TWI817071B - 一種可應用於皮膚外用投予且提升活性物質效能的細胞穿透胜肽-活性物組合製劑 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種細胞穿透胜肽用於皮膚保健或製備皮膚藥用組合製劑之用途，其中該細胞穿透胜肽(或胜肽X)之序列為NYBX1BX2 BNQX3；其中該細胞穿透胜肽可有效地將特定包含多酚類、抗氧化劑或可刺激細胞外基質分泌之物質在內的活性物質形成具有選擇性的『複合物』並將活性物送入皮膚細胞內，同時提升該等活性物質的活性功效。本發明亦提供一種包含該細胞穿透胜肽、活性物質及載劑的組合製劑並可製成多種皮膚外用投予之劑型型態。

Description

一種可應用於皮膚外用投予且提升活性物質效能的細胞穿 透胜肽-活性物組合製劑
本發明係關於皮膚保健或外用藥物投予或治療領域，特別係關於細胞穿透胜肽用於皮膚保健或外用藥物投予或治療之技術領域。
空氣污染、紫外線等因子會引起皮膚大量過氧化，進而導致細胞內自由基(Free radical)和活性含氧物(Reactive oxygen species,ROS)的產生。活性含氧物為一種相當微小的粒子，其包括超氧陰離子、過氧化氫和氫氧自由基等。活性含氧物十分活躍，過高量的活性含氧物會對細胞和基因結構造成損壞並引起諸如炎症和衰老等問題。皮膚的老化現象和許多疾病亦與細胞內的活性含氧物有關，因此許多的皮膚保健產品是透過抗氧化，包含清除細胞內的自由基和活性含氧物來達到抗衰老及護膚功效。目前常見用於抗氧化的活性物質(Active substance)有兒茶素(Catechin)、維他命B3、維他命C、A酸、抗炎性黃酮類或多酚類等，然而該等活性物質或其他多種眾所周知的抗氧化劑，由於本身結構的關係以及皮膚角質層的屏障等因素，不易進入皮膚細胞內部從而發揮其去除細胞內活性含氧物、自由基或者其他重要生理功能的作用。
皮膚組織主要包含角質層、表皮層、真皮層以及皮下結締組織等。角質層是死去的細胞組織，角質層以下的表皮和真皮組織的細胞則具有活 力並展示出特定功能。經皮吸收理論的主流看法是，分子量小於500Da的活性物質、特定親油/親脂比例的結構、以及胜肽序列中沒有極性中心或極性中心很少的分子比較具有機會穿透皮膚組織並被皮膚細胞吸收[1]。多數的活性物質不易穿過皮膚屏障，也不容易穿過細胞膜到達細胞內發揮其活性功能。
由於皮膚保養和醫美等產業蓬勃的發展和消費市場的需求，近年來開發在皮膚組織上傳送藥物或活性物質的研究主題很受重視。有不少使用促進成分被吸收的增強物(Enhancer)或物理方式(例如微針)被開發來促進經皮吸收，然而這些處理可能破壞皮膚屏障、引起皮膚刺激性和過敏、不方便和較高成本等問題[2,3]。因此，如何在不破壞皮膚屏障、不引起過敏及降低成本等前提下，提升活性物質被皮膚細胞吸收的效率，並使活性物質保有其活性，即為本發明所屬技術領域急欲解決的問題。
細胞穿透胜肽(Cell penetrating peptide,CPP)是可以將活性物質(例如化合物，蛋白質，肽和納米顆粒)運輸到細胞中的胜肽。大多數細胞穿透胜肽序列富含帶正電荷的支鏈，並且在與帶負電荷的糖胺聚醣(Glycosaminoglycan,GAG)相互作用下並聚集在細胞膜表面後被細胞內噬化[4]。例如，來自人體免疫缺陷病毒(HIV)：tat(RKKRRQRRR)的PTD(蛋白質轉訊區域)胜肽經修飾後可以具有細胞膜穿透特性，可將治療性蛋白傳遞到哺乳動物細胞中[5]。
參考文獻：
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是以，本發明申請人為了改善習用方法的不足(例如：傳統的細胞穿透胜肽之使用須將細胞穿透胜肽與活性物質接合製成複合物、細胞穿透胜肽本身無降低細胞內活性含氧物之功能等)，經長時間的研發後，找到了一種可以容易與活性物質合併使用，並可快速提升活性物質在皮膚組織或細胞內效能的細胞穿透胜肽-活性物組合製劑。本發明的細胞穿透胜肽除了可與活性物質接合製成複合物外，更可在與活性物質及載劑簡單混合製成組合製劑後即具有足夠能力將活性物質攜帶進入皮膚組織或細胞(例如：表皮細胞、角質形成細胞、纖維母細胞或者黑色素細胞等皮膚相關細胞)，且，活性物質被本發明的細胞穿透胜肽帶入皮膚細胞中後，不但仍可具有活性功能，其活性效能更會被本發明的細胞穿透胜肽進一步提升。
因此，本發明之目的在於提供一種皮膚外用組合物，其係包含一細胞穿透胜肽及一活性物質；其中該細胞穿透胜肽之序列為NYBX1BX2 BNQX3，其中N代表天門冬醯胺，Y代表酪胺酸，B代表精胺酸或離胺酸，X1代表色胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸，X2代表半胱胺酸，Q代表麩醯胺酸，且X3代表天門冬醯胺或不存在。
