CN110732028B - 一种可限制激活CRISPR/Cas13a的双锁纳米粒子的制备方法和应用 - Google Patents

一种可限制激活CRISPR/Cas13a的双锁纳米粒子的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种可限制激活CRISPR/Cas13a的双锁纳米粒子的制备方法和应用，这种纳米颗粒(DLNP)只能在肿瘤组织中限制CRISPR/Cas13a的激活，以进行有效的癌症免疫治疗。DLNP设计为核‑壳结构，其中CRISPR/Cas13a封装在核内，被一层双响应聚合物网络覆盖。在聚乙二醇外壳的保护作用下，DLNP表现出血液循环稳定性。在低pH和高H2O2的肿瘤微环境中，DLNP选择性将CRISPR/Cas13a释放。使用这种双锁纳米颗粒，在小鼠中观察到有效的肿瘤生长抑制作用，无明显副作用。由于CRISPR/Cas13a的临床应用主要受到不可控激活所带来毒副作用限制，因此这种双锁纳米粒子为精确控制CRISPR/Cas13a的激活及在有效癌症治疗中的应用提供了一种可行的方法。

Description

一种可限制激活CRISPR/Cas13a的双锁纳米粒子的制备方法 和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种可限制激活CRISPR/Cas13a的双锁纳米粒子的制备方法和应用。
背景技术
癌症的特征是多种遗传改变或突变所引起的异常代谢和增殖。肿瘤细胞在药物代谢过程的基因突变或药物靶点的修复可引起细胞对传统疗法的耐受。最近，一种新型的簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关酶(Cas)，Cas13a(以前称为C2c2)被鉴定为RNA导向的靶向RNA的CRISPR效应子。Cas13a/CRISPR RNA(crRNA)复合物在靶标目的RNA后同样会激活一般的RNase活性，导致细胞RNA的非特异性裂解，并最终导致程序性细胞死亡或休眠(即“附带效应”)。这种独特的“附带效应”自动绕过了实体瘤对传统疗法的复杂耐药性和逃逸机制，从而使CRISPR/Cas13a系统成为癌症治疗的理想治疗剂，具有降低有效剂量和最小化的耐药性的潜能。
但是，这种“附带效应”并不是专门针对肿瘤细胞的，因为一旦任何细胞的RNA达到与Cas13a/crRNA复合物的互补结合，它就可以被激活。当全身施用基于CRISPR/Cas13a系统的药物时，可能会导致与肿瘤以外的组织中不希望的细胞死亡有关的安全性问题。因此，仅在肿瘤细胞中限制CRISPR/Cas13a系统激活的可行策略对于基于CRISPR/Cas13a的药物在癌症治疗中的安全应用至关重要。为了实现对体内CRISPR/Cas13a激活的精确控制，将基于CRISPR/Cas13a的试剂特异地递送到肿瘤组织中至关重要。肿瘤微环境(TME)，特别是酸性微环境(pHe)，是实体瘤的典型特征。基于这一特征，已经成功开发了几种pH响应性非病毒载体(包括无机纳米颗粒和聚合物)来递送CRISPR系统。但是，某些酸性细胞器或其他外部酸性刺激也可能触发CRISPR/Cas13a激活，从而导致潜在的安全问题和严重的副作用。因此，需要更加精确控制的CRISPR/Cas13a激活策略，该策略不通过对酸性微环境单一性响应来实现对CRISPR/Cas13a系统的释放。过表达的活性氧(ROS)，特别是过氧化氢(H2O2)是肿瘤的另一个特征，它不仅在肿瘤的发生中起着独特的作用，而且还影响细胞DNA突变和肿瘤的进展。pHe和H2O2的结合可以有效地区分肿瘤组织和正常组织。因此，响应pHe和H2O2浓度释放有效载荷的载体在CRISPR/Cas13a系统的递送中应该是理想的，这将为CRISPR/Cas13a的激活提供空前的控制。
发明内容
本发明目的是解决CRISPR/Cas13a系统临床应用过程中所伴随的严重毒副作用的问题，提供一种可限制激活CRISPR/Cas13a系统的双锁纳米粒子(DLNP)的制备方法和应用。
