TWI648291B - 氧化性修飾改善細胞穿透性胜肽之成藥性以作為藥物載體 - Google Patents

氧化性修飾改善細胞穿透性胜肽之成藥性以作為藥物載體 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種經由氧化性修飾所得之細胞穿透性胜肽二聚體，藉由雙硫鍵將兩單體連接而成。該二聚體可透過增強胜肽載體的穩定性、降低其被酵素水解的速率、保持細胞穿透能力及增加硫酸乙醯肝素之結合專一性與結合力來增加胜肽之成藥性。此經修飾之胜肽可作為適合的藥物載體來傳遞藥物，以應用於標靶治療。

Description

氧化性修飾改善細胞穿透性胜肽之成藥性以作為藥物 載體
本發明係關於一種經氧化修飾所產生的細胞穿透性胜肽二聚體，特別是關於一種透過雙硫鍵連接的細胞穿透性胜肽二聚體。此二聚體改善原有之細胞穿透性胜肽的特性，尤其是應用於藥物載體時所產生的藥物安定性問題，所導致的成藥性障礙。
目前在癌症治療之化學療法中，常產生嚴重的不良副作用，乃是因藥物對癌細胞和正常細胞不具辨識度，無選擇性的攻擊，因而導致藥物療效區間(therapeutic window)範圍狹小，更損及臨床預後結果(prognosis)。為了降低對正常組織的危害，用於抗癌的化學治療常常給予未達標準的治療劑量，導致治療效果不全然達到預期的效果。為了克服這些挑戰，標靶藥物傳遞系統應運而生，藉由專一性的特定細胞結合能力，藥物功效得以改善並降低副作用。時至今日，研究顯示，除單株抗體外，胜肽、蛋白質及小分子皆有可能作為載體，與藥物結合形成載體-藥物複合物，能選擇性地將藥物帶至特定受體異常表現的癌細胞。然而，截至目前為止，尚未有任何利用胜肽所形成的載體-藥物複合物成功地上市。這可能歸咎於許多原因，包含(a)發現能匹配特定細胞表面標靶受體(targeted receptor)的適當配體(ligand)的工程艱鉅；(b)缺乏配體被細胞吸收與胞內排除等機轉 的相關研究資訊；及(c)關於此類複合物的物理、化學性質與傳輸特性等系統性研究十分有限。
近期，有一種新型態細胞穿透性胜肽(CPP)的發現，已針對上述諸多問題，貢獻可能的解決方案。此種胜肽CPPecp，衍生自人類嗜酸性陽離子蛋白質的特定胺基酸序列[ECP(32-41)]。之前已被證明位於CPPecp之特定內部結構區域(motif)具有肝素或硫酸乙醯肝素之結合能力，且CPPecp同時展現低細胞毒性與適度的癌細胞轉移抑制性，並透過巨胞飲作用(macropinocytosis)而達到其優越的細胞穿透性功效。這些功能特性也同步宣告CPPecp可能作為治療用之藥物載體。
然而，一般而言，自然存在的胜肽在循環血清中通常具有相對較短的半衰期，低穿透性及代謝不穩定性，導致其在組織中的滯留時間是有限且短暫的。即使CPPecp被證明具有高度的穿透性，考量藥物吸收、分佈、代謝和排泄(ADME)等諸多議題，低半衰期仍是使其成為成功的藥物載體的艱鉅挑戰。在本發明中，透過加強胜肽載體的穩定性、降低其被酵素水解的速率、保持穿透性及增加其對於硫酸乙醯肝素的選擇性結合活性，發展出改善胜肽成藥性之策略。
在上述發明背景說明段落中所揭露之內容，僅為增進對本發明之背景技術的瞭解，因此，上述之內容含有不構成阻礙本發明之先前技術，且應為本領域習知技藝者所熟知。。
緣此，本發明提供一種用於改善細胞穿透性胜肽之胜肽成藥性的概念，此細胞穿透性胜肽稱為CPPecp，其具有後述之序列：NYBX1BX2BNQX3(SEQ.ID NO：1)，其中B代表鹼性胺基酸，X1代表帶有芳香基、疏水性或不帶電之側鏈的胺基酸，X2代表半胱胺酸(Cysteine)，及X3代表天門冬醯胺(Asparagine)或不存在。
本發明更提供一種氧化性修飾之策略，透過加強胜肽穩定性、降低其被酵素水解的速率、保持穿透性及增加其對於硫酸乙醯肝素的選擇性結合活性，進而改善胜肽應用於藥物載體之成藥性。
本發明另提供一種胞內輸送之方法，包含：(a)提供一複合物包含本發明之細胞穿透性胜肽聚合物，及(b)將該複合物與目標細胞進行培養。
本發明亦提供一種複合物，其包含本發明之經修飾的藥物載體以及一至二個物質，這類物質可由以下群組構成，包含：治療劑、診斷探針、胜肽、核苷酸、反譯寡核苷酸、蛋白質、奈米粒子、微脂體、小分子及放射性標記物質可用於單獨或組合治療。
