TWI406946B - 用於胞內輸送之細胞穿透胜肽 - Google Patents
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Description
本發明係關於分子的胞內輸送,例如:胜肽、反義寡核酸、奈米粒子、蛋白質或核苷酸。具體而言,本發明係關於一種衍生自嗜酸性白血球陽離子蛋白質(eosinophil cationic protein,ECP)的新穎細胞穿透胜肽(cell penetrating peptide,CPP),其具有高細胞穿透效率及低毒性。
通常細胞膜的屏障使得蛋白質、核酸或大型親水性治療藥劑無法穿透細胞內,因此運送各種分子由細胞外進入細胞內,為藥物輸送領域的一項挑戰。為解決此問題,目前已經開發出數種載體輸送系統,其中之一為以胜肽為基礎的輸送系統。具有細胞穿透特性的胜肽擁有許多優勢,不僅可修改序列使胜肽載體應用於不同的細胞中,同時可針對不同的目的結合各式藥物或小分子物質。細胞穿透胜肽(例如:由果蠅觸角足突變衍生的穿膜肽和人類免疫缺陷病毒的Tat胜肽)已廣泛用於傳遞胜肽、蛋白質和寡核苷酸進入細胞,其應用領域的範圍從細胞生物學到生物醫學研究。細胞穿透胜肽的免疫相關性對生物醫學研究非常重要,然而目前大多數使用的細胞穿透胜肽都非源自人類,可能誘發體內免疫反應,尤其當細胞穿透胜肽與蛋白質或奈米粒子結合時。因此,從人類蛋白質序列中發現的細胞穿透胜肽(例如:衍生自人體降血鈣素的胜肽、與人類蛋白訊息序列相關的胜肽)是極具發展性的載體。
由活化的嗜酸性白血球分泌的人類嗜酸性白血球陽離子蛋白質(ECP)具有133個胺基酸、等電點(pI)為10.8,因不同糖基化程度,其分子量範圍為16至22 kDa。人類嗜酸性白血球陽離子蛋白對革蘭氏陽性菌(例如:金黃色葡萄球菌(S. aureus
))和革蘭氏陰性菌(包括大腸桿菌(E. coli
))都具有抗菌活性。除了抗菌活性,人類嗜酸性白血球陽離子蛋白亦具有蠕蟲毒性(helminthotoxic)和抗呼吸融合病毒(RSV)活性。過去的研究指出人類ECP(1-45)胜肽具有抗菌能力,其中必要的胺基酸序列為ECP(24-45)。已知細胞表面的葡萄胺聚糖(GAGs)(特別是硫酸乙醯肝素蛋白多糖(HSPGs))會促進ECP經巨胞飲作用(macropinocytosis)進入細胞。本研究結果顯示位於ECP(34-38)區域內且含有帶電胺基酸和芳香胺基酸的序列可調節ECP和肝素之間的作用。美國專利第7,595,374號中也揭露該序列的特性。
此外,已經證實抗菌胜肽和細胞穿透胜肽具有相似的功能特性。例如,源自南非爪蛙Xenopus laevis
皮膚的爪蟾抗菌肽(Magainin 2)不但能進入哺乳動物細胞還表現出抗菌活性。
本發明中揭露一種源自於嗜酸性白血球陽離子蛋白質(ECP)的新穎細胞穿透胜肽的生物功能和潛在應用,此細胞穿透胜肽包含一肝素結合序列。
本發明提供一種細胞穿透胜肽,其包含下列胺基酸序列:NYBX1
BX2
BNQX3
,其中N代表天門冬醯胺,Y代表酪胺酸,B代表一鹼性胺基酸,X1
代表一具有一芳基、一疏水性或一不帶電之側鏈的胺基酸,X2
代表任何胺基酸,Q代表麩醯胺酸,且X3
代表天門冬醯胺或不存在。
在本發明之一具體實施例中,上述胺基酸序列中的X1
代表色胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸。在另一具體實施例中,上述胺基酸序列中的X2
代表一極性且不帶電之胺基酸。在另一具體實施例中,上述胺基酸序列中的X2
代表半胱胺酸。
在本發明之一具體實施例中,該細胞穿透胜肽之胺基酸序列係SEQ ID NO: 1。在本發明之另一具體實施例中,該細胞穿透胜肽之胺基酸序列係SEQ ID NO: 2。
在本發明的一個態樣中,該細胞穿透胜肽進一步包含一種物質。本文中所使用之術語「物質」包括但不限於治療劑、診斷探針、胜肽、核苷酸、反義寡核酸、蛋白質、奈米粒子、微脂體、小分子及標記物質。