DLNP具有核-壳结构，其中CRISPR/Cas13a系统封装在核内，并具有一层双响应聚合物网络。在血液循环或正常组织中，此类聚合物层可赋予DLNP带负电荷的聚乙二醇化表面，从而有效维持其循环稳定性，并通过抑制DLNP的细胞吸收来阻止CRISPR/Cas13a活化。到达肿瘤微环境后，聚合物层将降解为阳离子聚合物，从而促进CRISPR/Cas13a系统的细胞内在化和基因编辑的激活。类似于只能同时打开两个锁的双锁保险箱，DLNP只能在同时存在低pH值和高H2O2浓度的微环境中释放CRISPR/Cas13a系统。DLNP的这种独特特征可以改善CRISPR/Cas13a系统的积累，并增强其在肿瘤部位的基因编辑效率。此外，它还可以通过避免正常组织的意外激活来帮助降低基于CRISPR/Cas13a的癌症治疗的副作用。在这项研究中，选择了在免疫逃逸中起着至关重要作用的PD-L1作为靶点。在CRISPR/Cas13a激活的精准控制下，DLNP成功地积聚到肿瘤中并诱导了PD-L1阳性肿瘤细胞的死亡，并通过对免疫抑制性肿瘤微环境(TME)进行调控而引起了T细胞介导的抗肿瘤免疫的有效激活。
本发明的技术方案：
一种可限制激活CRISPR/Cas13a系统的双锁纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
1)PEI1.8k-HPBA/pDNA的合成，
以40的N/P比将编码CRISPR/Cas13a系统的质粒DNA(pDNA)与4-(羟甲基)苯基硼酸(HPBA)修饰的聚乙烯亚胺(PEI1.8k-HPBA)混合以形成多聚体PEI1.8k-HPBA/pDNA。
2)双锁纳米粒子DLNP的制备，
将步骤1)合成的PEI1.8k-HPBA/pDNA与顺式乌头酸酐(CA)和葡庚糖酸钠脱水物(SGD)改性的聚(乙二醇)-b-聚赖氨酸(mPEG113-b-Plys/SGD/CA)按质量比1:10混合，获得双锁纳米粒子DLNP。
进一步的，步骤1)PEI1.8k-HPBA/pDNA的具体合成方法是：
首先将4-(羟甲基)苯基硼酸频哪醇酯与羰二咪唑(CDI)以摩尔比1:1.9溶解在超干二氯甲烷(DCM)中室温反应1h。随后将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并用去离子水洗涤；有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到CDI活化的频哪醇硼酸酯；然后将PEI1.8k溶解于超干DCM中的溶液中，依次加入CDI活化的频哪醇硼酸酯和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，并在室温下搅拌2h；在室温下，用0.05N的盐酸溶液透析48小时，冻干得PEI1.8k-HPBA；
然后将PEI1.8k-HPBA溶解于10mM磷酸盐缓冲液中(PBS)配置1mg/ml的溶液，以40的N/P比将编码CRISPR/Cas13a系统的质粒DNA(pDNA)与PEI1.8k-HPBA混合以形成多聚体PEI1.8k-HPBA/pDNA。
进一步的，步骤2)双锁纳米粒子DLNP的具体制备方法是：
首先将苄氧羰基-L-赖氨酸与三光气于四氢呋喃(THF)中在60℃下搅拌反应2h以制备苄氧羰基-L-赖氨酸酐Lys(Z)-NCA。随后将Lys(Z)-NCA与甲氧基封端，分子量为5000，末端为伯氨的聚乙二醇(mPEG113-NH2)以摩尔比1:150，溶解于N,N二甲基甲酰胺中。将反应混合物在35℃干燥氩气气氛下搅拌3天，然后在减压下蒸发溶剂，将得到的产物溶解在15ml的三氯甲烷中，然后沉淀到过量的冰乙醚中以获得mPEG-b-PLys(Z)；通过向mPEG-b-PLys(Z)溶液中添加氢溴酸将mPEG-b-PLys(Z)中的Z基团脱保护；用冷乙醚沉淀后，将产物重新溶解在DMF中，并通过0.22μm的Millipore过滤器过滤而纯化；将滤液在过量的乙醚中沉淀，以除去残留的CF3COOH，得到mPEG113-b-PLys，收率60％；然后将产物在室温下真空干燥；
