CN110325176A - 纳米脂质体载体组合物或者用于治疗由于kras基因突变而对抗癌药物具有抗性的结直肠癌的包含所述组合物的治疗剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及其中负载有包含CAS9蛋白、抑制KRAS基因表达的指导RNA和阳离子聚合物之复合物的纳米脂质体载体组合物,或者用于由于其中KRAS基因突变而对抗癌剂具有抗性的结直肠癌的包含所述纳米脂质体载体组合物的治疗剂。西妥昔单抗目前被用作用于转移性结直肠癌的治疗剂,其仅对患有KRAS野生型结直肠癌的患者有效。西妥昔单抗的致命的缺点在于,给予西妥昔单抗的连续治疗时,即使患有KRAS野生型结直肠癌的患者在60%至80%的情况下也可能发生KRAS突变体结直肠癌。然而,使用本发明的纳米脂质体组合物不仅可以从根本上抑制KRAS(其是结直肠癌中的癌基因)的突变,而且还可以非常有效地治疗KRAS突变体转移性结直肠癌。
Description
技术领域
本发明涉及具有包封在纳米脂质体中的Cas9蛋白、指导RNA和阳离子聚合物之复合物的纳米脂质体载体组合物。更具体地,本发明涉及纳米脂质体载体组合物,其中Cas9蛋白、抑制KRAS基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物包封在纳米脂质体中,或涉及用于改善或治疗由 KRAS基因突变引起的对抗癌药物具有抗性的结直肠癌的包含所述纳米脂质体载体组合物的组合物。
背景技术
基因编辑技术是源自微生物的适应性免疫的技术。这开始集中于这样的免疫系统,其中噬菌体片段通过噬菌体感染被记忆为DNA,然后被Cas9 (CRISPR相关蛋白9:RNA指导的DNA核酸内切酶)切割,Cas9是当再次感染时充当基因剪刀的核酸酶;并且已发展成如果基因组中的特定碱基序列被指导RNA(guide RNA,gRNA)识别,则允许切割期望位点的基因校正技术(Woo JW等,2015)。
该技术作为治疗基因突变诱导的疾病(其被认为是无法治愈的疾病) 的根本病因的方法而受到关注。然而,仍然存在待解决的问题,例如基因编辑系统的有效体内递送和靶基因之外基因的脱靶。特别地,使用最初使用的Cas9质粒的基因编辑系统的安全性需要关于体内递送时的多种免疫应答和抗生素抗性进行验证。最近,用于体外产生由蛋白质和指导RNA 构成的基因剪刀(Cas9)和递送其的系统已被用作另外的替代,但也存在与有效地递送至细胞以及蛋白质和RNA的稳定性相关的问题 (Ramakrishna S等,2014)。
结直肠癌是由在大肠中出现的癌细胞构成的恶性肿瘤。由于大肠完全吸收来自小肠中的食物的水分、收集直肠中的剩余物质并以粪便的形式将其排出,包含致癌物质或在人体内无用的物质的废物(而不是营养物质) 聚集在大肠中,大肠因此比其他器官更容易成为癌细胞生长的部位。
常规结直肠癌治疗通过手术和抗癌化疗进行,并且西妥昔单抗 (Erbitux)注射是典型的靶向治疗。西妥昔单抗是一种单克隆抗体,其靶向表皮生长因子受体(epidermalgrowth factor receptor,EGFR),并且特异性结合结直肠癌细胞表面的EGFR,从而抑制引起癌细胞增殖的信号传导通路的预定部分,以由此抑制癌细胞的整体增殖。然而,具有KRAS(为结直肠癌中的癌基因)突变的患者(所有结直肠癌患者的40%至50%)不能用这种注射治疗。此外,当具有野生型KRAS基因的结直肠癌患者继续进行西妥昔单抗治疗时,其60%至80%出现KRAS基因突变。
KRAS是与结直肠癌的产生相关的数种基因之一,并且在决定定制治疗(例如西妥昔单抗)的有效性方面被认为是非常重要的,因为已知结直肠癌患者的药物响应和存活时间取决于是否发生KRAS基因突变而显著改善。
同时,细胞内药物递送系统中所需的两个重要特性是效率和细胞毒性 (安全性),并且由胆固醇或脂质构成的纳米脂质体载体技术被广泛使用 (Zuris JA等,2015)。
因此,本发明人已经通过将Cas9蛋白、抑制KRAS基因表达的指导 RNA和阳离子聚合物的复合物包封在纳米脂质体中制备了具有良好药物递送效率的细胞载体,以通过基因编辑治疗结直肠癌,并已使用所述细胞载体作为治疗剂用于结直肠癌的治疗,从而最终实现本发明。
[引用列表]
(专利文献1)韩国专利申请公开No.10-2015-0101476(发明名称: Compositionfor cleaving target DNA comprising guide RNA specific to target DNA and Cas-protein-encoding nucleic acid or Cas protein,and use thereof,申请人:ToolGen,公开日:2015年9月03日)
(专利文献2)韩国专利申请公开No.10-2015-0101477(发明名称: Compositionfor cleaving target DNA comprising guide RNA specific to target DNA and Cas-protein-encoding nucleic acid or Cas protein,and use thereof,申请人:ToolGen,公开日:2015年9月03日)
(专利文献3)韩国专利申请公开No.10-2015-0101478(发明名称: Compositionfor cleaving target DNA comprising guide RNA specific to target DNA and Cas-protein-encoding nucleic acid or Cas protein,and use thereof,申请人:ToolGen,公开日:2015年9月3日)
(非专利文献1)Belov L等,Cell surface markers in colorectal cancerprognosis,Int.J.Mol.Sci.,2010,12(1),78-113。
(非专利文献2)Dos Santos T等,Effects of transport inhibitors on thecellular uptake of carboxylated polystyrene nanoparticles in different celllines, PLoS One,2011,6(9):e24438。
(非专利文献3)Dow LE等,Apc Restoration Promotes CellularDifferentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer,Cell,2015,161(7),1539-1552。
(非专利文献4)Lee J等,Effect of simvastatin on Cetuximab resistance inhuman colorectal cancer with KRAS mutations,J.Natl.Cancer Inst.,2011, 103(8),674-688。
(非专利文献5)Lievre等,KRAS mutation status is predictive of responseto Cetuximab therapy in colorectal cancer,Cancer Res.,2006,66(8), 3992-3995。