術語「反義寡核酸」或「反義化合物」可交互使用且代表一種環狀單元之序列,各單元具有鹼基配對部分,藉由單元間鏈結連接使得該些鹼基配對部分得以由華生-克立克鹼基配對雜交至一核苷酸型式的目標序列(通常為一RNA),以在該目標序列中形成一核苷酸:寡聚合物非互補雙螺旋。該環狀單元係以核糖或其他五碳糖或者,在一較佳具體實施例中為一嗎啉基(嗎啉基)為主。該寡聚合物可具有與該目標序列完全或相近的序列互補性;一般而言在靠近寡聚合物終端序列變異比在內部序列變異為佳。
術語「標記物質」包含放射性同位素(例如:125
I、131
I、35
S、3
H、或32
P)、酵素(例如:鹼性磷酸酵素(alkaline phosphatase)、山葵過氧化酵素(horseradish peroxidase)、冷光素(luciferase)、或β-半乳糖酵素(β-galactosidase))、螢光物質(例如:螢光素(fluorescein)、羅丹明(rhodamine)、藻紅素(phycoerythrin)、綠色螢光蛋白(GFP)或藍色螢光蛋白(BFP))、發光物質(例如:QdotTM
奈米粒子,由Quantum Dot Corporation,Palo Alto,CA所提供)、或磁性物質等。
本發明亦提供一種胞內輸送的方法,一種胞內輸送之方法,包括:a.提供一胺基酸序列為NYBX1
BX2
BNQX3
之細胞穿透胜肽,其中N代表天門冬醯胺,Y代表酪胺酸,B代表一鹼性胺基酸,X1
代表一具有一芳基、一疏水性或一不帶電之側鏈的胺基酸,X2
代表任何胺基酸,Q代表麩醯胺酸,且X3
代表天門冬醯胺或不存在,及b.將該細胞穿透胜肽與目標細胞進行培養。
在本發明之一具體實施例中,該細胞穿透胜肽進一步包含一種選自由治療劑、診斷探針、胜肽、核苷酸、反義寡核酸、蛋白質、奈米粒子、微脂體、小分子及標記物質組成之群組的物質。在本發明之另一具體實施例中,該目標細胞為肺臟細胞、卵巢細胞、胃細胞或腸細胞。
本發明進一步提供一種複合物,其包含本發明之胜肽及一種選自由治療劑、診斷探針、胜肽、核苷酸、反義寡核酸、蛋白質、奈米粒子、微脂體、小分子及標記物質所組成之群組的物質,其中該物質較佳係選自由標記物質、胜肽及蛋白質組成之群組。在一具體實施態樣中,本發明係關於利用一種細胞穿透胜肽,或如上述之複合物,以製備一種用於治療或科學研究之醫藥組合物。
本發明亦提供一種用於將一物質輸送至一主體內之方法,包含:a.製備一複合物,其包含本發明之細胞穿透胜肽及一種選自由治療劑、診斷探針、胜肽、核苷酸、反義寡核酸、蛋白質、奈米粒子、微脂體、小分子及標記物質組成之群組的物質,其中該物質較佳係選自由標記物質、胜肽及蛋白質組成之群組;及b.經口腔、關節內、腹腔內、脊椎腔內、動脈內、鼻內、實質細胞內、皮下、肌肉內、靜脈內、皮膚、直腸內或局部將該複合物施予該主體,其中該主體係一種脊椎動物,或更具體而言,係一斑馬魚。在一較佳具體實施例中,該物質較佳係選自由標記物質、胜肽及蛋白質組成之群組。
實例1
鑑定ECP(32-41)的特定肝素結合胺基酸
細胞培養
將人類支氣管上皮細胞(Beas-2B)培養於RPMI 1640培養基(Gibco,Invitrogen,USA),輔以熱滅活性十分之一的胎牛血清(FBS)(Gibco,Invitrogen,USA)和百分之一的麩醯胺酸-青黴素-鏈黴素(biosera)。將細胞加入100毫米的培養皿中,放置於攝氏三十七度、含百分之五二氧化碳的培養箱中培養。
蛋白表現和純化
為進行細胞結合試驗,選用pMAL-C2G載體(New England Biolabs)表現和純化重組人類嗜酸性白血球陽離子蛋白質。以Eco
RI和Xba
I區間融合N