接下来用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于4℃下对葡萄糖庚酸钠(SGD)进行活化，2h后将活化的SGD添加到上述制备的mPEG113-b-PLys溶液中并于4℃反应8h，然后用蒸馏水渗析并冷冻干燥，冻干获得mPEG113-b-PLys/SGD；
随后将mPEG113-b-Plys/SGD溶解在碳酸氢钠缓冲液(pH 8.5，200mM)中得到10mg/mL的溶液；同时，将顺乌头酸酐(CA)溶解在无水DMSO中，得到200mg/mL的母液，然后逐滴添加到mPEG113-b-Plys/SGD中；反应期间，使用200mM Na2CO3将溶液的pH值保持在8.0-8.5的范围内；反应后，通过透析除去未反应的CA，冻干获得mPEG113-b-PLys/SGD/CA；
最后将PEI1.8k-HPBA/pDNA与mPEG113-b-PLys/SGD5/CA按质量比1:10混合，获得DLNP。
一种可限制激活CRISPR/Cas13a系统的双锁纳米粒子的应用，包括以下方面：
1)双锁纳米粒子在pHe/H2O2共存下限制激活CRISRP/Cas13a系统的应用；
2)双锁纳米粒子在细胞摄取和基因转染方面的应用；
3)双锁纳米粒子在细胞RNA切割和肿瘤细胞杀伤方面的应用；
4)双锁纳米粒子在小鼠中靶向肿瘤组织的应用；
5)双锁纳米粒子在增强T细胞活性，T细胞浸润及抑制肿瘤生长方面的应用。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供的此纳米粒子DLNP被设计为核-壳结构，其中CRISPR/Cas13a系统封装在核内，并具有一层双响应聚合物网络。有了基于PEG的聚合物外壳涂层，DLNP能够在血液中保持优异的血液循环稳定性。DLNP只能在同时存在低pH和高H2O2浓度的肿瘤微环境中释放CRISPR/Cas13a系统，能够显著降低CRISPR/Cas13a系统的毒副作用。使用这种双锁纳米颗粒，在小鼠中观察到有效的肿瘤生长抑制作用。而这种双锁纳米粒子制备简单，易于操作，成本较低，极易于推广应用。
附图说明
图1为双锁纳米粒子功能示意图。
图2为双锁纳米粒子的制备及pHe/H2O2双响应性，其中，a为双锁纳米粒子DLNP的制备示意图，b为DLNP的粒径和电镜，c为DLNP及对照组pH-NP，H2O2-NP在不同条件下的表面电位，d为DLNP及对照组pH-NP，H2O2-NP在不同条件下的蛋白吸附比例，e为DLNP及对照组pH-NP，H2O2-NP在不同条件下的荧光谱图，f为DLNP及对照组pH-NP，H2O2-NP在不同条件下的细胞摄取平均荧光强度，g为DLNP及对照组pH-NP，H2O2-NP在不同条件下细胞摄取的激光共聚焦图，h为DLNP在不同条件下的细胞转染图。
图3为双锁纳米粒子诱导细胞RNA切割和肿瘤细胞杀伤，其中，a为DLNP处理后的B16F10肿瘤细胞的RNA条带，b为DLNP处理后的GL261肿瘤细胞的RNA条带，c为DLNP处理后的4T1肿瘤细胞的RNA条带，d为DLNP在不同条件下处理后的B16F10细胞的细胞凋亡图，e为DLNP在不同条件下处理后的GL261和4T1细胞的细胞凋亡图。
图4为双锁纳米粒子在肿瘤部位的富集和滞留活体成像图。
图5为双锁纳米粒子增强T细胞活性，T细胞浸润及抑制肿瘤生长，其中，a为DLNP及对照组pH-NP，H2O2-NP治疗后的小鼠肿瘤生长曲线，b为DLNP及对照组pH-NP，H2O2-NP治疗后的小鼠生存曲线，c为DLNP及对照组pH-NP，H2O2-NP治疗后的小鼠体重，d为DLNP治疗后的正常小鼠及CD8删除小鼠肿瘤生长曲线，e为DLNP治疗后的正常小鼠及CD8删除小鼠生存曲线，f为DLNP治疗后的正常小鼠及CD8删除小鼠体重，g为DLNP治疗后的PD-L1阳性的B16F10肿瘤和PD-L1阴性的4T1肿瘤生长曲线，h为DLNP治疗后PD-L1阳性的B16F10肿瘤和PD-L1阴性的4T1肿瘤的CD4和CD8流式图。
具体实施方式
以下通过非限定性实例进一步详细说明本发明。