為達前述發明目的，其中該活性物質包含小分子化合物、核酸、奈米粒子、多醣體、胜肽或蛋白質。
為達前述發明目的，其中該活性物質為乙基雙亞氨基甲基愈創木酚錳氯化物(Ethylbisiminomethylguaiacol manganese chloride,EUK-134TM)，該EUK-134TM為超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase)的功能屬性。
為達前述發明目的，其中該活性物質包含細胞激素(Cytokines)。
為達前述發明目的，其中該細胞激素為乙型轉化生長因子(Transforming Growth Factor Beta,TGF-β)。
為達前述發明目的，其中該活性物質包含酚類化合物(Phenolics)。
為達前述發明目的，其中該酚類化合物包含黃酮類化合物(Flavonoids)或二苯乙烯類化合物(Stilbenes)。
為達前述發明目的，其中該黃酮類化合物包含黃烷醇(Flavanole)、黃酮醇(Flavanonole)、查耳酮(Chalkone)、花青素(Anthocyanidine)、噢哢(Aurone)、黃酮(Flavone)、黃烷酮(Flavanone)或異黃酮(Isoflavone)。
為達前述發明目的，其中該黃烷醇(Flavanole)包含兒茶素(Catechin)。
為達前述發明目的，其中該兒茶素包含表兒茶素(Epicatechin,EC)、表沒食子兒茶素(Epigallocatechin,EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(Epicatechin gallate,ECG)或表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)。
為達前述發明目的，其中該二苯乙烯類化合物(Stilbenes)包含白藜蘆醇(Resveratrol)。
為達前述發明目的，其中該皮膚外用組合製劑可以被進一步製成外用擦藥、外用醫藥品、外用保養品或化粧品。
為達前述發明目的，其中該外用保養品係化粧水、乳液、油膏、護膚霜、保濕液、護唇膏、美容液面膜或洗面乳。
本發明亦另提供一種細胞穿透胜肽用於皮膚保健的用途，其中該細胞穿透胜肽之序列為NYBX1BX2 BNQX3，其中N代表天門冬醯胺，Y代表酪胺酸，B代表精胺酸或離胺酸，X1代表色胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸，X2代表半胱胺酸，Q代表麩醯胺酸，且X3代表天門冬醯胺或不存在。
為達前述發明目的，其中該細胞穿透胜肽係用於將一活性物質送入皮膚細胞內。
為達前述發明目的，其中該活性物質包含抗氧化劑或可刺激細胞外基質(Extracellular matrix)分泌之物質。
為達前述發明目的，其中該抗氧化劑包含多酚類化合物(Polyphenols)。
為達前述發明目的，其中該多酚類化合物包含茶多酚(Tea Polyphenols)或白藜蘆醇。
為達前述發明目的，其中該抗氧化劑為乙基雙亞氨基甲基愈創木酚錳氯化物(EUK-134TM)。
為達前述發明目的，其中該可刺激細胞外基質分泌之物質包含乙型轉化生長因子(TGF-β)。
為達前述發明目的，其中該細胞外基質為膠原蛋白(collagen)。
本發明亦提供一種細胞穿透胜肽用於製備皮膚藥用組合物的用途，其中該細胞穿透胜肽之序列為NYBX1BX2 BNQX3，其中N代表天門冬醯 胺，Y代表酪胺酸，B代表精胺酸或離胺酸，X1代表色胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸，X2代表半胱胺酸，Q代表麩醯胺酸，且X3代表天門冬醯胺或不存在。
本發明的細胞穿透胜肽可以在短時間內藉由皮膚細胞的內噬化(Cell internalization)或吞噬(Cell pinocytosis)作用將活性物質有效地帶入細胞。本發明的皮膚外用組合製劑具有可經角質穿透皮膚、快速進入細胞內進行活性作用，及可高度安全地遞送生物活性貨物(Cargo delivery)的優點。因此，對於化粧品工業，本發明的細胞穿透胜肽可以作為一種高效、高安全性之有效抗污染、抗氧化、抗發炎和抗老化的原料，此亦為該細胞穿透胜肽所屬穿膜蛋白家族胜肽(Cell penetrating family peptide)在皮膚保健領域的第一個創新商業應用。