本發明更提供一種用於傳遞所欲物質至受試者的方法，包含：(a)製備一包含本發明之經修飾的藥物載體之複合物；(b)口服、關節內、腹腔內、鞘內、動脈內、鼻內、腦內、皮下、肌肉內、靜脈內、表皮內、直腸內、或局部投入該複合物予受試者。
本發明的優點是可應用於組合治療(combinatorial therapy)或診斷治療(theranostics)。
本發明一個或一個以上實施例的細節將於所附圖式和以下描述中予以闡述。透過這些描述、圖式和申請專利範圍，將可容易地瞭解本發明的其他特徵、目的和優點。同時，為了讓本發明之上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明。
本發明將參照附圖合併後文的詳細敘述使得本發明更加容易理解：圖1顯示CPPecp於小鼠血清中的穩定性；其中CPPecp係溶於1xPBS(4mg/ml)中，並於下列各種不同的時間點與等體積的小鼠血清(最終濃度50%)一同培養：0、2、5、15、30、60分鐘。反應係透過加入等體積的TCA溶液(最終濃度50%)終止反應，且透過離心以移除變性的血清蛋白。上清液透過HPLC測量定量出剩餘的CPPecp。設定 反應起始點(t=0)之CPPecp回收量為百分之百並計算在每個時間點回收的CPPecp相對量。資料代表三個獨立實驗的平均數±標準差。CPPecp的半衰期(t1/2)係由CompuSyn軟體計算獲得。
圖2顯示CPPecp與N端帶有FITC螢光染劑標記的CPPecp複合物於小鼠血清中的穩定性比較；其中兩者係溶於去離子水(0.5mg/ml)，並於下列各種不同的時間點與等體積的20%小鼠血清(最終濃度10%)一同培養：0、2、5、15、30、60分鐘。反應係透過加入等體積的TCA溶液(最終濃度50%)終止反應，且透過離心以移除變性的血清蛋白。上清液透過HPLC測量定量出剩餘的胜肽。設定起始點(t=0)之CPPecp回收量為百分之百並計算在每個時間點回收的CPPecp相對量。CPPecp與帶有FITC標記的CPPecp的半衰期(t1/2)係由CompuSyn軟體計算獲得。
圖3顯示N端帶有螢光染劑標記的(5-FAM)-CPPecp-CPPecp(A)及N端乙醯化的Ac-CPPecp(B)等胜肽複合物於小鼠血清中的穩定性；其中兩者經修飾之胜肽係溶於蒸餾水(0.5mg/ml)，並於下列各種不同的時間點與等體積的20%小鼠血清(最終濃度10%)一同培養：0-24小時培養(5-FAM)-CPPecp-CPPecp、0-60分鐘培養Ac-CPPecp。反應係透過加入等體積的TCA溶液(最終濃度50%)終止反應，且透過離心以移除變性的血清蛋白。上清液透過HPLC測量定量出剩餘的胜肽。設定起始點(t=0)之CPPecp回收量為百分之百並計算在每個時間點回收CPPecp相對量。(5-FAM)-CPPecp-CPPecp及Ac-CPPecp的半衰期(t1/2)係由CompuSyn軟體計算獲得。
圖4顯示CPPecp二聚體的分子量(A)及經2-巰基乙醇還原的CPPecp二聚體HPLC分析圖(B)；其中CPPecp的半胱胺酸硫醇基係以10mM的過氧化氫或50μM的硫酸銅於室溫下進行氧化12-16小時。CPPecp二聚體的分子量係以質譜儀所測定。為了更進一步確認胜肽間雙硫鍵的形成，CPPecp二聚體係於室溫下以1%的2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)培養5分鐘，再以HPLC分析。2-巰基乙醇係用以還原雙硫鍵至硫醇基。
圖5顯示CPPecp(A)與CPPecp二聚體(B)於小鼠血清中穩定性的比較；其中兩者的胜肽係溶於1xPBS(4mg/ml)中，並於下列各種不同的時間點與等體積的小鼠血清(最終濃度50%)一同培養：0-60分鐘培養CPPecp、0-48小時培養CPPecp二聚體。反應係透過加入等體積的TCA溶液(最終濃度50%)終止反應，且透過離心以移除變性的血清蛋白。上清液透過HPLC測量定量出剩餘的胜肽。設定反應起始點(t=0)之CPPecp回收量為百分之百並計算在每個時間點回收的CPPecp相對量。資料代表三個獨立實驗的平均數±標準差。CPPecp與CPPecp二聚體的半衰期(t1/2)係由CompuSyn軟體計算獲得。
