KR101781600B1 - 항암 및 항염증 활성을 갖는 약물 복합체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항암 및 항염증 활성을 갖는 약물 복합체에 관한 것으로서, RAGE 결합 펩타이드, 질병 치료용 유전자 및 양이온성 고분자를 포함하는 약물 복합체에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, RAGE에 의해서 매개되는 신호전달 체계를 효과적으로 방해할 수 있을 뿐만 아니라, 질병 치료를 위한 유전자를 포함함으로써 펩타이드와 유전자의 복합 치료 효과를 달성할 수 있고, 대장균 등의 박테리아에 의해서도 대량생산이 가능한 약물 복합체를 제공할 수 있다.
본 발명에 따르면, RAGE에 의해서 매개되는 신호전달 체계를 효과적으로 방해할 수 있을 뿐만 아니라, 질병 치료를 위한 유전자를 포함함으로써 펩타이드와 유전자의 복합 치료 효과를 달성할 수 있고, 대장균 등의 박테리아에 의해서도 대량생산이 가능한 약물 복합체를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 항암 및 항염증 활성을 갖는 약물 복합체에 관한 것이다.
최종당화산물 수용체 (receptor for advanced glycation endproducts, RAGE)란 면역글로불린 계열의 막투과 단백질로서, 최종당화산물과 결합하는 능력을 보유한다. 또한, 최종당화산물 (advanced glycation endproducts, AGE)은 체내 또는 체외에서 생성되며, 당화 반응 (glycation)에 의해서 당류가 단백질과 결합함으로써 생성된다. 최종당화산물은 당뇨, 동맥경화, 만성 신장질화 및 알츠하이머병 등과 같은 다양한 퇴행성 질환의 발병 및 악화에 관여하는 핵심적 물질이며, 또한 노화 및 노화관련 질병들에도 폭 넓게 관여하는 것으로 알려져 있다.
수용체인 RAGE와 그에 대한 리간드인 AGE 사이의 상호작용은 염증관련 유전자들의 활성화를 촉진하는 것으로 잘 알려져 있으며 (Nawroth PP et al., Diabetes-associated sustained activation of the transcription factor nuclear factor-kappaB, Diabetes 50 (12): 2792-2808), 당뇨병 환자 등 다양한 환자군에서 RAGE의 수준이 높게 관찰되는 것으로부터, RAGE가 이러한 질병들에서 염증 유발에 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 보고되고 있고, 더 나아가 일부 암들의 발병에도 관여하는 것으로 알려져 있다.
따라서, RAGE에 의한 다양한 질병 발병을 억제하기 위한 노력의 일환으로서, RAGE에 결합함으로써 RAGE에 의한 신호전달과정을 억제하기 위한 연구들이 보고된 바 있다. 예를 들어, 대한민국 공개특허공보 제2013-0082474호에서는, RAGE의 막투과 도메인 및 세포질 도메인이 결여된 sRAGE (가용성 RAGE)를 사용하여 이를 유효성분으로 포함하는 심근염 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하고자 하였다. 또한, RAGE에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하는 기술도 공지된 바 있다 (예를 들어, 항-RAGE 항체로서, abcam사로부터의 제품명 ab89911 항체).
그러나, 전술한 기술들은 큰 분자량을 갖는 거대 단백질들에 기반한 것으로서, 상대적으로 그 안정성이 떨어질 뿐만 아니라, 동물 세포에서 생산을 수행하여야 하는 특성상 생산성도 매우 떨어진다는 문제점을 갖는다. 또한, 전술한 기술들은 모두 RAGE의 신호전달과정만을 억제하기 위한 것으로서, 단백질 치료제로서의 기능 이외에 다른 기능을 보유하고 있지 않다.
관련하여, 대한민국 공개특허공보 제2011-0136504호에서는 RAGE 수용체 표적 펩타이드에 뇌질환 치료제 또는 뇌질환 진단시약을 결합시킴으로써, 뇌질환 치료제 등의 뇌로의 이행을 촉진하기 위한 약물 복합체를 개시하고 있다. 그러나, 이러한 기술 역시 RAGE 수용체 표적 펩타이드를 약물 운반체로 사용할 수 있다는 가능성만을 제시하고 있을 뿐, 안정적인 복합체 형성을 위한 기반기술을 제시하고 있지는 못한 실정이다.