-端麥芽糖結合蛋白質(MBP),並以可溶形式表現於在大腸桿菌中。利用QuickChange定點突變技術將人類嗜酸性白血球陽離子蛋白的胺基酸中第34個精胺酸、第35個色胺酸、第36個精胺酸和第38個離胺酸個別以其他胺基酸取代,本實驗使用的引子對列於下表:
*R代表精胺酸;A代表丙胺酸;K代表離胺酸;W代表色胺酸;F代表苯丙胺酸;及Y代表酪胺酸。
以氯化鈣法製備大腸桿菌勝任細胞,並以傳統方法進行質體的轉殖。重組正常型MBP-ECP和其單點突變MBP-ECP,經IPTG誘導劑誘導表現蛋白,以親和層析法進行蛋白質純化。
細胞酵素連結免疫吸附分析法(細胞免疫吸附分析法ELISA)
將人類支氣管上皮細胞(Beas-2B)接種於96孔培養皿,接種密度為每孔2×104
細胞,並在攝氏三十七度、含百分之五二氧化碳的環境培養24小時。將人類支氣管上皮細胞(Beas-2B)在96孔培養皿中分別加入不同濃度的野生型或突變MBP-ECP處理,置於攝氏4度的環境1小時。接著用冰磷酸鹽緩衝液潤洗細胞,以2%三聚甲醛於室溫固定15分鐘,之後在室溫以2%小牛血清蛋白/磷酸鹽緩衝液混合90分鐘。最後以增強型化學冷光檢測技術(ECL)檢測系統測量MBP-ECP與細胞結合的訊息強度,以小鼠單株抗麥芽糖結合蛋白抗體檢測MBP-ECP,並加入接合HRP的山羊抗小鼠IgG為第二級抗體。
為分析肝素結合區域的序列相關性,將人類支氣管上皮細胞與各濃度的正常型MBP-ECP或單點突變MBP-ECP(200、400、600和800 nM)在攝氏4度培養1小時後,以λex
為570奈米偵測螢光。將800 nM正常型MBP-ECP與人類支氣管上皮細胞結合的平均值設為100%,其他單點突變MBP-ECP與細胞結合量都以800 nM正常型MBP-ECP為依據計算相對結合親和力。圖1為正常型MBP-ECP與單點突變MBP-ECP對人類支氣管上皮細胞的相對結合能力比較,利用丙胺酸掃描式突變法判別與肝素結合時必需的胺基酸。單點突變MBP-ECP中R34A、R36A和R38A突變蛋白與人類支氣管上皮細胞結合能力減弱,證明結合區域中帶正電的胺基酸與肝素分子間交互作用具有相關性(圖1A)。此外,以同類帶電胺基酸取代的突變MBP-ECP包括R34K、R36K和K38R,對人類支氣管上皮細胞的結合能力與正常型MBP-ECP相當(圖1B),顯示結合反應主要為正負電結合,而非特定胺基酸序列。接著以單點突變MBP-ECP中W35F或W35Y蛋白確定肝素結合是否需要ECP第35個位置的芳香族胺基酸。結果顯示單點突變W35F或W35Y仍然能夠與人類支氣管上皮細胞結合(圖1B)。因此Trp35可以其他胺基酸取代,包括酪胺酸、苯丙胺酸和丙胺酸(圖1A),顯示此位置可容忍多種胺基酸突變。綜合上述,可定義ECP的肝素結合區域為一致序列:BXBXB,其係由鹼性(B)和疏水性或不帶電的(X)胺基酸組成。
實例2
ECP(32-41)的細胞穿透性
流式細胞儀
將細胞(人類支氣管上皮細胞,每孔2.0×105
細胞)接種於6孔微孔培養皿,於含十分之一熱滅活性牛血清的RPMI1640培養液在攝氏37度環境下培養24小時。細胞貼附完成後,更換成新鮮含血清之培養液,於培養基中加入以螢光物質標定的胜肽,之後再以磷酸鹽緩衝液潤洗。接著在攝氏37度以0.25%胰蛋白酶處理細胞10分鐘,之後再加入磷酸鹽緩衝液,於攝氏4度以300×g離心5分鐘。將上清液移除,以磷酸鹽緩衝液潤洗細胞,在攝氏4度以300×g離心5分鐘。再次重複潤洗程序,再將細胞懸浮於磷酸鹽緩衝液中,以488奈米的雷射激發515-545奈米的散射光,用FACScalibur(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)流式細胞儀進行螢光分析。
為評估胜肽運輸,人類支氣管上皮細胞以20 μM FITC(對照組)或FITC-ECP(32-41)(SEQ ID No: 1)處理30分鐘。隨後以胰蛋白酶移除結合在細胞表面外的FITC-ECP(32-41)螢光。以胰蛋白酶處理細胞後,再經離心及潤洗步驟,以流式細胞儀量化FITC-ECP(32-41)螢光標記胜肽的細胞穿透性。加入FITC-ECP(32-41)處裡後的細胞可發現明顯螢光訊號(圖2),此結果顯示ECP(32-41)可穿透人類支氣管上皮細胞。
