TWI740342B - 胜肽ＣＰＰｅｃｐ二聚體用於治療皮膚炎之用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種組合物用於製備治療皮膚炎之藥物的用途，其中該組合物包含一有效劑量之胜肽CPPecp二聚體。

Description

胜肽CPPecp二聚體用於治療皮膚炎之用途

本發明係關於一種醫藥組合物用於製備治療皮膚炎或過敏相關疾病的藥物的用途，特別是關於一種醫藥組合物用於製備治療急性皮膚炎、慢性皮膚炎、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎或過敏性氣喘的藥物的用途。

皮膚炎是一群導致皮膚發炎的疾病的總稱。這些疾病的症狀包括瘙癢、皮膚紅、和皮疹(skin rash)。皮膚炎可依據發生的原因區分為外因性皮膚炎與內因性皮膚炎。外因性皮膚炎是外來因素造成刺激或過敏而導致的皮膚炎，像化妝品過敏、清潔劑刺激皮膚等都是屬於這一類；內因性皮膚炎則是病人本身內在的因素所造成的皮膚炎，例如過敏性體質誘發個體出現異位性皮膚炎。依據皮膚炎發病的快慢與症狀又可將皮膚炎區分為急性皮膚炎、亞急性皮膚炎、與慢性皮膚炎。急性皮膚炎常會出現又紅又癢、有時會刺痛的病灶，有時甚至出現水疱；亞急性皮膚炎的臨床症狀則是粉紅色至紅色帶有輕微皮屑的皮疹；慢性皮膚炎個體的病灶處常常發生表皮增厚的情形，好像長成厚繭一般，顏色往往比較不紅，但會有較多皮屑。皮膚炎影響的皮膚區域可以從局部到全身，可能實質影響個體的生 活品質。

異位性皮膚炎是一種反覆發作的過敏性皮膚疾病，常與遺傳有關，是嬰幼兒最常見的皮膚疾病之一。兒童異位性皮膚炎的盛行率約8%-20%。80%的異位性皮膚炎患者會發展為氣喘和/或過敏性鼻炎，因此反應出異位性皮膚炎治療的重要性和對治療藥物的龐大需求。異位性皮膚炎成因複雜，從免疫機轉來看，被認為是一種因雙相T細胞免疫偏離所介導的疾病，在急性發炎期偏向Th2免疫反應為主，而慢性皮膚病變期則轉變成以Th1免疫反應為主。

異位性皮膚炎致病的機轉與以免疫系統功能失調，發炎細胞(T淋巴細胞、單核球......等)的活性及分泌功能不正常所導致。增加免疫球蛋白(IgE)，並刺激肥胖細胞產生組織胺；血液中的嗜伊性白血球增加，分泌了不正常的蛋白(eosinophil cation protein)；T淋巴球(T-helper cells)分泌細胞激素(cytokine)不平衡，導致更多的發炎細胞形成慢性的持續產生發炎反應。

細胞激素(cytokines)是蛋白質並且在人體免疫反應中扮演著重要的作用。在正常T細胞(T-cell)媒介免疫(cell-mediated immunity)中的作用、炎症反應(inflammatory response)、癌症、自身免疫(autoimmunity)和過敏(allergy)過程中細胞激素具有功能多樣性(diverse)的角色。因此在各種病理狀況，細胞激素的含量會有不同的變化。與Th2免疫反應有關的細胞激素如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、IL-17和IL-31等。

過去研究結果顯示在異位性皮膚炎機制中，IL-4能夠調控STAT6訊號傳遞路徑，而當IL-4誘導STAT6表現量增加時，便造成表皮屏障 相關蛋白質的表現量降低，進而使皮膚越來越脆弱敏感，最終導致異位性皮膚炎症狀產生。

一般治療皮膚疾病的方式包括口服或外用製劑。類固醇及抗組織胺藥物現在被廣泛地使用於治療異位性皮膚炎等過敏性疾病，嚴重時可給予免疫抑制藥劑。但是這些方式僅呈現短暫的治療效果，而且容易產生副作用，例如皮膚變薄、容易感染和影響生長發育等。在長期使用這些化學合成的醫藥成分後，需增加藥物的劑量，且藥物的使用頻率也一定會增加，長久下來會對身體產生無法挽回的嚴重副作用。因此，有必要開發有效且低副作用的藥物。

近期研究證實一個衍生自人類內生性嗜酸性球陽離子蛋白(Eosinophil cationic protein,ECP)的胺基酸片段可結合硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)，並透過細胞脂筏和胞飲作用(lipid-raft endocytosis and macropinocytosis)而穿透細胞膜，因而具有細胞穿透的特性(cell penetrating character)。此外，該胜肽片段亦具有免疫調節功能，研究證實該胜肽片段可有效降低活體內的免疫球蛋白E(Immunoglobulin E，簡稱IgE)等過敏性生物指標(biological indicator of allergy)的含量、減少包含嗜酸性白血球(eosinophils)在內的免疫細胞的趨化反應(chemotaxis)、減少第二型輔助性免疫反應(T-helper 2 immune response)中與過敏反應相關的IL-5及IL-13等細胞激素和嗜酸细胞趨化因子(Eotaxin-1，又稱為C-C motif chemokine 11，簡稱CCL11)的含量，進而影響白血球趨化至組織發炎位置，並降低相關細胞激素(cytokines)的分泌以避免後續誘發及放大發炎反應，達到抑制發炎反應及改善氣喘動物的肺部呼吸功能的效果。