이에, RAGE를 표적화할 수 있는 RAGE 결합 펩타이드를 기반으로 하되, RAGE 결합 펩타이드의 RAGE 신호전달과정 억제를 도모할 뿐만 아니라, 대상 질병을 효과적으로 치료할 수 있는 질병 치료용 유전자를 부가적으로 도입하여 복합적 치료 효과를 야기하고, 더 나아가 최종 복합체의 안정성을 획기적으로 개선할 수 있는 약물 복합체에 대한 개발이 시급한 실정이다.
따라서, 본 발명에서는 RAGE에 의해서 매개되는 신호전달 체계를 효과적으로 방해할 수 있을 뿐만 아니라, RAGE 결합 펩타이드에 DNA와 정전기적 인력을 통해서 결합할 수 있는 능력 및 핵지향성을 부여함으로써 질병 치료 유전자를 세포핵으로 효과적으로 전달할 수 있는 능력이 부여되고, 더 나아가 동물 세포가 아닌 대장균 등의 박테리아에 의해서도 대량생산이 가능한 약물 복합체를 제공하고자 한다.
이에, 본 발명에서는 상기 과제를 해결하기 위해서,
RAGE 결합 펩타이드, 질병 치료용 유전자 및 양이온성 고분자를 포함하는 약물 복합체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 RAGE 결합 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 RAGE 결합 펩타이드는 상기 질병 치료용 유전자 1 중량부에 대해서 4 중량부 내지 10 중량부의 함량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 양이온성 고분자는 상기 질병 치료용 유전자 1 중량부에 대해서 1 중량부 내지 30 중량부의 함량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 질병 치료용 유전자는 항암 유전자일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 항암 유전자는 HSV-TK 유전자, PTEN 유전자, PDCD4 유전자 및 APC 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 질병 치료용 유전자는 항염증 유전자일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 항염증 유전자는 HO-1 유전자, 아디포넥틴 (adiponectin) 유전자 및 TGF-β 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 양이온성 고분자는 폴리-L-라이신, 폴리(N-에틸-4-비닐피리디늄 브로마이드), 폴리에틸렌이민, 키토산, 폴리(디메틸아미노에틸 메틸아크릴레이트) 및 폴리아미도아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 양이온성 고분자일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 양이온성 고분자는 2 kDa 내지 25 kDa의 분자량을 갖는 폴리에틸렌이민일 수 있다.
본 발명에 따르면, RAGE에 의해서 매개되는 신호전달 체계를 효과적으로 방해할 수 있을 뿐만 아니라, 질병 치료를 위한 유전자를 포함함으로써 펩타이드와 유전자의 복합 치료 효과를 달성할 수 있고, 대장균 등의 박테리아에 의해서도 대량생산이 가능한 약물 복합체를 제공할 수 있다.
도 1a 내지 1d는 본 발명에 따른 RAGE 결합 펩타이드를 대량으로 생산하기 위한 발현벡터의 개략적인 구조 (a 및 b), 펩타이드의 정제 결과를 나타낸 그래프 (c) 및 SDS-PAGE를 통한 RAGE 결합 펩타이드의 확인 결과 (d)를 나타낸 도면이다.
도 2는 서열번호 1의 RAGE 결합 펩타이드가 RAGE에 결합함으로써 S100B에 의한 TNF-α 방출을 억제하는지를 확인하는 실험에 대한 결과를 도시한 그래프이다.
도 3은 서열번호 1의 RAGE 결합 펩타이드가 RAGE에 결합함으로써 S100B에 의한 VEGF 생성을 억제하는지를 확인하는 실험에 대한 결과를 도시한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 RAGE 결합 펩타이드, 루시퍼라아제를 암호화하는 DNA 및 폴리에틸렌이민을 포함하는 복합체를 제조하는 과정을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 5는 아가로오스 겔 상에서 DNA와 RAGE 결합 펩타이드의 중량비에 따른 이동도, 및 DNA, RAGE 결합 펩타이드 및 폴리에틸렌이민의 중량비에 따른 이동도를 측정하기 위해서 겔 지연 분석을 수행한 결과를 도시한 것이다.