實例3
ECP(32-41)的細胞內分佈
共軛焦顯微鏡
將細胞(1.0×104
細胞/孔)接種於18 mm的玻璃底培養皿(Marienfeld,Germany),培養於含十分之一熱滅活性胎牛血清的培養皿達24小時。附著完成後,移除細胞培養基,然後在含螢光標記胜肽的新鮮培養基中繼續培養。將細胞以磷酸鹽緩衝液潤洗,在磷酸鹽緩衝液中以百分之二的三聚甲醛(PFA)固定15分鐘,加入含50 mM氯化銨的磷酸鹽緩衝液消去三聚甲醛的螢光。隨後以共軛焦雷射顯微鏡(Zeiss)分析細胞內螢光標記胜肽的分佈情形。
運用共軛焦顯微鏡研究Beas-2B細胞中的FITC-ECP(32-41)胞內分佈情形。以5 μM FITC-ECP(32-41)處理5分鐘後,可在Beas-2B細胞內觀察到明顯螢光訊號,表示ECP(32-41)可在短時間內進入細胞。當細胞以FITC-ECP(32-41)處理60分鐘後,可得到更強的訊號。如圖3所示,在細胞質和細胞核中都觀察到細胞內ECP(32-41)的分佈,證明ECP(32-41)穿透細胞之運輸過程與時間相關。
實例4
ECP(32-41)穿透能力與長度相關
ECP(32-41)由10個胺基酸組成,屬於長度中等的細胞穿透胜肽,其包含能夠讓ECP和細胞表面硫酸乙醯肝素蛋白多醣作用的肝素結合區域。為找出細胞穿透活性的最低序列要求,合成移除C端序列的短胜肽,並用短胜肽處理人類支氣管上皮細胞,接著利用共軛焦顯微鏡進行分析。圖4顯示ECP(32-41)和ECP(32-41) D1(SEQ ID No: 2)兩者皆可以進入人類支氣管上皮細胞,而ECP(32-41) D2(SEQ ID No: 3)則不能。然而以ECP(32-41)處理的細胞,觀察到較強的螢光訊號,表示有效的細胞吸收所需要的長度為10個胺基酸。
實例5
ECP(32-41)的蛋白質傳遞
蛋白表現和純化
使用增強型綠螢光蛋白(eGFP)融合蛋白進行細胞穿透試驗。利用標準的聚合酵素連鎖反應複製生成含eGFP和eGFP-ECP(32-41)的基因片段碼。eGFP和eGFP-ECP(32-41)基因片段碼係衍生自pEGFP-N1載體(Clontech),本實驗使用的引子對列於下表:
將聚合酵素連鎖反應產物單獨複製到pET-28a載體(New England Biolab,Beverly,MA)Nde
I和Eco
RI區間,以產生重組的pET-28a-eGFP和pET-28a-eGFP-ECP(32-41)質體,兩質體分別轉型入大腸桿菌中以表現重組蛋白質。將5毫升的隔夜培養物接種到含100微克/毫升青黴素的250毫升LB中,並在攝氏37度的環境培養4小時。加入最終濃度為0.5 mM的IPTG誘導劑,在攝氏20度培養4小時後收集菌體。利用親和性層析法純化在細菌細胞裂解液中可溶的重組eGFP和eGFP-ECP(32-41)融合蛋白。
運輸多種物質至細胞內的能力,是細胞穿透胜肽的重要特徵,此特徵使細胞穿透胜肽在生物和生物醫學研究有應用價值。本文中證明ECP(32-41)可運輸物質至細胞內。首先,製備含Dp2(SEQ ID No: 4,屋塵蟎第2類過敏原)胜肽的重組Dp2-ECP(32-41)(SEQ ID No: 5)。於Beas-2B細胞加入5 μM FITC-Dp2或FITC-Dp2-ECP(32-41)在攝氏37度培養30分鐘後分析各胜肽進入細胞量。結果顯示只有Dp2-ECP(32-41)能夠進入細胞(圖5)。另一個經由ECP(32-41)轉運物質的實例為分子量28 kDa的增強型綠螢光蛋白(eGFP)。將5 μM eGFP-ECP(32-41)加入Beas-2B細胞,並於攝氏37度培養1小時,接著以488 nm波長監測eGFP-ECP(32-41)進入細胞之情況。如圖6所示,僅加入eGFP並未產生螢光訊號移轉,加入eGFP-ECP(32-41)後則螢光訊號產生顯著移轉,證明eGFP確實經由ECP(32-41)送入細胞中。上述兩個傳遞實例均證明ECP(32-41)序列可以協助運輸蛋白質或胜肽至細胞內。