然而，先前技術未能將該胜肽片段作為穩定之醫藥組合物。發明人藉由該胜肽片段的特性，利用雙硫鍵將胜肽連結為一種具有細胞穿透性的胜肽二聚體，以加強胜肽穩定性、降低其被酵素水解的速率、保持其穿透性，進而改善胜肽應用於藥物載體之成藥性(druggability)，並進一步開發成局部外用製劑，可有效應用於治療急性皮膚炎、慢性皮膚炎、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎及過敏性氣喘。

本發明提供一種胜肽CPPecp二聚體組合物用於製備治療異位性皮膚炎、皮膚炎、急性皮膚炎、搔癢、過敏性鼻炎或過敏性氣喘之醫藥組合物之用途。

本發明所稱的胜肽CPPecp二聚體，係藉由雙硫鍵將兩個CPPecp單體連接而成，其中該雙硫鍵可透過化學性修飾、氧化修飾、或其他習知之方式修飾形成。該CPPecp單體之序列為NYBX₁BX₂BNQX₃，其中B代表鹼性胺基酸，X₁代表帶有芳香基、疏水性或不帶電之側鏈的胺基酸，X₂代表半胱胺酸(Cysteine)，及X₃代表天門冬醯胺(Asparagine)或不存在。在一些實施例中，B代表精胺酸(Arginine)或離胺酸(Lysine)，X₁代表色胺酸(Tryptophan)，X₂代表半胱胺酸(Cysteine)，及X₃代表天門冬醯胺(Asparagine)。在一些實施例中，本發明提供一種胜肽CPPecp二聚體，由兩個CPPecp單體連接而成，其中該CPPecp單體之序列係分別選自由SEQ ID NO：1-8所組成之群組。

本發明提供一種經由氧化性修飾所得之細胞穿透性胜肽CPPecp二聚體，藉由雙硫鍵將兩個CPPecp單體連接而成。該CPPecp二聚體 比單體更能增強胜肽的穩定性、降低其被酵素水解的速率，保持細胞穿透能力來增加胜肽之成藥性，具備更有效率的免疫調節的功能。本發明之胜肽CPPecp二聚體作為藥物載體時具有更佳的成藥性(druggability)。

本發明之組合物可以透過抑制免疫調節相關激素以治療或抑制異位性皮膚炎，而非透過抑制TNFα發炎相關細胞激素。

本發明醫藥組合物可被調配成外用製劑，例如乳霜、軟膏、凝膠、洗劑、貼布等，或吸劑、氣溶膠、栓劑等。較佳地，本發明之醫藥組合物為一乳霜或凝膠劑型。本發明之外用製劑，可包含0.01-0.1%或0.02-0.05%的胜肽CPPecp二聚體，例如0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%或0.1%的胜肽CPPecp二聚體。

本發明醫藥組合物可包含醫藥上可接受賦形劑，尤其是可進一步包含預定之溶劑或油類，如果需要，並可進一步包含分散劑。

可用於本發明之溶劑的實例包括水、1,3-丁二醇、丙二醇、甘油等，但不以此為限。

可用於本發明之油類的實例係選自由玉米油、芝麻油、亞麻油、棉花籽油、大豆油、花生油、單-甘油酯、二-甘油酯、三-甘油酯、礦物油、深海魚鮫油角鯊烯(Squalene)、荷荷巴油(jojoba oil)、橄欖油、月見草油、琉璃苣油(Borage Oil)、葡萄籽油、椰子油、葵花籽油、乳油木果脂及其任意組合所組成之群組，但不以此為限。

溶劑及油類可單獨使用或使用其任何之組合。

有益之分散劑實例可包含卵磷脂、有機單甘油酯、山黎醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、硬脂酸山梨醇酐酯等，但不以此為限。這些 原料亦可單獨使用或使用其任何之組合。

若需要，組合物可進一步包含額外原料，例如抗菌劑或防腐劑。

同時，習知活性成分可與組合物同時使用，只要其在本發明組合物之醫藥活性上不具有反效果即可。

當使用醫藥組合物作為外用製劑時，可使用適當外用皮膚製劑作為基礎原料，使用水性溶液、非水性溶劑、懸浮液、乳液或凍乾製劑等，其依習知方法消毒。

在實際上被投與或施用之本發明組合物中，劑量可根據各種因素決定，例如投與路徑、年齡、性別、及病患體重、與疾病嚴重性及作為活性成分之藥劑型式。

在本發明組合物可為化妝品組合物之情況，可經由適當添加至少一種美容可接受性載劑而製備該組合物。

圖1：CCPecp二聚體化學結構圖

圖2：CPPecp二聚體化學指紋圖譜

圖3A：CPPecp二聚體在室溫水中比CPPecp單體更加穩定。

圖3B：CPPecp二聚體在40℃中比CPPecp單體更加穩定。

圖4：CPPecp二聚體在小鼠肺部灌洗液24小時仍有19%，CPPecp單體於60分鐘時只剩23%。

圖5A：CPPecp二聚體在40℃凝膠中比CPPecp單體凝膠中更加穩定。

圖5B：CPPecp二聚體在40℃乳霜中比CPPecp單體乳霜中更加穩定。

圖6A：0.02% CPPecp二聚體治療後第6小時減緩急性發炎而耳朵腫脹程度的趨勢。

圖6B：0.02% CPPecp二聚體治療後第24小時抑制急性發炎而耳朵腫脹的效果比0.01%、0.04% CPPecp二聚體及CPPecp單體的抑制腫脹程度更好。