도 6a는 다양한 비율의 DNA : 폴리에틸렌이민 중량비를 갖는 복합체들에 대한 상대 루시퍼라아제 단위를 측정한 결과를 도시한 그래프이고, 도 6b는 다양한 비율의 DNA : RAGE 결합 펩타이드 : 폴리에틸렌이민 중량비를 갖는 복합체들에 대한 상대 루시퍼라아제 단위를 측정한 결과를 도시한 그래프이다.
도 7은 DNA + RAGE 결합 펩타이드 복합체, DNA + 폴리에틸렌이민 복합체, 및 DNA + RAGE 결합 펩타이드 + 폴리에틸렌이민 복합체 각각의 크기 및 표면 전하를 측정한 결과를 도시한 그래프이다.
도 8은 C6 신경교모세포종 세포주를 사용한 형질전환감염 실험을 통해서, 본 발명에 따른 약물 복합체의 유전자 전달 효율을 루시퍼라아제 분석 방법을 사용하여 다른 약물전달체와 비교 평가한 결과를 도시한 그래프이다.
도 9는 C6 신경교모세포종 세포주를 사용한 형질전환감염 실험을 통해서, 본 발명에 따른 약물 복합체의 세포 내 독성을 MTT 분석방법을 사용하여 다른 약물전달체와 비교 평가한 결과를 도시한 그래프이다.
도 10a 내지 10e는 HSV-TK 유전자와 다양한 유전자 전달체와의 복합체를 사용하여 C6 신경교모세포종 세포주를 사용한 형질전환감염 실험을 통해서, 본 발명에 따른 약물 복합체의 암세포 사멸 효과를 비교 평가한 결과를 도시한 그래프이다.
도 11a 및 11b는 각각 다양한 복합체로 C6 신경교모세포종 세포주가 주입된 동물 모델을 처리한 후 전체 뇌 조직 중 종양의 백분율을 나타낸 그래프와, 실제 뇌 조직에 대한 관찰 사진이다.
도 2는 서열번호 1의 RAGE 결합 펩타이드가 RAGE에 결합함으로써 S100B에 의한 TNF-α 방출을 억제하는지를 확인하는 실험에 대한 결과를 도시한 그래프이다.
도 3은 서열번호 1의 RAGE 결합 펩타이드가 RAGE에 결합함으로써 S100B에 의한 VEGF 생성을 억제하는지를 확인하는 실험에 대한 결과를 도시한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 RAGE 결합 펩타이드, 루시퍼라아제를 암호화하는 DNA 및 폴리에틸렌이민을 포함하는 복합체를 제조하는 과정을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 5는 아가로오스 겔 상에서 DNA와 RAGE 결합 펩타이드의 중량비에 따른 이동도, 및 DNA, RAGE 결합 펩타이드 및 폴리에틸렌이민의 중량비에 따른 이동도를 측정하기 위해서 겔 지연 분석을 수행한 결과를 도시한 것이다.
도 6a는 다양한 비율의 DNA : 폴리에틸렌이민 중량비를 갖는 복합체들에 대한 상대 루시퍼라아제 단위를 측정한 결과를 도시한 그래프이고, 도 6b는 다양한 비율의 DNA : RAGE 결합 펩타이드 : 폴리에틸렌이민 중량비를 갖는 복합체들에 대한 상대 루시퍼라아제 단위를 측정한 결과를 도시한 그래프이다.
도 7은 DNA + RAGE 결합 펩타이드 복합체, DNA + 폴리에틸렌이민 복합체, 및 DNA + RAGE 결합 펩타이드 + 폴리에틸렌이민 복합체 각각의 크기 및 표면 전하를 측정한 결과를 도시한 그래프이다.
도 8은 C6 신경교모세포종 세포주를 사용한 형질전환감염 실험을 통해서, 본 발명에 따른 약물 복합체의 유전자 전달 효율을 루시퍼라아제 분석 방법을 사용하여 다른 약물전달체와 비교 평가한 결과를 도시한 그래프이다.