实施例1：
附图1示出了本发明双锁纳米粒子功能示意图，本发明方法制备的双锁纳米粒子的粒径为128.9±13.93nm。DLNP能够在血液中保持优异的血液循环稳定性。DLNP只能在同时存在低pH和高H2O2浓度的肿瘤微环境中释放CRISPR/Cas13a系统，能够显著降低CRISPR/Cas13a系统的毒副作用。
参见附图1，本发明限制激活CRISPR/Cas13a系统的双锁纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
1)PEI1.8k-HPBA/pDNA的合成，
将预先制备的PEI1.8k-HPBA2.0溶解于10mM磷酸盐缓冲液中(PBS)配置1mg/ml的溶液，以40的N/P比将编码CRISPR/Cas13a系统的质粒DNA(pDNA)与PEI1.8k-HPBA混合以形成多聚体PEI1.8k-HPBA/pDNA。具体步骤如下：
首先将4-(羟甲基)苯基硼酸频哪醇酯与羰二咪唑(CDI)以摩尔比1:1.9溶解在50mL超干二氯甲烷(DCM)中室温反应1h。随后将反应混合物用30mL乙酸乙酯稀释，并用去离子水洗涤；有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到CDI活化的频哪醇硼酸酯；然后将PEI1.8k溶解于8mL超干DCM中的溶液中，依次加入CDI活化的频哪醇硼酸酯和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，并在室温下搅拌2h；在室温下，用0.05N的盐酸溶液透析48小时，冻干得PEI1.8k-HPBA；
然后将PEI1.8k-HPBA溶解于10mM磷酸盐缓冲液中(PBS)配置1mg/ml的溶液，以40的N/P比将编码CRISPR/Cas13a系统的质粒DNA(pDNA)与PEI1.8k-HPBA混合以形成多聚体PEI1.8k-HPBA/pDNA。
2)双锁纳米粒子DLNP的制备，
将预制备的mPEG113-b-PLys/SGD/CA溶解于50mM，pH 8.5的碳酸氢钠缓冲液中配置1mg/ml的溶液，以1:10的质量比与PEI1.8k-HPBA/pDNA混合，获得DLNP。具体制备步骤如下：
首先将苄氧羰基-L-赖氨酸与三光气于四氢呋喃(THF)中在60℃下搅拌反应2h以制备苄氧羰基-L-赖氨酸酐Lys(Z)-NCA。随后将Lys(Z)-NCA与甲氧基封端，分子量为5000，末端为伯氨的聚乙二醇(mPEG113-NH2)以摩尔比1:150，溶解于N,N二甲基甲酰胺中。将反应混合物在35℃干燥氩气气氛下搅拌3天，然后在减压下蒸发溶剂，将得到的产物溶解在15ml的三氯甲烷中，然后沉淀到过量的冰乙醚中以获得mPEG-b-PLys(Z)；通过向20mL的mPEG-b-PLys(Z)(2.0g)溶液中添加氢溴酸将mPEG-b-PLys(Z)中的Z基团脱保护；用冷乙醚沉淀后，将产物重新溶解在DMF中，并通过0.22μm的Millipore过滤器过滤而纯化；将滤液在过量的乙醚中沉淀，以除去残留的CF3COOH，得到mPEG113-b-PLys，收率60％；然后将产物在室温下真空干燥；
接下来用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于4℃下对葡萄糖庚酸钠(SGD)进行活化，2h后将活化的SGD添加到上述制备的mPEG113-b-PLys溶液中并于4℃反应8h，然后用蒸馏水渗析并冷冻干燥，冻干获得mPEG113-b-PLys/SGD；
随后将mPEG113-b-Plys/SGD溶解在碳酸氢钠缓冲液(pH 8.5，200mM)中得到10mg/mL的溶液；同时，将顺乌头酸酐(CA)溶解在无水DMSO中，得到200mg/mL的母液，然后逐滴添加到mPEG113-b-Plys/SGD中；反应期间，使用200mM Na2CO3将溶液的pH值保持在8.0-8.5的范围内；反应后，通过透析除去未反应的CA，冻干获得mPEG113-b-PLys/SGD/CA；