圖6C：CPPecp二聚體治療後第24小時小鼠耳朵組織發炎程度比CPPecp單體更減輕。

圖6D：凝膠0.05%-2 CPPecp二聚體及乳霜0.02%CPPecp二聚體在第6小時時的耳朵發炎腫脹抑制效果最佳。

圖6E：凝膠0.05%-2 CPPecp二聚體及乳霜0.02%CPPecp二聚體在第6小時時耳朵發炎腫脹抑制的抑制效果最佳。

圖7A：5μM及10μM CPPecp二聚體對於PHA誘發的細胞激素IL-2有抑制作用。

圖7B：10μM CPPecp二聚體對於PHA誘發的細胞激素IL-4有抑制作用。

圖7C：10μM CPPecp二聚體對於PHA誘發的細胞激素IL-5有抑制作用。

圖7D：2.5μM、5μM及10μM CPPecp二聚體對於PHA誘發的細胞激素IL-6有抑制作用。

圖7E：10μM CPPecp二聚體對於PHA誘發的細胞激素IL-13有抑制作用。

圖7F：5μM及10μM CPPecp二聚體對於PHA誘發的細胞激素IL-17有抑制作用。

圖7G：2.5μM、5μM及10μM CPPecp二聚體對於PHA誘發的細胞激素IL-31有抑制作用。

圖7H：CPPecp二聚體對於PHA誘發的TNF-α沒有抑制效果。

圖7I：5μM及10μM CPPecp二聚體對於PHA誘發的IFN有抑制作用。

圖8A：CPPecp二聚體調控Eotaxin-1蛋白質表現

圖8B：CPPecp二聚體調控Th2免疫機制中IL-4訊息傳遞路徑中的STAT6蛋白質表現。

圖9A：0.05%CPPecp二聚體抑制慢性耳朵發腫脹的程度效果比CPPecp單體更佳。

圖9B：慢性治療後不同時間點的耳朵外觀。

圖10A：陽性對照物在第15與22日時體重較低。

圖10B：慢性刺激後出現皮膚炎的症狀，不同濃度之CPPecp二聚體有效降低皮膚炎。

圖10C：皮膚表皮層H&E染色，CPPecp二聚體治療後皮膚表皮層染色圖明顯變薄的現象。

圖10D：CPPecp二聚體治療後皮膚表皮層明顯變薄。

圖10E：CPPecp二聚體治療後組織學分數優於Oxa與Oxa+陰 性對照物組別。

圖11A：CPPecp二聚體對oxazolone誘導後的細胞激素IL-4沒有抑制作用。

圖11B：0.05% CPPecp二聚體對oxazolone誘導後的細胞激素IL-6有抑制作用。

圖11C：0.01%及0.05%CPPecp二聚體對oxazolone誘導後的細胞激素IL-13有抑制作用。

圖11D：CPPecp二聚體對oxazolone誘導後的細胞激素IL-17沒有抑制作用。

以下係利用本發明之實施例之詳細說明，以及本發明之技術、特點。然本實施例並非用以限定本發明，任何熟悉此技術者，在不脫離本發明之精神和範圍內所作之各種更動、潤飾，均應包含在本發明之申請專利範圍內。

實施例一：製備CPPecp二聚體

未經修飾的胜肽CPPecp單體(NH₂-NYRWRCKNQN-COOH)係由台灣的明欣生物科技有限公司(MISSION BIOTECH Inc.,Taiwan)所合成。所述CPPecp單體的分子量為1.38kDa。

為了增加CPPecp單體的穩定性並改善其應用潛力，發明人進一步委託台灣的明欣生物科技有限公司(MISSION BIOTECH Inc.,Taiwan)透過雙硫鍵將CPPecp單體連結為如圖1所示之CCPecp二聚體。所述CCPecp二聚體中，雙硫鍵係存在於兩個胜肽CPPecp單體的半胱胺酸殘基之 間。利用雙硫鍵將胜肽CPPecp單體連結為CCPecp二聚體的方法有許多種，例如將CPPecp單體與10mM的過氧化氫或50μM的硫酸銅混合，於室溫下進行氧化作用12-16小時，使兩個胜肽CPPecp單體中的半胱胺酸的硫醇基(thiol group)之間鍵結形成雙硫鍵而獲得CPPecp二聚體(Abouelatta,A.I.,Campanali,A.A.,Ekkati,A.R.,Shmoun,M.,Kalapugama,S.,& Kodanko,J.J.(2009).Oxidation of the natural amino acids by ferryl complex：kinetic and mechanistic studies with peptide model compounds.Inorganic chemistry,48(16),7729-7739)。CPPecp二聚體的分子量為2.76kDa。進一步利用質譜儀(MASS spectrometry)分析後可知，本實驗產物的分子量與CPPecp二聚體的分子量(分子量：2.76kDa)相符，其確認了本實驗產物為CPPecp二聚體。