實例6
促使細胞凋亡胜肽的細胞內傳遞
細胞培養
將中國倉鼠卵巢(CHO)細胞和胃腺癌上皮(AGS)細胞分別培養在含十分之一熱滅活性胎牛血清(Gibco,Invitrogen,USA)的F-12營養混合物中(Ham's F-12)。將Beas-B2細胞培養於RPMI 1640培養基(Gibco,Invitrogen,USA),輔以十分之一的熱滅活性胎牛血清(FBS)(Gibco,Invitrogen,USA),和百分之一的榖胺醯胺-青黴素-鏈黴素(biosera)。將A549細胞培養於DEME(Gibco,Invitrogen,USA),輔以十分之一的熱滅活性胎牛血清(FBS)(Gibco,Invitrogen,USA),和百分之一的榖胺醯胺-青黴素-鏈黴素(biosera)。於培養基(MEM;Gibco BRL Life Technologies,Scotland)、十分之一胎牛血清(FBS)、百分之一非必要胺基酸(Gibco)、百分之一的左旋榖胺醯胺(Biowhittaker)和百分之一的榖胺醯胺-青黴素-鏈黴素(biosera)中培養Caco-2細胞。所有細胞在攝氏37度、5%之二氧化碳環境進行培養。
活性測定
運用3-(4,5-二甲基-2-基)-2,5-二苯基溴化(MTT)(US Biological,Marblehead,MA)比色檢定測定胜肽對細胞生長的細胞毒性。將細胞接種於96孔培養皿(每孔1.0×104
細胞),並在攝氏37度隔夜培養,使每樣本與指定濃度(1-100 μM)的胜肽培養。以指定胜肽處理24小時後,以MTT試劑進行染色,測定波長570 nm之吸光值以代表粒線體的活性,即活細胞數目。
先前文獻記載的促使細胞凋亡胜肽:(KLAKLAK)2
(SEQ ID No: 6)可選擇性破壞帶負電荷的粒線體膜,但並不能直接與真核細胞的細胞膜作用穿透細胞。因此,可將該胜肽與運輸載體結合進入特定細胞後誘導細胞死亡,評估運輸系統的能力。為評估ECP(32-41)在體外的輸送功能,利用標準固態胜肽合成法製備與ECP(32-41)接合的類胜肽藥物(KLAKLAK)2
-ECP(32-41),並測試類胜肽藥物的細胞毒性。
雖然(KLAKLAK)2
和ECP(32-41)各自缺乏細胞穿透活性和細胞毒性,但(KLAKLAK)2
-ECP(32-41)(SEQ ID No: 7)在Beas-2B細胞上能誘導細胞死亡(圖7A)。(KLAKLAK)2
-ECP(32-41)的IC50
值為7.2 μM。
在不同細胞株包含CHO-K1、A549、Beas-2B、Caco-2及AGS細胞的實驗中,(KLAKLAK)2
-ECP(32-41)對各細胞活性的影響均顯示強烈的細胞毒性(圖7B-C)。綜合上述,證明利用ECP(32-41)進行活體外誘發凋亡胜肽的特定輸送係可實施的。
實例7
ECP(32-41)於活生物體內的活體輸送
體內輸送
為進行顯微注射,將受精72小時後(hpf)的斑馬魚幼魚浸泡在含0.17微克/毫升的胺基苯甲酸乙酯(tricaine)(Sigma)的水中麻醉,以1.2%低熔點瓊脂凝膠固定。根據先前文獻中描述的標準作法(Levraud,J. P.,Colucci-Guyon,E.,Redd,M. J.,Lutfalla,G.,and Herbomel,P.(2008)Methods Mol Biol 415
,337-63),將4.6 nl 5 mM FITC或FITC-ECP(32-41)顯微注射至幼魚血管中。以螢光顯微鏡偵測FITC訊號。為經由培養環境直接傳遞,將受精72天後(dpi)的斑馬魚幼魚浸泡於含1 mM FITC-ECP(32-41)的水中24小時。然後,將斑馬魚幼魚移到淡水飼養2天,再以螢光顯微鏡觀察。
本文中以斑馬魚作為模型系統研究ECP(32-41)的輸送效果。將5 mM FITC或FITC-ECP(32-41)注入受精72小時(hpf)的斑馬魚幼魚循環系統。注射後24小時之內,FITC本身的螢光幾乎完全消失(圖8A)。然而,注射2天後,可於幼魚體內發現明顯之螢光FITC-ECP(32-41)訊號(圖8B)。以下實驗提供另一成功體內傳遞的證據:將孵化後7天(dpf)的斑馬魚幼魚浸泡於含1 mM FITC-ECP(32-41)的水中1天後,換不含胜肽的水再飼養2天。幼魚體內明顯的螢光訊號與之前的實驗結果一致(圖8C),強烈顯示ECP(32-41)可傳遞螢光物質到活的有機體內,並於斑馬魚體內長時間保持穩定。
雖然本發明以充分細節描述和舉例,供本領域技術製作和使用,但在不偏離本發明精神和範圍下,尚有各種替代方案、修飾和改良。
技術領域中具有通常知識者很容易地領會到本發明適於實現所提及的,以及其中所固有的目的,並得到其目標與優點。用於達成或製造本發明之動物、製程或方法係較佳具體實施例之代表,僅作為例式性,而非意圖限制本發明之範疇。技術領域中具有通常知識者將可想到其中的修飾及它種用途。該些修飾係被包含於本發明之精神中,且係由申請專利範圍之範疇而定義。
第1圖顯示正常型MBP-ECP或單點突變MBP-ECP與Beas-2B細胞的相對結合活性。(A)R34A、W35A、R36A及K38A;(B)R34K、W35F、W35Y、R36K及K38R。將Beas-2B細胞以帶有單點突變的MBP-ECP在RPMI-1640培養液中在攝氏4度處理1小時。該些細胞以磷酸鹽緩衝液清洗並以PFA固定。運用ELISA測定結合至細胞表面MBP-ECP的量。以MBP-ECP(800 nM)做為100%結合的正控制組,且以此計算單點突變MBP-ECP之相對結合親和力。實驗結果代表三重複實驗之平均值。誤差槓顯示三重複實驗之標準差。
第2圖顯示ECP(32-41)穿透細胞活性。將Beas-2B細胞與20 μM FITC(控制組)或FITC-ECP(32-41)在攝氏37度培養30分鐘。處理結束後,以500 μl磷酸鹽緩衝液清洗細胞並以胰蛋白酶於攝氏37度處理10分鐘以去除黏附在細胞外之胜肽。將細胞重新懸浮在500 μl磷酸鹽緩衝液中,並利用流式細胞儀FACScalibur(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)測定平均螢光強度(mean fluorescence intensity,MFI)以分析細胞活性。實驗結果代表三重複實驗之平均值。
第3圖顯示ECP(32-41)於胞內分佈情形。將Beas-2B細胞與5 μM FITC-ECP(32-41)在攝氏37度培養5或60分鐘。以1 ml磷酸鹽緩衝液緩衝液洗滌兩次之後,運用共軛焦雷射掃描顯微鏡分析細胞所吸收之胜肽。放大倍率:63X。比例尺:50 μm。
第4圖顯示ECP(32-41)所需的最短長度。將Beas-2B細胞分別與5 μM FITC-ECP(32-41)、FITC-ECP(32-41) D1及FITC-ECP(32-41) D2在攝氏37度培養30分鐘。以1 ml磷酸鹽緩衝液緩衝液洗滌兩次之後,運用共軛焦雷射掃描顯微鏡分析細胞所吸收的胜肽。放大倍率:40X。比例尺:50 μm。
第5圖顯示體外試驗ECP(32-41)的胜肽運輸。將Beas-2B細胞與5 μM FITC(控制組)、FITC-Dp2或FITC-Dp2-ECP(32-41)在攝氏37度培養1小時。處理後,以500 μl磷酸鹽緩衝液洗滌細胞並以胰蛋白酶在攝氏37度處理10分鐘以去除黏附在細胞外之胜肽。將細胞再懸浮於500 μl磷酸鹽緩衝液中,並運用流式細胞儀FACScalibur(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)之平均螢光強度(mean fluorescence intensity,MFI)分析細胞吸收活性。實驗結果代表三重複實驗之平均值。
