KR20230136878A - 면역 회피성 박테리오파지 및 이의 용도 - Google Patents

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유정식
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Abstract

본 발명은 캡시드에 신규의 면역 회피성 펩티드를 포함하는 박테리오파지 및 이의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로 상기 신규의 면역 회피성 펩티드는 체내 면역 작용을 회피함으로써, 오랜 기간 혈액을 따라 순환될 수 있어 세균에 의한 감염증 예방 또는 치료 효과를 제공하며, 기존 항생제에 내성을 가진 다제내성균의 효과적인 치료제로서 활용될 수 있다.

Description

면역 회피성 박테리오파지 및 이의 용도{IMMUNOLOGICALLY CLOAKING BACTERIOPHAGE AND USE THEREOF}
본 발명은 면역 회피성 박테리오파지에 관한 것으로서, 상세하게는 대식세포의 자가 인식을 유도하는 펩티드를 캡시드에 포함한 박테리오파지 및 이의 용도에 관한 것이다.
항생제의 남용으로 박테리아들은 항생제 내성을 획득하고 있다. 이에 대응해 신규 항생제가 개발되고 있으나, 대부분 기존 항생제처럼 박테리아 내 대사 활동을 방해하는 약제이며, 이에 따라 박테리아가 exclusion pump, 세포 투과성 감소 등 유사한 메커니즘으로 내성을 획득할 수 있기 때문에 내성 발생 속도는 점점 빨라지고 있다.
한편, 박테리오파지는 박테리아를 감염시키는 바이러스로, 생물권에서 광범위하게 분포하고 있으며, 토양과 해수에도 매우 높은 농도로 존재한다. 박테리오파지는 종류에 따라 특정 박테리아를 선택적으로 감염시키는데, 이러한 성질을 이용하여 항생제 용도로 사용하기 위한 여러 시도들이 이루어져 왔다.
그러나 포유류 체내 면역으로 인해 박테리오파지가 제거되는 문제가 발생하여 실용화되기에는 여전히 한계가 존재하고, 포유류 체내의 비특이적 면역작용으로 박테리오파지가 박테리아 살균 이전에 제거되어 감염치료 효과가 떨어진다는 문제가 있다.
이에 박테리오파지의 면역 제거를 지연시킴으로써 체내 존속 시간을 증대시키기 위한 시도로서 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같은 고분자를 박테리오파지 표면에 도입하는 연구가 수행되었다. 그러나 PEG는 박테리오파지의 표면에 박테리오파지 및 박테리아 사이의 상호작용을 방해하는 입체 장벽을 형성할 수 있다. 또한 최초 PEG로 표지된 박테리오파지가 증식할 경우, 증식한 박테리오파지에는 PEG이 표지되지 않기 때문에 PEG에 의한 효과가 사라지게 된다. 그러므로 증식된 박테리오파지에 의한 박테리아 제거 효과는 기대하기 어렵고, 지속적인 화학적 처리가 필요한 단점도 있다.
따라서 기존에 사용되던 항생 물질외에 바이러스나 박테리아를 응용한 항생제 개발을 위해 생체 내에 존재하는 면역 작용을 회피하는 방안에 대한 기술이 필요하다.
본 발명은 캡시드(capsid)에 면역 회피성 펩티드를 포함하는 박테리오파지를 제공하고, 이를 활용한 항균 조성물, 세균에 의해 유발되는 감염증의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물, 및 항균 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명에 따른 면역 회피성 박테리오파지를 포함하는 항균 조성물은 기존 항생제에 내성을 가지는 다제내성균에 효과적인 치료제 제공을 목적으로 한다.