實施例二：CPPecp二聚體之高效液相層析法分析

本實驗利用高效液相層析法(high performance liquid chromatography，簡稱HPLC)分析CPPecp二聚體之化學指紋圖譜。首先，將CPPecp二聚體與水溶液混合，並使用振盪器(vortex)使CPPecp二聚體完全溶解於水中，以配製出CPPecp二聚體濃度為0.4mg/mL的水溶液。使用HPLC進行分析時，溫度設定為攝氏40度，樣品的注射體積為10μL，固定相為InertSustain C18 5um 4.6 x 250mm管柱(column)，移動相包含溶劑A(solvent A：0.1% TFA in dH2O)與溶劑B(solvent B：0.1% TFA in ACN)，移動相的流速為1.0mL/min。請參見表一，溶劑A及溶劑B的體積的起始比例為88：12；於分析進行至第15分鐘時，溶劑A及溶劑B的體積的比例為70：30；於分析進行至第20分鐘時，溶劑A及溶劑B的體積的比例為88：12。

表一：使用HPLC進行分析時，溶劑A及溶劑B的體積比

由圖2可知，將偵測波長設定為280nm，並利用上述方式進行HPLC分析時，於滯留時間(Retention time)10分鐘處顯示CPPecp二聚體的波峰。

實施例三：CPPecp二聚體在水中之安定性

為了比較CPPecp單體及CPPecp二聚體在水溶液中的安定性，本實驗分別配製CPPecp單體水溶液及CPPecp二聚體水溶液進行分析。將CPPecp單體與水溶液混合，並使用振盪器(vortex)使CPPecp單體完全溶解於水中，使CPPecp單體的濃度為5mg/mL，以獲得CPPecp單體水溶液。將CPPecp二聚體與水溶液混合，並使用振盪器(vortex)使CPPecp二聚體完全溶解於水中，使CPPecp二聚體的濃度為5mg/mL，以獲得CPPecp二聚體水溶液。將CPPecp單體水溶液及CPPecp二聚體水溶液放置於室溫(25℃)或40℃環境下，並於室溫(25℃)環境中的第0、1、2、3、4、7、10、15、21、30天及40℃環境中的第0、1、3、7、10、14天取樣，再利用高效液相層析法分析CPPecp單體水溶液樣品中的CPPecp單體含量、及CPPecp二聚體水溶液中的CPPecp二聚體含量。

請參見圖3A。由圖3A可知，CPPecp單體放置在室溫(25℃)則僅五天內維持90%以上，自第8天開始至第30天隨時間降解，第30天僅剩47%。CPPecp二聚體溶於水至30天時仍維持99%，比CPPecp單體於水中更 加穩定。

請參見圖3B。由圖3B可知，CPPecp單體放置在40℃則僅三天內維持70%以上，第14天僅剩24%。CPPecp二聚體溶於水至10天時仍維持90%以上，比CPPecp單體於水中更加穩定。

實施例四：CPPecp二聚體在組織液中之安定性

為了比較CPPecp單體及CPPecp二聚體在組織液中的安定性，本實驗於小鼠犧牲後採集支氣管肺泡沖洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，先將每個樣品加入BALF，再快速加入配置好的CPPecp單體1mg/ml及CPPecp二聚體1mg/ml水溶液，立刻稍微vortex並輕微離心，靜置37℃培養箱等待，隨後，依照不同時間點(CPPecp單體：0、2、5、15、30、60分鐘；CPPecp二聚體：0、1、2、4、8、12、24小時)取出並加入TCA，震盪5秒，離心18000g、4℃、2分鐘，取上清液50μl，以HPLC進行分析。

請參見圖4。由圖4可知，在罹患氣喘小鼠的肺部灌洗液中第2分鐘測得的CPPecp單體已低於90%，15~30分之間低於50%，甚至第60分鐘時只剩23%。CPPecp二聚體第1~2小時測得數值介於80%以上，8~12小時之間開始低於50%，顯示CPPecp二聚體比CPPecp單體較安定，CPPecp二聚體在氣喘症狀的肺部灌洗液24小時仍有19%。

劑型開發vs藥效 實施例五：CPPecp二聚體在凝膠及乳霜中之安定性

實驗5-1：為了比較CPPecp單體及CPPecp二聚體在凝膠(gel)中的安定性，本實驗分別配製CPPecp單體凝膠及CPPecp二聚體凝膠進行分析。CPPecp單體凝膠或CPPecp二聚體凝膠的配製方法為將1%carbomer 940 溶液與CPPecp單體或CPPecp二聚體的濃度為5mg/mL，均勻混合後加入0.3M的arginine，再加入1N HCl(比例為1：1)，並使用振盪器(vortex)使CPPecp二聚體完全溶解於凝膠(gel)中。安定性測試實驗方法為將CPPecp單體或CPPecp二聚體在凝膠(gel)中放置於40℃環境下，並於第0、1、3、7及14天取出，震盪5秒，離心10000rcf、25℃，取上清液，再利用高效液相層析法分析CPPecp單體凝膠中及CPPecp二聚體凝膠的安定性。

請參見圖5A。由圖5A可知，CPPecp單體在凝膠中放置在40℃環境下第一天開始降解至46%，第7天僅剩3%。CPPecp二聚體在凝膠中放置在40℃環境下至14天時仍維持90%，比CPPecp單體在凝膠中更加穩定。