(非专利文献6)Matano M等,Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids,Nat.Med., 2015,21(3),256-262。
(非专利文献7)Montagut C等,Identification of a mutation in theextracellular domain of the Epidermal Growth Factor Receptor conferringCetuximab resistance in colorectal cancer,Nat.Med.,2012,18(2),221-223。
(非专利文献8)Ramakrishna S等,Gene disruption by cell-penetratingpeptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA,Genome Res., 2014,24(6),1020-1027。
(非专利文献9)Woo JW等,DNA-free genome editing in plants withpreassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins,Nat.Biotechnol.,2015, 33(11),1162-1164。
(非专利文献10)Zuris JA等,Cationic lipid-mediated delivery of proteinsenables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo,Nat.Biotechnol.,2015,33(1),73-80。
发明内容
技术问题
因此,本发明旨在提供具有包封在纳米脂质体中的Cas9蛋白、指导 RNA和阳离子聚合物之复合物的纳米脂质体载体组合物。更具体地,本发明旨在提供纳米脂质体载体组合物,其中Cas9蛋白、抑制KRAS基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物包封在纳米脂质体中,或者用于改善或治疗由KRAS基因突变引起的对抗癌药物具有抗性的结直肠癌的包含所述纳米脂质体载体组合物的组合物。
技术方案
本发涉及具有包封在纳米脂质体中的Cas9蛋白、抑制KRAS基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物的纳米脂质体载体组合物。
抑制KRAS基因表达的指导RNA可包含SEQ.ID.NO:1或2的碱基序列。
纳米脂质体可包含卵磷脂、胆固醇、阳离子磷脂和金属螯合脂质。
纳米脂质体可与单克隆或多克隆抗体结合,所述单克隆或多克隆抗体能够识别选自以下的在结直肠癌细胞中表达的至少一种蛋白质:EGFR(表皮生长因子受体)、EpCAM(上皮细胞黏附分子)、CEA(癌胚抗原)和膜联蛋白。
纳米脂质体的颗粒尺寸可为10至2,000nm。
本发明可提供用于改善或治疗结直肠癌的包含纳米脂质体载体组合物的组合物。
用于改善或治疗结直肠癌的组合物可添加有西妥昔单抗。
此外,本发明提供了制备能够选择性识别结直肠癌细胞的纳米脂质体载体组合物的方法。
优选地,上述方法包括:
S1)制备Cas9蛋白、抑制KRAS基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物,并通过将卵磷脂、金属螯合脂质、胆固醇和阳离子磷脂在氯仿中混合来制备脂质膜组合物;
S2)向脂质膜组合物添加Cas9蛋白、抑制KRAS基因表达的指导RNA 和阳离子聚合物的复合物并进行超声;
S3)对经超声的脂质膜组合物进行冷冻-解冻然后进行超声;
S4)对在S3中进行超声的脂质膜组合物进行离心并回收沉淀的纳米脂质体;以及
S5)使用交联剂使抗体与在S4中获得的沉淀的纳米脂质体结合。
以下,将给出本发明的详细描述。
本发明涉及纳米脂质体载体组合物,其中Cas9蛋白、抑制KRAS基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物包封在纳米脂质体中。
Cas9蛋白可获自用pET28a/Cas9-Cys质粒(Cas9-Cys插入pET28a(+) 载体中)转化的细胞或菌株。优选地,通过将pET28a/Cas9-Cys质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli)中并过表达Cas9蛋白来获得Cas9蛋白。
在本发明中,指导RNA包含以下SEQ.ID.NO:1或2的碱基序列,并且包含指导RNA的纳米脂质体载体组合物用于通过抑制KRAS野生型基因或突变基因的表达来改善或治疗结直肠癌。
SEQ.ID.NO:1:CUGAAUUAGCUGUAUCGUCA
SEQ.ID.NO:2:GAAUAUAAACUUGUGGUAGU
SEQ.ID.NO:1的指导RNA衍生自以下SEQ.ID.NO:3的人(智人) KRAS的DNA序列的一部分,并且靶向以下SEQ.ID.NO:5的KRAS的 DNA序列的一部分(SEQ.ID.NO:3和SEQ.ID.NO:5具有彼此互补的碱基序列)。SEQ.ID.NO:2的指导RNA衍生自以下SEQ.ID.NO:4的KRAS 的DNA序列的一部分,并且靶向以下SEQ.ID.NO:6的KRAS的DNA序列的一部分(SEQ.ID.NO:4和SEQ.ID.NO:6具有彼此互补的碱基序列)。
SEQ.ID.NO:3:CTGAATTAGCTGTATCGTCA
SEQ.ID.NO:4:GAATATAAACTTGTGGTAGT
SEQ.ID.NO:5:TGACGATACAGCTAATTCAG
SEQ.ID.NO:6:CTTATATTTGAACACCATCA
在SEQ.ID.NO:1或2的指导RNA序列之后可包含支架序列以与Cas9 蛋白形成复合物。此处,支架序列的种类没有特别的限制,并且可使用任何序列,只要其是用于制备指导RNA的典型碱基序列即可。
因此,应用于本发明的纳米脂质体的指导RNA可包含:
SEQ.ID.NO:7:
或SEQ.ID.NO:8:
作为被SEQ.ID.NO:1或2的指导RNA序列靶向的SEQ.ID.NO:5 或6的DNA序列,被人的SEQ.ID.NO:1或2的指导RNA序列靶向的 SEQ.ID.NO:5或6的DNA序列是存在于KRAS的外显子2(智人染色体 12,GenBank No.NC_000012.12)中的碱基序列,并且外显子2的DNA 被SEQ.ID.NO:1或2的指导RNA切割。
如图1a和1b中示意性示出的,KRAS基因突变发生在人基因组DNA 的KRAS外显子2的密码子12序列上,并且在作为结直肠癌细胞的SW480 和SNU407细胞系中被证实。
SEQ.ID.NO:1、2、7、8的指导RNA可使用T7RNA聚合酶通过体外转录来合成。
阳离子聚合物优选地包含选自以下的至少一种:聚-L-赖氨酸、聚酰氨基胺、聚[2-(N,N-二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯]、壳聚糖、聚-L-鸟氨酸、环糊精、组蛋白、胶原蛋白、葡聚糖和聚乙烯亚胺。最优选地,使用聚乙烯亚胺。