아울러, 본 발명은 식품 첨가제, 또는 사료 첨가제 등 다양한 분야에서 활용될 수 있는 항균 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 캡시드(capsid)에 서열번호 1(ADARYKS), 서열번호 2(AGHVVPR), 서열번호 3(MPRLPPA), 서열번호 4(QTEKNPL), 서열번호 5(SILPVTR) 및 서열번호 6(YRAIPSP)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역 회피성 펩티드를 포함하는 박테리오파지를 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 박테리오파지는 용균성(lytic)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 박테리오파지는 T7, T3 β-phage, Phage C1, H-19B, ΦFC3208, ΦN315, Φ13, ΦMu50A, ΦETA, PVL, PV83, T12, CS112, 315.2, 및 M30로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한 본 발명은 상술한 박테리오파지를 포함하는, 세균에 의해 유발되는 감염증의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세균은 대장균(E. coli), 시겔라소네이균(Shigella sonnei) 및 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium), 코네리박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 클로스트리듐 보툴리누스(Clostridium botulinum), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 화농연쇄상구균(Streptococcus pyogenes) 및 콜레라균(Vibrio cholera)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 감염증은 장염, 세균성 이질, 디프테리아(diphtheria), 급성발열, 성홍열, 콜레라 및 식중독으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 감염증일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 개체 내 항균 방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 상술한 박테리오파지를 포함하는 항균(anti-bacterial) 조성물을 제공할 수 있다.
아울러 본 발명은 상기 항균 조성무을 포함하는 항균용 식품 첨가제 및 사료 첨가제를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 면역 회피성 펩티드가 도입된 박테리오파지는 체내 면역 작용을 회피할 수 있어, 오랜 기간 혈액을 따라 순환될 수 있기 때문에 세균에 의한 감염증의 치료 및 예방 효과가 매우 우수하다.
또한 본 발명은 기존 항생제에 내성을 가진 다제내성균의 효과적인 치료제로도 활용될 수 있으며, 식품 첨가제 및 사료 첨가제에도 면역 회피성이 널리 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실험예 1에 따라 수행된 바이오패닝 결과 선별된 7-mer 펩티드 서열들을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명 실험예 2에 따른 서열번호 1로 표시되는 면역 회피성 펩티드(ADARYKS)를 코딩하는 서열이 삽입되는 T7 박테리오파지 10B캡시드 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명 실험예 2에 따른 서열번호 1로 표시되는 면역 회피성 펩티드(ADARYKS)가 포함된 T7 박테리오파지의 DNA 시퀀싱 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명 실험예 3에 따른 면역 회피성 T7 박테리오파지의 J774a.1 대식세포에 대한 식작용 회피 효과를 형광 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 5는 본 발명 실험예 3에 따른 면역 회피성 T7 박테리오파지의 J774a.1 대식세포에 대한 식작용 회피 효과와 관련된 유세포분석 결과이다.
도 6는 본 발명 실험예 4에 따라 야생형(WT) 및 면역 회피성 펩티드(ADARYKS)가 도입된 T7 박테리오파지를 각각 주사한 마우스로부터 채취한 혈액 내 생존하고 있는 파지 수를 플라크 형성 어세이로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명 실험예 5에 따라 마우스 감염모델에 야생형(WT) 및 면역 회피성 펩티드(ADARYKS)가 도입된 T7 박테리오파지를 각각 주사해 치료 효능을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여 본 발명에 따른 면역 회피성 박테리오파지에 대하여 상세히 설명한다.
본 명세서에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
본 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미하고, 중량%는 달리 정의되지 않는 한 전체 조성물 중 어느 하나의 성분이 조성물 내에서 차지하는 중량%를 의미한다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 수치 범위는 하한치와 상한치와 그 범위 내에서의 모든 값, 정의되는 범위의 형태와 폭에서 논리적으로 유도되는 증분, 이중 한정된 모든 값 및 서로 다른 형태로 한정된 수치 범위의 상한 및 하한의 모든 가능한 조합을 포함한다. 본 발명의 명세서에서 특별한 정의가 없는 한 실험 오차 또는 값의 반올림으로 인해 발생할 가능성이 있는 수치범위 외의 값 역시 정의된 수치범위에 포함된다.
또한, 본 명세서의 용어, "포함한다"는 "구비한다", "함유한다", "가진다" 또는 "특징으로 한다" 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다.
또한, 본 명세서의 용어, "실질적으로~ 포함하지 않는다"는 특정된 요소, 재료 또는 공정과 함께 열거되어 있지 않은 다른 요소, 재료 또는 공정이 발명의 적어도 하나의 기본적이고 신규한 기술적 사상에 허용할 수 없을 만큼의 현저한 영향을 미치지 않는 양 또는 정도로 존재할 수 있는 것을 의미한다.