도 9는 C6 신경교모세포종 세포주를 사용한 형질전환감염 실험을 통해서, 본 발명에 따른 약물 복합체의 세포 내 독성을 MTT 분석방법을 사용하여 다른 약물전달체와 비교 평가한 결과를 도시한 그래프이다.
도 10a 내지 10e는 HSV-TK 유전자와 다양한 유전자 전달체와의 복합체를 사용하여 C6 신경교모세포종 세포주를 사용한 형질전환감염 실험을 통해서, 본 발명에 따른 약물 복합체의 암세포 사멸 효과를 비교 평가한 결과를 도시한 그래프이다.
도 11a 및 11b는 각각 다양한 복합체로 C6 신경교모세포종 세포주가 주입된 동물 모델을 처리한 후 전체 뇌 조직 중 종양의 백분율을 나타낸 그래프와, 실제 뇌 조직에 대한 관찰 사진이다.
이하, 도면 및 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.
염증성 질환 및 암을 치료하기 위해서는 단일 치료법에 의해서는 충분한 치료 효과를 달성할 수 없으며, 다양한 치료 방법을 복합적으로 적용하여야만 우수한 치료 효과를 달성할 수 있다는 점은 주지의 사실이다.
이에, 본 발명에서는, RAGE에 결합함으로써 RAGE에 의해서 매개되는 신호전달 경로를 효과적으로 방해하여 항암 또는 항염증 등의 치료 효과를 나타내는 성분으로서 RAGE 결합 펩타이드와, 상기 RACE 결합 펩타이이드에 정전기적 인력에 의해서 결합되어 세포 내로 운반되어 대상 질병에 대한 치료 효능을 나타내는 질병 치료용 유전자, 또한 상기 RACE 결합 펩타이드 및 질병 치료용 유전자와 안정적인 복합체를 형성하여 세포 내로의 고효율 전달을 가능케 하기 위한 양이온성 고분자를 포함하는 약물 복합체를 제공하고자 한다.
하기 실시예에도 서술된 바와 같이, 본 발명에서는 우선 RAGE에 결합하는 펩타이드를 발현하는 유전자 염기서열을 확보한 이후에, 이를 이용하여 상기 유전자 염기서열의 대량 생산을 위한 발현벡터를 제작하였는 바, 박테리아를 이용한 펩타이드의 대량 생산을 가능케 하였다.
종래, RAGE에 결합하는 것으로 알려진 리간드들에는 전술한 AGE, HMGB1, S100B, S100A7, S100P, 아밀로이드-β-단백질, Mac-1 및 포스파티딜세린 등이 존재하며, 바람직하게는 상기 RAGE 결합 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 펩타이드일 수 있다. 특히, 상기 서열번호 1로 표시되는 펩타이드는 HMGB1의 RAGE 결합 부분 뿐만 아니라, 핵 전달 서열을 포함하며, 또한 다른 전달체와 화학적 결합이 가능하도록 하기 위해서 시스테인 아미노산을 포함한다.
본 발명자들은 또한 RAGE 결합 펩타이드와 질병 치료용 유전자의 함량비가 적당한 비율로 조절되면 더욱 안정적이고 단단한 복합체를 형성할 수 있으며, 결과적으로 우수한 유전자 전달 효율을 달성할 수 있다는 사실을 밝혀냈는 바, 바람직하게는 상기 RAGE 결합 펩타이드는 상기 질병 치료용 유전자 1 중량부에 대해서 4 중량부 내지 10 중량부의 함량으로 포함될 수 있다. RAGE 결합 펩타이드의 함량이 4 중량부 미만인 경우에는 형성되는 복합체의 안정성 및 유전자 전달 효율이 떨어진다는 문제점이 있으며, 10 중량부를 초과하는 경우에도 유전자 전달 효율이 떨어진다는 문제점이 있어서 바람직하지 않다.
더 나아가, 상기 질병 치료용 유전자와 상기 양이온성 고분자의 함량비 역시 안정적인 복합체 형성 및 고효율의 유전자 전달에 중요한 영향을 미치는 바, 바람직하게는 상기 양이온성 고분자는 상기 질병 치료용 유전자 1 중량부에 대해서 1 중량부 내지 30 중량부의 함량으로 포함될 수 있다. 양이온성 고분자의 함량이 1 중량부 미만인 경우에는 상기 양이온성 고분자에 의해서 형성되는 복합체 표면의 양전하 분포의 정도가 미약하여 세포내 전달 효율이 떨어진다는 문제점이 있으며, 30 중량부를 초과하는 경우에는 유전자 전달 효율이 떨어질 수 있다는 문제점이 있어서 바람직하지 않다.