圖6顯示在螢光顯微鏡下，CPPecp(A)與CPPecp二聚體(B)結合與穿透細胞的影像；其中，處理前，含細胞的每個孔(井)(12孔的微量細胞培養盤)係透過2%的BSA阻隔(blocking)1小時並以PBS洗滌兩次。阻隔之後，A549細胞分別以12.5μM的FITC-CPPecp及FITC-CPPecp二聚體在37℃下培養30分鐘。在以PBST洗滌二次後，細胞以甲醇固定20分鐘且由PBST洗滌四次。最終，細胞係透過含DAPI的封片劑(DAPI containing mounting medium)所固定。胜肽的結合與穿透情形係透過螢光共軛焦顯微鏡所分析。放大倍率：100x；比例尺：30μm。
圖7顯示CPPecp與CPPecp二聚體於NCl-H460細胞的結合專一性；其中，處理前，含細胞的每個孔(井)(96孔的微量細胞培養盤)在4℃下係透過2%的BSA阻隔1小時並以PBS洗滌一次。阻隔之後，NCI-H460細胞分別以0.625、1.25及2.5μM的FITC-CPPecp及FITC-CPPecp二聚體在4℃下培養1小時。以PBS洗滌之後，FITC-CPPecp及FITC-CPPecp二聚體的結合係以螢光分光光度計所測量(A)。為了測試結合專一性，在胜肽處理之前，細胞係與肝素酶(5U/ml)在37℃下先行培養2小時(B及C)。將已知用於處理細胞的所有胜肽量(包含結合及洗出)定義為百分之百，並計算FITC-CPPecp及FITC-CPPecp二聚體的相對結合。資料代表三次獨立實驗(triplicate incubation)之平均數。誤差線(error bar)顯示三重複實驗中的標準差。
圖8顯示CPPecp及CPPecp二聚體對於不同肺癌細胞株的毒性；其中，細胞在37℃下與下列不同濃度的CPPecp及CPPecp二聚體分別培養72小時：0、0.3、1、3、10及30μM。細胞存活率係由MTS試驗法測量獲得。不經胜肽處理的細胞數定義為百分之百(對照組)且計算出經不同胜肽濃度處理下的細胞相對存活率。
本發明之優點、特徵以及達成方法將透過例示性實施例及附圖進行更詳細地描述而更容易被理解。然而，本發明可以不同形式來實現且不應該被理解僅限於此處所陳述的實施例。相反地，對所屬技術領域具有通常知識者而言，所提供的此些實施例將使本揭露更加透徹與全面且完整地傳達本發明的範疇，且本發明將僅為所附加的申請專利範圍所定義。在圖中，成分或元件的尺寸及相對尺寸為了清晰易懂而可能以誇示方法表示。
除非另外定義，所有使用於後文的術語(包含科技及科學術語)具有與本發明所屬該領域的技術人士一般所理解相同的意思。將更可理解的是，例如於一般所使用的字典所定義的那些術語應被理解為具有與相關領域的內容一致的意思，且除非明顯地定義於後文，將以一般或普通的意義理解。
後述的實施例係提供以闡述本發明的實施態樣且輔助所屬領域通常知識者實踐本發明。這些實例並非被視為限制本發明之範圍的手段。
實施例
本發明將參照後文中的實例，進一步地描述製備細胞穿透性胜肽二聚體之流程步驟及其性質分析，其僅為例示性，非為限制性。其目的在使熟習此項技藝之人士能夠瞭解本發明之內容並據以實現。有關本發明所主張之範圍，應以申請專利範圍為準。
實例1 對於CPP ecp 穩定性的改善
未經修飾的CPPecp(NH2-NYRWRCKNQN-COOH(SEQ.ID NO：2))係由台灣的明欣生物科技有限公司(MISSION BIOTECH Inc.)所合成。為了測定未經修飾的CPPecp在小鼠血清中的穩定性，CPPecp(0.5mg/ml或4mg/ml)係與等體積的全小鼠血清(品種：CD-1(ICR)，最終濃度50%)混合且在室溫下培養0、2、5、15、30及60分鐘。此反應透過加入等體積的100%TCA溶液200μl而停止，並震盪5秒以沉澱血清蛋白。變性且沉澱的血清蛋白係透過在4℃，18000 x g的條件離心2分鐘移除。上清液係由HPLC(管柱：Purospher® STAR EP-18e；移動相A：0.1%TFA於去離子水；移動相B：0.1%TFA於乙腈；流速：1ml/min；移動相梯度條件：移動相B於15分鐘內由2%上升至35%；偵測波長：280nm)分析。設定起始點(t=0)之CPPecp回收量為百分之百並計算在每個時間點回收的CPPecp相對量。CPPecp的半衰期(t1/2)係由CompuSyn軟體1.0版計算獲得。如圖1所示，未經修飾的CPPecp於小鼠血清中的半衰期僅為2.34分鐘，結果顯示其未來應用於臨床上的效益十分有限。