纳米脂质体可包含卵磷脂(α-磷脂酰胆碱)、阳离子磷脂、胆固醇和金属螯合脂质,从而通过卵磷脂、阳离子磷脂、胆固醇和金属螯合脂质形成构成纳米脂质体的膜。
卵磷脂广泛分布在动物/植物中并且具有优异的生物相容性,并且先前已经证实其稳定性,因此卵磷脂可广泛用于食品和药物载体技术。此外,其可用作有助于控制纳米脂质体的尺寸和改变纳米脂质体的形状的材料。
阳离子磷脂可包含选自以下的至少一种:二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPhPE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3- 磷酸乙醇胺(DPPE)和1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)。优选地可使用1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)。
金属螯合脂质优选地包含选自以下的至少一种:DOGS-NTA-Ni脂质、 DMPE-DTPA-Gd脂质和DMPE-DTPA-Cu脂质。DOGS-NTA-Ni脂质是具有由以下化学式1表示的化学结构的脂质:
[化学式1]
并且被称为1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰](镍盐)。
*1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiaceticacid)succinyl](nickel salt)
DMPE-DTPA-Gd脂质是具有由以下化学式2表示的化学结构的脂质:
[化学式2]
并且被称为1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-二亚乙基三胺五乙酸(钆盐)。
*1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid(gadolinium salt)
DMPE-DTPA-Cu脂质是具有由以下化学式3表示的化学结构的脂质:
[化学式3]
并且被称为1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-二亚乙基三胺五乙酸(铜盐)
*1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-diethylenetriaminepentaacetic acid(copper salt)。
DOGS-NTA-Ni脂质的功能是使用在蛋白质纯化过程中使用的 His-Tag(6X组氨酸)和Ni2+亲和力有效地将Cas9蛋白(包含His-Tag) 包封到纳米脂质体中。更具体地,DOGS-NTA-Ni被配置成在18碳原子上形成一个双键,因此能够与卵磷脂形成脂质,并且Ni2+附着于其末端,因此附着于Cas9蛋白的两个(His-Tag)与一个Ni2+彼此连接,由此将Cas9 蛋白更有效地包封到纳米脂质体中。DMPE-DTPA-Gd脂质和 DMPE-DTPA-Cu脂质具有与上述相同的作用,并有效地诱导将包含Cas9 蛋白的复合物包封到纳米脂质体中。
在本发明的纳米脂质体中,与包含SEQ.ID.NO:1的碱基序列的指导 RNA结合的Cas9蛋白和与包含SEQ.ID.NO:2的碱基序列的指导RNA 结合的Cas9蛋白也可组合存在。
纳米脂质体的颗粒尺寸可为10至2,000nm。如果纳米脂质体的尺寸小于10nm,则难以将Cas9蛋白、抑制KRAS基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物包封到纳米脂质体中,并且在体内注射时其稳定性可能降低,这是不期望的。另一方面,如果其尺寸超过2,000nm,则包含纳米脂质体的组合物在体内注射时稳定性可能降低,这是不期望的。
纳米脂质体能够与单克隆或多克隆抗体结合,所述单克隆或多克隆抗体能够识别选自以下的在结直肠癌细胞中表达的至少一种蛋白质:EGFR (表皮生长因子受体)、EpCAM(上皮细胞黏附分子)、CEA(癌胚抗原) 和膜联蛋白。
可使用本领域中广泛已知的技术容易地产生抗体。多克隆抗体可获自在将选自EGFR、EpCAM、CEA和膜联蛋白的任一种蛋白质注射到动物中之后收集的血清。动物可包括任何动物宿主,例如山羊、兔、猪等。单克隆抗体可使用如本发明所属领域中广泛已知的杂交瘤方法(Kohler G. 和Milstein C.)或噬菌体抗体文库方法(Clackson等;Mark等)来制备。杂交瘤方法可使用免疫相关宿主动物(例如小鼠)的细胞和癌症或骨髓瘤细胞系进行。然后,通过本发明所属领域中广泛已知的使用聚乙二醇的方法将两种细胞融合,然后可通过标准组织培养方法来增殖产生抗体的细胞。然后,通过使用有限稀释技术的亚克隆获得均匀的细胞群,然后可使用标准技术在体外或体内大量培养能够产生对选自EGFR、EpCAM、CEA和膜联蛋白的任一种蛋白质具有特异性的抗体的杂交瘤。噬菌体抗体文库方法可以以这样的方式进行:其中,获得针对选自EGFR、EpCAM、CEA 和膜联蛋白的任一种蛋白质的抗体基因,并以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面上,从而体外制备抗体文库,然后从文库中分离并且从而产生与选自EGFR、EpCAM、CEA和膜联蛋白的任一种蛋白质结合的单克隆抗体。由此产生的抗体可通过电泳、透析、离子交换色谱法、亲和色谱法等分离。
抗体可包括抗体分子的功能性片段以及具有两条全长轻链和两条全长重链的完整形式。抗体分子的功能性片段是至少具有抗原结合功能的片段,包括Fab、F(ab’)、F(ab’)2、F(ab)2、Fv等。
在本发明中,抗体可使用选自以下的至少一种交联剂作为接头进行结合:1,4-双-马来酰亚胺基丁烷、1,11-双-马来酰亚胺基四甘醇、1-乙基-3-[3- 二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐、琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基环己烷-1-羧基-[6-酰胺基己酸酯]]及其磺酸酯(磺基-SMCC)、琥珀酰亚胺基6-[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺]己酸酯]及其磺酸酯(磺基-SPDP)、间- 马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯及其磺酸酯(磺基-MBS)和琥珀酰亚胺基[4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯]及其磺酸酯(磺基 -SMPB)。
接头的功能是使纳米脂质体的阳离子磷脂与抗体彼此连接。
本发明的纳米脂质体可稳定地分散在中性水、细胞培养液、血液等中持续数小时或更久。
本发明可提供用于改善或治疗结直肠癌的包含纳米脂质体载体组合物的组合物。组合物可还包含西妥昔单抗。结直肠癌可以是具有KRAS野生型基因型或突变体基因型的结直肠癌。纳米脂质体载体组合物有效地治疗具有KRAS突变体基因型并且因此对西妥昔单抗具有抗药性的结直肠癌。