한편, 본 발명에 따른 약물 복합체에 의해서 전달이 가능한 질병 치료용 유전자로는, 이에 제한되는 것은 아니지만, HSV-TK 유전자, PTEN 유전자, PDCD4 유전자 및 APC 유전자 등과 같은 하나 이상의 항암 유전자; 또는 HO-1 유전자, 아디포넥틴 (adiponectin) 유전자 및 TGF-β 유전자 등과 같은 하나 이상의 항염증 유전자를 예로 들 수 있다.
또한, 상기 양이온성 고분자로는 폴리-L-라이신, 폴리(N-에틸-4-비닐피리디늄 브로마이드), 폴리에틸렌이민, 키토산, 폴리(디메틸아미노에틸 메틸아크릴레이트) 및 폴리아미도아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 양이온성 고분자를 예로 들 수 있고, 특히 생체 적합성 및 복합체 전달 후 분해 가능성 등을 고려할 때, 2 kDa 내지 25 kDa의 분자량을 갖는 폴리에틸렌이민을 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예
1.
RAGE
결합
펩타이드의
대량 생산 시스템 구축
HMGB1 DNA를 주형으로 하여, 94 ℃에서 30초 동안 DNA 변성, 52 ℃에서 30초 동안 프라이머 결합, 및 72 ℃에서 30초 동안 DNA 합성을 수행하는 조건에 의해서 PCR 반응을 수행함으로써, 서열번호 1의 RAGE 결합 펩타이드를 암호화하는 서열번호 2의 DNA 서열을 대량으로 제작하였다.
이어서, 상기와 같이 제작된 서열번호 2의 DNA 서열과, T7 프로모터 및 lac 오퍼레이터를 구비하고 6-Histidine tag를 발현하는 pET-21a 벡터를 Nhe I/Xho I 제한효소로 처리함으로써 RAGE 결합 펩타이드의 발현을 위한 발현 벡터를 제작하였다. 도 1a 내지 1d에는 상기 과정에 의해서 제작된 발현벡터의 개략적인 구조 (a 및 b), 펩타이드의 정제 결과를 나타낸 그래프 (c) 및 SDS-PAGE를 통한 RAGE 결합 펩타이드의 확인 결과 (d)를 도시하였다.
실시예
2.
RAGE
결합
펩타이드에
의한 암 유발 신호전달 경로의 방해 확인
S100B는 공지된 RAGE 리간드이며, RAGE에 결합하여 TNF-α 방출을 촉진하는 것으로 알려져 있는 바, 실시예 1에서 제작된 RAGE 결합 펩타이드가 RAGE에 결합함으로써 S100B에 의한 TNF-α 방출을 억제하는지를 확인하는 실험을 진행하였다. Raw 264.7 대식세포에 대해서, 아무런 리간드도 처리하지 않은 경우 (대조군), 서열번호 1에 따른 RAGE 결합 펩타이드만을 처리한 실험군 (RBP), S100B만을 처리한 실험군 (S100B), S100B와 서열번호 1에 따른 RAGE 결합 펩타이드를 함께 처리한 실험군 (S100B + RBP), S100B와 우혈청 알부민을 처리한 실험군 (S100B + BSA) 각각의 TNF-α 방출 정도를 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 도시하였다.
도 2를 참조하면, 공지된 TNF-α 방출 촉진 인자인 S100B를 처리하였을 경우의 TNF-α 방출 정도에 비해서 (S100B), 서열번호 1에 따른 RAGE 결합 펩타이드를 함께 처리하였을 경우 (S100B + RBP)에 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, S100B와 서열번호 1에 따른 RAGE 결합 펩타이드를 C6 신경교모세포종 세포주에 처리한 후, VEGF ELISA를 사용하여 혈관생성 억제 효과를 평가하였다. 아무런 리간드도 처리하지 않은 경우 (대조군), 서열번호 1에 따른 RAGE 결합 펩타이드만을 처리한 실험군 (RBP), S100B와 서열번호 1에 따른 RAGE 결합 펩타이드를 함께 처리한 실험군 (S100B + RBP), S100B와 우혈청 알부민을 처리한 실험군 (S100B + BSA) 각각의 VEGF 생성 정도를 측정하였으며, 그 결과를 도 3에 도시하였다.