本發明的細胞穿透胜肽本身無刺激性、無致敏性、不破壞皮膚屏障且具有抗發炎的潛力；本發明的細胞穿透胜肽可以與親水性的小分子、親油性的小分子、較大胜肽分子、蛋白質類的分子或奈米粒子等活性物質一同製作成混合製劑，以使該混合製劑中的該等活性物質可藉由本發明的細胞穿透胜肽進行製劑組合後被攜帶進入皮膚組織或細胞內，並且可持續地、更高效率地發揮其活性功效。該混合製劑可被廣泛且重要地應用於外用醫藥、皮膚照護、化粧保養產品、藥粧品等領域。
Grand View Research的報告指出：「全球抗污染護膚品市場規模在2018年估計為90.7億美元，並可能在2019年至2025年期間以4.2%的複合年增長率進一步增長」，同樣，針對自由基和細胞內活性氧種類的紫外線防護的市場也在不斷增長。本發明所提供之包含一細胞穿透胜肽及一活性物質(例如：白藜蘆醇、EUK-134TM或其他活性物質)的組合物可作為一種超級抗氧化劑，為滿足市場需求提供出色的解決方案。
總歸來說，本發明提供了一種細胞穿透胜肽用於皮膚保健或製備皮膚藥用組合物的用途，以及由該細胞穿透胜肽所組成的皮膚外用組合物。本發明所使用的細胞穿透胜肽可作為優秀的活性物質攜帶者(carrier)，用於促進活性物質穿透並進入皮膚，讓包含胜肽、蛋白質、生長因子、奈米粒子、多醣體、DNA、RNA或其他具藥理活性作用的活性物質快速進到細胞內。本發明所使用的細胞穿透胜肽不具細胞毒性，其與活性物質作成組合製劑使用可以提升活性物質之功效，很適合用於開發及製備新型皮膚保養化粧品、化粧品及皮膚外用藥品等相關產品。
圖1係本發明的細胞穿透胜肽對由過氧化氫(H2O2)所誘發之細胞內活性含氧物(ROS)含量的影響；圖2係茶多酚對由過氧化氫所誘發之細胞內活性含氧物含量的影響；圖3係本發明的細胞穿透胜肽與茶多酚合併使用對由過氧化氫所誘發之細胞內活性含氧物含量的影響；圖4係EUK-134TM對由過氧化氫所誘發之細胞內活性含氧物含量的影響；圖5係本發明的細胞穿透胜肽與EUK-134TM合併使用對由過氧化氫所誘發之細胞內活性含氧物含量的影響；圖6係本發明的細胞穿透胜肽與白藜蘆醇合併使用對由過氧化氫所誘發之細胞內活性含氧物含量的影響；圖7係本發明的細胞穿透胜肽與TGF-β合併使用對細胞內第一型膠原蛋白原含量的影響。
本說明書中所述之所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。
本說明書及申請專利範圍中所述之單數用語「一」、「一個」、「該」，除非另有說明，皆可指涉多於一個對象。
本發明圖式縱坐標所使用之用語「fold of control」是指以控制組(control)數據值訂為1.0所得之相對值。
本說明書使用之「或」、「以及」、「和」，除非另有說明，皆指涉「或/和」。此外，用語「包含」、「包括」皆非有所限制之開放式連接詞。前述段落僅為系統性之指涉而不應解釋為對發明主體之限制。
本說明書用語「合併使用」或近似用語，係指涉給予、施予一服用者至少一種選擇之藥物，且包含一療程，該療程係同時或分別以相同或多種途徑給藥。
術語"藥學或化粧品上可接受之載劑"意謂物質或組合物必須與調配物之其他成份相容，且對患者無害。
其中該藥學或化粧品上可接受之載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(Solvent)、乳化劑(Emulsifier)、懸浮劑(Suspending agent)、分解劑(Decomposer)、黏結劑(Binding agent)、賦形劑(Excipient)、安定劑(Stabilizing agent)、螯合劑(Chelating agent)、稀釋劑(Diluent)、膠凝劑(Gelling agent)、防腐劑(Preservative)、潤滑劑(Lubricant)、表面活性劑(Surfactant)可以被進一步製成的水包油(oil-in-water,O/W)乳液、油包水(water-in-oil,W/O)乳液、逆微胞(Reversed micelle)、微脂體(Liposome)等的形式，及其他類似或適用本發明之製劑(或載劑)，及其他類似或適用本發明之製劑。
本發明所提供之細胞穿透胜肽用於皮膚保健或皮膚藥用組合物之用途，其使用劑型，可視需求適宜調整，並未特別限定，較佳者為皮膚外用劑型。
本發明所使用之材料，除有特別指明者，皆為市售易於取得之材料。
本發明所使用的細胞穿透胜肽之序列為NYBX1BX2 BNQX3，其中N代表天門冬醯胺，Y代表酪胺酸，B代表精胺酸或離胺酸，X1代表色胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸，X2代表半胱胺酸，Q代表麩醯胺酸，且X3代表天門冬醯胺或不存在；該細胞穿透胜肽係取自嗜酸性白血球陽離子蛋白(Eosinophil cationic protein，ECP；Uniprot編號：P12724；基因ID：6037)之主要與GAG結合基序的10個殘基片段。