作為一可用的藥物載體，蛋白質水解的穩定性及標靶傳遞的專一性為兩個關鍵的性質。為了改善CPPecp的穩定性，係導入數個典型或非典型的修飾進行測試，包含：(1)N端螢光染劑標記(FITC及5-FAM)的胜肽複合物以模擬藥物接合；(2)N端乙醯化(Ac)的胜肽複合物；(3)胜 肽複合物C端與另一生物分子接合；及(4)透過氧化性修飾使得胜肽間(inter-peptide)的雙硫鍵形成。為了測定FITC-CPPecp、(5-FAM)-CPPecp-CPPecp及Ac-CPPecp的穩定性，將0.5mg/ml的胜肽溶於蒸餾水，並與等體積的20%小鼠血清(最終為10%)混合，且透過上述的HPLC條件做分析。為了更進一步地測定長時間的穩定性，故延長培養時間(0、1、2、3、4、6、8、12、24及48小時)。如圖2所示，與未經修飾的CPPecp比較，FITC-CPPecp並未顯著改善胜肽穩定性。此結果暗示單純的藥物接合無法改善CPPecp的穩定性，需另行探索其他的策略。於圖3A中，N端的5-FAM標記及胜肽複合物C端與另一生物分子標記的(5-FAM)-CPPecp-CPPecp延伸作用確實延長了其穩定性。然而，觀察到此類胜肽數量於第一小時內急劇降低也暗示了其與小鼠血清蛋白的快速結合現象。另一方面，N端乙醯化，其作為一種傳統改善胜肽穩定性的方式，也不足以改善CPPecp的穩定性，如同圖3B所示。然而，令人驚訝的是，氧化性修飾形成的CPPecp二聚體可顯著增加CPPecp的穩定性約達180倍，這指示了CPPecp二聚體可望成為有效性的臨床藥物載體(圖5)。所有胜肽修飾複合物與CPPecp比較的半衰期係列於以下表一，並以CPPecp的半衰期(t1/2)為比較的基準點(one-fold)。
實例2 CPP ecp 經氧化修飾形成CPPecp 二聚體
為了增加CPPecp的穩定性並改善其應用潛力，胜肽間雙硫鍵係存在於形成兩個CPPecp胜肽的半胱胺酸殘基之間。為了使雙硫鍵形成，半胱胺酸的硫醇基(thiol group)於CPPecp中係以10mM的過氧化氫或50μM的硫酸銅於室溫下進行氧化12-16小時以形成CPPecp二聚體(Abouelatta,A.I.,Campanali,A.A.,Ekkati,A.R.,Shmoun,M.,Kalapugama,S.,& Kodanko,J.J.(2009).Oxidation of the natural amino acids by ferryl complex：kinetic and mechanistic studies with peptide model compounds.Inorganic chemistry,48(16),7729-7739)。CPPecp二聚體由HPLC分析(條件如實例1所述)所呈現，而其分子量經由明欣生物科技有限公司(MISSION BIOTECH Inc.)的質譜儀(MASS spectrometry)分析確定。為了更進一步確認胜肽間雙硫鍵的形成，CPPecp二聚體係於室溫下以1%的2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)(SIGMA)培養5分鐘，並再以HPLC分析。2-巰基乙醇係用以還原雙硫鍵至硫醇基。如圖4A所示，質譜儀的分析結果係與CPPecp二聚體的分子量符合(分子量：2.76kDa)，其確認了CPPecp二聚體的形成。另一方面，CPPecp二聚體係透過2-巰基乙醇還原至單體(分子量：1.38kDa)，其再次確認了經雙硫鍵所形成的CPPecp二聚體(圖4B)。
實例3 CPPecp 二聚體的細胞表面結合與穿透 細胞培養
A549細胞係以RPMI1640完全培養基(Hyclone)輔以經加熱去活化的10%(v/v)胎牛血清(FBS；Gibco)及1%(v/v)的青黴素-鏈黴素(Gibco)培養。細胞係於15mm的蓋玻片上生長，並於37℃下、5%的二氧化碳中培養。
CPPecp 二聚體的細胞表面結合與滲透