實驗5-2：為了比較CPPecp單體及CPPecp二聚體在乳霜(cream)中的安定性，本實驗分別配製CPPecp單體乳霜及CPPecp二聚體乳霜進行分析。CPPecp單體乳霜或CPPecp二聚體乳霜的配製方法為將賦形劑(脂肪酸甘油酯、硬脂醇、鯨蠟醇、EGMS、水)與，CPPecp單體或CPPecp二聚體的濃度為5mg/mL，均勻混合後加入後以1N HCl、四氫呋喃(tetrahydrofuran)(三者比例為2：1：1)，並使用振盪器(vortex)使CPPecp二聚體完全溶解於乳霜中。安定性測試的詳細實驗方法：此實驗為CPPecp單體或CPPecp二聚體乳霜放置於(40℃)環境下，並於第0、1、3、7及14天取出，震盪5秒，離心10000rcf、25℃，取上清液，再利用高效液相層析法分析CPPecp單體乳霜及CPPecp二聚體乳霜的安定性。

請參見圖5B。由圖5B可知，CPPecp單體在40℃乳霜環境中第1天的回收率僅剩24%，顯示CPPecp單體在乳霜中的穩定性較差。CPPecp二聚體在乳霜中放置在40℃環境下至14天時仍維持90%，比CPPecp單體在 乳霜中更加穩定。

實施例六：以PMA誘發耳朵腫脹試驗之小鼠實驗 實驗6-1：CPPecp二聚體水溶液對急性發炎的影響

為了解CPPecp二聚體是否能夠減緩皮膚發炎、達到治療效果，因此利用PMA誘導小鼠耳朵急性發炎，並使用CPPecp二聚體治療(溶劑為水)，同時也比較CPPecp單體、及陽性對照組類固醇藥物Budesonide的治療效果。

將CPPecp單體與二次水混合，並使用振盪器(vortex)使CPPecp單體完全溶解於二次水中，使CPPecp單體的重量百分濃度為0.02%。將CPPecp二聚體與二次水混合，並使用振盪器(vortex)使CPPecp二聚體完全溶解於二次水中，使CPPecp二聚體的重量百分濃度為0.01%、0.02%、或0.04%。類固醇藥物Budesonide軟膏係購買自SIGMA代理經銷公司友和貿易股份有限公司(型號為Lot #BCBQ8374V)，所述Budesonide軟膏中，Budesonide的重量百分濃度為0.04%。給藥方法為將測試品塗抹均勻塗抹在左耳朵前側及後側，一耳共需塗抹20μl。30分鐘後塗抹PMA[醋酸鹽(Phorbol 12-myristate 13-acetate)]以95%酒精配置PMA，左耳共給前側及後側共塗抹20μl。15分鐘後再次塗抹測試品。經過6小時後，測量左右耳朵厚度。經過18小時後再次測量左右耳朵厚度，並計算出不同時間點的耳朵腫脹程度。每個時間點的右耳厚度(刺激並給藥的耳)減掉右耳厚度(vehicle control的耳)，便會得到耳朵因發炎而腫脹的程度。

圖6A為給藥後第6小時的實驗結果。由圖6A可知，budesonide(陽性對照組)治療後皆能減緩耳朵因發炎而腫脹程度，其中 0.02%CPPecp二聚體減緩耳朵因發炎而腫脹程度趨勢，但未達到顯著差異。而CPPecp單體無法抑制耳朵發炎腫脹的程度。

圖6B為給藥後第24小時的實驗結果。由圖6B可知，CPPecp二聚體、CPPecp單體、budesonide治療後皆能減緩耳朵因發炎而腫脹程度，其中0.02%CPPecp二聚體及budesonide能顯著抑制耳朵腫脹的效果(p<0.01)比0.01% CPPecp二聚體、0.04% CPPecp二聚體及CPPecp單體(p<0.05)的抑制腫脹程度更好。

圖6C為給藥後第24小時小鼠耳朵外觀及組織的細胞浸潤結果。由圖6C可知，耳朵組織H&E染色結果得知，CPPecp二聚體、CPPecp單體、及budesonide皆能減少組織內免疫細胞數目，但相較之下，經CPPecp二聚體、或budesonide治療後的組織發炎現象最輕微。

表二係依據給藥後第24小時小鼠耳朵外觀及組織中細胞浸潤情形所進行的評分結果。

由圖6A-6C及表二可知，0.02% CPPecp二聚體為最佳有效劑量，且抑制腫脹的程度與0.04%類固醇藥物budesonide幾乎相同，減緩發炎腫脹的程度更優於修飾前的胜肽(CPPecp單體)，極具開發為異位性皮膚炎藥物的潛力。

實驗6-2：CPPecp二聚體凝膠或乳霜對急性發炎的影響

為了解CPPecp二聚體凝膠或乳霜是否能夠減緩急性皮膚發炎、達到治療效果，因此利用PMA誘導小鼠耳朵急性發炎，並使用不同配方凝膠或乳霜的CPPecp二聚體治療，同時也比較CPPecp單體乳霜及類固醇藥物Budesonide的治療效果。