本發明的細胞穿透胜肽可以經由習知的化學合成方法來產生，該化學合成分法係包含但不限於液相合成(Liquid-phase synthesis)或固相多肽合成(Solid-phase synthesis)；此外，也可以利用基因重組(包括核酸分子、載體或宿主細胞)技術來產生本發明的細胞穿透胜肽。
本發明的細胞穿透胜肽可與活性物質一同被製作成組合製劑，該組合製劑可包含或不包含表面活性劑或醇，該組合製劑可以被進一步製成水包油(oil-in-water,O/W)乳液、油包水(water-in-oil,W/O)乳液，此外，該組合製劑可以是逆微胞(Reversed micelle)或微脂體(Liposome)等的形式，及其他類似或適用本發明之製劑。可使用固態材料(Solid material)製作該逆微胞，舉例來說，可將固態材料加熱至約70℃，使其熔化並在加熱下攪拌幾分鐘，然後將細胞穿透胜 肽和活性物質的水溶液逐滴加入該熔化的固態材料中；其中該固態材料係包含但不限於肉荳蔻酸異丙酯(Isopropyl myristate)、異丙醇(Isopropanol)、甘油單油酸酯(Glyceryl monooleate)、硬脂酸異丙酯(Isopropyl stearate)、棕櫚酸異丙酯(Isopropyl palmitate)、丁二醇(Butanediol)、丙二醇(Propyl glycol)或1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺(1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide,EDC)；又或者，可使用常用的脂質體製備方法來包被細胞穿透胜肽和活性物質，該脂質體可以包含或不包含磷脂或膽固醇。在該混合製劑中，細胞穿透胜肽的濃度範圍可以為0.01μM~5μM，活性物質的濃度則取決於用途，通常為0.001μM~5μM。
其中若為使其該組合製劑達到最佳效果，則該中該組合製劑可包含肉荳蔻酸異丙酯、異丙醇、甘油單油酸酯和水；其中該荳蔻酸異丙酯在該混合製劑中的重量占比為80%~92%，該異丙醇在該混合製劑中的重量占比為2%~10%，該甘油單油酸酯在該混合製劑中的重量占比為4%~8%，該水在該混合製劑中的重量占比為0.5%~4%。
本發明所使用的茶多酚可從市面購買而得，或經由一般習知方法萃取而得，舉例來說，可經由以下步驟萃取獲得茶多酚：使用熱水從茶葉和樹枝中萃取茶多酚萃取物，然後用膜分離法去除其中的脂肪、蛋白質、部分多醣和生物鹼，接著以乙醇為溶劑搭配特定樹脂進一步去除該萃取物中的咖啡因，再去除乙醇後，即可得到所需的茶多酚。本發明實施例中所使用的茶多酚含有7.25%的EGCG，但本發明不受該EGCG含量所限制。
本發明之新穎技術特徵，包含特定特徵，係揭示於申請專利範圍，針對本發明之技術特徵，較佳之理解茲配合說明書、依據本發明原理之實施例、和圖式將本發明較佳之實施例詳細說明。
本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。
實施例一、細胞穿透胜肽與其組合製劑的製備
利用固相合成法由羧基端(C-terminal)往胺基端(N-terminal)合成序列為Asn-Tyr-Arg-Trp-Arg-Cys-Lys-Asn-Gln-Asn(NYRWRCKNQN；SEQ ID No：1)的細胞穿透胜肽(共有10個胺基酸，分子量約為1381.54)，將保護基(Protecting groups)去除(Deprotection)後透析並使用反相高效液相色譜(Reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)純化細胞穿透胜肽，接著將純化完之細胞穿透胜肽(以下簡稱胜肽X(Peptide X))凍乾並儲存於-20℃備用。本發明申請人在經試驗後，發現將前述細胞穿透胜肽(SEQ ID No：1)置換成序列為Asn-Tyr-Arg-Tyr-Arg-Cys-Lys-Asn-Gln-Asn(NYRYRCKNQN；SEQ ID No：2)的細胞穿透胜肽(共有10個胺基酸，分子量約為1358.50)對以下所述實施例二到實施例五的實驗結果未產生顯著差異影響。此外，下所述實施例二到實施例五所使用的細胞穿透胜肽之序列為NYBX1BX2 BNQX3對實驗結果亦不會產生顯著差異影響；其中，N代表天門冬醯胺，Y代表酪胺酸，B代表精胺酸或離胺酸，X1代表色胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸，X2代表半胱胺酸，Q代表麩醯胺酸，且X3代表天門冬醯胺或不存在。
