST149，阴性对照组与噬菌体对照组腹腔注射100μLPBS。攻毒后8、32和56h，噬菌体治疗组与噬菌体对照组分别灌服1mL 1×108PFU/mL实施例3制备的噬菌体鸡尾酒制剂，攻毒组与阴性对照组则灌服1mLSM缓冲液。
在第7d统计各组存活率并对各组鸡只进行称重，随机剖检6只，观察脏器病理变化并计数各脏器载菌量。
结果显示，阴性对照组、噬菌体对照组和噬菌体治疗组雏鸡存活率100％(图4A)；说明该噬菌体鸡尾酒制剂可提高鼠伤寒沙门菌感染雏鸡的存活率。
与攻毒组相比，噬菌体治疗组能够降低肝、脾、法氏囊和盲肠内容物中沙门菌载量，减轻脏器病变(图4B)。
实施例5：噬菌体鸡尾酒制剂在小鼠模型中的应用
鼠伤寒沙门菌等非伤寒类沙门菌的全身侵袭性感染常发生在婴幼儿、老人或免疫力低下的人群，为探究该噬菌体混合制剂的防治效果及机体免疫系统的作用，首先通过腹腔注射ICR5周龄小鼠建立鼠伤寒沙门菌全身感染模型，确定鼠伤寒沙门菌ST149的致病力。结果显示108CFU腹腔感染可致100％小鼠死亡，107CFU攻毒导致小鼠4天内死亡率为16.7％，14天内死亡率为83.3％，而106CFU感染14d内未导致小鼠死亡。
随后以107CFU(100μL)鼠伤寒沙门菌ST149感染的小鼠为攻毒对照组(标记为ST149或ST)；噬菌体治疗组(标记为ST149+噬菌体，或者标记为ST+Φ)则分别在感染前18h及感染后1d和2d腹腔注射100μL实施例3制备的噬菌体鸡尾酒制剂；噬菌体对照组(标记为Φ)不攻毒，注射与噬菌体治疗组同等剂量的实施例3制备的噬菌体鸡尾酒制剂；阴性对照组(标记为Con)不攻毒，腹腔注射同等剂量PBS以代替沙门菌和噬菌体。
每天观察小鼠精神状态并记录其死亡情况。在沙门菌感染后每3d随机挑选3只存活小鼠，称重后，从眼眶下静脉丛采血用于ELISA测定血清中白介素水平。所用IL-6和IL-10ELISA试剂盒购自江苏太仓依科赛(ExCell Bio)生物科技有限公司，具体测定方法参考说明书进行。使用异氟烷对小鼠进行呼吸麻醉后，取肝脏、脾脏、胸腺、肾脏于含1mLPBS的离心管中用于细菌与噬菌体计数。对于沙门菌计数，将样品匀浆后，直接稀释点板于XLD平板；对于脏器中噬菌体PLL1和F118P13滴度测定，向样品中加入2-3滴氯仿，涡旋振荡后离心，取上清进行梯度稀释，分别点板于含沙门菌ST149和SE3377的双层板。此外，另取一部分脾脏样品于含有10％FBS的1640培养基中，并立即液氮冻存用于流式细胞术测定脾细胞中的淋巴细胞亚群比例。主要具体步骤如下：分离淋巴细胞后加细胞冻存液，程序性梯度降温，保存于液氮中；之后，使用含胎牛血清的1640细胞培养基复苏细胞；台盼蓝染色后，分别用FITC标记的抗体CD3和eFlour 450标记的抗体CD4荧光染色混合体系、FITC标记的CD11bM1/70和SB436标记的F4/80抗体(ThermoFisher公司)荧光染色混合体系进行染色，同时使用流式微球制作单染样品，用于调节补偿；沉淀细胞加入eBioscienceTMFixable ViabilityDye，4℃避光孵育30min；PBS洗涤沉淀后，加200-400μL流式上样缓冲液上机检测。FlowJo软件分析流式结果，其中CD3+CD4+标记CD4+T细胞，CD11b+F4/80+标记巨噬细胞，使用前向散射光FSC及侧向散射光SSC对组织细胞进行分群，并圈定中性粒细胞；并分别计算各细胞种类在活细胞中的占比。
结果显示，鼠伤寒沙门菌全身性感染模型可导致小鼠100％死亡，而噬菌体治疗可提高沙门菌感染小鼠的存活率至100％(图5A)；减缓鼠伤寒沙门菌在体内脾脏、胸腺等脏器的增殖与扩散速度(图5B)；体内噬菌体滴度测定结果显示，可导致鼠伤寒沙门菌流产感染的噬菌体F118P13滴度总体高于噬菌体PLL1约100倍，表明噬菌体F118P13更不容易被机体免疫系统清除(图5C)；噬菌体治疗可显著降低血清中IL-6和IL-10的水平，表明该噬菌体制剂可降低炎症反应，从而缓解脏器损伤(图5D)。CD4+ T细胞对于控制沙门菌早期感染非常重要，而中性粒细胞则在噬菌体治疗中发挥重要作用。本研究流式细胞术结果显示，沙门菌感染后第3d和第6d CD4+ T细胞均显著低于阴性对照组(Con)，而噬菌体治疗则缓解了小鼠第3d和第6d时CD4+ T细胞降低，协同噬菌体抑制体内沙门菌增殖；粒细胞在沙门菌感染后第3d和第6d急剧上升，表明体内急性炎症爆发，而噬菌体治疗则延缓了感染前期粒细胞上升速度，在感染第9d粒细胞达到峰值，之后随沙门菌降低而逐渐降低；巨噬细胞可吞噬沙门菌，但其在沙门菌感染后第3d被抑制，之后升高，而噬菌体治疗第3d缓解了巨噬细胞被抑制的局面，协同噬菌体逐渐清除体内沙门菌(图5F-H)。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种噬菌体组合物，由保藏编号为CCTCC M 20222004的噬菌体PLL1和保藏编号为CCTCC M 20222003的噬菌体F118P13组成。
2.根据权利要求1所述的噬菌体组合物，其特征在于，噬菌体组合物中，各噬菌体的效价分别单独的为108-109PFU/ml。
3.一种噬菌体鸡尾酒制剂，其特征在于，所述噬菌体鸡尾酒制剂以权利要求1或2所述的噬菌体组合物为活性成分。
4.根据权利要求3所述的噬菌体鸡尾酒制剂，其特征在于，所述噬菌体鸡尾酒制剂中，噬菌体PLL1和噬菌体F118P13的剂量均大于或等于106PFU/ml。
5.根据权利要求3所述的噬菌体鸡尾酒制剂，其特征在于，所述噬菌体鸡尾酒制剂中还包括药学上可接受的辅料。
6.根据权利要求5所述的噬菌体鸡尾酒制剂，其特征在于，所述药学上可接受的辅料包括分散剂、稳定剂、填料和溶剂中的一种或几种。
7.根据权利要求3-6任一项所述的噬菌体鸡尾酒制剂，其特征在于，所述噬菌体鸡尾酒制剂的剂型为液体制剂、冻干制剂或口服固体制剂。
8.权利要求1或2所述的噬菌体组合物或者权利要求3-7任一项所述的噬菌体鸡尾酒制剂在如下(1)-(3)任一项中的应用：
(1)降低病原体的抗噬菌体突变率；
(2)制备抑制或杀灭沙门氏菌的产品；
(3)制备预防和/或治疗沙门氏菌感染的药物。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述沙门氏菌为鼠伤寒沙门菌或肠炎沙门菌。
10.含有权利要求1或2所述的噬菌体组合物的饲料添加剂、饮用水添加剂或环境杀菌剂。
CN202310016970.XA 2023-01-06 2023-01-06 一种噬菌体组合物及其应用 Pending CN116144611A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310016970.XA CN116144611A (zh) 2023-01-06 2023-01-06 一种噬菌体组合物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310016970.XA CN116144611A (zh) 2023-01-06 2023-01-06 一种噬菌体组合物及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116144611A true CN116144611A (zh) 2023-05-23