將CPPecp二聚體與凝膠或乳霜中配製混合，使CPPecp二聚體完全溶解於凝膠或乳霜中。使用的凝膠或乳霜賦形劑如下：凝膠賦形劑-1(Carbopol 940、NaOH、EtOH及水)，凝膠賦形劑-2(維他命E、VB5、泛醇、甘草二酸鉀、尿素、1-3丙二醇、聚乙二醇200、增稠劑、水)、乳霜賦形劑(水、甘草酸二鉀、尿素、1.3丙二醇、乳化劑、橄欖油、PEG200)、乳霜賦形劑-1(水、甘草酸二鉀、尿素、1.3丙二醇、乳化劑、橄欖油、PEG200)、乳霜賦形劑-2(SPAN 80、SPAN85、凡士林、礦物油、NaCl、水)及乳霜賦形劑-3(脂肪酸甘油酯、硬脂醇、鯨蠟醇、EGMS、水)。

前述凝膠或乳霜的配製方法為將賦形劑與CPPecp單體或二聚體混合，使CPPecp單體的重量百分濃度為0.05%，CPPecp二聚體的重量百分濃度為0.02%或0.05%。給藥方法參考實驗6-1動物實驗。

圖6D為給凝膠或乳霜後第6小時的實驗結果。由圖6D可知，凝膠CPPecp二聚體0.05%-2(0.05% CPPecp二聚體、Carbopol 940、NaOH、 EtOH及水)、乳霜CPPecp二聚體0.02%(0.02% CPPecp二聚體、水、甘草酸二鉀、尿素、1.3丙二醇、乳化劑、橄欖油、PEG200)、乳霜CPPecp二聚體0.05%-2(0.05% CPPecp二聚體、SPAN 80、SPAN85、凡士林、礦物油、NaCl、水)、與乳霜CPPecp二聚體0.05%-3(0.05% CPPecp二聚體、脂肪酸甘油酯、硬脂醇、鯨蠟醇、EGMS、水)之組別皆能減緩耳朵因發炎而腫脹程度(p<0.01)，其中0.02%CPPecp二聚體乳霜的抑制效果最佳(p<0.001)。而0.05% CPPecp單體乳霜(0.05% CPPecp單體、水、甘草酸二鉀、尿素、1.3丙二醇、乳化劑、橄欖油、PEG200)則無法明顯抑制耳朵發炎腫脹的程度。

圖6E為給凝膠或乳霜後第24小時的實驗結果。由圖6E可知，與第6小時的實驗結果趨勢相同，凝膠0.05%-2 CPPecp二聚體(p<0.01)及各個乳霜劑型之CPPecp二聚體(p<0.001)皆抑制急性耳朵因發炎而腫脹程度。0.05% CPPecp單體乳霜則無法明顯抑制耳朵發炎腫脹的程度。

實施例七：評估CPPecp二聚體對於人類週邊血液單核球細胞(PBMC)細胞激素分泌影響

於24孔盤中每孔加入0.5mL細胞濃度為2×10⁶cells/mL之細胞懸浮液(1×10⁶cells/well)，於培養箱中隔夜培養。每孔各加入試驗物質，培養48小時後，收集細胞培養液並離心(1500rpm，5min)。離心完後，收集上清液(supernatant)。利用酵素免疫分析法(sandwich-ELISA)法，量測步驟各組之上清液中所含的各種細胞激素含量。發炎相關的細胞激素，種類為腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、干擾素γ(Interferon gamma,IFN-γ)、介白素-2(Interleukin-2,IL-2)、介白素-4(Interleukin-4,IL-4)、介白素-5(Interleukin-5,IL-5)、介白素-6(Interleukin-6,IL-6)、介白素-13 (Interleukin-13,IL-13)、介白素-17(Interleukin-17,IL-17)和介白素-13(Interleukin-31,IL-31)。以Sino Biological廠牌為主之ELISA kits(SEKA10602、11725、11846、15673、10395、10369、12047)，遵照其所提供之方式量測細胞激素。

由圖7A-7I可知，CPPecp二聚體10μM對於PHA誘發的細胞激素IL-2(p<0.001),IL-4(p<0.05),IL-5(p<0.01),IL-6(p<0.001),IL-13(p<0.05),IL-17(p<0.05),IL-31(p<0.05)及IFN(p<0.05)皆有顯著的抑制效果。CPPecp單體10μM對於PHA誘發的細胞激素則沒有任何顯著的抑制效果。

實施例八：以西方點墨法偵測人類肺上皮細胞株BEAS-2B經IL-4誘發導致Eotaxin-1和STAT6蛋白表現含量

IL-4能夠調控STAT6訊號傳遞路徑和Eotaxin-1蛋白表現，而當IL-4誘導STAT6表現量增加時，便造成表皮屏障相關蛋白質的表現量降低，進而使皮膚越來越脆弱敏感，最終導致異位性皮膚炎症狀產生。運用IL-4誘導下使STAT6的活性增加之體外試驗中發現，若添加修飾後的穩定胜肽(CPPecp二聚體)會導致活化的STAT6表現逐漸減少。尤其以10μM CPPecp二聚體更能顯著降低活化的STAT6的表現量，10μM CPPecp二聚體也能顯著降低Eotaxin-1的表現量，此結果也顯示CPPecp二聚體具有可透過免疫調節機轉來降低異位性皮膚炎發生的潛力。