實施例二、胜肽X用於茶多酚的可行性評估
茶多酚(Tea Polyphenols)為茶葉中多酚類化合物的總稱，其具有消除自由基、抗氧化等功效。在針對抗氧化的研究中均顯示，具有抗氧化功能的多酚類中，以茶多酚之抗氧化功效為優，其中以表兒茶素(Epicatechin, EC)、表沒食子兒茶素(Epigallocatechin,EGC)及酯化型的表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin-3-gallate,EGC)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)等四種兒茶素最常被研究及探討，而EGCG為含量最高，也最有生物活性的茶多酚。。兒茶素雖已被證實具有抗氧化之功效，可用於清除活性含氧物(Reactive oxygen species,ROS)，然而兒茶素的扁平結構使其不易進入細胞中，導致其清除活性含氧物的效果有限。
為確認胜肽X是否可將茶多酚順利帶入皮膚細胞內，及其對茶多酚之抗氧化功效的影響，在試驗前一天將人類角質形成細胞株細胞(HaCaT)分盤至96孔盤(96-well plate)中(細胞種2x106/mL加入100μL)，將孔盤中的培養基(DMEM medium)吸掉後，加入100μL之不同濃度的胜肽X(1μM)和茶多酚(0.01%、0.05%、0.1%)反應不同時間(2小時、4小時、6小時、16小時或24小時)，接著吸掉加入上述胜肽X和茶多酚，並加入含有1.2mM過氧化氫(H2O2)的DMEM培養基反應兩小時以誘發HaCaT細胞產生活性含氧物(避光)，於上述反應完成後，吸掉孔盤中的培養基，加入100μL的10μM DCFDA(2',7'-dichlorofluorescin diacetate)進行細胞內活性含氧物含量的螢光檢測試驗，半小時後將DCFDA吸掉並加入200μL之PBS沖洗(wash)，吸掉PBS後加入100μL透明的DMEM培養基，然後於波長488/520nm下檢測螢光吸光值(活性含氧物含量)，將透明的DMEM培養基去除後，加入100μL的1mg/mL MTT並反應2小時，然後於吸光值595nm測MTT之吸光值，計算細胞存活率。
由圖1的實驗結果可看出，單獨處理胜肽X(1.0μM)不會產生細胞毒性，亦不會降低被過氧化氫誘發出現的細胞內活性含氧物的濃度，即胜肽X本身並無清除細胞內活性含氧物的功能。
由圖2的實驗結果可看出，隨著茶多酚的濃度上升，被過氧化氫所誘發的細胞內活性含氧物有下降的趨勢(圖2中標記0小時的組別僅有處理過氧化氫，而未添加茶多酚)，且，隨著細胞以茶多酚處理的時間增長(2小時、4小時、6小時、16小時、24小時)，細胞內活性含氧物的下降亦有逐漸增大的趨勢。若要完全使被過氧化氫所誘發的細胞內活性含氧物下降至與控制組相當，則約需使用0.1%的茶多酚處理細胞24小時。此外，由圖2的實驗結果亦可看出，以含有7.25% EGCG的茶多酚(0.01%,0.05%,0.1%)處理細胞，並不會產生細胞毒性。
由圖3的實驗結果可看出，胜肽X(1μM)和茶多酚(0.01%、0.05%、0.1%)及載劑組合成製劑後共同加入細胞中，從細胞存活率來看並無細胞毒性。而自加入胜肽X及茶多酚15分鐘之後就有明顯的抑制細胞內活性含氧物的功效，經過45分鐘之後，0.01%、0.05%、0.1%的茶多酚抑制細胞內活性含氧物的抑制率分別達到了64%、74%、甚至92%，而再經過了1小時之後，處理較高濃度(0.05、0.1%)茶多酚的組別，其細胞內活性含氧物含量已經降至跟控制組相當。該結果可以證實胜肽X符合預期，本身確實能幫助茶多酚被細胞吸收，進而促進茶多酚抑制細胞內因過氧化氫誘發而產生之活性含氧物的效能。
綜合圖1~圖3的實驗結果可看出，胜肽X可以將原本由於結構的關係不易進入細胞膜的茶多酚(含7.25% EGCG)快速地進入HaCaT細胞內、並且持續保留多酚在細胞內作為水溶性超級抗氧化物質的功能，且，只需1μM的胜肽X即可使茶多酚在同一濃度下發揮清除細胞內活性含氧物含量效能達24倍之多(與未與胜肽X併用時的細胞內活性含氧物清除速度相比較)。
實施例三、胜肽X用於運送EUK-134 TM 的可行性評估
乙基雙亞氨基甲基愈創木酚錳氯化物(Ethylbisiminomethylguaiacol manganese chloride,EUK-134TM)為超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的模擬物，是一種具有超氧化物歧化酶活性的人工合成化合物，其為由Lucas Meyer公司所販售之使用在化粧保養品的化合物原料。EUK-134TM作為化粧保養品原料應用的活性功能為抗氧化(Antioxidant)(此為該化合物在INCI登錄的用途功能)，可以使用在各類化粧保養品產品作為抗氧化、抗老化、抗發炎等功能。