도 3을 참조하면, S100B만을 처리하였을 경우의 VEGF 생성 정도에 비해서 (S100B), 서열번호 1에 따른 RAGE 결합 펩타이드를 함께 처리하였을 경우 (S100B + RBP)에 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
3.
RAGE
결합
펩타이드
,
DNA
및
양이온성
고분자를 포함하는 복합체 제조
실시예 1에 따라서 제조된 RAGE 결합 펩타이드, 루시퍼라아제를 암호화하는 DNA 및 폴리에틸렌이민을 사용하여 복합체를 제조하였다. 도 4에는 복합체의 제조 과정을 개략적으로 도시하였는 바, 먼저 루시퍼라아제 DNA 및 RAGE 결합 펩타이드를 소정 비율로 혼합해준 다음, 15 분 경과 후에 폴리에틸렌이민 (분자량 2kDa)을 소정 비율로 혼합해주고, 30분 동안 복합체 형성 시간을 부여하였다.
전술한 바와 같이 제조된 RAGE 결합 펩타이드와 DNA의 복합체를 아가로오스 겔 상에서 전기영동시켰으며, 겔 상에서의 DNA 이동 변화를 겔 지연 분석 (gel retardation assay)을 통해서 분석하였다. 또한, RAGE 결합 펩타이드 및 DNA에 양이온성 고분자로서 폴리에틸렌이민 (분자량 2kDa)을 추가하여 동일한 분석을 수행하였으며, 도 5에는 DNA와 RAGE 결합 펩타이드의 중량비에 따른 이동도, 및 DNA, RAGE 결합 펩타이드 및 폴리에틸렌이민의 중량비에 따른 이동도를 측정한 결과를 도시하였다.
도 5를 참조하면, DNA : RAGE 결합 펩타이드의 중량비가 1 : 4 이상이 되는 경우, 단단한 복합체가 형성됨을 확인할 수 있고, 이에 더해서 폴리에틸렌이민이 추가되는 경우 더욱 단단한 복합체가 형성됨을 알 수 있다.
더 나아가, DNA : RAGE 결합 펩타이드 : 폴리에틸렌이민 복합체의 최적 전달 비율을 도출하기 위해서 루시퍼라아제 (luciferase) 분석을 수행하였다. 이는, 루시퍼라아제 유전자를 사용하여 수행하였는 바, 복합체를 통해서 전달된 루시퍼라아제 유전자의 발현은 루시퍼라아제 단백질의 생성을 야기하고, 전달 효율에 다른 루시퍼라아제 단백질의 차이를 루시퍼라아제의 기질인 루시페린으로 처리해 주었을 때 발생하는 빛의 세기 차이를 분석하였다.
도 6a에는 DNA 중량에 대해서 각각 0배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배의 폴리에틸렌이민을 가해준 경우의 복합체들에 대한 상대 루시퍼라아제 단위 (relative luciferase unit, RLU)를 측정한 결과를 도시하였다. 도 6a를 참조하면, DNA : 폴리에틸렌이민의 중량비가 1 : 20 이상이 되는 경우 높은 RLU가 측정됨을 알 수 있고, 중량비 1: 20 근방에서 가장 높은 RLU가 측정됨을 알 수 있다.
또한, DNA : 폴리에틸렌이민의 최적 중량비로 도출된 1 : 20 중량비 복합체에 RAGE 결합 펩타이드를 첨가한 복합체들의 RLU를 측정한 결과를 도 6b에 도시하였다. 도 6b를 참조하면, DNA : RAGE 결합 펩타이드 : 폴리에틸렌이민의 중량비가 대략 1 : 8 : 20 내외인 경우에 가장 최적의 전달 성능을 나타냄을 알 수 있다.