由圖8A-8B可知，CPPecp二聚體從細胞層次得知能調控Th2免疫機制中IL-4訊息傳遞路徑中的STAT6活性和Eotaxin-1蛋白質表現(p<0.05)。

實施例九：CPPecp二聚體乳霜對於Oxazolone誘導小鼠耳朵異位性皮膚炎模式之功效評估

已知CPPecp二聚體乳霜能抑制急性皮膚發炎反應(PMA誘導)，為了解CPPecp二聚體乳霜是否也能抑制慢性發炎反應。本實驗使用oxazolone誘導小鼠異位性皮膚炎，並測試CPPecp二聚體乳霜之功效。

Oxazolone誘導小鼠異位性皮膚炎模式方法為分配不同組(正常對照組、Oxazolone組、Oxazolone+陽性對照組、Oxazolone+CPPecp單體乳霜及Oxazolone+CPPecp二聚體乳霜)，依據不同組別先測量左右耳朵厚度。Dial thickness gauge的測量砧板(anvil)先輕輕把耳朵表面的中心點，確定測量位置及耳朵後方不會夾到鼠毛髮即可夾住耳朵。夾住耳朵後10秒的數值為該時間點的耳朵厚度，左右耳需測量，耳朵厚度測量完畢後塗抹待測試品。第0天以acetone配置0.3% oxazolone，在左右耳均勻滴上0.3% oxazolone，取10μl的0.3% oxazolone滴在耳朵前側，均勻滴整個耳朵前側表面。後側也同樣取10μl均勻滴上，一耳共需20μl。第5天~14天每天需要塗抹待測試品，一週塗抹5天，第6、7、9、13及14天時一天塗抹一次，第5、8及12天一天塗抹2次，第10及11天不塗抹任何藥品。第5、8及12天為誘導刺激日，先將右耳塗抹待測乳霜，經過4小時後，右耳前後側均勻滴上0.1% oxazolone，再一次經過4小時後右耳塗上待測試品。塗抹oxazolone 24小時後測量耳朵厚度。第6、9、13及15天測量左右耳朵腫脹程度及拍照記錄。將Tacrolimus為藥膏劑型，每次塗抹15mg，將藥膏平均分配在右耳前側及後側平均塗抹。第15天只需測量耳朵厚度，並計算不同天數的耳朵腫脹程度。

圖9A-9B為慢性給藥後的實驗結果。由圖9A-9B可知， 0.05%CPPecp二聚體乳霜明顯的具有抑制慢性耳朵發腫脹的程度(p<0.001)，但0.05%CPPecp單體乳霜無法抑制慢性耳朵發炎腫脹的程度。

實施例十：CPPecp二聚體乳霜是否有改善Oxazolone誘導小鼠異位性皮膚炎模式之功效

本實驗測試CPPecp二聚體乳霜對於小鼠背部異位性皮膚炎之功效，試驗開始前3日，剃除小鼠背部之毛髮，並以適量除毛膏進行除毛，持續觀察除毛處表皮是否有過敏情形至試驗起始日。動物致敏以100%酒精配製所需濃度之oxazolone，試驗起始日以微量滴管在動物背部剃毛處之2x2cm²面積內均勻塗抹20μl，以5% oxazolone致敏，並於試驗第8日起，以0.1% oxazolone進行再刺激，連續15日。試驗第8日時，進行體重秤量，並依體重進行隨機分組，分別為正常對照組、Oxazolone(Oxa)組、Oxa+陽性對照物1組(0.1% Tacrolimus)、Oxa+陽性對照物2組(1% Hydrocortisone)、Oxa+0.01%試驗物質組(CPPecp二聚體乳霜0.01%)、Oxa+0.05%試驗物質組CPPecp二聚體乳霜0.05%)、Oxa+0.1%試驗物質組(CPPecp二聚體乳霜0.1%)與OX+陰性對照物組(Vehicle)。試驗第8日起，每日以0.1% Oxazolone刺激後1小時，塗抹0.2g試驗物質、陽性對照物質與陰性對照物質，並間隔6小時後再次給與，一天兩次至試驗結束。

試驗動物於試驗開始後，每週測量體重變化與評估皮膚外觀及臨床症狀，評分方式為紅斑/出血、水腫、抓傷/表皮脫落、脫屑/乾燥等4腫指標，無症狀為0分，輕微為1分，中度為2分，重度為3分。試驗第15日及試驗結束時進行血清採集與照相記錄背部剃毛處表皮影像。試驗結束日犠牲動物取下剃毛處皮膚以中性福馬林固定後進行石蠟包埋，製作厚度 3-5μm之組織切片玻片，再將已切好的組織石蠟片利用全自動染色機進行H&E染色。

試驗數據以EXCEL軟體內之one-way ANOVA與T-test進行統計分析。

由圖10A及表三可知，給與陽性對照物1與陽性對照物2組別在試驗第15與22日時，體重顯著低於Oxa與Oxa+陰性對照物組(p值小於0.01)，而試驗物質各劑量組則無顯著差異。

表三係依據給藥後不同天數體重變化的評分結果。

由圖10B及表四可知，oxazolone致敏後皆出現皮膚炎之症狀，持續給予陽性對照物1與陽性對照物2組則有效降低症狀的產生，而給與不同濃度之CPPecp二聚體乳霜亦可有效降低皮膚炎之症狀。