為確認胜肽X是否可將EUK-134TM順利帶入皮膚細胞內，並使其保有其清除活性含氧物的活性，參考實施例二的實驗方法，將單獨EUK-134TM(0.12μM、0.23μM)以及胜肽X(1.0μM)與EUK-134TM(0.12μM、0.23μM)之混合製劑分別加入人類皮膚角質細胞(HaCaT)中反應8小時，接著將EUK-134TM(0.12μM、0.23μM)以及胜肽X(1.0μM)與EUK-134TM(0.12μM、0.23μM)之混合製劑移除後，以1.2mM的過氧化氫誘發細胞內產生活性含氧物，然後以DCFDA確認細胞中的活性含氧物含量，並以MTT法確認細胞存活率。
由圖4的實驗結果可看出，EUK-134TM(0.12μM、0.23μM、2.35μM)不會產生細胞毒性，且在未加入胜肽X的情況下，以EUK-134TM處理被過氧化氫誘發產生活性含氧物的HaCaT細胞，當使用的EUK-134TM濃度上升，被過氧化氫誘發的細胞內活性含氧物有微幅下降的趨勢。使用0.12μM的EUK-134TM處理細胞8小時，可使被過氧化氫誘發的細胞內活性含氧物下降約50%。
由圖5的實驗結果可看出，胜肽X(1.0μM)與EUK-134TM(0.12μM、0.23μM)及載劑組合成製劑後共同加入細胞中，從細胞存活率來看並無細胞毒性，且，加入胜肽X及EUK-134TM(0.12μM)之混和製劑45分 鐘，即可發現細胞中的活性含氧物有明顯被抑制的現象，抑制功效可達約50%，相較於未加入胜肽X、單獨處理EUK-134TM(0.12μM)作用8小時的情形，合併使用胜肽X及EUK-134TM的細胞內活性含氧物之清除速度快了約10.67倍。
綜合圖4及圖5的實驗結果可知，胜肽X可以將一種具有超氧化物歧化酶功能的化合物(EUK-134TM)快速地帶入表皮細胞內。將1μM的胜肽X和0.23μM的EUK-134TM共同加入細胞當中，從細胞存活率看來並無明顯毒性，並且合併使用後可在1小時即將受1.2mM之過氧化氫誘發的細胞內活性含氧物含量下降至與控制組相同。然而，在沒有加入1μM胜肽X的情況下，0.23μM的EUK-134TM即使作用了8小時，也僅能將細胞內的活性含氧物清除約50%。由上述結果可看出，胜肽X可以將EUK-134TM之清除活性含氧物的效率提升約10.67倍，此表示胜肽X不但可以將EUK-134TM快速地帶入表皮細胞內，且可提升EUK-134TM作為超氧化物歧化酶的效能。
實施例四、胜肽X用於運送白藜蘆醇的可行性評估
白藜蘆醇(Resveratrol)為酚類化合物，廣泛存在於葡萄、花生、百合、松樹等許多植物當中，是一種植物防禦素(Phytoalexin)，當植物受到環境壓力、真菌和細菌感染時，就會產生用以對抗外源物之侵襲。已有許多文獻指出白藜蘆醇具有良好的抗氧化、抗光老化、抗發炎、抗細胞增殖[6]以及心血管保護作用[7]，亦有抑制黑色素生合成之功效[8]。然而，其化學穩定性、溶解度差以及低生物可利用度，使其在開發及應用的過程中受到限制[9]。白藜蘆醇的結構式如下：
Figure 109147082-A0305-02-0018-2
為確認胜肽X是否可將白藜蘆醇順利帶入皮膚細胞內，參考實施例二的實驗方法，將單獨之白藜蘆醇(6.25μM、12.5μM、25μM)以及胜肽X(1.0μM)與白藜蘆醇(6.25μM、12.5μM、25μM)之混合製劑分別加入人類皮膚角質細胞(HaCaT)中反應不同時間，接著將單獨之白藜蘆醇(6.25μM、12.5μM、25μM)以及胜肽X(1.0μM)與白藜蘆醇(6.25μM、12.5μM、25μM)之組合製劑移除後，以1.2mM的過氧化氫誘發細胞內產生活性含氧物，然後以DCFDA確認細胞中的活性含氧物含量，並以MTT法確認細胞存活率。單獨處理白藜蘆醇與過氧化氫的細胞為對照組。
由圖6的實驗結果可看出，胜肽X(1.0μM)與白藜蘆醇(6.25μM、12.5μM或25μM)及載劑組合成製劑後共同加入細胞中，從細胞存活率來看並無細胞毒性。在未加入胜肽X的對照組(圖6最右邊僅添加6.25μM、12.5μM或25μM之白藜蘆醇的3組對照組)，可以看到白藜蘆醇可將以過氧化氫誘發所產生的細胞內活性含氧物清除約75~80%，雖然不同添加濃度之各組間的清除效果相差不大。然而，添加胜肽X(1.0μM)與白藜蘆醇混合製劑的各組，明顯看到清除細胞內活性含氧物的功效比對照組效率大幅提昇。以添加胜肽X(1.0μM)與白藜蘆醇(6.25μM)的這組為例，僅需0.75小時的作用時間即可將細胞中的活性含氧物含量降低至與控制組(Control)相當，以清除細胞內活性含氧物的速率來說，其較對照組快了至少30倍。由實驗結果也觀察到，胜肽X促進白藜蘆醇清除細胞內活性含氧物的效果，在作用時間較短(例如30 min內)時，白藜蘆醇的添加濃度對其會產生影響，濃度較高的白藜蘆醇清除細胞內活性含氧物的效率好一些。但作用時間拉長的話，則對於胜肽X促進白藜蘆醇清除細胞內活性含氧物的效果來說，作用時間因素的影響顯然更重要於白藜蘆醇的添加濃度。