為了驗證CPPecp的雙硫鍵結二聚體是否仍維持原先CPPecp所具有的功能，透過有FITC標記的CPPecp單體及二聚體分別進行細胞結合與穿透能力的分析，並經由螢光顯微鏡觀察。胜肽處理前，12孔(well)的細胞培養盤中的每個孔及內部附著細胞的蓋玻片係由含2%BSA的阻隔緩衝液浸泡1小時，以防止胜肽的非專一性結合，輔以PBS洗滌兩次。在阻隔之後，生長於15mm蓋玻片上的A549細胞係以12.5μM的FITC-CPPecp及FITC-CPPecp二聚體在37℃下培養30分鐘。在以PBST洗滌二次後，細胞以甲醇固定20分鐘且由PBST洗滌四次。細胞係透過含DAPI的封片劑(DAPI containing mounting medium)所固定以對比觀測出細胞核。胜肽對細胞的結合與穿透情形透過螢光共軛焦顯微鏡(Leica)分析(圖6)(放大倍率：100x；比例尺：30μm)。如圖6所示，與FITC-CPPecp單體比較(圖6A)，FITC-CPPecp二聚體同樣具有細胞結合與穿透的特徵，且可於A549細胞的細胞表面、細胞質及細胞核分別觀察到胜肽的螢光訊號，這指出了CPPecp的原生功能在雙硫鍵形成後並不會改變(圖6B)。
實例4 CPPecp 二聚體對於硫酸乙醯肝素的結合專一性 細胞培養
NCI-H460細胞係以RPMI1640完全培養基輔以經加熱去活化的10%(v/v)胎牛血清(FBS；Gibco)及1%(v/v)的青黴素-鏈黴素(Gibco)培養。細胞係於15mm的蓋玻片上生長，並於37℃下、5%的二氧化碳中培養。
硫酸乙醯肝素結合檢定
為了證實雙硫鍵結的CPPecp二聚體是否仍維持原先CPPecp對於硫酸乙醯肝素的專一性結合親和性，硫酸乙醯肝素的結合親和性係透過有FITC標記的CPPecp單體及二聚體進行研究，並由螢光分光光度計所測量。將肺癌細胞，NCI-H460細胞(2*104/孔)，種於96孔的細胞培養盤中，經隔夜培養。待完全貼附之後，移除培養基，且每個孔在4℃環境下係透過2%的BSA(1xPBS)阻隔1小時以防止非專一性結合。阻隔之後，每個孔係以100μl的1xPBS清洗以移除殘餘的BSA。帶有FITC標記的胜肽材料(CPPecp單體及二聚體)係製備於去離子水(最終濃度100μM)中並以所欲之濃度加入每個孔中(5μl+95μl無血清培養基)，於4℃環境下培養1小時。反應之後，移除含未結合胜肽之培養基並轉移至另一細胞培養盤。每個孔係以100μl的1xPBS清洗，且將清洗的緩衝液轉移至第二盤。清洗之後，每個孔再加入100μl的1xPBS，且透過螢光分光光度計測量其螢光強度(激發波長：485nm；放射波長：521nm)以定義為結合部分。未結合且清洗掉的胜肽比例係加總培養基與緩衝液之螢光強度而獲得。為了確認CPPecp結合的專一性是否與硫酸乙醯肝素相關，在以BSA阻隔之前，細胞係與5U/ml的肝素酶(heparanase)混合物(SIGMA)培養2小時以移除細胞表面的硫酸乙醯肝素。酵素處理後，每個孔係以100μl的1xPBS清洗以移除殘餘肝素酶混合物，並持續進行如上所述之結合流程。
所有注入胜肽的總和(inputs；包含結合及洗出)係經由每個胜肽的外加螢光強度標準曲線所計算而獲得。FITC-CPPecp及FITC-CPPecp二 聚體的結合百分比係基於實際結合部分除以所有胜肽注入加以計算而得。資料代表三重複實驗(triplicate incubation)之平均數。誤差線(error bar)顯示三重複實驗中的標準偏差。如圖7A所示，與FITC-CPPecp(單體)比較，FITC-CPPecp二聚體的結合能力顯著地增加，其顯示了二聚化後顯著增加胜肽對於細胞的結合能力。為了進一步確認結合專一性是否與硫酸乙醯肝素相關，預先以肝素酶對於NCI-H460細胞進行處理，如圖7C所示，FITC-CPPecp二聚體對細胞的結合百分比顯著減少，相同的趨勢也在FITC-CPPecp單體上被發現(圖7B)。結論是，與FITC-CPPecp比較之下，FITC-CPPecp二聚體顯示出較佳的細胞結合親和性，且此結合被證明是透過硫酸乙醯肝素而導致的專一性結合。
實例5 CPPecp 二聚體作為有潛力的藥物載體
為了研究CPPecp二聚體作為藥物載體之應用潛力，係測試CPPecp單體與CPPecp二聚體於以下三肺癌細胞株中的毒性並相互比較：A549、NCI-H460及NCI-H441。肺癌細胞株係種於96孔的細胞培養盤(2*103/孔)經隔夜培養。附著之後，加入不同濃度之CPPecp單體及CPPecp二聚體(0、0.3、1、3、10及30μM)並培養72小時。細胞存活率試驗係由MST試劑(Promega Corp.)所測定。未經處理的細胞係設置為控制組及百分之百，且計算出每個濃度的相對存活率。結果如圖8所示，CPPecp單體及CPPecp二聚體於細胞存活率中顯示兩者對於三株肺癌細胞分裂皆無顯著抑制作用。