如下,本发明提供了制备能够选择性识别结直肠癌细胞的纳米脂质体载体组合物的方法。优选地,所述方法包括:S1)制备Cas9蛋白、抑制 KRAS基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物,并通过将卵磷脂、金属螯合脂质、胆固醇和阳离子磷脂在氯仿中混合来制备脂质膜组合物; S2)向脂质膜组合物添加Cas9蛋白、抑制KRAS基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物并进行超声;S3)对经超声的脂质膜组合物进行冷冻-解冻然后进行超声;S4)对在S3中进行超声的脂质膜组合物进行离心并回收沉淀的纳米脂质体;以及S5)使用交联剂使抗体与在S4中获得的沉淀的纳米脂质体结合。
当在S1中制备复合物时,Cas9蛋白、抑制KRAS基因表达的指导RNA 和阳离子聚合物可以以1∶1~3∶30~70的摩尔比混合。如果其混合比在上述范围之外,则复合物的制备可能变得困难。
在S1中,卵磷脂、金属螯合脂质、胆固醇和阳离子磷脂可以以 2∶0.1~5∶0.01~0.5∶0.01~0.5的摩尔比混合。如果其混合比在上述范围之外,则构成纳米脂质体的脂质的制备可能变得困难。
此处,S3中的冷冻-解冻可重复1至12次。当冷冻-解冻脂质膜组合物的过程以这种方式重复时,可形成具有更均匀尺寸的纳米脂质体分散溶液,并且可以提高纳米脂质体的药物包封效率。如果重复该过程的次数超过12次,则纳米脂质体的包封效率可能降低。因此,上述过程优选地进行12次或更少。
在S5中,将纳米脂质体与交联剂混合1至5小时,添加抗体,并一起混合1至5小时。
在S5中,纳米脂质体、交联剂和抗体可以以10~30∶1~5∶1的重量比结合。
当根据本发明制备纳米脂质体时,金属螯合脂质带负电荷(-),使得响应于Cas9和抑制KRAS基因表达的指导RNA的杂交体的负电荷(-)而难以实现脂质体包封。因此,为了克服该问题,可通过制备包含具有正电荷(+) 的阳离子聚合物的复合物来更有效地包封纳米脂质体。
此外,本发明可提供包含纳米脂质体载体组合物的药物组合物。本发明的药物组合物可根据各典型方法配制成经口剂型,例如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂和气溶胶制剂,以及外用制剂、栓剂和无菌可注射溶液。可包含在药物组合物中的载体、赋形剂和稀释剂可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、金合欢胶藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。制剂通常可使用稀释剂或赋形剂例如填充剂、增量剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等来制备。用于经口施用的固体制剂可包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等,并且这样的固体制剂可通过将本发明的组合物与至少一种赋形剂(例如,淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等)混合来制备。除简单的赋形剂之外,还可使用润滑剂例如硬脂酸镁、滑石等。经口液体制剂可包括混悬剂、溶液剂、乳剂或糖浆剂,并且还可不仅包含简单的稀释剂,例如水或液体石蜡,还可包含多种赋形剂,例如润湿剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。用于肠胃外施用的制剂可包括无菌水溶液剂、非水性溶剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。作为非水性溶剂或混悬剂,可使用丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)、可注射酯(例如油酸乙酯)等。作为栓剂的基质,可使用Witepsol、Macrogol、Tween 61、可可脂、月桂精酯、甘油明胶等。
当施用时,根据本发明的药物组合物的量可根据待治疗的对象的年龄、性别和体重、治疗的具体疾病或病理学状况、疾病或病理学状况的严重程度、施用途径和处方者的判断而有所不同。基于这些因素的剂量确定对于本领域技术人员来说将是明显的,并且剂量通常为0.01mg/kg/天至约 2000mg/kg/天。优选地,剂量设定为1mg/kg/天至500mg/kg/天。施用可每天一次或每天数次地进行。剂量不以任何方式限制本发明的范围。
根据本发明的药物组合物可通过多种途径施用于哺乳动物,例如小鼠、家畜、人等。可考虑所有施用方式,例如通过经口、直肠内、静脉内、肌内、皮下、腹膜内或脑室内注射。
有利效果
本发明涉及具有包封在纳米脂质体中的Cas9蛋白、抑制KRAS基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物的纳米脂质体载体组合物,或用于治疗由KRAS基因突变引起的对抗癌药物具有抗性的结直肠癌的包含所述纳米脂质体载体组合物的治疗剂。西妥昔单抗目前被用作用于治疗转移性结直肠癌的治疗剂,其对KRAS野生型结直肠癌患者是有效的,但其致命缺点在于,用西妥昔单抗连续治疗之后,60%至80%的KRAS野生型结直肠癌患者发展为KRAS突变体结直肠癌。然而,使用本发明的纳米脂质体组合物能够从根本上抑制KRAS(其是结直肠癌中的癌基因)的突变,并且还能够非常有效地治疗KRAS突变体转移性结直肠癌。
附图说明
图1a和1b示出了在HT29、SW480和SNU407结直肠癌细胞系中,鉴定每一类型细胞的基因组DNA的KRAS外显子2的密码子12序列以评价KRAS在外显子2的密码子12位置处是野生型(GGT)还是突变体(GTT 或GAT)的结果;
图2示出了通过质粒系统和KRAS mRNA表达评价根据本发明的单链指导RNA(sgRNA)1和2序列的效率的结果;
图3a示意性示出了根据本发明的单链指导RNA(sgRNA,SEQ.ID. NO:1)的碱基序列;
图3b示出了在对本发明中使用的Cas9蛋白进行纯化、SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)然后用考马斯蓝溶液染色之后鉴定蛋白质存在的结果;
图4示出了使用通过在实验室中结合制备的体外转录的sgRNA和经纯化的Cas9蛋白的杂交体(Cas9/sgRNA杂交体)确认KRAS基因是否实际上被切割的结果;
图5示意性示出了根据本发明实施例2的纳米脂质体的结构,其中纳米脂质体被配置成使得结合在一起的Cas9蛋白、指导RNA(sgRNA)和聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)的复合物被包封在其中,并且构成脂质体的膜由卵磷脂、胆固醇、DPPE(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺)和DOGS-NTA-Ni脂质构成,暴露于脂质体外表面的DPPE的胺基与靶向结直肠癌细胞的EGFR抗体(抗EGFR)使用磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯)作为接头连接;
图6示出了用抑制细胞内引入的抑制剂处理然后用Cas9的抗体进行免疫染色之后用共聚焦激光扫描显微术拍摄的图像,以评价根据本发明实施例2的纳米脂质体向结直肠癌细胞中的引入;