由上述結果可知，胜肽X不但可以將白藜蘆醇快速地帶入皮膚細胞內，且可大幅提升白藜蘆醇清除細胞內活性含氧物的功效。
實施例五、胜肽X用於運送乙型轉化生長因子(TGF-β)的可行性評估
乙型轉化生長因子(Transforming Growth Factor Beta,TGF-β)可促使下游Smad2(Mothers against decapentaplegic homolog 2)誘發第一型膠原蛋白原(Type I procollagen)的合成，導致真皮中膠原蛋白的增加，其常在皮膚保健用品領域中，被用於促進膠原蛋白的增生，以幫助皮膚得以保持良好彈性。
為確認胜肽X是否可將TGF-β帶入細胞內，將人類纖維母細胞(Hs68 cell)分盤至6孔盤(6 well Plate)中，把孔盤中的培養基吸掉後，在其中加入TGF-β I(10ng/mL)、胜肽X(1.0μM)或胜肽X(1.0μM)與TGF-β I(10ng/mL)及載劑組混合製劑反應不同時間(6hrs、12hrs、24hrs)，接著以ELISA套組搭配抗體(Human Pro-collagen 1 alpha 1 Capture Antibody/Human Pro-collagen 1 alpha 1 Detector Antibody)確認細胞中的第一型膠原蛋白原含量。
結果如圖7所示，所有實驗組的細胞生長狀況均正常，添加TGF-β I(10ng/mL)可使第一型膠原蛋白原的生成量增加約20%，而僅添加胜肽X(1.0μM)之實驗組，其第一型膠原蛋白原的生成量隨著作用時間的增加略有 增加。此外，在同樣是反應24小時的情況下，添加胜肽X(1.0μM)與TGF-β I(10ng/mL)之組別，其第一型膠原蛋白原的生成量可以比僅添加TGF-β I(10ng/mL)的組別增加了25%以上。此結果顯示胜肽X與TGF-β I合併使用可以進一步促進人類纖維母細胞株生成第一型膠原蛋白原。
總結上述結果可知，本發明的細胞穿透胜肽不會對皮膚細胞產生毒性，並可達到以下功效：
(1)可以將原本由於水溶性佳以及結構的關係不易進入細胞膜的茶多酚快速地攜帶進入表皮細胞內、並且所被攜帶的茶多酚在細胞外作為水溶性超級抗氧化物質的功能仍可持續發揮、甚至達到多倍率的效能。只需1μM的細胞穿透胜肽-活性物組合製劑即可使茶多酚在同一濃度下的清除細胞內活性含氧物之效能達24倍之多(與未與細胞穿透胜肽併用時的清除速度相比較)。
(2)可以將一種具有超氧化物歧化酶功能的化合物(EUK-134TM)快速地帶入表皮細胞內、並且持續保留EUK-134TM在細胞外作為超氧化物歧化酶的功能。 1μM的細胞穿透胜肽-活性物組合製劑可使0.23μM的EUK-134TM清除細胞內活性含氧物的效率提升約10.67倍。
(3)可以將脂溶性的白藜蘆醇快速地帶入表皮細胞內、並且大幅提升白藜蘆醇作為脂溶性超級抗氧化物質的功能。只需1μM的細胞穿透胜肽-活性物組合製劑即可使6.25μM的白藜蘆醇清除活性含氧物的速率提升了至少30倍。
(4)可將分子量較大的蛋白質生長因子帶入人類纖維母細胞內，例如，可將分子TGF-β帶入人類纖維母細胞內，使TGF-β更快速且持續地發揮其促進纖維母細胞生成第一型膠原蛋白原的功能。相較於未與細胞穿透胜肽合併使用，與1μM的細胞穿透胜肽合併使用可使TGF-β促進第一型膠原蛋白原生成的效果提高約25%。
據此，本發明的細胞穿透胜肽-活性物組合製劑除了本身可以快速進入細胞之外，還具有攜帶活性物質進入細胞內的功能，其可促進活性物質的細胞內噬化(Cell internalization)之速率(Speed)和效率(Efficacy)，其中該活性物質可以係包含但不限於親水性小分子、親油性小分子、稍大的胜肽、蛋白質、生長因子、奈米粒子、多醣體、DNA或RNA等。本發明之實施例的實驗結果可證明，具有體外抗氧化功能的活性物質，在經由本發明的細胞穿透胜肽-活性物組合製劑運送進入皮膚細胞內後，不但可發揮其抗氧化之功能，且，其清除細胞內活性含氧物的效率可以因由於本發明的細胞穿透胜肽之存在所快速發生地細胞內噬化(Cell internalization)或其他交互作用因素而被大幅度提升。此外，本發明的細胞穿透胜肽-活性物組合製劑亦有攜帶分子量較大之生長因子的能力，可增進生長因子促進皮膚細胞分泌細胞外基質的效能。