表四係依據給藥後不同天數動物背部皮膚平均臨床症狀的分數結果。

由圖10C可知，Oxa與Oxa+陰性對照物組相較於正常對照組，表皮層有明顯增厚現象，而陽性對照物1、陽性對照物2組與各劑量之CPPecp二聚體乳霜皆相較於Oxa與Oxa+陰性對照物組別有明顯變薄的現象。

由圖10D及表五可知，陽性對照物1、陽性對照物2組與各劑量之CPPecp二聚體乳霜皆皮膚表層薄於Oxa與Oxa+陰性對照物組別，具有統計上顯著的差異(p<0.01)。

表五係依據給藥後表皮層厚度的評分結果。

由圖10E及表六可知，陽性對照物2組、0.05%CPPecp二聚體乳霜及0.1%CPPecp二聚體乳霜的組織學分數優於Oxa與Oxa+陰性對照物組別，具有統計上顯著的差異。

表六係依據給藥後組織學數的評分結果。

實施例十一：評估CPPecp二聚體對於Oxazolone誘導小鼠異位性皮膚發炎後血液中細胞激素分泌影響

試驗動物結束時(第23日)，採取小鼠眼窩血並離心(1000g，10min)，離心完後，收集上清液(supernatant)並利用酵素免疫分析法(sandwich-ELISA)法，測量各組之上清液中所含的各種細胞激素含量。發炎相關的細胞激素，種類為介白素-4(IL-4)、介白素-6(IL-6)、介白素-13(IL-13)和介白素-17(IL-17)。以Milipore ELISA kits(MIL4-MAG、MCYIL6-MAG、MIL13-MAG、MIL17-MAG)，遵照其所提供之方式量測細胞激素。

由圖11A-11D可知，0.05%CPPecp二聚體對於oxazolone誘導後的細胞激素IL-6及IL-13有顯著的抑制效果。而0.01%CPPecp二聚體對於oxazolone誘導後的細胞激素IL-6及IL-13有顯著的抑制效果(p<0.05)。而對於IL-4及IL-17則沒有顯著的抑制效果。

以上所述僅為本發明之較佳實施例，並非用以限定本發明之申請專利範圍，因此凡其它未脫離本發明所揭示之精神下所完成之各種更動或潤飾等，均應包含於本案之申請專利範圍內。

<110> 傑安生技股份有限公司

<120> 胜肽CPPecp二聚體用於治療皮膚炎之用途

<160> 8

<210> SEQ ID NO：1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

<210> SEQ ID NO：2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

<210> SEQ ID NO：3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

<210> SEQ ID NO：4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

<210> SEQ ID NO：5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

<210> SEQ ID NO：6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

<210> SEQ ID NO：7

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

<210> SEQ ID NO：8

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

<210> SEQ ID NO：9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> B是鹼性胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> X₁是帶有芳香基、疏水性或不帶電之側鏈的胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> B是鹼性胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> X₂是半胱胺酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> B是鹼性胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> X₃是天門冬醯胺(Asparagine)或不存在

<400> 9

Claims (13)

1. 一種胜肽CPPecp二聚體組合物用於製備治療異位性皮膚炎或其他皮膚炎之醫藥組合物之用途，其中該胜肽CPPecp二聚體包含兩單體，該兩單體之序列為SEQ ID NO：5，其中該胜肽CPPecp二聚體係藉由雙硫鍵將兩單體連接而成。
2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該其他皮膚炎係急性皮膚炎、或搔癢。
3. 如申請專利範圍第1至2項中任一項之用途，其中該醫藥組合物係一外用製劑，其劑型為乳霜、軟膏、凝膠、洗劑、貼布、吸劑、氣溶膠、或栓劑。
4. 如申請專利範圍第3項之用途，其中該外用製劑之基礎原料係選自由水性溶液、非水性溶劑、懸浮液、乳液及凍乾製劑所組成之群組。
5. 如申請專利範圍第1至2項中任一項之用途，其中該醫藥組合物進一步包含溶劑、油類、分散劑、或其任意之組合。
6. 如申請專利範圍第5項之用途，其中該溶劑係選自由水、1,3-丁二醇、丙二醇、及甘油所組成之群組。
7. 如申請專利範圍第5項之用途，其中該油類係選自由玉米油、芝麻油、亞麻油、棉花籽油、大豆油、花生油、單-甘油酯、二-甘油酯、三-甘油酯、礦物油、深海魚鮫油角鯊烯(Squalene)、荷荷巴油(jojoba oil)、橄欖油、月見草油、琉璃苣油(Borage Oil)、葡萄籽油、椰子油、葵花籽油、乳油木果脂及其任意組合所組成之群組。
8. 如申請專利範圍第5項之用途，其中該分散劑係選自由卵磷脂、有機單甘油酯、山黎醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪酸酯、硬脂酸山梨醇酐酯、及其任意之組合所組成之群組。
9. 如申請專利範圍第1至2項中任一項之用途，其中該醫藥組合物進一步包含抗菌劑或防腐劑。
10. 如申請專利範圍第1至2項中任一項之用途，其中該醫藥組合物係透過抑制免疫調節相關激素，而非透過抑制TNFα發炎相關細胞激素治療皮膚炎。
11. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該醫藥組合物係一皮膚外用之劑型。
12. 如申請專利範圍第11項之用途，該劑型為乳霜或凝膠。
13. 如申請專利範圍第12項之用途，該醫藥組合物中包含濃度為0.01-0.1%之該胜肽CPPecp二聚體。

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