박테리오파지는 세균(bacteria)를 숙주로 이용해 증식하는 바이러스로서 인간 및 인간 외의 동물에서 다양한 감염증을 일으키는 세균들을 제거하는데 이용할 수 있다. 그러나 박테리오파지 자체도 생체 내에서 생체 외부 물질로 인식되기 때문에 세망내피계(reticuloendothelial system (RES)) 등 생물의 다양한 면역 체계에 의하여 제거(immnune clearance)될 수 있다. 특히, 대식세포(macrophage)의 식균작용(phagocytosis)에 의한 바이러스의 제거는 비특이적으로 미생물을 제거하기 때문에 생체 내로 주입된 박테리오파지는 단기간에 제거될 수 있다.
본 발명 명세서에서 "면역 회피성 펩티드"는 생체 내에서 원래부터 존재하거나 내재되어 있던 펩티드, 혹은 생체 내의 면역 작용에 의한 제거(clearance) 신호를 막아 줄 수 있는 펩티드를 의미한다. 이때 면역 회피성 펩티드는 특정 단백질로부터 분리하거나, 재조합 미생물로부터 생산, 또는 인위적인 합성 등을 통해서 얻을 수 있다.
본 발명에서 면역 회피성 펩티드는 생체 내 면역 체계 중, 특히 비특이적으로 미생물을 제거할 수 있는 식세포에 의한 식균작용을 회피할 수 있도록, 식세포에 면역 작용 억제 신호를 보낼 수 있는 펩티드라면 제한되지 않는다.
구체적으로 본 발명에서의 면역 회피성 펩티드는 서열번호 1(ADARYKS), 서열번호 2(AGHVVPR), 서열번호 3(MPRLPPA), 서열번호 4(QTEKNPL), 서열번호 5(SILPVTR) 및 서열번호 6(YRAIPSP)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역 회피성 펩티드일 수 있다.
본 발명은 캡시드에 상기 면역 회피성 펩티드를 포함하는 박테리오파지를 제공함으로써, 대식세포에 의한 식균작용을 회피하면서 효과적으로 항균 효과를 달성할 수 있다.
일 예로서, 박테리오파지는 용균성(lytic)일 수 있다. 즉, 박테리오파지는 세균 세포벽 수용체에 부착되어 세포 내부로 박테리오파지 DNA를 주입함으로써, 박테리오파지의 DNA가 복제되고, 이는 세균을 파괴하기에 이를 수 있다. 이때 박테리오파지는 구체적으로 예를 들면, T7, T3 β-phage, Phage C1, H-19B, ΦFC3208, ΦN315, Φ13, ΦMu50A, ΦETA, PVL, PV83, T12, CS112, 315.2, 및 M30 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 박테리오파지의 캡시드에 발현된 면역 회피성 펩티드가 식세포의 다양한 신호조절단백질(signal regulatory protein)과 상호작용하여 식세포의 식균작용에 의한 제거를 회피할 수 있다. 구체적으로, 상기 면역 회피성 펩티드는 파지 캡시드의 C-말단(C-terminal)에 연결되어 발현되고, 캡시드에서 외부로 노출되어 면역세포와 상호작용(self-peptide receptor interaction)하여 면역세포의 작용으로부터 박테리오파지가 제거되지 않도록 할 수 있다.
본 발명에서 면역 회피성 펩티드는 박테리오파지의 캡시드에서 발현되어 외부로 노출될 수 있다. 캡시드에서 발현되어 외부로 노출된 면역 회피성 펩티드는 면역 작용에 필요한 생체 내 신호를 억제하거나, 면역 작용으로부터 회피할 수 있는 상호작용을 수행할 수 있다.