綜上所述，如本發明所述之結論，CPPecp的穩定性係透過於兩個CPPecp分子之間的雙硫鍵連結所形成的CPPecp二聚體所改善。此CPPecp二聚體仍維持如同原始CPPecp單體的細胞穿透性、增加對於硫酸乙醯肝素結合親和性且無顯著細胞毒性，顯出了未來醫藥應用之潛力。更進 一步地，CPPecp二聚體亦提供了接合不同組合之治療劑、診斷探針或其他小分子至同一載體的可能性以用於單獨或組合治療之需求，故可更進一步地應用於組合治療(combinatorial therapy)或診斷治療(theranostics)中。
以上所述之實施例僅係為說明本發明之技術思想及特點，其目的在使熟習此項技藝之人士能夠瞭解本發明之內容並據以實施，當不能以之限定本發明之專利範圍，即大凡依本發明所揭示之精神所作之均等變化或修飾，仍應涵蓋在本發明之專利範圍內。且任何熟悉此技術者可輕易完成之改變或均等性之安排均屬於本發明所主張之範圍，本發明之權利保護範圍應以申請專利範圍為準。
綜觀上述，可見本發明在突破先前之技術下，確實已達到所欲增進之功效，且也非熟悉該項技藝者所顯而易見，其所具之進步性、實用性，顯已符合專利之申請要件，爰依法提出專利申請，懇請 貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。
<160> NUMBER OF SEQ ID NOS：2
<110> 傑安生技股份有限公司
<120> 氧化性修飾改善細胞穿透性胜肽之成藥性以作為藥物載體
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> SEQ ID NO 1
<211> 長度：10
<212> 種類：胺基酸
<213> 生物體(Organism)：人工序列
<220> 特徵：B代表鹼性胺基酸，X1代表帶有芳香基、疏水性或不帶電之側鏈的胺基酸，X2代表半胱胺酸(Cysteine)，及X3代表天門冬醯胺(Asparagine)或不存在
<400> 序列：1
<210> SEQ ID NO 2
<211> 長度：10
<212> 種類：胺基酸
<213> 生物體(Organism)：人工序列
<400> 序列：2

Claims (7)

  1. 一種由二個細胞穿透性胜肽所組成之聚合物，該每一細胞穿透性胜肽係由下列序列所組成：NYBX1BX2BNQX3，其中B代表精胺酸(Arginine)或離胺酸(Lysine)，X1代表色胺酸(Tryptophan)，X2代表半胱胺酸(Cysteine)，及X3代表天門冬醯胺(Asparagine)；該二個細胞穿透性胜肽之間係透過雙硫鍵連接。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之聚合物，其中該聚合物具有硫酸乙醯肝素的選擇性結合活性。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之聚合物，其中該每一細胞穿透性胜肽係透過氧化修飾作用形成雙硫鍵鍵結。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之聚合物，其中該氧化修飾作用可透過加入過氧化氫或硫酸銅進行。
  5. 一種複合物，其包含如申請專利範圍第1~4項任一項之細胞穿透性胜肽聚合物及一選自由治療劑、診斷探針、胜肽、核苷酸、反譯寡核酸、蛋白質、奈米粒子、微脂體、小分子及標記物質組成之群組的物質。
  6. 一種胞內輸送之方法，包含：(a)提供一複合物包含如申請專利範圍第1~4項任一項之細胞穿透性胜肽聚合物，及(b)將該複合物與目標細胞於一活體外進行培養。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該複合物包含一選自由治療劑、診斷探針、胜肽、核苷酸、反義寡核酸、蛋白質、奈米粒子、微脂體、小分子及標記物質組成之群組的物質。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI740342B (zh) * 2019-12-31 2021-09-21 傑安生技股份有限公司 胜肽ＣＰＰｅｃｐ二聚體用於治療皮膚炎之用途