第6圖顯示體外試驗下ECP(32-41)的蛋白質運輸。Beas-2B細胞與5 μM FITC(控制組)、eGFP或eGFP-ECP(32-41)在攝氏37度下培養1小時。處理後,以500 μl磷酸鹽緩衝液洗滌細胞並以胰蛋白酶在37度處理10分鐘以去除黏附在細胞外之蛋白。將細胞再懸浮於500 μl磷酸鹽緩衝液中並藉由流式細胞儀進行分析。細胞穿透活性利用FACScalibur(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)流式細胞儀中平均螢光強度(mean fluorescence intensity,MFI)表示。實驗結果代表三重複實驗之平均值。
第7圖顯示體外試驗ECP(32-41)的仿胜肽藥物(peptidomimetic drug)運輸。(A)細胞存活試驗;將Beas-2B細胞與50 μM(KLAKLAK)2
-ECP(32-41)、ECP(32-41)或(KLAKLAK)2
在攝氏37度培養24小時。(B)(KLAKLAK)2
-ECP(32-41)對Beas-2B、A549及CHO-K1細胞的細胞存活率的影響。(C)(KLAKLAK)2
-ECP(32-41)對Caco-2及AGS細胞的細胞存活率的影響。各組別的細胞存活率係以MTT試驗測定,且各實驗皆重複三次。
第8圖顯示活體試驗ECP(32-41)的運輸。(A)將受精後72小時(72 hpf)的斑馬魚幼魚以顯微注射注入4.6 nl的5 mM FITC並在注射後1天(1 dpi)時以螢光顯微鏡觀察。(B)由顯微注射FITC-ECP(32-41)。將受精後72小時(72 hpf)的斑馬魚幼魚以顯微注射注入4.6 nl的5 mM FITC-ECP(32-41),並在注射後2天(2 dpi)時以螢光顯微鏡觀察。(C)經由培養環境輸送FITC-ECP(32-41)。將受精後7天(72 dpf)的斑馬魚幼魚浸泡在含有1 mM FITC-ECP(32-41)的水中,另外再培養於淡水中2天,並接著以螢光顯微鏡進行觀察。圖式放大倍率:(A)4倍,(B)20倍,及(C)10倍。
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Claims (7)
- 一種細胞穿透胜肽,其係由下列胺基酸序列所組成:NYBX1 BX2 BNQX3 ,其中N代表天門冬醯胺,Y代表酪胺酸,B代表一精胺酸或離胺酸,X1 代表一色胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸,X2 代表一半胱胺酸,Q代表麩醯胺酸,且X3 代表天門冬醯胺或不存在。
- 如申請專利範圍第1項之細胞穿透胜肽,其係SEQ ID NO:1。
- 如申請專利範圍第1項之細胞穿透胜肽,其係SEQ ID NO:2。
- 一種複合物,其包含如申請專利範圍第1項之細胞穿透胜肽及一種選自由治療劑、診斷探針、胜肽、核苷酸、反義寡核酸、蛋白質、奈米粒子、微脂體、小分子及標記物質組成之群組的物質。
- 如申請專利範圍第4項之複合物,其中該物質係選自標記物質、胜肽或蛋白質。
- 一種胞內輸送之方法,包括: a.提供一複合物包含如申請專利範圍第1項之細胞穿透胜肽,及b.將該複合物與目標細胞進行培養。
- 如申請專利範圍第6項之方法,其中該複合物進一步包含一種選自由治療劑、診斷探針、胜肽、核苷酸、反義寡核酸、蛋白質、奈米粒子、微脂體、小分子及標記物質組成之群組的物質。
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