본 발명에서 면역 회피성 펩티드는 박테리오파지의 캡시드(capsid, coat protein)에 포함되고, 캡시드 외부로 노출될 수 있다. 면역 회피성 펩티드가 포함된 캡시드는 박테리오파지 캡시드 중 머리(head)를 이루는 캡시드가 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, T7 박테리오파지의 경우 T7 박테리오파지 서열과 면역 회피성 펩티드의 재조합(recombinant)을 통해 면역 회피성 펩티드가 외피 단백질(coat protein) 중 10B의 C-말단에 연결되어 발현될 수 있다. 면역 회피성 펩티드는 캡시드를 이루는 단백질 중 다수를 차지하는 메이저 캡시드에만 연결되어 발현될 수 있는 것은 아니며, 마이너 캡시드에 발현되도록 T7 박테리오파지를 구축(construction)할 수 있다. 이러한 면역 회피성 펩티드를 연결하는 캡시드의 종류 차이는 면역 회피성을 가지도록 구축된 박테리오파지(constructed bacteriophage)의 면역 회피성 정도에 차이가 있을 수 있을 뿐 본 발명에서 목적하는 효과가 달라지는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, T7 박테리오파지의 캡시드인 10B에서 면역 회피성 펩티드가 발현되도록 박테리오파지를 구축하면, T7 박테리오파지의 헤드를 형성하는 415개의 10B에 면역 회피성 펩티드가 매우 균일하게 발현되어 외부로 노출될 수 있다. 이러한 발현의 균일성은 면역 회피를 위한 신호 전달 및 식세포 표면의 수용체와 일어나는 상호작용을 매우 효율적으로 할 수 있다.
본 발명의 면역 회피성 펩티드는 박테리오파지의 종류에 따라 박테리오파지의 서열과 재조합하는 방법이 달라질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 박테리오파지의 서열과 재조합하려는 면역 회피성 펩티드의 핵산 서열을 디자인하고, 당업계에 공지된 기술을 활용하여 이를 포함하는 벡터 및 제한효소를 통해 박테리오파지의 핵산에 면역 회피성 펩티드를 코딩하는 서열을 재조합 할 수 있다.
본 발명에서 상술한 박테리오파지 외에도 인간 또는 인간외 동물에 유해한 박테리오파지가 아니라면 특별히 제한되지 않는다. 용균성 박테리오파지는 박테리오파지의 숙주인 세균을 용균시켜 증식하므로 감염증을 유발하는 세균을 사멸시킬 수 있다. 또한 숙주인 세균이 존재하는 한, 면역 회피성 펩티드가 발현될 수 있는 박테리오파지가 계속 증식할 수 있다. 자가 증식으로 생성된 후세대 박테리오파지도 본 발명의 박테리오파지와 동일하게 캡시드에 면역 회피성 펩티드를 포함하고 있어 본 발명의 목적 및 효과를 그대로 가질 수 있다.
이러한 특징은 면역 회피성 펩티드가 수식된 나노입자와 구분되는 중요한 특징으로, 면역 회피성 펩티드가 수식된 나노입자는 스스로 증식할 수 없어 시간에 따라 그 수가 감소할 수 밖에 없다. 그리고 감염증의 정도에 따라 면역 회피성 펩티드가 수식된 나노입자를 지속적으로 주입해야 하고, 과량의 나노입자 주입에 의한 생체 내 이상 증상이 나타날 수 있는 한계가 있다.
본 발명에 따르면 목적 위치에 박테리오파지를 전달하기 위한 담체(carrier)도 필요하지 않을 수 있다. 또한 박테리오파지는 치료제로 사용할 수 있을 정도로 안전성도 검증되어 있다.
나아가, 본 발명의 박테리오파지는 자가 펩티드가 수식된 나노입자의 제조와 같이 나노입자 및 펩티드의 합성과 이들의 공유결합 형성에 필요한 복잡한 화학적 반응 유도도 필요하지 않은 이점이 있다.
본 발명은 캡시드에 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 면역 회피성 펩티드 중 하나 이상을 포함하는 박테리오파지를 활용하여 세균에 의한 감염증의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 박테리오파지를 포함한 약학적 조성물은 치료 또는 예방 대상인 세균 감염증의 종류에 적합하도록 박테리오파지를 선택할 수 있다. 세균 감염증은 장염, 세균성 이질, 디프테리아(diphtheria), 급성발열, 성홍열, 콜레라 및 식중독에서 선택되는 하나 이상이나 이에 제한되는 것은 아니다. 치료 또는 예방 대상의 세균 감염증을 유발하는 세균의 종류에 따라 해당 세균을 숙주로 하는 박테리오파지를 달리할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 약학적 조성물 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 항균 방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 약학적 조성물 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 세균에 의해 유발되는 감염증 치료 방법을 제공할 수 있다.