图7a示意性示出了KRAS基因中由根据本发明的sgRNA 1和sgRNA 2靶向的人基因组的位置;
图7b示意性示出了使用根据本发明实施例2的纳米脂质体切割KRAS 基因的20个碱基的序列;
图7c示出了用根据本发明实施例2的纳米脂质体处理的结直肠癌细胞(具有KRAS野生型基因的HT29细胞和具有KRAS突变体基因的SW480 和SNU407细胞)中抑制KRAS mRNA表达的效果;
图7d示出了评价用根据本发明实施例2的纳米脂质体处理的SW480 细胞中Ras蛋白表达程度和Erk 1/2信号传导的结果;
图7e和7f示意性示出了与K-ras、西妥昔单抗和Cas9/sgRNA相关的细胞信号传导过程;
图8a示出了作为用单独西妥昔单抗处理的细胞测试组的结果,具有 KRAS野生型基因的HT29细胞和具有KRAS突变体基因的SW480和 SNU407细胞的细胞存活和增殖的WST-1测定结果;
图8b示出了作为用西妥昔单抗处理使用根据本发明实施例2的纳米脂质体的KRAS基因编辑的细胞的测试组的结果,具有KRAS野生型基因的HT29细胞和具有KRAS突变体基因的SW480和SNU407细胞中的细胞存活和增殖的WST-1测定结果;
图9示出了在用对比例1(其中未包封Cas9、sgRNA和聚乙烯亚胺的复合物)的纳米脂质体和用根据本发明实施例2的纳米脂质体(其中包封Cas9、sgRNA和聚乙烯亚胺的复合物)处理的细胞中在凋亡期间不同蛋白质表达的结果;
图10示出了在用根据本发明实施例2的纳米脂质体处理的结直肠癌细胞中,测量胱天蛋白酶-3活性以评价由西妥昔单抗引起的凋亡的结果;
图11示出了在纳米脂质体制备之后通过测量滤液中残留的Cas9蛋白的量来评价纳米脂质体的包封效率的结果;
图12示出了质粒Cas指导载体(plasmid Cas guide vector)的结构;
图13示出了pET28a/Cas9-Cys质粒(Addgene质粒#53261)的结构;以及
图14示意性示出了获自[Wu S等]的制备半抗体的方法。
具体实施方式
通过以下实施例将给出对本发明更好的理解。然而,本发明不限于本文中描述的实施例,而是可以具体化为其他形式。此外,阐述实施例是为了向本领域技术人员提供对本发明精神的理解,以使得本文中的教导是彻底和完整的。
<实施例1.指导RNA的制备和Cas9蛋白的纯化>
实施例1-1.靶向KRAS基因的指导RNA的制备
使用T7RNA聚合酶(NEB)通过体外转录方法制备靶向KRAS基因的指导RNA。为此,通过PCR方法制备140b.p.DNA模板,其使用如下表1中所示的包含T7启动子序列和SEQ.ID.NO:3: CTGAATTAGCTGTATCGTCA和SEQ.ID.NO:4:GAATATAAACTTGTGGTAGT·(对应于KRAS基因的20b.p.序列)的两种‘69-mer正向引物’、包含与指导 RNA结合的支架序列的一种‘20-mer反向引物’和质粒Cas指导载体 (OriGene)。对该DNA模板、rNTP混合物、T7RNA聚合酶和RNA酶抑制剂在37℃下进行转录2小时,从而产生指导RNA,然后进行RNA纯化,由此提高RNA纯度。
*T7启动子序列对应于下表1的加下划线部分。
*表1的粗体序列是识别KRAS基因的位点,其中通过识别支架序列的模板(质粒Cas指导载体)来合成指导RNA,并且其碱基序列与最终指导RNA的序列是相同的(其中T替换为U)。
*F引物之后的GTTTTAGAGCTAGAAATAGCA是支架序列的一部分。
*质粒Cas指导载体包含支架序列的模板。
*该测试中使用的质粒Cas指导载体的结构如图12中所示。
来源:http://www.origene.com/CRISPR-CAS9/Detail.aspx?sku=GE100001
[表1]
通过上述实验,制备了具有下表2的碱基序列的指导RNA。
[表2]
在本发明中制备的表2的单链指导RNA(sgRNA)示意性在图3a中示出。
最终指导RNA的功能是通过识别作为靶标的人KRAS基因的SEQ.ID. NO:5:TGACGATACAGCTAATTCAG或SEQ.ID.NO:6:CTTATATTTGAACACCATCA的碱基序列来抑制每种KRAS基因表达。
实施例1-2.Cas9蛋白的纯化
将pET28a/Cas9-Cys质粒(Addgene质粒#53261)转化到大肠杆菌 (DH5α)中,并且在28℃下在0.5mM IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃型半乳糖苷)中过表达Cas9蛋白,并且在裂解缓冲液(20mM pH 8.0的 Tris-C1、300mM NaCl、20mM咪唑、1×蛋白酶抑制剂混合物、1mg/mL 溶菌酶)中超声过表达Cas9-蛋白的大肠杆菌。将在超声之后获得的裂解物离心以得到包含蛋白质的液体。使用Ni-NTA琼脂糖珠提取方法(洗脱缓冲液:20mM pH 8.0的Tris-C1、300mM NaCl、300mM咪唑、1×蛋白酶抑制剂混合物)从液体中分离Cas9蛋白。将由此分离的蛋白质在储存缓冲液(50mM pH 8.0的Tris-HCl、200mM KCl、0.1mM EDTA、1mM DTT、0.5mMPMSF、20%甘油)(截止10K)中透析,从而除去咪唑,然后量化蛋白质浓度(使用BCA方法)。此处,通过SDS-PAGE鉴定通过透析获得的Cas9蛋白,从其中证实了Cas9蛋白形成良好(图3b)。
**pET28a/Cas9-Cys质粒(Addgene质粒#53261)的结构:图13,来源:Addgene(http://www.addgene.org/)
<实施例2.纳米脂质体的产生>
通过将在实施例1中制备的Cas9蛋白、指导RNA和聚乙烯亚胺以 1∶2∶50的摩尔比混合来制备复合物。此处,用作指导RNA的是包含支架序列的SEQ.ID.NO:7或8(其中包含SEQ.ID.NO:1或2)。
接下来,将卵磷脂(Sigma Aldrich)、DOGS-NTA-Ni脂质(Avanti polar lipids)、胆固醇(Sigma Aldrich)和DPPE(Sigma Aldrich)以2∶1∶0.1∶0.05 的摩尔比在氯仿中混合,然后使用旋转蒸发器制成脂质膜。
向脂质膜添加Cas9蛋白/指导RNA/聚乙烯亚胺复合物并通过超声混合。重复使用液氮的冷冻-解冻循环十次,然后进行超声(探针模式),从而制备具有更小尺寸的均匀纳米脂质体组合物。
此后,回收通过离心沉淀的纳米脂质体组合物(脂质的总量:19.82 mg,Cas9和gRNA的总量:0.034mg)并与2.5mg的磺基-SMCC (ProteoChem)(充当用于抗体结合的接头)在室温(即25℃)下在PBS 中混合2小时。
接下来,提供经纯化的抗体以与纳米脂质体结合,并且用于与纳米脂质体结合的抗体是能够识别已知在结直肠癌细胞中过表达的EGFR(表皮生长因子受体)、EpCAM(上皮细胞黏附分子)、CEA(癌胚抗原)和膜联蛋白(Belov L等,2010)的单克隆或多克隆抗体。具体地,选择EGFR 抗体(抗-EGFR)(abcam,ab2430),与2-巯基乙胺(Thermo)在10mM EDTA中在37℃下混合2小时,然后用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)进行纯化(EGFR抗体和2-巯基乙胺以1mg∶0.6mg的比混合)。因此,抗体纯化描述如下(向包含相同的两个Y形链的抗体添加2-巯基乙胺以得到半抗体,然后将半抗体进行纯化并与纳米脂质体结合-Wu S等,Highlysensitive nanomechanical immunosensor using half antibody fragment,Anal.Chem.,2014,86(9),4271-4277)。*见图14。
如图所示,当制备半抗体时,产生了-SH。由于-NH2存在于纳米脂质体的DPPE脂质中,其与磺基-SMCC(接头)反应,并且因此纳米脂质体的磺基-SMCC与半抗体的-SH彼此结合。以这种方式,通过制备半抗体,纳米脂质体识别结直肠癌细胞的能力可以加倍。
将1mg如此纯化的抗体(抗EGFR)与接头结合的纳米脂质体组合物在4℃下混合12小时,然后回收离心产生的沉淀,从而获得本发明的能够选择性识别结直肠癌细胞的抗体结合的纳米脂质体,然后将其在处理缓冲液(细胞培养基或PBS[磷酸盐缓冲盐水])中混合并用于后续测试。
<对比例1.对比纳米脂质体的制备>
以与实施例2中相同的方式制备纳米脂质体,不同之处在于未添加 Cas9蛋白/指导RNA/聚乙烯亚胺复合物。
<对比例2.不含DOGS-NTA-Ni脂质和聚乙烯亚胺的纳米脂质体>
在不使用DOGS-NTA-Ni脂质的情况下制备纳米脂质体,并且如实施例2中那样进行后续程序,不同之处在于Cas9蛋白/指导RNA杂交体代替了Cas9蛋白/指导RNA/聚乙烯亚胺复合物被包封在纳米脂质体中。
<对比例3.不含聚乙烯亚胺的纳米脂质体>
以与实施例2中相同的方式制备纳米脂质体,不同之处在于Cas9蛋白/指导RNA杂交体代替了Cas9蛋白/指导RNA/聚乙烯亚胺复合物被包封在纳米脂质体中。
<对比例4.-未结合抗体的纳米脂质体>
以与实施例2中相同的方式制备纳米脂质体,不同之处在于抗体和接头不与其结合。
<测试例1.KRAS表达和活性的测量>
测试例1-1.指导RNA和Cas9蛋白的活性的测量
为了评价指导RNA的制备和Cas9蛋白的纯化(图3b),收集SW480 细胞,从中提取DNA,并使用正向引物:TGAAGTACAGTTCATTACGATACACG. 和反向引物:GGAAAGTAAAGTTCCCATATTAATGGT通过PCR方法制备模板片段(500bp)。然后,向片段引入单独的经纯化的Cas9蛋白或经纯化的Cas9蛋白和sgRNA1(SEQ.ID.NO:1,图3a)的组合。
参考图4,在使用单独的经纯化的Cas9蛋白的测试组中,由于缺乏指导RNA,片段未被Cas9蛋白切割,而在使用经纯化的Cas9蛋白和 sgRNA1(SEQ.ID.NO:1)的组合的测试组中,片段中的SEQ.ID.NO:5 序列被sgRNA 1识别,因此片段被Cas9蛋白切割。
测试例1-2.KRAS基因突变的鉴定
从结直肠癌细胞(HT29、SW480、SNU407)中提取DNA,并使用正向引物:TGAAGTACAGTTCATTACGATACACG,和反向引物: GGAAAGTAAAGTTCCCATATTAATGGT通过PCR方法制备模板片段。然后,使用T-blunt PCR cloning kit(SolGent)将模板片段插入T-blunt载体中,并通过Bionia Inc.提供的测序服务分析模板片段的序列。分析结果在图1 中示出,从其中可以证实,在KRAS基因的外显子2的密码子12的位置, HT29细胞是KRAS野生型而SW480和SNU407细胞是KRAS突变体。
测试例1-3.指导RNA的KRAS表达效率的比较
为了比较结直肠癌细胞HT29(对照;KRAS野生型细胞)和SW480 (KRAS突变体细胞)中sgRNA 1(SEQ.ID.NO:1)和sgRNA 2(SEQ.ID. NO:2)的效率,向pCas质粒(实施例1-1的pCas-Guide质粒)引入SEQ. ID.NO:3和SEQ.ID.NO:4,并且用其处理细胞。
收集经处理的细胞,使用TRIzol(Invitrogen)从其中提取总RNA,并使用SuprimeScript RT premix 2x(GeNetBio)合成cDNA。
使用SYBR green 2x Premix(Applied Biosystems)和AB Step One Plus real-time PCR system(Applied Biosystems)进行用于测量KRAS的mRNA 表达的实时PCR。因此,用于检测的引物的碱基序列如下。
KRAS有义:GACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGA
KRAS反义:TCCTCTTGACCTGCTGTGTCG
GAPDH有义:GCACCGTCAAGGCTGAGAA
GAPDH反义:AGGGATCTCGCTCCTGGAA
以上结果在图2中示出。基于HT29细胞和SW480细胞中sgRNA 1 和sgRNA 2的效率的比较结果,sgRNA 1(SEQ.ID.NO:1)最有效地降低KRAS mRNA表达,因此在所有后续测试中使用包含SEQ.ID.NO:1的指导RNA的那些。
同时,由SEQ.ID.NO:1或2的指导RNA识别的人基因组DNA的位置在图7a中示出,并且其示意图基于包含SEQ.ID.NO:1的纳米脂质体在图7b中示出。参考其可以证实20个碱基的序列通过本发明的纳米脂质体被指导RNA识别,并且PAM(protospacer adjacent motif,前间区序列邻近基序)(TGG序列等)位点被Cas9切割,由此证实了在经切割DNA 的自修复期间20DNA序列的切割(从用通过实施例1-2方法的纳米脂质体处理的细胞中直接提取基因组DNA,并且通过Bionia Inc.提供的测序服务鉴定图7b中所示的切割序列的位置)。
测试例1-4.纳米脂质体向结直肠癌细胞中的引入的评价
为了评价实施例2的纳米脂质体是否被引入到结直肠癌细胞中,将结直肠癌细胞(SW480细胞)用浓度为Cas9∶gRNA(24.7μg∶9.3μg-在全部的培养液中24.7μg Cas9和9.3μggRNA)的实施例2的纳米脂质体处理 24小时并用Cas9的抗体进行免疫染色。其共聚焦激光扫描显微术图像在图6中示出。此外,将结直肠癌细胞用能够阻断引入过程的药物进行处理,并作为对比组进行鉴定。对于免疫染色,使用CFL-488的Cas9一抗(兔) 标记细胞内Cas9蛋白,并通过共聚焦激光扫描显微术成像。基于包含SEQ. ID.NO:1的指导RNA的结果在图6中示出。在图6中,DIC示出了细胞的电子图像,DAPI示出了DNA染色的图像,Cas9示出了Cas9蛋白的 CFL-488染色的图像,并且合并示出了其组合的图像。因此,将细胞用作为阻断单独摄取途径之药物的染料木黄酮(genistein)(400μM)、氯丙嗪 (20μg/ml)、诺考达唑(100μM)和松胞菌素B(10μM)处理,在37℃下培养30分钟,并用实施例2的纳米脂质体处理,从而分析细胞内摄取过程。
参考图6,在对照中,由于用实施例2的纳米脂质体处理,看到RITC 和Cas9蛋白被有效地注射到结直肠癌细胞的细胞核中,并且在用诸如染料木黄酮、氯丙嗪、诺考达唑等药物处理的组中,药物的细胞内摄取在4℃下被抑制(在该温度下细胞不能使用能量),从其中可以证实本发明的纳米脂质体负责网格蛋白介导的胞吞作用、大型胞饮作用和能量依赖性胞吞作用。
外来物质进入细胞的摄取途径主要分为五种类型,即吞噬作用,通过其,膜的一部分从细胞表面突出并因此吞噬颗粒;大型胞饮作用,通过其,肌动蛋白丝由于膜皱褶而主动聚合从而吞噬颗粒;使用称为细胞质网格蛋白的蛋白质的网格蛋白介导的胞吞作用;使用高浓度的称为陷窝蛋白的膜蛋白和胆固醇的陷窝蛋白依赖性胞吞作用;以及不使用例如网格蛋白和陷窝蛋白的蛋白质之不依赖于网格蛋白和陷窝蛋白的胞吞作用。存在阻断单个摄取途径的药物,例如,染料木黄酮干扰陷窝蛋白依赖性胞吞作用,氯丙嗪干扰网格蛋白介导的胞吞作用,诺考达唑抑制大型胞饮作用,以及松胞菌素B抑制吞噬作用。同时,由于细胞在4℃下不能使用能量,因此可以抑制能量依赖性胞吞作用(Dos Santos T等,2011)。
测试例1-5.KRAS表达的测定-mRNA表达水平的测量
将结直肠癌细胞(HT29、SW480、SNU407)用浓度为Cas9∶gRNA(24.7 μg∶9.3μg)的本发明纳米脂质体处理24小时,然后使用TRIzol(Invitrogen) 从收集的细胞中提取总RNA,并使用SuprimeScript RT premix 2x (GeNetBio)合成cDNA。
使用SYBR green 2x Premix(Applied Biosystems)和AB Step One Plus real-time PCR system(Applied Biosystems)进行用于测量KRAS的mRNA 表达的实时PCR。用于检测的引物的碱基序列如下。
KRAS有义:GACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGA
KRA S反义:TCCTCTTGACCTGCTGTGTCG
GAPDH有义:GCACCGTCAAGGCTGAGAA
GAPDH反义:AGGGATCTCGCTCCTGGAA
以上结果在图7c中示出,从其中可以证实由于用实施例2的纳米脂质体进行处理,在所有结直肠癌细胞中KRAS蛋白质表达显著地降低。
此外,下面给出了实施例2的纳米脂质体和对比例的纳米脂质体的 mRNA表达水平。
[表3]
测试例1-6.KRAS相关细胞信号传导物质的蛋白质表达水平的测量
制备其中在与mRNA表达测试相同的条件下用纳米脂质体处理结直肠癌细胞(SW480)的测试组,其中用纳米脂质体处理24小时、更换培养基并用西妥昔单抗(10μg/mL)再处理24小时的测试组以及其中用西妥昔单抗(10μg/mL)单一处理24小时的测试组,然后收集细胞,并使用RIPA缓冲液(Sigma)从中提取蛋白质,然后鉴定蛋白质表达。
取决于结直肠癌细胞中西妥昔单抗相关的细胞信号传导(图7e和7f),用抗Ras(兔)、抗p-Akt(兔)、抗-p-Erk 1/2(兔)和抗-GAPDH(小鼠) 分析Ras、磷酸化Erk 1/2和磷酸化Akt的信号传导关系。因此,使用识别 Ras家族全部蛋白质(KRAS、NRAS、HRAS)的抗体来代替仅识别KRAS 的抗体。由于本发明的纳米脂质体仅对KRAS蛋白的表达有影响,因此在用本发明的纳米脂质体处理之后Ras全部蛋白质中降低的蛋白质的量与降低的KRAS的量一致。
参考图7d,仅用添加西妥昔单抗的实施例2的纳米脂质体处理的结直肠癌细胞中Erk 1/2和Akt蛋白的磷酸化程度显著降低,因此可以证实本发明的纳米脂质体控制对西妥昔单抗具有抗药性的结直肠癌中的KRAS 表达。
通过KRAS、Erk 1/2和Akt在西妥昔单抗处理的结直肠癌细胞中发生的过程在图7e和7f的a至e中示出。
如图7e的a中所示,受体(例如EGFR)存在于野生型结直肠癌细胞 (KRAS野生型)的细胞膜中,通过EGFR配体以二聚体的形式提供,并且通过自磷酸化向亚蛋白(P13K、KRAS)发出信号。在信号之中,PI3K 蛋白使Akt蛋白磷酸化从而影响细胞存活,并且KRAS蛋白使Erk蛋白磷酸化从而影响癌细胞的增殖。
在图7e的b中,开发以抑制结直肠癌细胞增殖的药物是西妥昔单抗,其用作抗体治疗剂,如图7e的a中所示,其中西妥昔单抗与EGFR结合从而阻止EGFR的二聚体形成,由此P13K或KRAS(其是接收EGFR信号的亚蛋白)不起作用,并且因此抑制细胞存活和增殖。
在图7e的c中,尽管用西妥昔单抗处理但结直肠癌细胞仍未死亡的原因在于KRAS基因突变,即使由于西妥昔单抗而没有接收到EGFR的信号,但KRAS蛋白因此继续活化,从而使Erk蛋白磷酸化因此影响细胞增殖。
在图7f的d中,将包含Cas9蛋白和能够编辑KRAS基因的指导RNA 的实施例2的纳米脂质体递送至细胞从而抑制结直肠癌细胞中的KRAS 蛋白。
在图7f的e中,当用西妥昔单抗处理通过纳米脂质体基因编辑的结直肠癌细胞时,如图7e的b中所示的两种细胞信号传导过程被阻断,因此,西妥昔单抗的作用在具有KRAS突变的结直肠癌患者中仍可以表现出来。
<测试例2.细胞生存力和增量速率的测量>
通过WST-1测定(EZ-cytox Cell Viability Assay Kit)来确定细胞生存力。将结直肠癌细胞(HT29、SW480、SNU407)以1×104/孔的密度在96 孔板中培养24小时,然后用浓度为Cas9∶gRNA(24.7μg∶9.3μg)的实施例2的纳米脂质体处理24小时,然后将培养基替换为包含各个不同浓度 (0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL)西妥昔单抗的培养基。24 小时之后,向其添加WST-1试剂。WST-1试剂以培养液的10%的量添加,并在1小时之后,在460nm下测量吸光度,由此将细胞存活和增殖与对照(未处理组)进行比较。在用纳米脂质体处理之后,以24小时的间隔评价细胞存活72小时。
此处,图8a示出了用单独西妥昔单抗处理的细胞测试组的结果,图 8b示出了用本发明实施例2的纳米脂质体处理然后用西妥昔单抗处理的细胞测试组的结果,其中可以看到用实施例2的纳米脂质体处理的具有 KRAS突变体基因的SW480和SNU407细胞的存活和增殖显著降低。这些结果意味着本发明实施例2的纳米脂质体能够在KRAS突变体细胞中有效地诱导西妥昔单抗的结直肠癌细胞凋亡作用。
同时,图8a和8b的图中各自的浓度表示西妥昔单抗的处理浓度。
<测试例4.凋亡蛋白的鉴定>
将SW480细胞用浓度为Cas9∶gRNA(24.7μg∶9.3μg)的对比例1的纳米脂质体和实施例2的纳米脂质体处理24小时,然后将培养基替换为包含10μg/mL西妥昔单抗的培养基,并使用Human Apoptosis Assay Kit (R&D Systems Inc,ARY009)评价凋亡相关蛋白质的表达程度。将对比例1的纳米脂质体用作对照的原因是在单独纳米脂质体的存在下不发生细胞凋亡。
以上结果在图9中示出,其中在用实施例2的纳米脂质体处理的测试组中,凋亡相关蛋白质的浓度增加。切割的胱天蛋白酶-3蛋白是在细胞凋亡期间获得的最终蛋白质,为前-胱天蛋白酶-3切割形式,并且在细胞凋亡期间起重要作用。切割的胱天蛋白酶-3蛋白的浓度增加意味着进行了凋亡过程。此外,Fas/TNFRSF6/CD95蛋白表明已经响应外部信号而进行凋亡,并且SMAC/Diablo和HTRA2/Omi蛋白的功能是抑制抗凋亡蛋白,并且这些蛋白的浓度增加意味着细胞凋亡已经进行。因此,当用本发明的纳米脂质体和西妥昔单抗处理细胞时,可以发现对西妥昔单抗具有抗药性的结直肠癌细胞的有效凋亡。
<测试例5.胱天蛋白酶-3活性的测量>
使用caspase-3 assay kit(Cell Signaling)测量胱天蛋白酶-3活性。将结直肠癌细胞(HT29、SW480、SNU407)用浓度为Cas9∶gRNA(24.7μg∶9.3 μg)的实施例2的纳米脂质体处理24小时,然后将培养基替换为包含西妥昔单抗(10μg)的培养基,然后进行细胞处理24小时。此后,从每种类型的细胞中提取蛋白质,并将提取的蛋白质与200μL的1×测定缓冲液 A和底物溶液B混合,并在37℃下反应30分钟。在反应之后,在380nm 的激发波长和440nm的发射波长下测量荧光值,从而确定活性。
以上结果在图10中示出,从其中可以证实在所有具有KRAS野生型基因的HT29细胞和具有KRAS突变体基因的SW480和SNU407细胞中,用纳米脂质体和西妥昔单抗二者处理之后胱天蛋白酶-3活性增加。
<测试例6.纳米脂质体的包封效率的评价>
通过western印迹测定来测量在纳米脂质体合成开始时添加的Cas9 蛋白的总量和在纳米脂质体合成之后保留在滤液中的Cas9蛋白的量,从而确定纳米脂质体的包封效率。此处,当制备纳米脂质体然后使用离心机以13000rpm离心时,纳米脂质体沉淀并且未包封在纳米脂质体中的Cas9 蛋白留在滤液中,因此只有未包含在纳米脂质体中但保留在滤液中的Cas9 蛋白进行western印迹测定。当与制备纳米脂质体之后保留在滤液中的 Cas9蛋白的量相比较时,可以容易地确定纳米脂质体的包封效率。
基于包含SEQ.ID.NO:1的指导RNA的包封效率的结果在下表4和图11中示出。
[表4]
类别 | 包封效率(%) |
实施例2 | 82.3 |
对比例1 | - |
对比例2 | 57.4 |
对比例3 | 29.9 |
对比例4 | 79.4 |
表4示出了图11的结果的数值,其中在实施例2和对比例4(抗体/ 接头未结合)的纳米脂质体中包含指导RNA的杂交体或复合物的包封效率非常高(由于在制备对比例1的纳米脂质体时未添加Cas9蛋白,因此滤液中不存在Cas9蛋白——用作对照)
<测试例7.纳米脂质体的表面电荷、尺寸和分散性的评价>
通过动态光散射(dynamic light scattering,DLS)测量在本发明中制备的纳米脂质体的表面电荷(ζ电位,mV)、尺寸和分散性。基于包含SEQ. ID.NO:1的指导RNA的结果在下表5中示出。
[表5]
为了将包含指导RNA的纳米脂质体递送到细胞中,优选地将具有负电荷(-)的表面电荷值尽可能减少。如从表4中明显的,实施例2的纳米脂质体具有低的表面电荷值。对比例2的纳米脂质体也具有低的表面电荷,但由于分散性随着时间降低(分散性未在上表中示出),纳米脂质体的稳定性变差。此外,关于纳米脂质体的颗粒尺寸,与实施例2和对比例4的纳米脂质体相比,对比例2和3的纳米脂质体显示出不均匀的尺寸分布。
<110> Moogene Medi Co., Ltd.
<120> 包含包载有CAS9蛋白、抑制KRAS基因之基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物的纳米脂质体的递送载体组合物,或者用于治疗对抗癌药物具有抗性的KRAS突变结肠癌的包含所述组合物的治疗剂
<130> P2016-0298
<160> 8
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
cugaauuagc uguaucguca 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 智人
<400> 2
gaauauaaac uugugguagu 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
ctgaattagc tgtatcgtca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
gaatataaac ttgtggtagt 20
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 5
tgacgataca gctaattcag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 智人
<400> 6
cttatatttg aacaccatca 20
<210> 7
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人的gRNA
<400> 7
cugaauuagc uguaucguca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104
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<211> 104
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<213> 人工序列
<220>
<223> 智人的gRNA
<400> 8
gaauauaaac uugugguagu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104
Claims (8)
1.纳米脂质体载体组合物,其中CAS9蛋白、抑制KRAS基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物包封在纳米脂质体中。
2.权利要求1所述的纳米脂质体载体组合物,其中所述抑制KRAS基因表达的指导RNA包含SEQ.ID.NO:1或2的碱基序列。
3.权利要求1所述的纳米脂质体载体组合物,其中所述纳米脂质体包含卵磷脂、胆固醇、阳离子磷脂和金属螯合脂质。
4.权利要求1所述的纳米脂质体载体组合物,所述纳米脂质体被配置成与单克隆或多克隆抗体结合,所述单克隆或多克隆抗体能够识别选自以下的在结直肠癌细胞中表达的至少一种蛋白质:EGFR(表皮生长因子受体)、EpCAM(上皮细胞黏附分子)、CEA(癌胚抗原)和膜联蛋白。
5.权利要求1所述的纳米脂质体载体组合物,其中所述纳米脂质体的颗粒尺寸为10至2,000nm。
6.用于改善或治疗结直肠癌的组合物,其包含权利要求1至5中任一项所述的纳米脂质体载体组合物。
7.权利要求6所述的组合物,其中所述纳米脂质体载体组合物添加有西妥昔单抗。
8.制备能够选择性识别结直肠癌细胞的纳米脂质体载体组合物的方法,所述方法包括:
S1)制备Cas9蛋白、抑制KRAS基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物,并通过将卵磷脂、金属螯合脂质、胆固醇和阳离子磷脂在氯仿中混合来制备脂质膜组合物;
S2)向所述脂质膜组合物添加所述Cas9蛋白、抑制KRAS基因表达的指导RNA和阳离子聚合物的复合物并进行超声;
S3)对经超声的脂质膜组合物进行冷冻-解冻然后进行超声;
S4)对在S3中进行超声的脂质膜组合物进行离心并回收沉淀的纳米脂质体;以及
S5)使用交联剂使抗体与在S4中获得的所述沉淀的纳米脂质体结合。
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