한편, DNA + RAGE 결합 펩타이드 복합체, DNA + 폴리에틸렌이민 복합체, 및 DNA + RAGE 결합 펩타이드 + 폴리에틸렌이민 복합체 각각의 크기 및 표면 전하를 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 도시하였다. 도 7을 참조하면, 본 발명에 따른 약물 복합체는 직경 100 ~ 150 nm의 크기 및 양의 제타 포텐셜을 갖는 바, 세포 내로 전달되기에 적합한 크기 및 전기적 특성을 갖는다는 사실을 알 수 있다.
실시예
4. 본 발명에 따른 약물 복합체의 유전자 전달 효율 비교
C6 신경교모세포종 세포주를 사용한 형질전환감염 실험을 통해서, 본 발명에 따른 약물 복합체의 루시퍼라아제 유전자 전달 효율을 루시퍼라아제 분석 방법을 사용하여 다른 약물전달체와 비교 평가하였으며, 그 결과를 도 8에 도시하였다. 도 8을 참조하면, 유전자 단독 (naked) 전달 효율과 비교할 때에, RAGE 결합 펩타이드와의 복합체 (RBP)는 전달 효율의 증가가 거의 관찰되지 않았고, 분자량 2 kDa의 폴리에틸렌이민과의 복합체 (PEI 2 kDa)는 약간 전달 효율 증가가 관찰되었으나, 유전자 + RAGE 결합 펩타이드 + 폴리에틸렌이민 복합체 (RBP + PEI 2 kDa)의 경우는 유전자가 RAGE 결합 펩타이드와 결합된 경우, 또는 폴리에틸렌이민과 결합된 경우에 비해서 더욱 향상된 전달 효율을 나타내었다.
실시예
5. 본 발명에 따른 약물 복합체의 세포 내 독성 비교
C6 신경교모세포종 세포주를 사용한 형질전환감염 실험을 통해서, 본 발명에 따른 약물 복합체의 세포 내 독성을 MTT 분석방법을 사용하여 비교 평가하였으며, 그 결과를 도 9에 도시하였다. 도 9를 참조하면, 본 발명에 따른 약물 복합체 (RBP + PEI 2kDa)는 분자량 25 kDa의 폴리에틸렌이민 또는 리포펙타민을 사용한 복합체보다 월등하게 낮은 세포 독성을 나타낸다는 점을 알 수 있다.
실시예
6. 본 발명에 따른 약물 복합체의 복합치료 효과 확인
암치료 유전자로서 공지된 활성을 갖는 HSV-TK 유전자를 다양한 유전자 전달체와 복합체를 형성하여 C6 신경교모세포종 세포주에 형질전환감염시킨 후, 간시클로비르 (ganciclovir)가 첨가된 배지 (10 ㎍/ml)에서 배양한 후, 아넥신 V 분석방법을 사용하여 세포사멸 효율을 평가하였다.
도 10a 내지 10e에는 각각 HSV-TK 유전자만을 사용한 대조군 (10a), 분자량 2 kDa의 폴리에틸렌이민과 HSV-TK 유전자와의 복합체를 사용한 실험군 (10b), 본 발명에 따른 약물 복합체로서 서열번호 1의 RAGE 결합 펩타이드, 분자량 2 kDa의 폴리에틸렌이민, 및 HSV-TK 유전자의 복합체를 사용한 실험군 (10c), 분자량 25 kDa의 폴리에틸렌이민과 HSV-TK 유전자와의 복합체를 사용한 실험군 (10d), 및 상용 유전자 전달체인 리포펙타민과 HSV-TK 유전자와의 복합체를 사용한 실험군 (10e)에 대한 암세포 사멸 효과를 그래프로 도시하였다.
도 10a 내지 10e를 참조하면, 본 발명에 따른 약물 복합체는, 분자량 2 kDa의 폴리에틸렌이민과 HSV-TK 유전자와의 복합체를 사용한 실험군 (10b) 보다 높은 암세포 사멸 효과를 나타내며, 또한, 상용 유전자 전달체인 리포펙타민을 사용한 경우 (10e)와 유사한 정도의 암세포 사멸 효과를 나타냄을 알 수 있다.