상기 개체는 인간 및/또는 인간을 제외한 동물일 수 있다. 상기 약학적 조성물을 경구로 투여하거나 주사로 투여할 수 있고, 투여 방법은 이에 반드시 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 혈관 투여 및 복강 투여로 각각 상이한 방법으로 박테리오파지를 투여하여도 면역 회피 작용 효과가 있고, 감염증의 치료가 가능하다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 박테리오파지의 투여량은 제한되지 않으나 혈액 내 식세포 수를 측정하여 적합한 투여량을 결정할 수 있다. 바람직하게는 식세포 수 대비 10 내지 100배이나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 캡시드에 면역 회피성 펩티드를 포함하는 박테리오파지를 활용하여 항균(anti-bacterial) 조성물을 제공할 수 있다.
이때 '항균'은 세균의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제 또는 제거하는 능력을 의미할 수 있다. 본 발명의 항균 조성물은 인간 및 인간을 제외한 동물에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에서 항균 대상은 대장균(E.coli), 시겔라소네이균(Shigella sonnei) 및 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium), 코네리박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 클로스트리듐 보툴리누스(Clostridium botulinum), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 화농연쇄상구균(Streptococcus pyogenes) 및 콜레라균(Vibrio cholera)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항균 조성물은 식품, 식품 첨가제, 사료 또는 사료첨가제 형태일 수 있다.
일 예로서, 캡시드에 면역 회피성 펩티드를 포함하는 박테리오파지를 활용하여 세균에 의한 감염증 예방용 건강기능성 식품을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 건강기능성 식품으로는 특별히 제한되는 것은 아니나 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
상기 유효성분은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.001 내지 15중량%, 구체적으로 0.01 내지 1중량%로 포함될 수 있으며, 음료 조성물의 경우 100 ㎖를 기준으로 0.001 내지 1 g, 구체적으로 0.01 내지 0.1 g의 비율로 포함될 수 있으나 이는 일 예일 뿐 상기 수치범위에 제한받지 않는다.
본 발명에 따른 건강기능성 식품은 필수 성분으로서 상기 면역 회피성 펩티드를 포함하는 박테리오파지를 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다. 상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A, 글리시르히진, 사카린, 아스파르탐 등을 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명에 따른 건강기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그 밖에 본 발명에 따른 건강기능성 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 건강기능성 식품의 제조방법은 특별히 제한되는 것은 아니며, 일반적으로 널리 알려진 식품의 제조방법을 도입하여 활용하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 변형하여 사용할 수도 있다.
본 발명에 따른 항균 조성물이 사료 첨가제로 사용되는 경우 고체 또는 액체 제조물 또는 이의 대안물의 형태로 사용될 수 있다. 고체 제조물의 예는 습윤 가능, 분무 건조, 또는 동결 건조될 수 있는 분말, 페이스트, 볼루스, 캡슐, 펠렛, 정제, 분진, 및 과립을 포함한다. 액체 제조물의 예는 수성, 유기 또는 수성-유기 용액, 현탁액 및 에멀젼을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일 실시예로서, 사료 첨가제는 사료와 혼합되거나 음용수에 투여되어 사용될 수 있다.
이하 실시예를 통해 본 발명에 대하여 더욱 상세히 설명한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 하나의 참조일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 여러 형태로 구현될 수 있다.
실험예 1. 바이오패닝(biopanning)
파지디스플레이를 이용한 바이오패닝을 통하여 대식세포의 식작용(phagocytosis)에 의해 제거되지 않고 살아남은 박테리오파지를 선별하였다.