Family

ID=86357656

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310016970.XA Pending CN116144611A (zh) 2023-01-06 2023-01-06 一种噬菌体组合物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116144611A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Reyes-Robles et al. Vibrio cholerae outer membrane vesicles inhibit bacteriophage infection
Wang et al. Use of bacteriophage in the treatment of experimental animal bacteremia from imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa
TWI459951B (zh) 新穎噬菌體及含該噬菌體之抗菌組成物
CN113416712B (zh) 一株宽裂解谱沙门氏菌噬菌体及其应用
CN113583972B (zh) 一株可降低抗生素耐药性的大肠杆菌噬菌体及其应用
CN114306616B (zh) 脆弱拟杆菌和免疫检查点抑制剂的新应用
CN114717199B (zh) 一株不具转导耐药基因能力的沙门菌噬菌体ckt1及其应用
JP5720045B2 (ja) スタフィロコッカス・アウレウス溶菌性バクテリオファージ
WO2020133805A1 (zh) 一种具有抗流感能力的益生菌混合制剂及其应用
US20190359948A1 (en) Novel pseudomonas aeruginosa bacteriophage pse-aep-3 and use thereof for inhibiting proliferation of pseudomonas aeruginosa
CN111718907A (zh) 新型溶藻弧菌噬菌体、其组合物及其应用
CN110093321B (zh) 噬菌体AH10-Phage-QY01在制备治疗或防控水产养殖细菌疾病药物的用途
KR101830892B1 (ko) 살모넬라, 병원성 대장균 o157 및 이질균에 대해 동시에 숙주감수성을 나타내는 박테리오파지 bsp10 및 이를 함유하는 조성물
CN116870118B (zh) 一种杂化膜囊泡及其制备方法和抗菌应用
CN111494431B (zh) 益生菌在制备治疗肝脏疾病制剂中的应用
CN116144611A (zh) 一种噬菌体组合物及其应用
CN116286671A (zh) 一株沙门氏菌噬菌体sp8、噬菌体组合物及其应用
CN114480302B (zh) 一株海藻希瓦氏菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
Jahrling et al. Correlates to increased lethality of attenuated Venezuelan encephalitis virus vaccine for immunosuppressed hamsters
Zhong et al. P2X4 receptor modulates gut inflammation and favours microbial homeostasis in colitis
CN111363723B (zh) 新型霍乱弧菌噬菌体及其应用
US10286019B2 (en) Therapeutic bacteriophages
CN114736875B (zh) 一种鸭疫里默氏杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN114763539B (zh) 一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体、其噬菌体组合物及其应用
CN117887671A (zh) 一株防止抗性产生的多价大肠杆菌噬菌体在家禽养殖中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination