KR102206676B1 - 비바이러스성 유전자편집 crispr 나노복합체 및 이의 제조방법 - Google Patents

비바이러스성 유전자편집 crispr 나노복합체 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비바이러스성 유전자편집 CRISPR 나노복합체, 그의 제조방법 등에 관한 것이다. 본 발명에 의한 비바이러스성 유전자편집 CRISPR 나노복합체는 수 나노미터~수 마이크론 단위의 크기이고, 외부의 물리적인 자극 없이 세포내 전달이 가능하고, 세포의 표적유전자에 대해 비바이러스성 경로에 의한 유전자편집에 유용하게 활용할 수 있다. 결과적으로 상기 CRISPR 나노복합체를 동물모델 제작, 미생물공학, 질병 치료를 위한 세포공학 또는 생체 투여 제형에 이용할 경우, 높은 세포내 전달 및 유전자편집 효율을 보이고, 비특이적 편집, 유전자변이, 세포 및 생체독성 유발 등의 문제를 최소화할 수 있다.

Description

비바이러스성 유전자편집 CRISPR 나노복합체 및 이의 제조방법{Nonviral genome editing CRISPR nanocomplex and fabrication method thereof}
본 발명은 비바이러스성 유전자편집 CRISPR 나노복합체, 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CRISPR 유전자편집 시스템의 효소 단백질에 캐리어물질을 화학적으로 컨쥬게이션하고 sgRNA와 형성한 나노복합체, 그의 제조방법 및 상기 나노복합체를 세포내에 전달하여 비바이러스성 유전자편집 시스템으로 사용하는 방법에 관한 것이다.
과거 수십년 동안 항생물질의 남용은 매우 증가되어왔으며, 그 결과 다제내성 박테리아의 출현 및 전파가 증가되었다. 많은 경우에 이 박테리아들은 심각한 병원성을 획득하고 사람들을 감염시키며, 다른 개체, 공동체, 보건기관, 및 병원으로 전파될 수 있다. 이들 병원체들의 대다수는 인간의 공생 박테리아(commensal bacteria)에서 발생하며, 면역이 억제되거나 특정한 의학적 조건에 처한 개체에 기회감염을 일으킨다. 항생제 치료가 지속될 경우 항생제 저항성을 지닌 변이 박테리아들의 클론들이 자연선택되고, 이러한 항생제 저항성은 약제의 효소적 분해 또는 약효의 억제에 수반되는 유전자의 내재적 발현 또는 수평적 전파에 의하여 획득된다.
전 세계적으로 가장 높은 출현율을 보이는 다제내성 박테리아의 종류로는 MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus), CRE(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae), MRAB(multidrug-resistant Acinetobacter baumannii), MRPA(multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa), VRE(vancomycin-resistant Enterococci) 등이 있으며 가장 최근에는 VRSA(vancomycin-resistant Staphlyococcus aureus)가 출현하기도 하였다.
다제내성 박테리아의 전파는 세균 감염증의 치료에 있어서 치료제 선택에 제한을 가져오며, 더 강력한 약제의 사용 및 개발을 필요로 한다. 그러나, 훨씬 더 강력한 약제를 사용하더라도 더 병원성이 강하고 더 저항성이 강한 균주만이 생겨날 뿐이며, 환자 치료시 더 높은 독성을 야기할 수 있다.
또 다른 문제는 현재 세균감염증 치료에 사용되는 대부분의 약제들은 광범위한 스펙트럼을 가진 저분자 항생제라는 점이다. 따라서, 특정한 병원체를 특이적으로 타겟팅할 수 있는 약제의 사용은 박테리아의 성장에 있어서 선택적 압력(selective pressure)을 최소화 하는데 훌륭한 이점을 제공한다. 불행히도, 좁은 스펙트럼을 가진 약제 또는 항체 치료제들은 시장성의 문제와 특이적 바이오마커의 부재 및 저항성의 획득과 같은 기술적인 문제들로 인하여 개발에 난항을 겪고 있다.
유전자 치료제는 타겟에 높은 특이성을 가진 약제를 설계함에 있어 간편하면서도 다양한 용도로 사용될 수 있기 때문에, 종래의 저분자 약제 또는 항체 치료제보다 혁신적인 접근방법으로 소개되어 왔다. 플라스미드 DNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 또는 바이러스 기반 벡터와 같은 형태의 유전적 약제들은 질병의 타겟의 발현을 유도하거나 또는 억제하기 위하여 투여될 수 있다. 바이러스 벡터들은 높은 트랜스펙션 효율로 인하여 유용하지만, 또한 세포성 면역반응의 유도나 항체 중화와 같은 문제들로 인한 임상적 한계를 나타내기도 한다.
포유류 세포를 타겟으로 하는 경우, 특정 유전자의 발현을 억제(silence)시키기 위한 siRNA의 사용은 치료제로 유망한 것으로 보이며, 현재 다양한 종류의 암, 녹내장, 혈우병, 및 가족성 아밀로이드성 질환 등의 치료를 위한 임상시험이 진행중이다. 그러나, 이러한 유전자 치료제를 직접 투여하는 경우에는, 체액 내에서의 즉각적인 효소적 분해 또는 표적 부위로의 낮은 전달 효율로 인해 효능이 떨어지게 된다. 따라서, 양이온성 고분자, 지질-기반 물질, 무기나노입자, 세포 투과성 펩타이드, 및 덴드리머와 같은 캐리어 물질들은 생물학적 활성이 있는 분자를 집약시키고, 타겟으로 전달하는데 사용되곤 하였다. 그러나, 박테리아 세포에서는, 낮은 효능 뿐만 아니라 세포벽을 통과하는 전달효율이 무척 떨어지기 때문에 비바이러스성 유전자 전달 전략을 사용하고자 하는 시도가 심각하게 제한된다.
최근 새롭게 진보된 유전자 편집 기술은 모델 유기체의 유전자 조작뿐만 아니라 유전자 치료제의 개발에 새로운 시대를 열었다. 현재 유전자 편집 기술은 특정 유전자를 인식하거나 변이시키는 방식에 따라 ZFN(zinc finger nuclease), TALEN(transcription activator-like effector nuclease), CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat) 등이 있다[Gaj, T., et al. Trends Biotechnol. 31, 397 (2011)]. 이 중 미생물의 획득 면역 체계로 알려진 CRISPR 시스템은 계통학적으로 1형, 2형, 3형으로 나누어지며, 이 중 2형인 화농성연쇄상구균(Streptococcus pyogens) 유래의 Cas9 단백질(SpCas9)은 유전자 편집에 있어 상보적인 결합을 통해 특정 유전자를 표적으로 하는 단일 가이드 RNA (sgRNA: single guide RNA)의 도움으로 DNA에서 이중 가닥 절단을 일으키는 작용을 한다[Zhang, F., et al. Science 339, 819 (2013)]. 특히, sgRNA의 표적 특이적 crRNA는 5’-NGG-3’의 서열을 지니는 PAM (protospacer-adjacent-motif) 염기서열을 인식하여 높은 표적 효율을 선보이며, 그 길이가 20 뉴클레오티드 정도로 초창기 유전자 가위인 ZFN (zinc finger nuclease) 또는 TALEN (transcription activator-like effector nuclease)에 비하여 매우 짧고, 다른 통상적인 유전자 편집법에 비해 단순화된 설계 및 제작으로 큰 이점을 제공한다. 이렇게 CRISPR 시스템은 표적 유전자 내의 특이적 절단을 유도함으로써 동물모델 제작에 널리 활용되고 있을 뿐만 아니라, 표적유전자를 억제 또는 편집하는 기능을 이용하여 치료제로 적용하고자 하는 연구가 지속적으로 시도되고 있다. 하지만 현재까지 CRISPR는 높은 형질 발현 효율을 지니는 바이러스성 편집이 가장 많이 이용되고 있으며, 벡터의 독성, 세포성 면역 반응 유도 및 항체 중화 반응 등의 문제로 인해 임상적 적용에 있어 한계를 가진다[Bouard, D., et al. Br. J. Pharmacol. 157, 153 (2009)].
CRISPR 제한효소 단백질 및 sgRNA의 비바이러스성 세포내 전달은 바이러스성 벡터를 이용하는 경우에 비해 그 효율이 낮다고 보고되고 있으며, 이를 극복하는 것이 큰 관건이다. 특히, 일반적으로 단백질 기반의 전달은 생체 내 즉각적인 효소에 의한 분해 또는 표적 부위에 대한 낮은 전달 효율로 인해 효능이 떨어지게 된다.
따라서 CRISPR를 이용한 치료에 있어 안전성과 간단한 합성 단계 및 높은 전달 효율 등을 장점으로 갖는 비바이러스성 유전자 편집의 필요성이 대두되고 있으며, 치료제로의 도입을 위해, 유전자/약물 전달용 재료로 양이온성 고분자, 지질 기반 물질(lipofectamine 등 lipid 계열 소재 캐리어), 무기 나노입자, 세포 침투성 펩티드 및 덴드리머(dendrimer)와 같은 운반체 물질이 보고되었다. 그러나 이들 재료는 양이온성 혹은 지용성을 지녀 생체 활성 분자를 응집시킬 수 있다는 한계가 있어, 비바이러스성 CRISPR 시스템의 전달을 위하여 Cas 단백질과 sgRNA의 표적으로의 전달 및 작동 효율을 증진시키고자 하는 노력들이 많이 보고되었다 [Zuris, J.A., et al. Nat. Biotech. 33, 73 (2015); Wang, M., et al. Proc . Natl . Acad. Sci . USA. 113, 2868 (2016); Sun, W., et al. Angew . Chem ., Int . Ed. 54, 12029 (2015)]. 상기 지질 계열 소재를 이용하여 Cas 단백질 및 sgRNA를 물리적, 비공유결합으로 봉입시킬 경우, 낮은 봉입 효율로 인해 실질적인 적용이 제한되고 이로 인한 높은 투여량으로 독성 문제가 야기된다[Bozzuto, G., et al. Int . J. Nanomed . 10, 975 (2015); Lin, G., et al. Mol . Pharmaceutics. 12, 314 (2015). Taranejoo, S., et al. J. Appl. Polym. Sci. 132, 42096 (2015)].
따라서, CRISPR의 독성이 없으면서도 효율적인 세포내 전달이 가능한 새로운 전달방법의 개발이 절실히 필요한 실정이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 기존의 바이러스성 유전자 편집방법이나 지질 기반 물질 제형의 유전자 편집 방법의 낮은 전달 효과, 독성문제를 극복한 새로운 형태의 비바이러스성 유전자 편집방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, CRISPR 효소 단백질을 고분자 캐리어 물질로 접합하고, 이를 sgRNA와 혼합하여 CRISPR 나노복합체를 제조하는 경우, 유전자 편집 효소의 전달효율 및 유전자 편집 효과가 우수하고 생체독성 등의 문제가 해결될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 효소 단백질을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질 및 sgRNA(single guide RNA)를 포함하는 CRISPR 나노복합체를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질 및 sgRNA를 혼합하는 단계를 포함하는 CRISPR 나노복합체의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질, 또는 상기 CRISPR 나노복합체를 포함하는 유전자 편집용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 효소 단백질을 제공한다.
CRISPR는 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats의 약자로, 박테리아의 면역체계에서 유래한 3세대 유전자 가위를 말한다. 박테리아는 바이러스에 감염됐을 때 대부분 죽지만 일부는 살아남으면서 그 바이러스 DNA의 일부를 자신의 유전체에 저장해 놓는다. 그 후 재감염이 일어나면 저장해 놓은 정보를 바탕으로 작은 가이드 RNA(sgRNA: small guide RNA)를 만들어낸 후 Cas9이라는 엔도뉴클레아제와 함께 결합하여 외부 DNA를 자른다. 이때 가이드 RNA는 원하는 표적유전자에 상보적 염기쌍을 이루어 결합하여 특이성을 결정하고 Cas9 단백질은 표적유전자를 자르는 핵산가수분해효소로서의 역할을 수행한다. 따라서 상기 가이드 RNA 염기서열에 따라 어떠한 DNA 염기서열도 자를 수 있기 때문에 최근 CRISPR-Cas9 유전자 가위를 이용한 활발한 연구가 진행되고 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CRISPR 효소 단백질은 CRISPR 유전자편집 과정에 의해 유전체상의 표적 부위를 절단 또는 편집할 수 있는 효소 단백질로, Cas1, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas9, Cse1, Cse2, Cse3, Cse4, Cas5d, Cas5e, Csy1, Csy2, Csy3, Csy4, Cpf1, Csn1, Csn2, Csd1, Csd2, Cst1, Cst2, Cas5t, Csh1, Csh2, Cas5h, Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, Cas5a, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Cmr1, Cmr2, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, dCas9 (dead Cas9), Cas9 nickase, C2c2 (Cas13a), CDA(cytidine deaminase enzyme), APOBEC(apolipoprotein B editing complex)14, UGI(uracil glycosylase inhibitor), 및 AID(activation-induced deaminase)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질, 또는 이들의 재조합 단백질 중에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 고분자 캐리어 물질로는 가지형 폴리에틸렌이민, 선형 폴리에틸렌이민, 폴리프로필렌이민, 폴리아미도아민, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 공중합체, 폴리-락트산, 폴리-글리콜산, 폴리-D,L-락트산-co-글리콜산, 폴리카프로락톤, 폴리포스포에스터, 폴리포스파진, 폴리베타아미노에스터, 가지형 폴리아미노에스터, 폴리아미노부틸-글리콜산, 폴리오르소에스터, 폴리하이드록시프롤린에스터, 폴리아크릴아마이드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, poly(2-(dimethylamino)ethylmethacrylate) (PDMAEMA), 덴드리머, 히알루론산, 알긴산, 키토산, 덱스트란, 사이클로덱스트린, 스퍼민, 폴리-Arginine, 및 폴리-Lysine, 이들의 공중합체 또는 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 고분자 캐리어 물질로 가지형 폴리에틸렌이민을 사용하였다.
상기 고분자 캐리어 물질은 CRISPR 효소 단백질과 접합(conjugation)되어 박테리아를 비롯한 원핵세포 및 진핵세포에 대하여 CRISPR 효소 단백질의 표적 세포내 전달 효율을 증진시킨다.
기존에 CRISPR 효소 단백질의 세포내 전달을 위해 사용되는 방법으로는 바이러스성 벡터를 이용한 방법과 리포펙타민 등 비바이러스성 캐리어(carrier, 전달체) 물질을 이용하는 방법이 있으나, 바이러스성 벡터의 경우에는 비특이적 반응이 많이 일어나고, 리포펙타민 등 지질기반의 비바이러스성 캐리어 물질을 이용하는 경우에는 진핵세포에서는 전달 효율이 좋으나, 박테리아 등 원핵생물에 대해서는 전달효율이 매우 불량하여 사용이 곤란하다는 문제가 있었다.
본 발명의 상기 캐리어 물질로 접합된 CRISPR 효소 단백질은 수용액상에서 DNA 절단 또는 편집 작용 기능을 가진다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 고분자 캐리어 물질과 CRISPR 효소 단백질은 SMCC(succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), sulfo-SMCC(sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), AMAS(N-α-maleimidoacet-oxysuccinimide ester), BMPS(N-β-maleimidopropyl-oxysuccinimide ester), GMBS(N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester), MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), EMCS(N-ε-malemidocaproyl-oxysuccinimide ester), SM(PEG) (PEGylated SMCC), SPDP(succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), PEG-SPDP(PEGylated SPDP), DSG(disuccinimidyl glutarate), DCC(Dicyclohexylcarbodiimide), DSS(disuccinimidyl suberate), BS3(Bissulfosuccinimidyl suberate), DSP(dithiobis(succinimidyl propionate)), EGS(ethylene glycol bis(succinimidyl succinate)), DMP(dimethyl pimelimidate), BMOE(bismaleimidoethane), BMB(1,4-bismaleimidobutane), DTME(dithiobismaleimidoethane), EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride), NHS(N-Hydroxysuccinimide), 프로파길-숙신이미딜-에스테르(propargyl-succinimidyl-ester), DBCO-말레이미드(Dibenzocyclooctyne-maleimide), DBCO-PEG-말레이미드(Dibenzocyclooctyne-PEG4-maleimide), DBCO-S-S-NHS 에스테르(Dibenzocyclooctyne-S-S-N-hydroxysuccinimidyl ester), DBCO-NHS 에스테르(dibenzocyclooctyne-N-hydroxysuccinimidyl ester), 아세틸렌-PEG-NHS 에스테르(acetylene-PEG-NHS ester), 및 알킬렌-PEG-말레이미드(alkyne-PEG-maleimide)로 이루어진 군으로부터 선택된 가교제로 접합(conjugation)될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 나열된 가교제들은 화학적 가교제들로, 가교제의 반응기와 접합시키고자 하는 단백질의 활성기간의 결합반응을 유도하여 상기 고분자 캐리어 물질과 본 발명의 CRISPR 효소 단백질을 접합할 수 있다.
상기한 화학적 가교제들의 반응기와 타겟 활성기를 예를 들어 설명하면, 하기 표 1과 같으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
가교제 반응기 타겟 활성기 가교제 반응기 타겟 활성기
아릴아자이드 -NH2 (일차아민 또는 비특이적) 말레이미드 설프하이드릴
카보이미드 아민/카복실 NHS-에스테르 아민
하드라자이드 카보하이드레이트(산화) PFP-에스테르 아민
히드록시메틸포스핀 아민 솔라렌 티민
이미도에스테르 아민 피리딜 다이설파이드 설프하이드릴
아이소시아네이트 히드록시기(비수용성) 비닐 설폰 설프하이드릴, 아민, 히드록시기
카보닐 하이드라진
본 발명의 일 실시예에서는 화학적 가교제로 sulfo-SMCC를 사용하였으며, 가지형 폴리에틸렌이민(bPEI)에 sulfo-SMCC를 첨가하여 가지형 폴리에틸렌이민의 아민기를 말레이미드기로 치환하여 활성화하였으며, 이어서 활성화된 폴리에틸렌이민의 1차 아민기과 SpCas9 단백질의 시스테인 잔기상의 자유 설프 하이드릴기를 반응시킴으로써 bPEI와 접합된 SpCas9(SpCas9-bPEI)를 제작하였으며, 상기 고분자 캐리어 물질과 CRISPR 효소 단백질(예컨대 SpCas9-bPEI)의 접합 반응은 하기 실시예에서 성공적으로 이루어진 것으로 입증되었다.
본 발명에서 상기 폴리에틸렌이민은 유전자 전달(예 : siRNA, 플라스미드 DNA)에 가장 널리 사용되는 캐리어 물질 중 하나이며 다양한 분자량의 가지형 또는 선형으로 사용할 수 있기 때문에 카고(cargo)의 개조를 위해 선택되었다. 또한, 가지형은 선형 아민류에 비해 특히 일차 아민을 포함하는 아민기가 풍부하여 패키징 및 전달이 효율적으로 이루어질 수 있기 때문에 선택되었다. 물리적인 캡슐화 대신, 단백질의 직접 공유 결합 변형을 선택하여 투여를 위한 캐리어 물질의 양을 최소화하여 생체독성 및 불충분한 방출로 인한 효능 감소 문제를 해결하고자 하였다. 상기 bPEI는 Cas9 엔도뉴클레아제에 공유결합적으로 도입되어, 정전기 상호 작용에 의한 패키징을 유도함으로써 sgRNA 뿐만 아니라, 단백질 자체의 세균 내 전달을 향상시켰다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 상기 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질의 제조방법을 제공한다:
(a) 고분자 캐리어 물질의 기능기를 양기능성 가교제(bifunctional crosslinker)로 반응시켜 활성화된 고분자 캐리어 물질을 제조하는 단계; 및
(b) CRISPR 효소 단백질의 기능기를 상기 활성화된 고분자 캐리어 물질과 반응시켜 접합 물질을 제조하는 단계.
본 발명의 상기 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.
단계 (a): 고분자 캐리어 물질의 기능기를 양기능성 가교제 ( bifunctional crosslinker )로 반응시켜 활성화된 고분자 캐리어 물질을 제조하는 단계
상기한 고분자 캐리어 물질의 기능기를 양기능성 화학적 가교제로 반응시켜 활성화시킨다. 상기 고분자 캐리어 물질의 기능기를 활성화시켜야만 다른 분자와 연결이 가능해진다.
화학적 가교제란, 서로 다른 종류의 두 개 이상의 분자를 화학적으로 결합하는 시약을 말하며, 상기 양기능성이란 두 개의 같거나 서로 다른 기능기를 가진 분자간의 연결을 유도하는 성질을 의미한다.
상기 고분자 캐리어 물질의 활성화 반응은 DMSO(dimethylsulfoxide), DMF(dimethylformamide), 에탄올, 메탄올, 물, 메틸렌클로라이드, 및 클로로포름으로 이루어진 군으로부터 선택된 용매 중에서 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 당업계에서 분자간 접합 반응을 위한 활성화 반응에 사용가능한 모든 용매를 제한없이 사용할 수 있다.
상기 고분자 캐리어 물질의 활성화 반응은 4~60℃, 구체적으로는 4~50℃, 4~40℃, 4~30℃, 또는 4~25℃의 온도 조건 하에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 고분자 캐리어 물질의 활성화 반응은 0.5~24시간, 구체적으로는 0.5~12시간, 0.5~6시간, 1~24시간, 1~12시간, 1~6시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단계에서 고분자 캐리어 물질의 종류는 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질과 관련하여 상술한 것과 중복되므로 그 기재를 생략한다.
단계 (b): CRISPR 효소 단백질의 기능기를 상기 활성화된 고분자 캐리어 물질과 반응시켜 접합 물질을 제조하는 단계
상기 단계 (a)에서 활성화 된 고분자 캐리어 물질의 기능기를 CRISPR 효소 단백질의 기능기와 반응시켜 접합물질을 제조한다.
이 때 상기 (b) 단계의 고분자 캐리어 물질 및 CRISPR 효소 단백질의 몰비는 예컨대 1:10-6 내지 1:106, 1:10-5 내지 1:105, 1:10-4 내지 1:104, 1:10-3 내지 1:103, 1:10-2 내지 1:102, 1:10-1 내지 1:101 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 고분자 캐리어 물질과 CRISPR 효소 단백질 간의 접합반응은 4~60°C에서, 보다 구체적으로는 4~50℃, 4~40℃, 4~30℃, 또는 4~25℃의 온도 조건 하에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 상기 고분자 캐리어 물질과 CRISPR 효소 단백질 간의 접합반응은 0.5~48시간, 구체적으로는 0.5~36시간, 0.5~24시간, 0.5~12시간, 보다 구체적으로는 1~48시간, 1~24시간, 1~12시간, 또는 4~12시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이 때 상기 고분자 캐리어 물질과 CRISPR 효소 단백질 간의 접합반응은 pH 4~10의 수용성 용매 중에서 이루어질 수 있으며, 상기 pH 범위를 유지하는 수용성 완충액이라면 제한 없이 사용될 수 있다.
또한 상기 CRISPR 효소 단백질의 종류는 본 발명의 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질과 관련하여 상술한 것과 중복되므로 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질 및 sgRNA(single guide RNA)를 포함하는 CRISPR 나노복합체를 제공한다.
본 발명에서 상기 CRISPR 나노복합체라 함은 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질과 표적유전자에 대한 sgRNA를 혼합한 제형으로, 상술한 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질과 sgRNA의 물리적인 상호 작용으로 형성된 복합물을 의미한다.
보다 구체적으로 상기 CRISPR 나노복합체라 함은 바이러스나 DNA 벡터가 아닌, 캐리어 물질 접합 CRISPR 효소 단백질 및 sgRNA로 구성된 복합물을 의미하며 따라서 비바이러스계 나노복합체라는 점에 특징이 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CRISPR 나노복합체는 수용액 상에서 분산이 가능한 복합체로서, 입도 크기가 1 내지 10,000 nm일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 CRISPR 나노복합체는 -100 ~ +100 mV의 제타 전위를 가진다.
본 발명의 상기 sgRNA는 CRISPR 효소 단백질을 유전체상의 표적 유전자의 특이적 부위에 안내하는 리보핵산이며, PAM (protospacer-adjacent motif) 서열과 근접한 표적 부위인 프로토스페이서(protospacer)에 대한 CrRNA(CRISPR RNA) 및 TracrRNA(trans-activating RNA) 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 sgRNA의 표적 유전자로는 발명자가 원하는 표적 유전자를 어느 것이든 선택할 수 있으며, 예컨대 mecA, mecR1, aph, NDM-1, KPC, oxa, ure, lrg, cap, spl, KPC, GES, IMP, VIM, KRAS, Stk11, TP53, PTEN, BRCA1, BRCA2, Akt, Stat, Stat4, JAK3,JAK2, WT1, ERBB2, ERBB3, ERBB4, NF1, NOTCH1, NOTCH3, ATM, ATR, HIF, HIF1 α, HIF3 α, Met, Bcl2, FGFR1, FGFR2, CDKN2α, APC, RB, MEN1, PPAR α, PPAR γ, AR, TSG101, IGF, Igf1, Igf2, Bax, Bcl2, caspase, Kras, Apc, NF1, MTOR, Grm1, Grm5, Grm7, Grm8, mGlurR1, mGlurR5, mGlurR8,PLC, AMPK, MAPK, Raf, ERK, TLR4, BRAF, PI3K,F8, F8C, F9, HEMB, KIR3DL1, NKAT3, NKB1, AMB1I, KIR3DS1, IFNG, CXCLI2, IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4, CCR5, SCYA5, D17S136E, TCP228, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR4, CCR6, CCR7, CX3CR1, CD4, CFTR, HBB, HBA2, HBD, HBA1, LCRB, SCN1A, CHD8, FMR1, VEGF, EGFR, myc, Bcl-2, survivin, SOX2, Nrgl, Erb4, Cplx1, Tph1, Tph2, GSK3, GSK3α, GSK3 β, El, UBB, PICALM, PSI, SORL1, CR1, Ubal, Uba3, CHIP, UCH,Tau, LRP, CH1P28, Uchl1, Uchl3, APP, Cx3crl, ptpn22, TNF-α, NOD2, IL-1a, IL-1b,IL-6, IL-10, IL-12, IL-1a, IL-1b IL-13, IL-17a, IL-17b, IL-17c, IL-17d, IL-17f, CT1LA4, Cx3c11J, DJ-1, PINK1, Prp, DJ-1, PINK1, LRRK2, ALAS2, ASB, ANH1, ABCB7,ABC7, ASAT, CDAN1, CDA1, DBA, PKLR, PK1, RIPS19, NT5C3, UMPH1, PSN1, RHAG,RH50A, NRAMP2, SPTB, TBXA2R, P2X1P, 2RX1, HF1, CFH, HUS, MCFD2, Drd2, Drd4, ABAT, BCL7A, BCL7,TALI, TCL5, TAL2, FLT3,NBS1, NBS, ZNEN1A1, TYR, ALDH, ALDH1A1, ADH, FASN, PI, ATT, F5, MDC1C, LAMA2, LAMM,LARGE, MDC1D, FCMD, TTID, MYOT, CAPN3, CANP3, DYSF, SGCG, DMDA1, SCG3, SGCA,ADL, DAG2, DMDA2, SGCB, LGMD2B, LGMD2C, LGMD2D, LGMD2E, LGMD2F, LGMD2G, LGMD2H, LGMD2I, SGCD, SGD, CMD1L, TCAP, CMD1N, TRIM32, HT2A, FKRP, POMT1, CAV3, LGMD1C,SEPN1, SELN, RSMD1, PLEC1, PLTN, EBS1, PPP2R1A, PPP2CA, PPP1CC, PPP2R5C, GFP, RFP, YFP, tdTomato, mCherry, luciferase 등을 표적 유전자로 할 수 있으나, 이는 예시적인 것일 뿐 이에 한정되는 것이 아님은 당업자에게 자명하다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 CRISPR 나노복합체의 제조방법을 제공한다.
상기 CRISPR 나노복합체의 제조방법은 상술한 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질과 표적 유전자에 관한 sgRNA를 혼합하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 CRISPR 나노복합체의 제조시 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질과 sgRNA의 혼합 몰비는 1:10-6 내지 1:106, 구체적으로는 1:10-5 내지 1:105, 1:10-4 내지 1:104, 가장 구체적으로는 1:10-3 내지 1:103 이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 혼합 온도는 4~37°C, 구체적으로는 4~25℃, 15~37℃, 15~25℃인 것이 바람직하나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 혼합 반응 시간은 0.1~12시간, 구체적으로는 0.1~6시간, 0.1~3시간, 0.1~1시간, 가장 구체적으로는 0.1~0.5시간 동안 수행되어 나노복합체를 제조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질, 또는 상술한 CRISPR 나노복합체를 포함하는 유전자 편집용 조성물을 제공한다.
상기 유전자 편집용 조성물에 포함되는 상기 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질과 상술한 CRISPR 나노복합체는 본 발명의 다른 양태에서 설명한 발명에 해당한다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물인 경우, 약제학적으로 허용되는 담체가 포함된다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 비경구 투여가 가능하며, 예컨대 정맥 내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하투여 또는 국부투여될 수 있다. 또한, 그밖에도 경구투여, 직장투여, 흡입투여, 경비투여 등이 가능하다.
본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나, 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물은 분리된 세포, 조직, 또는 개체에 투여되는 경우, 상술한 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질, 또는 CRISPR 나노복합체를 세포 내에 전달하여 CRISPR 효소 단백질의 유전자 편집 작용에 의하여 유전자 편집을 유도한다.
이때 상기 세포 내부로 전달이 가능한 세포로는 HeLa, A549, MDAMB, SK-BR-3, OVCAR, PC3, PC12, HEK293, Jurkat, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, RAW264.7, 대식세포, 단핵구, 호중구, NK 세포(natural killer cell), 수지상세포(dendritic cell), MDSC(Myeloid-derived Suppressor Cell), 배아줄기세포, 중간엽줄기세포, 유도만능줄기세포(iPSC), 혈관내피세포, 표피세포, 간세포, 근육세포, 뼈세포, 섬유아세포, 연골세포, 신경세포, 곰팡이 세포, 및 기생충 세포 등의 진핵세포이거나, 또는 S. aureus , E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae , A. baumannii, B . subtilis , S. epidermidis , E. faecalis , S. pneumoniae 등의 원핵세포이다.
본 발명의 일 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 상기 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질과, CRISPR 나노복합체는 박테리아의 세포 내부에 유입되어 유전자 편집 효과를 나타내었고, 포유류세포에서도 높은 전달 효율을 보였다.
본 발명의 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질과, CRISPR 나노복합체는 기존의 리포펙타민 등의 지질 기반 캐리어 물질과 비교하여 세포 내 전달 효율이 우수하였으며, 이에 따라 표적유전자의 편집 효과도 우수하게 나타났다.
상술한 바와 같이, 본 발명자들은 CRISPR에 의한 유전체 편집을 박테리아 및 포유류세포를 포함하는 세포 내에 높은 효율로 전달할 수 있는 새로운 전달방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였으며, 직접 공유 결합 변형에 의한 고분자 유도체화 CRISPR Cas9 단백질 및 이를 이용한 나노크기의 복합체를 형성하였으며, 이를 다제내성 박테리아를 표적으로하는 특이적 살상용도로 사용할 수 있음을 확인하였다.
기존에 플라스미드 기반 CRISPR 게놈 편집이 탈출 돌연변이(escape mutant)를 일으킨다는 보고가 있었으나, 이들 클론의 목표 부위(target locus)에서는 유전체적 변화가 일어나지 않았으며, 전달 벡터의 돌연변이에 의해서 유전체 편집 기능에 장애가 일어나 박테리아의 치사율이 낮게 나타나는 어려움이 있었다.
본 발명은 이전에 보고된 지질 기반의 비공유적 제형과 비교하여, Cas9와 고분자의 직접적인 컨쥬게이션을 유도하여 Cas9 단백질의 각각의 단일 분자가 캐리어 물질에 결합되는 것을 허용하므로 이전의 비공유적 제형의 경우에서 발견된 로딩 효율 문제가 해결되었으며, 하나 또는 두 분자의 고분자 캐리어 물질(bPEI)만이 각 Cas9 분자에 컨쥬게이션 되었기 때문에, 최소량의 캐리어 물질(단백질의 2 중량 % 이하)만을 사용하는 것이 가능하여 독성이나 부작용을 최소화하고 더 많은 용량을 투여할 수 있다는 장점이 있으며, 기존의 플라스미드 기반 제형과 비교하여 더 높은 전달 효율 및 특이성을 가진다는 장점이 있다.
본 발명에 의한 비바이러스성 유전자편집 CRISPR 나노복합체는 수 나노미터~수 마이크론 단위의 크기이고, 외부의 물리적인 자극 없이 세포내 전달이 가능하고, 세포의 표적유전자에 대해 비바이러스성 경로에 의한 유전자편집에 유용하게 활용할 수 있다. 결과적으로 상기 CRISPR 나노복합체를 동물모델 제작, 미생물공학, 질병 치료를 위한 세포공학 또는 생체 투여 제형에 이용할 경우, 높은 세포내 전달 및 유전자편집 효율을 보이고, 비특이적 편집, 유전자변이, 세포 및 생체독성 유발 등의 문제를 최소화할 수 있다.
도 1은 클로닝된 본 발명의 Streptococcus pyogenes로부터 얻은 재조합 Cas9 엔도뉴클레아제(SpCas9)의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 도이다. 상기 서열은 N에서 C 말단까지 6x His, FLAG, NLS(nuclear localization sequence), SpCas9 및 GFPuv(green fluorescent protein)을 포함하며, 소문자로 표시된 서열은 GFP 영역을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 발현 및 정제된 SpCas9 단백질의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다. SpCas9의 크기는 약 190kDa로 나타났다.
도 3은 본 발명의 SpCas9 단백질과 융합된 GFP의 형광은 UV 일루미네이터 하에서 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 mecA 유전자를 표적으로 하는 단일 가이드 RNA(sgRNA) 서열을 나타낸 도이다.
도 5는 mecA 유전자를 표적으로 하는 sgRNA 서열을 제작하기 위한 mecA 유전자 주형의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 도이다.
도 6은 mecA 유전자 주형의 증폭을 위한 프라이머 서열을 나타낸 도이다.
도 7은 sgRNA 합성을 위한 주형의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸 도이다.
도 8은 sgRNA 주형의 합성을 위한 프라이머 서열을 나타낸 도이다.
도 9는 합성된 sgRNA 주형을 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명에서 합성한 3종의 sgRNA를 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 SpCas9과 bPEI 간의 컨쥬게이션 과정에 관한 모식도를 나타낸 도이다.
도 12는 SpCas9에 대한 bPEI의 성공적 컨쥬게이션을 확인하기 위한 겔 지연 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 SpCas9에 대한 bPEI의 성공적 컨쥬게이션을 확인하기 위한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 SpCas9-bPEI와 sgRNA 간의 복합체(Cr-나노복합체) 및 대조군인 개질되지 않은 SpCas9 단백질과 sgRNA 간의 복합체(천연 복합체) 제조에 관한 모식도를 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 Cr-나노복합체 및 천연 복합체의 입도크기를 비교하여 나타낸 도이다.
도 16은 합성된 표적 DNA를 Cr-나노복합체와 함께 첨가하여 절단을 유도한 후의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 17은 본 발명의 고분자 유도체화된 SpCas9의 세균내 전달 결과를 공초점 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 본 발명의 고분자 유도체화된 SpCas9의 세균내 전달 효율을 대조군과 비교하여 나타낸 도이다.
도 19 내지 도 21은 고분자 유도체화된 SpCas9의 세균 내로의 유입을 확인하기 위하여 공초점 이미지 단면을 3D 이미지로 재구성하여 SpCas9과 핵 염색의 형광 신호의 중첩으로부터 세균 세포 내의 SpCas9의 존재를 나타낸 도이다.
도 22는 다른 분자량(분자량 25,000)의 고분자 캐리어를 이용하여 고분자 유도체화된 SpCas9의 세균 내로의 유입을 확인하기 위하여 SpCas9과 핵염색의 형광신호를 중첩하여 나타낸 도이다.
도 23는 A549 세포에서의 Cr-나노복합체 유입 효율을 다초점형광현미경으로 관찰 분석하여 나타낸 도이다.
도 24는 HaCat 세포에서의 Cr-나노복합체 유입 효율을 다초점형광현미경으로 관찰 분석하여 나타낸 도이다.
도 25는 Cr-나노복합체의 HaCat 세포내로의 유입을 확인하기 위하여 공초점 이미지 단면을 3D 이미지로 재구성하여 복합체와 핵 염색의 형광 신호의 중첩으로부터 동물세포 내 복합체의 존재를 나타낸 도이다.
도 26는 Raw 264.7 세포에서의 Cr-나노복합체 유입 효율을 다초점형광현미경으로 관찰 분석하여 나타낸 도이다.
도 27는 Jurkat 세포에서의 Cr-나노복합체 유입 효율을 다초점형광현미경으로 관찰 분석하여 나타낸 도이다.
도 28은 본 발명의 Cr-나노복합체의 유전체 편집 효율성 평가를 위한 실험과정의 모식도를 나타낸 도이다.
도 29는 본 발명의 Cr-나노복합체로 처리한 세균의 현탁 배양 후 OD600 값을 측정하여 성장률을 나타낸 도이다.
도 30는 유전체 편집 패턴을 추가적으로 평가하기 위하여, 세균을 Cr-나노복합체 또는 대조군으로 처리하고 oxacillin의 존재 또는 부존재하에 CFU 수를 계산하여 나타낸 도이다.
도 31은 본 발명의 Cr-나노복합체를 박테리아에 처리시 상대적 성장률을 나타낸 도이다.
도 32은 본 발명의 Cr-나노복합체의 농도별로 유전체 편집 효율을 비교하여 나타낸 도이다.
도 33은 본 발명의 Cr-나노복합체로 처리한 박테리아의 레플리카 배양실험 결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. 캐리어 물질 접합 CRISPR 효소 단백질의 제조
1-1. SpCas9 단백질의 발현 및 정제
유전체 편집 카고(genome editing cargo)를 박테리아 내에 효율적으로 전달하기 위해 제작된 본 발명의 Cr-나노복합체(CRISPR nanocomplex) 시스템은 고분자 유도체화된 Cas9 단백질과 sgRNA와의 복합체를 이용하여 개발되었다.
먼저 SpCas9 단백질을 발현시키기 위하여 lentiCRISPR (Addgene) 로부터 얻은 SpCas9 유전자를 pET21a (Novagen) 에 클로닝하였다. SpCas9에는 5′-GGGCATATGGGCAGCAGCCATCACCATCATCACCACGATTACAAAGACGATGACGATAAGATGGCC-3′ 및 5′-CCCAAGCTTTTTCTTTTTTGCCTGGCCGGCCTTT-3′ 프라이머를 사용하였고, GFPuv(green fluorescent protein)에는 5′-CCCAAGCTTATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3′및 5′-CCCAAGCTTTTATTTGTAGAGCTCATCCA-3′를 프라이머로 사용하였다.
상기 SpCas9는 N에서 C 말단까지 6x His, FLAG, NLS(nuclear localization sequence), SpCas9 및 GFPuv(green fluorescent protein)을 포함하였다. 클로닝 된 서열은 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 발현 벡터를 BL21-(DE3) E. coli competent cell로 형질 전환한 후 LB(Luria-Bertani) 브로스 (100 μg/ml ampicillin 포함)에 접종하고 30 ℃에서 밤새 배양(OD600 0.4 ) 하였고, 0.5 mM IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 SpCas9 발현을 유도하였다. 세포를 16 시간 동안 배양한 후 5000 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 수확하고, 라이시스 버퍼(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 0.05 % β-머캡토에탄올, pH 8.0)로 처리하고 41%의 중격계수(duty)로 2초간 펄스를 주고, 5초간 정지하는 과정을 반복하며 총 30 분간 얼음 위에서 수행하였다.
세포 파쇄물은 His 태깅된 SpCas9가 친화성 칼럼에 결합되도록 Ni-NTA 아가로스 비드(Qiagen)에서 배양 및 세척하였고, 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 200 mM imidazole, 0.05 % β-머캡토에탄올 (pH 8.0)을 포함하는 완충액으로 용출하였다.
용출된 액은 저장 버퍼(50 mM Tris HCl, pH 8.0, 200 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 20% 글리세롤, 1 mM DTT, and 0.5 mM PMSF)에 대해 2 시간마다 완충액을 교환하면서 12 시간 동안 투석하였고, -70 ℃에서 보관하였다. Streptococcus pyogenes로부터 얻은 재조합 Cas9 엔도뉴클레아제(SpCas9)는 발현 플라스미드를 E.coli competent cell로 형질 전환시키고 친화성 크로마토그래피로 정제함으로써 수득하였다. 클로닝된 SpCas9의 시퀀스는 도 1에 나타내었다.
정제된 SpCas9는 SDS-PAGE 전기 영동에 의해 분석되었다. 본 발명의 정제된 SpCas9 단백질의 SDS-PAGE 결과를 도 2에 나타내었다. SpCas9의 크기는 약 190kDa로 확인되었다.
또한, SpCas9의 GFP 형광은 UV 일루미네이터 하에서 관찰함으로써 확인되었다(도 3).
1-2. sgRNA(단일 가이드 RNA)의 설계 및 합성
sgRNA의 설계
MRSA에서 mecA 유전자를 표적으로 하는 sgRNA(Single guide RNA)는 SpCas9에 의해 세균 유전체에서 이중-가닥을 파괴하도록 설계되었다. 세 가지 다른 sgRNA 서열을 mecA 유전자 내의 다양한 표적 부위에 따라 프로토스페이서(protospacer)로 결정하였다(도 4). 프로토스페이서 영역은 PAM (protospacer-adjacent motif) 서열 (NGG)에 모두 인접해 있었으며, 이로부터 3개의 염기의 상류(upstream) 부위에서 표적 절단(target cleavage)이 일어날 것이다.
sgRNA는 mecA를 타겟으로 하는 CrRNA(CRISPR RNA)와 TracrRNA(trans-activating crRNA)를 포함한다. 링커(GG)도 5 '말단에 포함되었다. sgRNA에 대한 주형(template)은 HelixAmp Power-Pfu (NanoHelix) 및 올리고뉴클레오티드 프라이머(Bioneer)를 사용하여 60 ℃에서 40 초 동안 어닐링하고, 72 ℃에서 30 초 동안 연장하는 과정을 30 사이클 반복한 후, 겔 추출(QIAquick, Qiagen)에 의해 제작되었다. 인 비트로 전사는 37 ℃에서 120 분 동안 파지 T7 RNA 중합효소 (Promega)를 사용하여 수행 하였다. 증폭물(amplicon) 및 프라이머의 서열을 도 4에 나타내었다. 전사된 sgRNA를 5 M 암모늄 아세테이트를 사용하여 침전시키고 에탄올로 침전하여 정제하였다.
sgRNA를 제작하기 위해, 각각의 sgRNA에 대한 DNA 주형은 먼저 시험 관내 전사를 위해 도 8의 프라이머를 사용하여 합성되었다. 각각의 sgRNA에 대한 DNA 주형은 T7 프로모터 영역, CrRNA를 위한 주형 영역 및 TracrRNA를위한 주형 영역을 포함 하였다(도 7). 합성된 DNA 주형은 도 9에 나타내었다.