실시예
7. 동물 모델에서의 본 발명에 따른 약물 복합체의 복합치료 효과 확인
암치료 유전자로서 공지된 활성을 갖는 HSV-TK 유전자를 다양한 유전자 전달체와 복합체를 형성하여 C6 신경교모세포종 세포주가 주입된 동물 모델 (Sprague dawley rat, male, 7 weeks)에 처리한 후, 간시클로비르 (ganciclovir)를 복강 내 주사로 투여하였다. 동물 모델에서의 항암 효과는 동물의 뇌 조직을 이용한 Nissl 염색에 의해서 평가하였다.
도 11a 및 11b에는 각각 다양한 복합체로 처리한 후 전체 뇌 조직 중 종양의 백분율을 나타낸 그래프와, 실제 뇌 조직 관찰 사진을 도시하였다. 도 11a 및 11b를 참조하면, 본 발명에 따른 복합체 (TK/RBP/PEI 2 kDa)를 사용하여 치료 유전자를 전달한 경우에, 분자량 2 kDa의 폴리에틸렌이민 전달체만을 사용한 경우 또는 분자량 25 kDa의 폴리에틸렌이민 전달체를 사용한 경우에 비해서 더욱 우수한 암 성장 억제 효과를 나타냄을 알 수 있다.
<110> IUCF-HYU
<120> Drug composite having anti-cancer and anti-inflammation activity
<130> JKP-0160
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RAGE binding peptide
<400> 1
Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg Ala Lys
1 5 10 15
Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser
20 25 30
Lys Lys Lys Lys Glu Cys
35
<210> 2
<211> 114
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA encoding RAGE binding peptide
<400> 2
aagctgaagg aaaaatacga aaaggatatt gctgcatatc gagctaaagg aaagcctgat 60
gcagcaaaaa agggagttgt caaggctgaa aaaagcaaga aaaagaagga atgt 114
Claims (10)
- 서열번호 1로 표시되는 RAGE 결합 펩타이드;
HSV-TK 유전자, PTEN 유전자, PDCD 유전자 및 APC 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 항암 유전자; 및
폴리-L-라이신, 폴리(N-에틸-4-비닐피리디늄 브로마이드), 폴리에틸렌이민, 키토산, 폴리(디메틸아미노에틸 메틸아크릴레이트) 및 폴리아미도아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 양이온성 고분자;를 포함하고,
상기 RAGE 결합 펩타이드는 상기 항암 유전자 1 중량부에 대해서 4 중량부 내지 10 중량부의 함량으로 포함되고,
상기 양이온성 고분자는 상기 항암 유전자 1 중량부에 대해서 1 중량부 내지 30 중량부의 함량으로 포함되는 것을 특징으로 하는 약물 복합체. - 삭제
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- 제1항에 있어서, 상기 양이온성 고분자는 2 kDa 내지 25 kDa의 분자량을 갖는 폴리에틸렌이민인 것을 특징으로 하는 약물 복합체.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150093008A KR101781600B1 (ko) | 2015-06-30 | 2015-06-30 | 항암 및 항염증 활성을 갖는 약물 복합체 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150093008A KR101781600B1 (ko) | 2015-06-30 | 2015-06-30 | 항암 및 항염증 활성을 갖는 약물 복합체 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20170002983A KR20170002983A (ko) | 2017-01-09 |
| KR101781600B1 true KR101781600B1 (ko) | 2017-09-25 |
Family
ID=57811006
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020150093008A KR101781600B1 (ko) | 2015-06-30 | 2015-06-30 | 항암 및 항염증 활성을 갖는 약물 복합체 |
Country Status (1)
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Family Cites Families (2)
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|---|---|---|---|---|
| KR20110136504A (ko) | 2010-06-15 | 2011-12-21 | 울산대학교 산학협력단 | Ｒａｇｅ 수용체 표적 펩타이드에 약물을 결합시킨 것을 특징으로 하는 약물 복합체 |
| US9388417B2 (en) | 2012-01-11 | 2016-07-12 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | Synthesis-regulating sRNA and method for preparing same |
-
2015
- 2015-06-30 KR KR1020150093008A patent/KR101781600B1/ko active IP Right Grant
Also Published As
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| KR20170002983A (ko) | 2017-01-09 |
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