구체적으로, 6-웰 세포배양 플레이트의 각 웰에 1×106 개씩의 U937 세포를 깔고 RPMI 배양액에서 하룻동안 CO2 배양기에서 배양하였다. 파지 라이브러리는 NEW ENGLAND BioLabs의 Ph.D.-7 Phage Display Peptide Library Kit를 사용하였다. M13 박테리오파지가 1×1012 pfu/㎖ 들어가도록 U937 세포와 박테리오파지를 1시간 동안 공배양하였다. 125×g에서 7분간 원심분리기로 세포와 세포에 결합하지 않은 파지를 포함하는 배양액을 분리하였다. U937 세포의 표면에 결합은 하였으나, 식작용에 의해 분해되지 않은 파지를 글라이신 버퍼를 이용해 용리를 유도하여 파지를 수확하였다. 회수된 파지로 상기의 바이오패닝을 3회 실시하였고, 최종적으로 U937 세포의 식작용에 의해 제거되지 않은 파지의 DNA 염기서열을 분석하였다. 그 결과는 도 1 및 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1] 선별된 면역 회피성 펩티드
실험예 2. 면역 회피성 펩티드 기능평가를 위한 T7 파지 클로닝
체내에서 면역 회피성 펩티드의 기능을 평가하기 위한 플랫폼으로 구형에 가까운 이십면체의 구조를 지닌 T7 파지가 선형의 구조를 지닌 M13 파지보다 효과적이라 판단되어, 바이오패닝으로 선별된 면역 회피성 펩티드 서열번호 1(ADARYKS)가 도입된 T7 파지를 제조하였다.
구체적으로, T7 파지의 캡시드 단백질 10B에 면역 회피성 펩티드를 발현시키기 위해서 Novagen사의 T7Select415-1b 클로닝벡터를 사용하였고, 서열번호 1로 표시되는 면역 회피성 펩티드를 T7 파지 캡시드에 발현시키기 위해서 두 개의 단일가닥 DNA 서열을 디자인하여 사용하였다. 합성된 서열은 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2]
상기의 단일가닥 DNA 한 쌍을 94 ℃까지 온도를 높인 다음 온도를 천천히 16 ℃까지 내려 상보결합을 유도하여 삽입 DNA를 제조하였다. T7Select415-1b 벡터 DNA를 제한효소 EcoRI과 HindIII로 절단하고, 0.5% 아가로즈젤 전기영동을 실시한 후 정제하였다. 벡터 DNA와 삽입 DNA를 T4 DNA Ligase를 사용하여 라이게이션 하여 T7 파지 10B 캡시드 단백질의 C-말단에 면역 회피성 펩티드가 발현되도록 하였다.
최종적으로 DNA 시퀀싱을 통해서 염기서열을 분석하여, 서열번호 1로 표시되는 면역 회피성 펩티드가 T7 박테리오파지의 메이저 캡시드인 10B 캡시드에 415개 발현되는 것을 확인하였다.
실험예 3. 면역 회피성 펩티드가 도입된 T7 파지의 식작용(Phagocytosis) 회피 효과 평가(in vitro)
서열번호 1로 표시되는 면역 회피성 펩티드가 파지 표면에 발현되는 T7 파지를 대식세포와 공배양하여 대식세포의 식작용으로 세포 내부로 유입되는 파지를 확인하였다. 먼저 6-웰플레이트에 J774a.1 세포 5×105개를 CO2 인큐베이터에서 배양하고, 형광(Cy5.5) 표지된 야생형(WT) 및 상기 면역 회피성 펩티드가 발현된 T7 박테리오파지를 J774a.1 세포와 1시간 동안 공배양 하였다. 형광 현미경 및 유세포 분석을 통해 대식세포에 의해 잡아 먹힌 T7 박테리오파지를 정량적으로 비교하였고, 그 결과는 도 4 및 도 5에 도시되었다. in vitro에서 대식세포에 의한 식작용 회피 효과를 분석한 결과, 면역 회피성 펩티드가 표면에 도입된 T7 박테리오파지에 대한 대식세포의 식작용이 야생형과 비교하여 현저하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4. 혈액순환 시간(blood circulation time) 비교 실험(in vivo)
체내에서 면역 회피성 펩티드가 도입된 T7 박테리오파지가 야생형 박테리오파지 보다 더 오랫동안 생존하는지를 마우스 동물모델을 이용해서 평가하였다. 6 주령 Balb/c 수컷 마우스를 준비하였다. 야생형 및 면역 회피성 펩티드가 발현된 T7 박테리오파지를 정맥 주사하고 15분, 30분, 60분 후에 각각의 마우스로부터 혈액을 채취하여 10% 헤파린이 포함된 튜브에 수집하였다. 수집한 혈액 내에 생존하고 있는 T7 박테리오파지의 수를 플라크 형성 어세이(plaque assay)로 평가하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, 면역 회피성 펩티드가 도입된 T7 박테리오파지는 야생형과 비교해 혈액에서 더 오랜 시간 생존하였고, 주사 후 15분부터 T7 박테리오파지의 생존률에서 현저한 차이를 나타내며 시간이 지나도 지속되었다. 이로부터 면역 회피성 펩티드가 도입된 T7 박테리오파지는 혈액에서 더 오랜 시간 동안 순환될 수 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 5. 마우스 감염모델에서 파지를 이용한 치료 효과 평가