於本說明書較佳實施例揭示之內容，本發明所屬領域具有通常知識者可明顯得知前述實施例僅為例示；具本發明所屬技術領域通常知識者可藉由諸多變換、替換而實施，而不與本發明之技術特徵有所差異。依據說明書實施例，本發明可有多種變換仍無礙於實施。本說明書提供之請求項界定本發明之範圍，該範圍涵蓋前述方法與結構及與其相等之發明。
上述多項功效，實屬充分符合新穎性及進步性之法定專利要件，爰依法提出申請，懇請 貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明。 
<![CDATA[<110>  妍禾生醫科技股份有限公司]]>
          <![CDATA[<120>  一種可與活性物質合併使用並提升該活性物質效能的細胞穿透胜肽用於皮膚保健之用途]]>
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Claims (12)

  1. 一種可應用於皮膚外用投予(Topical delivery)且提升活性物質效能的細胞穿透胜肽-活性物組合製劑，其係包含一細胞穿透胜肽及一活性物質；其中該細胞穿透胜肽之序列為NYBX1BX2 BNQX3，其中N代表天門冬醯胺，Y代表酪胺酸，B代表精胺酸或離胺酸，X1代表色胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸，X2代表半胱胺酸，Q代表麩醯胺酸，且X3代表天門冬醯胺或不存在；其中，該活性物質為乙基雙亞氨基甲基愈創木酚錳氯化物(EUK-134TM)、細胞激素/生長因子或酚類化合物；其中，該細胞穿透胜肽及該活性物質未接合成複合物；其中，該細胞穿透胜肽係用於將該活性物質攜帶進入哺乳類的皮膚組織或細胞中；該組合物可以被進一步製成的水包油乳液、油包水乳液、逆微胞、微脂體等的形式。
  2. 如請求項1所述之組合製劑，其中該酚類化合物包含黃酮類化合物或二苯乙烯類化合物。
  3. 如請求項1所述之組合製劑，其中該活性物質為兒茶素。
  4. 如請求項1所述之組合製劑，其中該活性物質為茶多酚。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之組合製劑，其中該皮膚外用組合物可以被進一步製成外用擦藥、外用醫藥品、外用保養品或化粧品。
  6. 如請求項5所述之組合製劑，其中該外用保養品係化粧水、乳液、油膏、護膚霜、保濕液、護唇膏、美容液面膜或洗面乳。
  7. 一種提升活性物質效能的細胞穿透胜肽-活性物組合用於製備皮膚外用投予製劑的用途，其中該組合物係包含一細胞穿透胜肽及一活性物質；其中該細胞穿透胜肽之序列為NYBX1BX2 BNQX3，其中N代表天門冬醯胺，Y代表酪胺酸，B代表精胺酸或離胺酸，X1代表色胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸，X2代表半胱胺酸，Q代表麩醯胺酸，且X3代表天門冬醯胺或不存在；其中，該活性物質包含小分子化合物、核酸、奈米粒子、多醣體、胜肽或蛋白質；其中，該細胞穿透胜肽及該活性物質未接合成複合物；其中，該細胞穿透胜肽係用於將該活性物質攜帶進入哺乳類的皮膚組織或細胞中；其中該活性物質包含抗氧化劑或可刺激細胞外基質分泌之物質；該組合物可以被進一步製成的水包油乳液、油包水乳液、逆微胞、微脂體等的形式。
  8. 如請求項7所述之用途，其中該細胞穿透胜肽係用於將該活性物質送入皮膚細胞內。
  9. 如請求項7所述之用途，其中該抗氧化劑包含多酚類化合物。
  10. 如請求項7所述之用途，其中該抗氧化劑包含茶多酚、白藜蘆醇或乙基雙亞氨基甲基愈創木酚錳氯化物(EUK-134TM)。
  11. 如請求項7所述之用途，其中該可刺激細胞外基質分泌之物質包含乙型轉化生長因子(TGF-β)。
  12. 一種提升活性物質效能的細胞穿透胜肽-活性物組合用於製備皮膚藥用組合物的用途，其中該組合物係包含一細胞穿透胜肽及一活性物質；其中該細胞穿透胜肽之序列為NYBX1BX2 BNQX3，其中N代表天門冬醯胺，Y代表酪胺酸，B代表精胺酸或離胺酸，X1代表色胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸，X2代表半胱胺酸，Q代表麩醯胺酸，且X3代表天門冬醯胺或不存在； 其中，該活性物質為白藜蘆醇；其中，該細胞穿透胜肽及該活性物質未接合成複合物；其中，該細胞穿透胜肽係用於將該活性物質攜帶進入哺乳類的皮膚組織或細胞中；該組合物可以被進一步製成的水包油乳液、油包水乳液、逆微胞、微脂體等的形式。
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