WO2022141500A1 (zh) * 2020-12-31 2022-07-07 妍禾生医科技股份有限公司 一种可与活性物质合并使用并提升该活性物质效能的细胞穿透胜肽用于皮肤保健之用途

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2551756B2 (ja) * 1985-05-07 1996-11-06 武田薬品工業株式会社 ポリオキシカルボン酸エステルおよびその製造法
US5316935A (en) * 1992-04-06 1994-05-31 California Institute Of Technology Subtilisin variants suitable for hydrolysis and synthesis in organic media
GB2307476A (en) * 1995-06-06 1997-05-28 Procter & Gamble Peptides with anti-adherence activity for use in oral care compositions
US8399416B2 (en) * 2008-05-21 2013-03-19 National Tsing Hua University Method of using heparin binding motif for treating asthma
US7595374B1 (en) 2008-05-21 2009-09-29 National Tsing Hua University Heparin binding motif and use thereof
US8372951B2 (en) 2010-05-14 2013-02-12 National Tsing Hua University Cell penetrating peptides for intracellular delivery
US20130315828A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 National Tsing Hua University Kit and method of use of targeting peptide for diagnosis and therapy of cancer
WO2014036971A1 (en) * 2012-09-10 2014-03-13 Margaret Dah-Tsyr Chang Methods of using immunomodulating peptide for treating or preventing inflammatory related diseases

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chen CJ et al,"A Heparan Sulfate-Binding Cell Penetrating Peptide for Tumor Targeting and Migration Inhibition.", Biomed Res Int, Epub 2015 May 3. *
Fang SL et al,"A novel cell-penetrating peptide derived from human eosinophil cationic protein.", PLoS One. 2013;8(3):e57318. *
Kristensen M et al,"Applications and Challenges for Use of Cell-Penetrating Peptides as Delivery Vectors for Peptide and Protein Cargos.", Int J Mol Sci. 2016 Jan 30;17(2). *
盧佳吟，"利用核磁共振技術研究醣肝素促進 細胞穿透胜肽 ECP32-41 與微胞體的交互作用"， 立清華大學，碩士論文，2015年。
盧佳吟，"利用核磁共振技術研究醣肝素促進 細胞穿透胜肽 與微胞體的交互作用"， 立清華大學，碩士論文，2015年 *

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