balb/c 수컷 마우스에 E. coli BL21을 복강 주사로 마우스에 감염시켰다. 감염 후, 야생형(WT)과 서열번호 1(ADARYKS)로 표시되는 면역 회피성 펩타이드가 도입된 T7 박테리오파지를 정맥 주사로 투여하였다. 대장균(E. coli)를 감염시키지 않은 건강한 마우스 (No E.coli (healthy control)) 그룹 및 대장균 감염 후, 박테리오파지를 주사하지 않고 PBS 버퍼만을 주사한 그룹(PBS (buffer control))도 진행하여 비교평가 하였다. 대조군 및 실험군은 각 마우스 3마리로 구성하였다. 이후 마우스의 신체 증상을 점수화 하여 치료 효능을 평가하였다. 신체 증상 점수화는 [정상: 0], [활동감소 1], [혼수상태, 주름진 모피 및 꼽추: 2], [혼수상태, 주름진 모피 및 꼽추, 눈 주위 삼출물(exudates)로 감긴 눈: 3], [빈사상태: 4], [죽음: 5]으로 평가하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, PBS를 처리한 마우스는 24시간만에 증상이 급격히 악화되어 48시간까지 악화된 증상이 유지되었다. 야생형 박테리오파지를 처리한 경우 PBS와 비교하여 증상이 빠르게 호전되는 것을 확인하였다. 서열번호 1로 표시되는 면역 회피성 펩티드가 도입된 박테리오파지를 투여한 마우스는 야생형(WT) 및 PBS에 비교해서 증상이 악화되지 않고 1점 이하 수준에서 머물다가 72시간에는 완전히 회복하였다. 면역 회피성 펩타이드가 도입된 박테리오파지는 체내 면역 작용을 회피할 수 있어, 혈액 내 오랜 기간 머물 수 있기 때문에, 더 많은 감염균을 사멸할 수 있어 치료 효능이 더 뛰어난 것으로 사료된다.

Claims (10)

  1. 캡시드(capsid)에 서열번호 1(ADARYKS), 서열번호 2(AGHVVPR), 서열번호 3(MPRLPPA), 서열번호 4(QTEKNPL), 서열번호 5(SILPVTR) 및 서열번호 6(YRAIPSP)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 면역 회피성 펩티드를 포함하는 박테리오파지.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 박테리오파지는 용균성(lytic)인 박테리오파지.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 박테리오파지는 T7, T3 β-phage, Phage C1, H-19B, ΦFC3208, ΦN315, Φ13, ΦMu50A, ΦETA, PVL, PV83, T12, CS112, 315.2, 및 M30로 이루어진 군에서 선택되는 박테리오파지.
  4. 제 1항의 박테리오파지를 포함하는, 세균에 의해 유발되는 감염증의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 세균은 대장균(E. coli), 시겔라소네이균(Shigella sonnei) 및 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium), 코네리박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 클로스트리듐 보툴리누스(Clostridium botulinum), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 화농연쇄상구균(Streptococcus pyogenes) 및 콜레라균(Vibrio cholera)으로 이루어진 군에서 선택되는, 약학적 조성물.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 감염증은 장염, 세균성 이질, 디프테리아(diphtheria), 급성발열, 성홍열, 콜레라 및 식중독으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 감염증인 약학적 조성물.
  7. 제 4항에 따른 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 개체 내 항균 방법.
  8. 제 1항의 박테리오파지를 포함하는 항균(anti-bacterial) 조성물.
  9. 제 8항에 따른 항균 조성물을 포함하는, 항균용 식품 첨가제.
  10. 제 8항에 따른 항균 조성물을 포함하는, 항균용 사료 첨가제.
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