시험관 내 전사는 이어서 합성 된 DNA 주형 및 T7 중합효소를 사용하여 수행하여 각 sgRNA를 생성하였다. 도 10은 mecA의 다른 영역을 표적으로 하는 세 가지 다른 유형의 sgRNAssgRNA (1), sgRNA (2) 및 sgRNA (3)가 성공적으로 합성되었음을 보여준다. 합성된 3 개의 모든 sgRNA는 ~ 100 bp의 뉴클레오타이드 크기를 갖는 것으로 나타났다.
sgRNA의 선별
상기에서 제조한 세 가지 sgRNA의 이중 가닥 분열을 유도하기 위한 기능성 또한 조사되었다. 표적 DNA로서, 배양된 MRSA의 총 RNA로부터 mecA 유전자(도 5) 내의 1803 bp 영역의 RT-PCR에 의해 순수한 무 세포 DNA 용액을 제조하였다. 정제된 천연형 SpCas9 단백질과 sgRNA (1), sgRNA (2) 및 sgRNA (3)을 각각 혼합하고 PCR 증폭 된 mecA 표적 DNA를 첨가하여 엔도뉴클레아제 절단을 유도하였다.
sgRNA (3)이 겔 전기영동 결과에서 두 개의 단편(648 bp와 1155 bp)을 모두 나타내어 가장 높은 절단 효율을 나타내었고, sgRNA (2)는 절단되지 않은 DNA 바로 아래에 1463 bp 단편에 해당하는 명확한 단편을 보여 주었지만 다른 단편은 관찰하기 어려웠다. sgRNA (1)의 경우 절단된 생성물 중 어느 것도 보이지 않았으므로 검출 효율이 너무 낮거나 sgRNA가 특정 이중 가닥 파괴를 유도하는 데는 기능하지 않는다고 평가되었다. 따라서, 상기 sgRNA (3)를 본 발명의 나노복합체 형성 및 세균 내 전달에 대한 추가 검사에 사용하였다.
1-3. 세균 균주 및 배양
MRSA 균주인 CCARM 3798, 3803, 및 3877 균주들을 CCARM(Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes)으로부터 수득하고 약제 내성을 가진 표적 세균으로 사용하였다. MSSA 균주인 KCTC 3881은 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에서 수득하였고, 약제 내성이 없는 균주로 사용하였다. 배양을 위해, 각 세균 균주들은 TSB(tryptic soy broth, BD Biosciences)에 접종하고 37 ℃에서 진탕배양기(shaking incubator)에서 1216 시간 동안 부유배양 하였다. 세균의 성장 및 농도는 600 nm 파장에서의 OD 값으로 측정하였다(0.4-0.6).
실시예 2. 고분자에 의해 유도체 합성된 Cas9의 제조
2-1. SpCas9-bPEI의 제조
유전자편집 단백질인 Cas9 제한효소에 양이온성을 지니는 캐리어 물질인 폴리에틸렌이민을 접합하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
가지형 폴리에틸렌이민(Branched polyethylenimine, bPEI, Mw 2000 및 25000)은 초순수 정제수에 용해된 5 mg의 sulfo-SMCC(sulfosuccinimidyl 4-(Nmaleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, Thermo Scientific)에 16 mg의 bPEI를 첨가하여 활성화하였고, 25 ℃에서 3 시간 동안 반응시켰다(bPEI: sulfo-SMCC의 몰농도비 = 1:10). 다음으로 반응 용액을 탈이온수(MWCO 5001000, Spectra/Por)에 대하여 48 시간 동안 투석하고, 아민기가 말레이미드(maleimide)로 치환된 폴리에틸렌이민 고분자를 동결건조 하였다(FD8508, IlshinBioBase).
또한, 상술한 바와 같이 유전자편집 단백질로 Cas9 제한효소를 생산하기 위해, Streptococcus pyogens 유래의 Cas9 단백질(SpCas9)의 벡터를 E. coli에 발현시켜 히스티딘을 이용하여 정제하였다.
상기 유전자편집 단백질(SpCas9)에 폴리에틸렌이민을 접합하기 위해, 상기 정제된 SpCas9 단백질 2mg을 인산완충용액(PBS) 1.2ml에 녹이고, 상기 말레이미드로 활성화된 폴리에틸렌이민 고분자를 몰비 1:100로 4 °C, pH 6.9 에서 4시간 동안 반응시키고, 최종 산물(SpCas9-bPEI)을 Cas9 저장용 완충용액(50 mM Tris HCl at pH 8.0, 200 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 20% glycerol, 1 mM DTT, and 0.5 mM PMSF)에 대해 투석을 24시간 수행한 후 액체질소에서 급속 냉각 후 80°C에서 저장하였다.
상기 SpCas9-bPEI의 합성과정에 관한 모식도를 도 11에 나타내었다.
bPEI의 Cas9에 대한 컨쥬게이션은 0.5% 아가로즈 겔 및 5% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용한 겔 지연분석법(gel retardation)으로 확인하였다
SpCas9에 대한 bPEI의 성공적 컨쥬게이션을 확인하기 위한 겔 지연 분석 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에 나타낸 바와 같이, bPEI와 컨쥬게이션 된 SpCas9(SpCas9-bPEI)는 (-) 방향으로 실질적으로 이동하는 천연 SpCas9와 반대 방향인 (-) 방향으로 약간 이동하는 것으로 나타났다. 상기 SpCas9-bPEI의 겔 지연 분석 결과는 폴리머와의 변형으로 인한 이동성의 변화 및 단백질 분자의 응집(clustering) 때문일 수 있다. 단백질의 분자량을 4000 Da 만큼만 증가시킴으로써 최대 2 개의 bPEI 분자가 각 단백질 분자에 컨쥬게이션 될 수 있지만, 이 경미한 변화 (1-2 %)는 구조적 또는 차원적 변화로 인하여 전기 영동하는 동안 단백질의 이동성에 실질적으로 영향을 미칠 수 있다. GFP 융합 SpCas9 단백질의 이론적인 전하는 매우 음성일 것으로 예상되었다. bPEI는 극히 고밀도의 아민 작용기를 가지고 있어서 양이온성이 높기 때문에 bPEI의 SpCas9와의 결합은 단백질의 분자 전하에 영향을 주거나 정전기적 단백질-고분자 상호 작용에 의한 응집을 유도할 수 있다.
또한, SpCas9에 대한 bPEI의 성공적 컨쥬게이션을 확인하기 위한 SDS-PAGE 분석 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13에 나타낸 바와 같이, SpCas9-bPEI와 천연 SpCas9가 유사한 영역에 나타났으며, 공유 결합으로 가교 된 SpCas9 단백질들이 접합 반응 후에 존재하지 않는 것으로 나타났다(도 13). 따라서, SpCas9와 bPEI의 컨쥬게이션이 성공적으로 이루어졌으며 SpCas9 단백질 분자 사이에서는 가교가 일어나지 않았음을 확인하였다.
실시예 3. CRISPR 유전자 편집 나노복합체(Cr-나노복합체)의 제조 및 특징
3-1. Cr-나노복합체의 제조
본 발명의 Cr-나노복합체를 제조하기 위하여, SpCas9-bPEI (990 nM) 및 sgRNA(3) (1.8 μM)을 탈이온수(pH 6.5)에서 혼합하여 상온(25℃_에서 15분간 정적 조건(static condition)에서 배양하였다. 대조군으로, 원래의 SpCas9 (990 nM)을 sgRNA(3) (1.8 μM)과 위와 같은 조건에서 혼합하였다. 그 결과 Spcas9-bPEI와 sgRNA (3)가 자기조립된 나노크기 복합체가 제조되었다(도 14). 상기 sgRNA는 MRSA (methicillin-resistant Staphylococcus aureus)의 항생제 내성 유전자 mecA를 표적으로 하는 서열을 사용하였다. 상기 나노복합체 형성 과정 중의 pH는 ~6.4로 bPEI (2 kDa)의 pKa (~8.6)보다 낮았고, 아민 작용기를 양성자화하여 음이온성 sgRNA와의 정전기적 결합을 유도 하였다.
복합체의 크기 측정 및 제타전위 측정
동적 광산란(DLS: dynamic light scattering) 및 제타 포텐셜(zeta potential) 측정을 위하여, 상기 복합용액을 PBS 또는 탈이온수로 희석하여, 각각 168 nM SpCas9 및 300 nM sgRNA(3)의 최종 농도로 맞추었다. Cr-나노복합체 또는 자연의 복합체들의 유체역학적 직경(hydrodynamic size) 및 제타 전위는 ELSZ-2000ZS (Otsuka)으로 측정하였다.
동적 광산란(DLS: dynamic light scattering) 측정 결과, Cr-나노복합체의 경우 입도 크기 (Z 평균)가 163.3 nm 로 나타나 개질되지 않은 Cas9 단백질과 sgRNA의 천연 복합체의 크기 82.6 nm에 비해 큰 것으로 나타났다(도 15). 상기 결과로부터 SpCas9-bPEI 내에서 음으로 하전된 sgRNA와 양전하를 띤 폴리머 사이의 전하 상호 작용에 의해 작은 나노 크기의 단백질-중합체 컨쥬게이트/RNA 복합체가 성공적으로 형성되었음을 확인할 수 있었다. 각각의 복합체는 단일 sgRNA 분자에 결합된 단일 단백질의 형태로 주로 존재하는 변형되지 않은 SpCas9와는 달리, 몇 분자의 SpCas9-bPEI 및 sgRNA들을 포함하여 더 큰 복합구조를 형성할 것이다.
Cr-나노복합체와 천연 복합체의 제타 전위 값은 모두 단백질 표면에 결합 된 sgRNA의 존재로 인해 음의 값을 보였으나 Cr-나노복합체(-12.1 mV)는 천연 복합체(-19.0 mV)에 비해 상대적으로 적은 음이온성을 나타내었다. 또한, 복합체 형성 전의 SpCas9-bPEI의 제타 전위는 양이온성 중합체의 도입으로 인해 양의 값(+ 4.0 mV)을 나타내었으며, 이는 천연 SpCas9의 제타전위(-17.2 mV)와 비교하여 상당히 변화된 것이었으며, 이러한 Cr-나노복합체의 더 낮은 음이온성은 세균 내로의 전달을 향상시키는 데 도움이 될 것으로 예상되었다.
3-2. Cas9 엔도뉴클레아제 활성 측정을 위한 절단 분석(Cleavage Assay for Endonuclease Activity)
본 발명의 Cas9 제한효소가 폴리머 유도체화 및 Cr-나노복합체 형성 후 이중 가닥 DNA 절단을 유도하는 기능적 활성을 유지하는지 여부를 조사하기 위하여, 배양된 박테리아로부터 유래된 PCR 증폭 주형 DNA를 사용하여 인 비트로 절단 분석을 수행하였다.
먼저 MRSA 및 MSSA 균주를 배양하고, 총 RNA를 Trizol 시약(Invitrogen) 추출한 다음, amfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GenDEPOT)를 사용하여 60 ℃ 에서 1 분간 (denaturation), 25 ℃에서 5 분간 (어닐링), 55 ℃에서 60 분간 (연장), 및 85 ℃에서 1 분간 (비활성화)하여 역전사하였다. cDNA는 power pfu 중합효소 (Nanohelix)와 mecA 유전자에 특이적인 프라이머(Bioneer)로 다음 조건으로 증폭하였다: 95 ℃에서 2분간 개시; 35 사이클 95℃에서 20 초간(변성), 59 ℃에서 40초간 (어닐링), 72 ℃에서 3 분 38 초간 (연장); 및 72 ℃에서 5 분간 종결.
그런 다음 증폭된 주형 DNA를 SpCas9 : sgRNA : 표적 DNA의 몰비가 10 : 10 : 1이 되도록 SpCas9-bPEI 또는 sgRNA (3)와 복합체로 된 천연 SpCas9로 처리하고 Cas9 핵산분해 반응 완충액 (20 mM HEPES , 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, pH 6.5)에 37 ℃에서 1 시간 동안 처리 하였다. 최종 산물은 아가로스 겔 전기영동하여 DNA의 분절의 존재 및 크기를 확인하였다.
결과는 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 예상되는 크기인 1155 bp와 648 bp에 해당하는 하나의 큰 DNA 단편과 하나의 작은 DNA 단편이 나타나, SpCas9는 bPEI와의 직접 공유결합적 변형 및 sgRNA와의 복합체 형성 이후에도 표적 DNA의 이중 가닥 절단을 `유도할 수 있음을 확인하였다.
3-3. 고분자 유도체화된 SpCas9의 세균내 전달 및 현미경 관찰
본 발명의 Cas9 단백질의 고분자 유도체화는 천연 Cas9와 비교하여 세균 내로의 흡수(uptake)를 증가시킬 것으로 기대되었다. 본 발명자들은 세균 고분자 유도체화된 SpCas9의 세균으로의 전달 효율을 입증하기 위해, SpCas9-bPEI를 in vitro 배양 된 MRSA로 처리하고 공초점 현미경으로 관찰 하였다. MRSA 균주 3798 및 3803은 상기 처리 전에 배양하였다.
PBS 중의 SpCas9-bPEI (200 nM) 또는 천연 SpCas9 (200 nM)를 1 x 107의 배양된 MRSA에 처리하였다. 농축 SpCas9와 bPEI (Mw 2000)를 혼합하고, 25 ℃에서 15 분간 배양하고, 최종 농도가 SpCas9 - 200 nM, bPEI - 3 μg/mL이 되도록 PBS로 (7x) 희석하여 만든, bPEI와 단순히 혼합한 천연 SpCas9를 대조군으로 사용하였다.
각 실험군을 37 ℃에서 2 시간 동안 진탕 배양기를 사용하여 부드럽게 교반 배양한 후, 세균을 원심분리 후 PBS로 반복 세척하여 잔류 복합체를 제거하였다. 세균을 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정시키고 Vectashield (Vector Laboratories)를 사용하여 현미경 슬라이드에 마운팅하고 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (LSM780, Carl Zeiss)을 사용하여 관찰하였다. 상대적 세균내 전달량(uptake)을 정량화하기 위해, 상기 혼합물로 1.7×107/mL로 4 시간 동안 세균을 처리하였다. 또 다른 대조군으로, 천연 SpCas9를 리포펙타민 3000(Thermo Fisher Scientific)과 제조사의 프로토콜에 따라 혼합하였다(최종 농도 SpCas9 400 nM). 이로부터 저배율 영상을 공초점 현미경으로 얻었고 녹색 형광 신호 (SpCas9)를 ImageJ (NIH)를 사용하여 적색 형광 (PI 염색)으로 표준화했다.
결과는 도 17 및 도 18에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 폴리에틸렌이민으로 컨쥬게이션된 Cas9 단백질(SpCas9-bPEI)은 개질되지 않은 Cas9 단백질(SpCas9)이나, 반응하지 않은 폴리에틸렌이민 고분자와 Cas9 단백질의 혼합물(SpCas9+bPEI (mix))과 비교하여 월등하게 높은 효율로 세균 내로 성공적으로 흡수되었음을 확인할 수 있었다. 본 발명의 SpCas9-bPEI의 경우 GFPuv의 밝은 녹색 형광이 핵 염색에 인접하여 명확하게 관찰된 반면에, 천연 SpCas9는 어떠한 흡수도 나타내지 않았다. 대조군으로서 bPEI와 단순히 (비공유 결합으로) 혼합된 천연 SpCas9(SpCas9+bPEI (mix))도 역시 흡수의 징후를 나타내지 않았다.
또한, 고분자 유도체화된 SpCas9의 세균 내로의 흡수를 더 확인하기 위하여 공초점 이미지 단면을 3D 이미지로 재구성하여 SpCas9과 핵 염색의 형광 신호의 중첩으로부터 세균 세포 내의 SpCas9의 존재를 나타내었다(도 19, 도 20).
형광 신호의 히스토그램은 또한 공초점 이미지 내에서 스캔된 다른 영역으로부터 얻어졌으며, 그 결과 SpCas9로부터의 신호는 핵 염색의 신호가 존재하는 지점에서만 나타났다(도 21).
도 19에 나타낸 바와 같이, 상대적 흡수 값은 SpCas9-bPEI의 경우 0.4273으로 나타났으며, 천연 SpCas9의 경우, bPEI가 단순히 혼합된 천연 SpCas9의 경우 및 리포펙타민과 혼합된 천연 SpCas9의 경우에 각각 0.0041, 0.0001, 0.0083으로 나타났다. bPEI 컨쥬게이션에 대한 Cas9 단백질의 흡수가 크게 증가한 것은 폴리머의 높은 양이온성 또는 그로 인한 단백질의 극성 증가로 인한 것일 수 있다.
bPEI 폴리머는 높은 분자 밀도에서 3차, 2차 및 1차 아민기를 풍부하게 갖기 때문에, SpCas9-bPEI와 그람 양성균의 음으로 하전된 세포벽과의 상호 작용은 천연 SpCas9과의 상호작용에 비해 실질적으로 증가할 것으로 보인다. 또한, SpCas9의 표면상에 bPEI가 존재하면 클러스터의 형성 또는 분자의 축합이 가능해진다. 전반적으로 박테리아 세포벽에 대한 SpCas9의 강화된 결합은 아마도 펩티도글리칸(peptidoglycan)을 통한 침투 및 연속된 세포막을 통한 흡수에 의한 투과에 의한 것이어서 더 높은 흡수 가능성을 초래할 것이다. 또한 bPEI의 강한 양이온성은 박테리아 DNA와 정전기적으로 상호 작용하여 SpCas9의 유전체 표적에 대한 분자적 인력을 허용할 것으로 기대된다.
한편, 캐리어로서 종래의 리포펙타민을 사용하는 것은 약물의 로딩 효율이 낮고 세포 내로의 방출이 어렵 기 때문에 한계가 있음을 보여 주었다.
본 발명자들은 SpCas9 단백질을 양이온성 폴리머로 공유 결합시켜 이들 문제를 해결할 수 있을 것으로 기대하였다. 양이온성 폴리머는 그 변형이 기능 활성에 영향을 미치지 않는 한, 단백질의 각 단일 분자에 적용되며 동시에 최소량의 캐리어 물질을 사용할 수 있도록 해줄 것으로 기대된다. 또 다른 이점은 전달을 위한 카고물질의 방출 단계가 추가로 필요한 캐리어 물질 내로의 캡슐화 공정을 피할 수 있다는 점에 있다.
더 많은 증거는 분자량 25 000의 bPEI로 변형된 SpCas9를 사용한 치료 실험에서 확인할 수 있었다. 도 22는 더 큰 bPEI 폴리머로 변형시키면 세균에 처리했을 때 단백질이 유의한 흡수를 보이지 않음을 나타낸다. 작은 분자량의 bPEI를 사용한 변형만이 높은 전달 효율을 나타내었기 때문에, 운반 효율을 최대화하고 독성을 최소화하기 위해서는 분자량이 작으면서도 최적량의 캐리어 물질을 사용하는 것이 중요함을 알 수 있다.
3-4. Cr -나노복합체의 동물세포 전달 및 현미경 관찰
본 발명의 Cas9 단백질의 고분자 유도체화는 천연 Cas9와 비교하여 포유류세포(mammalian cell)내로의 흡수(uptake)를 증가시킬 것으로 기대되었다. 본 발명자들은 Cr-나노복합체의 포유류세포로의 전달 효율을 입증하기 위해, SpCas9-bPEI 및 sgRNA를 in vitro 배양된 동물세포에 처리하고 공초점 현미경으로 관찰하였다. A549, HaCat, Raw264.7 동물 세포는 처리 30시간 전에 1x104 cells로 8 well chamber에서 배양되었고 Jurkat 동물세포의 경우 48 well cell culture plate에서 배양 되었다.
PBS 중의 SpCas9-bPEI2000/sgRNA (168 nM) 또는 SpCas9-bPEI25000/sgRNA(168 nM) 또는 천연 SpCas9/sgRNA (168 nM)복합체를 배양된 포유류세포들에 처리하였다. 또 다른 대조군으로, 천연 SpCas9/sgRNA (168 nM)를 리포펙타민 RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific)를 제조사의 프로토콜에 따라 혼합하였다(최종 농도 SpCas9/sgRNA 각각 - 168 nM). 각 실험군을 37 ℃, 5% CO₂ 에서 1-1.6 시간 동안 세포배양기를 사용하여 배양한 후, PBS로 3회이상 반복 세척하여 잔류 복합체를 제거하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드 용액으로 15분간 고정시키고 ® Mounting Medium with (Vector Laboratories)를 사용하여 현미경 슬라이드에 마운팅하고 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (LSM780, Carl Zeiss)을 사용하여 관찰하였다. 이로부터 저배율 영상을 공초점 현미경으로 얻었고 녹색 형광 신호 (SpCas9)와 청색 형광 (DAPI- nucleous 염색)을 확인할 수 있었다.
도 23에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 폴리에틸렌이민 분자량2000으로 컨쥬게이션된 Cas9 단백질(SpCas9-bPEI)/sgRNA 복합체는 개질되지 않은 Cas9 단백질(SpCas9)/sgRNA 복합체와 비교하여 월등하게 높은 효율로 A549 동물세포내로 성공적으로 흡수되었음을 확인할 수 있었으며, 리포펙타민 RNAiMAX와의 혼합물에 비해서도 상당히 높은 흡수율을 보였다. 또 다른 대조군으로 분자량이 25000 으로 폴리에틸렌이민의 분자량이 12.5 배 차이나는 SpCas9-bPEI25000/sgRNA을 처리 하였을 때는 확연한 세포내 흡수를 전혀 확인 할 수가 없었다. 또한, HaCat 동물세포에 처리가 되었을 때도 마찬가지로, 도 24에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 폴리에틸렌이민으로 컨쥬게이션된 Cas9 단백질(SpCas9-bPEI)/sgRNA 복합체는 개질되지 않은 Cas9 단백질(SpCas9)/sgRNA 복합체와 또 다른 대조군인 리포펙타민 RNAiMAX와의 혼합물에 비교하여 월등하게 높은 효율로 동물세포내로 성공적으로 흡수되었음을 확인할 수 있었다. Cr-나노복합체의 세포 내로의 흡수를 더 확인하기 위하여 공초점 이미지 단면을 3D 이미지로 재구성하여 복합체 (SpCas9/sgRNA: 녹색형광)와 핵(DAPI:파란색 형광) 염색의 형광 신호의 중첩으로부터 HaCat 동물 세포 내의 복합체의 존재를 도 25에 나타내었다. 도 25에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 폴리에틸렌이민으로 컨쥬게이션된 Cas9 단백질(SpCas9-bPEI)/sgRNA 복합체의 경우 녹색 형광 신호 (SpCas9)와 청색 형광 (DAPI- nucleous 염색)이 가장 많이 겹쳐짐을 확인 할 수 있었다. 이는 Raw 264.7 동물세포에서도 동일한 결과를 보였으며, 도 26에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 SpCas9-bPEI/sgRNA 복합체의 경우 Cas9 단백질의 GFPuv 밝은 녹색 형광이 핵 염색에 인접하여 명확하게 관찰된 반면에, 천연 SpCas9/sgRNA 복합체는 상대적으로 적은 형광이 관찰되었다. 도 27에서 나타내는 바와 같이, 면역세포인 Jurkat 동물 세포의 경우에 처리 되었을 경우에는 본 발명의 SpCas9-bPEI/sgRNA 복합체의 경우 Cas9 단백질이 개질되지 않은 Cas9 단백질(SpCas9)/sgRNA 복합체와 비교하여 상당히 높은 효율을 나타내었으며, 리포펙타민 RNAiMAX와의 혼합물보다 다소 증가된 세포내 흡수율을 나타내었다.
3-5. Cr-나노복합체에 의한 유전체(genome) 편집 효율성 평가
본 발명자들은 Cr-나노복합체가 세균 유전체를 편집하고 항생제 내성을 표적화할 수 있는지 여부를 조사하였다. mecA를 표적으로 하는 sgRNA 및 SpCas9-bPEI로 형성된 Cr-나노복합체를 배양된 MRSA(3798 및 3803 균주)에 시험관 내에서 처리하고 세균의 성장을 선택 배지에서의 후속 배양으로 조사하였다. 배양된 MRSA 균주는 이전에 메티실린과 옥사실린 모두에 저항성이 있다는 것이 입증되었다.
실험군으로 본 발명의 Cr-나노복합체를 SpCas9-bPEI (990 nM)와 sgRNA (3) (1.8 μM)을 혼합하고 15 분 동안 배양하여 제조하였다. 대조군으로서 상기와 동일한 조건에서 천연 SpCas9 (990 nM)를 sgRNA (3) (1.8 μM)와 혼합하였다. 또 다른 대조군으로 기존의 지질 기반 제형은 제조사의 프로토콜에 따라 Lipofectamine RNAiMAX (15.8 μL, Thermo Fisher Scientific)에 천연 복합체 (50 μL)를 첨가하여 제조하였다. 단백질만 (sgRNA없이), SpCas9-bPEI만, 또는 천연 SpCas9 만 990 nM 농도로 포함하는 것들도 대조군으로 제조하였다.
모든 샘플을 TSB(tryptic soy broth)에서 6배 희석(SpCas9의 최종 농도 : sgRNA = 165 : 300 nM)하고, MRSA 5×106 에 37 ℃에서 4 시간 동안 부드럽게 진탕배양하며 처리하였다. 처리된 박테리아를 PBS로 세척하고, 6 μg/mL oxacillin이 포함된 TSB에서 100 배 희석하고 37 ℃에서 90 분 동안 진탕배양기에서 배양하였다. 세균 성장은 90 분간 배양 후 600 nm에서의 OD 값을 측정((Nanophotometer, Implen)하여 결정하였다.
나노 복합체로 처리한 세균도 PBS로 희석 (105x)하고 6 μg/mL oxacillin을 포함하는 MRSA 한천 평판배지 위에 스프레딩하여 30 ℃에서 21 시간 동안 배양한 후 CFU(colony forming unit)를 계수하였다.
Cr-나노복합체로 처리 한 박테리아를 현탁 배양하거나 oxacillin (6 μg / mL)을 포함하는 한천 배지에서 배양하는 경우, 이중 가닥 DNA가 파괴된 클론은 성장할 수 없고, 영향을 받지 않은 클론은 세균집락을 형성할 것이다. 상기 실험과정에 관한 모식도는 도 28에 나타내었다.
본 발명의 Cr-나노복합체로 처리한 세균의 현탁 배양 후 OD600 값을 측정하여 성장률을 도 29에 나타내었다. 도 29에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Cr-나노복합체 처리시 sgRNA가없는 SpCas9-bPEI를 대조군으로 처리하는 것 보다 32 % 감소시키켜 성장을 유의하게 억제하는 것으로 나타났다.
또한, 유전체 편집 패턴을 추가적으로 평가하기 위하여, 세균을 Cr-나노복합체 또는 대조군으로 처리하고 oxacillin의 존재 또는 부존재하에 CFU 수를 계산하여 도 30에 나타내었다.
도 30에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Cr-나노복합체로 처리 한 결과 Oxacillin의 존재 하에서 대조군(SpCas9 only의 경우 335 × 106 CFU/mL, SpCas9-bPEI 의 경우 401 × 106 CFU/mL)과 비교하여 성장이 유의하게 감소하였으나(65 × 106 CFU/mL), 천연 SpCas9/sgRNA 복합체로 처리한 경우에는 성장 감소가 더 적게 나타났다 (121 × 106 CFU/mL). 또한, sgRNA 없이 SpCas9-bPEI만을 처리시(SpCas9-bPEI Only)에는 현저한 세균 성장의 감소를 나타내지 않아 Cr-나노복합체로 처리했을 때 감소된 세균 성장이 bPEI의 존재에 의한 독성에서 비롯된 것이 아니라는 것을 보여 주었다. 놀랍게도, 천연 SpCas9/sgRNA 복합체의 리포펙타민 제제는 SpCas9만으로 처리한 대조군과 비교하여서 세균 성장에서 현저한 감소를 나타내지 않았다(361 × 106 CFU/mL). 따라서 SpCas9/sgRNA 복합체의 전달을 위한 리포펙타민의 사용은 포유동물 세포에서는 실질적인 전달 효율을 나타내었지만 세균 세포의 경우에는 전달 효율이 매우 불량함을 알 수 있다. 또한, 생체 활성 분자 (예를 들어, Cas9와 같은 단백질)의 존재 하에 세균을 배양하는 것이 이를 영양공급원 또는 자극제로서 작용하여 세균의 성장에 영향을 미칠 수도 있다는 사실을 고려하였다.
따라서 “상대적 성장”은 (1) sgRNA를 포함한 복합체로 처리했을 때의 CFU 수로 계산되었고, (2) sgRNA를 제외한 복합체로 처리한 경우의 CFU 수로 정규화하여 도 31에 나타내었다. 도 31에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Cr-나노복합체로 처리한 결과를 SpCas9-bPEI로만 처리한 결과와 비교시 16.3 %의 상대적 성장을 보인 반면, SpCas9/sgRNA 복합체로 처리한 결과를 SpCas9로만 처리한 결과와 비교시 35.9 %의 상대적 성장을 보였다. 리포펙타민의 존재 하에 천연 SpCas9/sgRNA 복합체로 처리한 결과, sgRNA가 없는 리포펙타민을 함유한 SpCas9와 비교하여 71.6%의 상대적 성장이 나타났다(도 31). 이러한 결과는 종래의 리포펙타민 캐리어의 사용 여부에 관계없이 천연 SpCas9 복합체를 사용하는 것과 비교하여, 본 발명의 Cr-나노복합체가 훨씬 높은 효율로 sgRNA와 SpCas9 단백질을 세균 내로 전달하여 표적 DNA를 이중 가닥 절단 할 수 있음을 입증한다.
또한, 다양한 농도의 Cr-나노복합체를 세균에 처리하여 용량-의존적 유전체 편집 효율을 결정하였다(도 32). 도 32에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Cr-나노복합체는 천연 복합체와 비교할 때, 낮은 농도에서의 처리는 상대적인 성장을 18.7 % 억제하였고, 보다 높은 농도에서의 처리는 상대적인 성장을 57.7 % 억제하였다. 고농도에서의 처리는 중간 농도에서 처리한 경우에 비해 성장을 억제하는 평균치가 약간 더 높았지만, 중간 치료의 경우에만 통계적으로 유의한 것으로 나타났다. 저농도의 Cr-나노복합체를 처리하는 것은 유의하게 유전체 편집 효능을 발휘하기에는 충분하지 않은 반면, 고농도의 Cr-나노복합체 처리는 세균의 기능 및 흡수에 영향을 미치거나 세균 증식을 자극하여 게놈 편집 과정을 방해했을 수 있다.
또 다른 중요한 발견은 oxacillin 부존재 조건에서 박테리아 성장을 조사한 결과, Cr-나노복합체의 경우 67x106 CFU/mL, 천연 복합체의 경우 135x106 CFU/mL, SpCas9-bPEI 만의 경우 414 × 106 CFU/mL을 나타내어 oxacillin이 존재할 때와 비슷한 결과를 보였다는 것이다(도 30).
Cr-나노복합체로 처리된 세균으로부터 형성된 세균집락의 레플리카 배양도 수행되었다. 여기서 oxacillin을 포함하는 1 차 플레이트는 oxacillin 없이 2 차 플레이트에 복제되어 30℃에서 12시간 동안 배양하고, 세균 집락수를 계수하였다. 그 결과 비 선택성 배지에서 콜로니를 형성한 모든 클론 또한 선택 배지에서 자랄 수 있음을 보여 주었다(도 33). 이러한 결과는 Cr-나노복합체에 의한 유전체 편집이 박테리아의 치사를 초래하는 반면, 상기 Cr-나노복합체 처리를 견디는 박테리아는 계속 증가함을 나타낸다.
통계적 분석
모든 통계 자료는 평균 ± 표준 편차로 계산하여 나타내었다. 통계적 유의성은 Student 's t test를 사용하여 p 값을 얻음으로써 결정하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (22)

  1. 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)에 있어서, 상기 고분자 캐리어 물질은 가지형 폴리에틸렌이민, 선형 폴리에틸렌이민, 폴리프로필렌이민, 및 이들의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 CRISPR 유전자편집 효소 단백질은 Cas1(CRISPR associated protein 1), Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas9 , Cse1, Cse2, Cse3, Cse4, Cas5d, Cas5e, Csy1, Csy2, Csy3, Csy4, Cpf1, Csn1, Csn2, Csd1, Csd2, Cst1, Cst2, Cas5t, Csh1, Csh2, Cas5h, Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, Cas5a, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Cmr1, Cmr2, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, C2c2(Cas13a), dCas9(dead Cas9), Cas9 nickase, CDA(cytidine deaminase enzyme), APOBEC(apolipoprotein B editing complex)14, UGI(uracil glycosylase inhibitor), 및 AID(activation-induced deaminase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 고분자 캐리어 물질은 폴리아미도아민, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 공중합체, 폴리-락트산, 폴리-글리콜산, 폴리-D,L-락트산-co-글리콜산, 폴리카프로락톤, 폴리포스포에스터, 폴리포스파진, 폴리베타아미노에스터, 가지형 폴리아미노에스터, 폴리아미노부틸-글리콜산, 폴리오르소에스터, 폴리하이드록시프롤린에스터, 폴리아크릴아마이드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, poly(2-(dimethylamino)ethylmethacrylate) (PDMAEMA), 덴드리머, 히알루론산, 알긴산, 키토산, 덱스트란, 사이클로덱스트린, 스퍼민, 폴리-Arginine, 폴리-Lysine, 및 이들의 공중합체 또는 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 추가적으로 포함하는, 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 고분자 캐리어 물질과 CRISPR 효소 단백질은 SMCC(succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)), sulfo-SMCC(sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), AMAS(N-α-maleimidoacet-oxysuccinimide ester), BMPS(N-β-maleimidopropyl-oxysuccinimide ester), GMBS(N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester), MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), EMCS(N-ε-malemidocaproyl-oxysuccinimide ester), SM(PEG) (PEGylated SMCC), SPDP(succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), PEG-SPDP(PEGylated SPDP), DSG(disuccinimidyl glutarate), DCC(Dicyclohexylcarbodiimide), DSS(disuccinimidyl suberate), BS3(Bissulfosuccinimidyl suberate), DSP(dithiobis(succinimidyl propionate)), EGS(ethylene glycol bis(succinimidyl succinate)), DMP(dimethyl pimelimidate), BMOE(bismaleimidoethane), BMB(1,4-bismaleimidobutane), DTME(dithiobismaleimidoethane), EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride), NHS(N-Hydroxysuccinimide), 프로파길-숙신이미딜-에스테르(propargyl-succinimidyl-ester), DBCO-말레이미드(Dibenzocyclooctyne-maleimide), DBCO-PEG-말레이미드(Dibenzocyclooctyne-PEG4-maleimide), DBCO-S-S-NHS 에스테르(Dibenzocyclooctyne-S-S-N-hydroxysuccinimidyl ester), DBCO-NHS 에스테르(dibenzocyclooctyne-N-hydroxysuccinimidyl ester), 아세틸렌-PEG-NHS 에스테르(acetylene-PEG-NHS ester), 및 알킬렌-PEG-말레이미드(alkyne-PEG-maleimide)로 이루어진 군으로부터 선택된 가교제로 접합(conjugation)된 것을 특징으로 하는, 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질.
  5. 다음 단계를 포함하는 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 효소 단백질의 제조방법:
    (a) 고분자 캐리어 물질의 기능기를 양기능성 가교제(bifunctional crosslinker)로 반응시켜 활성화된 고분자 캐리어 물질을 제조하는 단계; 및
    (b) CRISPR 효소 단백질의 기능기를 상기 활성화된 고분자 캐리어 물질과 반응시켜 접합 물질을 제조하는 단계,
    상기 (a) 단계의 고분자 캐리어 물질은 가지형 폴리에틸렌이민, 선형 폴리에틸렌이민, 폴리프로필렌이민, 및 이들의 공중합체 또는 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 함.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 CRISPR 효소 단백질은 Cas1(CRISPR associated protein 1), Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas9, Cse1, Cse2, Cse3, Cse4, Cas5d, Cas5e, Csy1, Csy2, Csy3, Csy4, Cpf1, Csn1, Csn2, Csd1, Csd2, Cst1, Cst2, Cas5t, Csh1, Csh2, Cas5h, Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, Cas5a, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Cmr1, Cmr2, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, dCas9(dead Cas9), Cas9, C2c2 (Cas13a), CDA(cytidine deaminase enzyme), APOBEC(apolipoprotein B editing complex)14, UGI(uracil glycosylase inhibitor), 및 AID(activation-induced deaminase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질의 제조방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 고분자 캐리어 물질은 폴리아미도아민, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 공중합체, 폴리-락트산, 폴리-글리콜산, 폴리-D,L-락트산-co-글리콜산, 폴리카프로락톤, 폴리포스포에스터, 폴리포스파진, 폴리베타아미노에스터, 가지형 폴리아미노에스터, 폴리아미노부틸-글리콜산, 폴리오르소에스터, 폴리하이드록시프롤린에스터, 폴리아크릴아마이드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, poly(2-(dimethylamino)ethylmethacrylate) (PDMAEMA), 덴드리머, 히알루론산, 알긴산, 키토산, 덱스트란, 사이클로덱스트린, 스퍼민, 폴리-Arginine, 폴리-Lysine, 및 이들의 공중합체 또는 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 추가적으로 포함하는, 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질의 제조방법.
  8. 제 5 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 가교제는 SMCC(succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)), sulfo-SMCC(sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), AMAS(N-α-maleimidoacet-oxysuccinimide ester), BMPS(N-β-maleimidopropyl-oxysuccinimide ester), GMBS(N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester), MBS(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), EMCS(N-ε-malemidocaproyl-oxysuccinimide ester), SM(PEG) (PEGylated SMCC), SPDP(succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), PEG-SPDP(PEGylated SPDP), DSG(disuccinimidyl glutarate), DCC(Dicyclohexylcarbodiimide), DSS(disuccinimidyl suberate), BS3(Bissulfosuccinimidyl suberate), DSP(dithiobis(succinimidyl propionate)), EGS(ethylene glycol bis(succinimidyl succinate)), DMP(dimethyl pimelimidate), BMOE(bismaleimidoethane), BMB(1,4-bismaleimidobutane), DTME(dithiobismaleimidoethane), EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride), NHS(N-Hydroxysuccinimide), 프로파길-숙신이미딜-에스테르(propargyl-succinimidyl-ester), DBCO-말레이미드(Dibenzocyclooctyne-maleimide), DBCO-PEG-말레이미드(Dibenzocyclooctyne-PEG4-maleimide), DBCO-S-S-NHS 에스테르(Dibenzocyclooctyne-S-S-N-hydroxysuccinimidyl ester), DBCO-NHS 에스테르(dibenzocyclooctyne-N-hydroxysuccinimidyl ester), 아세틸렌-PEG-NHS 에스테르(acetylene-PEG-NHS ester), 및 알킬렌-PEG-말레이미드(alkyne-PEG-maleimide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질의 제조방법.
  9. 제 5 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 고분자 캐리어 물질의 활성화 반응은 DMSO(dimethylsulfoxide), DMF(dimethylformamide), 에탄올, 메탄올, 물, 메틸렌클로라이드, 및 클로로포름으로 이루어진 군으로부터 선택된 용매 중에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제 5 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 고분자 캐리어 물질의 활성화 반응은 4~60℃에서, 0.5~24시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제 5 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 고분자 캐리어 물질 및 CRISPR 효소 단백질의 몰비는 10-1:1 내지 105:1인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제 5 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 CRISPR 효소 단백질의 기능기와 활성화된 고분자 캐리어 물질의 접합 반응은 4~60°C에서, 1~48시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제 5 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 CRISPR 효소 단백질의 기능기와 활성화된 고분자 캐리어 물질의 접합 반응은 pH 4~10의 수용성 용매 중에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 효소 단백질 및 sgRNA(single guide RNA)를 포함하는 CRISPR 나노복합체.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 CRISPR 나노복합체는 수용액 분산상태에서 입도크기가 1 내지 10,000 nm인 것을 특징으로 하는 CRISPR 나노복합체.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 CRISPR 나노복합체는 제타 전위가 -100 ~ +100 mV인 것을 특징으로 하는 CRISPR 나노복합체.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 효소 단백질 및 sgRNA(single guide RNA)를 혼합하는 단계를 포함하는 CRISPR 나노복합체의 제조방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 고분자 캐리어-접합 CRISPR 효소 단백질과 sgRNA의 몰비는 1:10-6 내지 1:106 인 것을 특징으로 하는 CRISPR 나노복합체의 제조방법.
  19. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질, 또는 제 14 항의 CRISPR 나노복합체를 포함하는 유전자 편집용 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 조성물은 고분자 캐리어 물질-접합 CRISPR 효소 단백질, 또는 CRISPR 나노복합체를 세포내에 전달하여 유전자 편집을 유도하는 것을 특징으로 하는 유전자 편집용 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 세포는 진핵세포 또는 원핵세포인 것을 특징으로 하는 유전자 편집용 조성물.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 세포는 S. aureus , E. coli, P. aeruginosa , K. pneumoniae , A. baumannii, B. subtilis , S. epidermidis , E. faecalis , S. pneumoniae , HeLa, A549, MDAMB, SK-BR-3, OVCAR, PC3, PC12, HEK293, Jurkat, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, RAW264.7, 대식세포, 단핵구, 호중구, NK 세포(natural killer cell), 수지상세포(dendritic cell), MDSC(Myeloid-derived Suppressor Cell), 배아줄기세포, 중간엽줄기세포, 유도만능줄기세포(iPSC), 혈관내피세포, 표피세포, 간세포, 근육세포, 뼈세포, 섬유아세포, 연골세포, 신경세포, 곰팡이 세포, 및 기생충 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 편집용 조성물.
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