最后将PEI1.8k-HPBA/pDNA与mPEG113-b-PLys/SGD/CA按质量比1:10混合，获得DLNP。
本发明方法制备的可限制激活CRISPR/Cas13a系统的双锁纳米粒子具有以下几方面的应用：
1)双锁纳米粒子在pHe/H2O2共存下限制激活CRISRP/Cas13a系统的应用；
2)双锁纳米粒子在细胞摄取和基因转染方面的应用；
3)双锁纳米粒子在细胞RNA切割和肿瘤细胞杀伤方面的应用；
4)双锁纳米粒子在小鼠中靶向肿瘤组织的应用；
5)双锁纳米粒子在增强T细胞活性，T细胞浸润及抑制肿瘤生长方面的应用。
实施例2：观察双锁纳米粒子在pHe/H2O2双响应性方面的应用。
为了更好地评价DLNP的pHe/H2O2双响应性，按照与DLNP类似的方法制备了两种类型的对比纳米颗粒，即非pH但H2O2响应纳米颗粒(表示为H2O2-NP)和非H2O2但pH响应纳米颗粒(表示为pH-NP)。
为了进行zeta电位分析，首先将pDNA，PEI1.8k-HPBA/pDNA，DLNP，H2O2-NP和pH-NP(50μg/mL pDNA，2mL)在37℃的不同条件下(pH 7.4，pH 7.4/H2O2，pH 6.8，pH 6.8/H2O2)孵育8小时。然后通过离心超滤将培养液与PBS(10mM，7.4)交换，随后进行zeta电位测试。
对于非特异性蛋白质吸附分析，首先将pDNA，PEI1.8k-HPBA/pDNA，DLNP，H2O2-NP和pH-NP(50μg/mL pDNA，2mL)在37℃下于不同条件(pH 7.4，pH 7.4/H2O2，pH 6.8，pH 6.8/H2O2)孵育8小时。然后通过离心超滤将培养液与PBS(10mM，7.4)交换。随后，将这些样品与相同体积的FBS(10％，v/v)溶液混合，并在37℃下孵育60分钟。孵育后，将所有溶液过滤并通过离心过滤(MWCO＝300kDa)用PBS洗涤5次，以去除未吸收的FBS蛋白。收集流出物并调节至相同体积，然后使用BCA测定法测量每个样品的FBS浓度。根据以下公式计算FBS在纳米颗粒上的吸附：
Figure BDA0002256981830000071
对于FRET分析，首先根据制造商的说明制备Cy3-PEI1.8k-HPBA，Cy3-PEI1.8k-PBA，Cy5-mPEG113-b-PLys/SGD/CA和Cy5-mPEG113-b-PLys/SGD/SA。随后，使用这些荧光标记的聚合物制备PEI1.8k-HPBA/pDNA，PEI1.8k-PBA/pDNA，DLNP，H2O2-NP和pH-NP，然后在不同条件下(pH 7.4，pH 7.4/H2O2，pH 6.8，pH 6.8/H2O2)。孵育后，在那些样品和PBS之间进行缓冲液交换实验，然后在515nm的激发波长下测量荧光发射光谱。
实验结果如图2所示：双锁纳米粒子同对照组相比，在pHe/H2O2下zeta电位是最高的，蛋白吸附量是最高的，FRET效率也是最高的。表明DLNP相比pH-NP和H2O2-NP的pHe/H2O2双响应性能更好。
实施例3：观察双锁纳米粒子在细胞摄取和基因转染方面的应用
为了进行CLSM观察，在与纳米颗粒共培养之前，将U87细胞以每孔1×105个细胞的密度播种在35mm共聚焦培养皿(Ф＝15mm)中孵育一天。然后将相同量的YOYO-1标记的DLNP，H2O2-NP和pH-NP(1μg pDNA)添加到细胞中，并在完全培养基中在不同条件下(pH 7.4，pH 7.4/H2O2，pH 6.8，pH 6.8/H2O2)培养2小时。随后，将细胞用冰冷的PBS冲洗，并在室温下用新鲜的4％多聚甲醛固定15分钟。根据制造商提供的方案，对细胞核用DAPI进一步染色，用罗丹明鬼笔环肽对细胞肌动蛋白进行染色。CLSM图像是在Olympus CLSM上以×60的物镜拍摄的。
对于基于FACS的测定，在与纳米颗粒共培养之前，将U87细胞以每孔1×105个细胞的密度播种到6孔板中一天。然后将相同量的YOYO-1标记的DLNP，H2O2-NP和pH-NP(3μgpDNA)添加到细胞中，并在完全培养基中在不同条件下(pH 7.4，pH 7.4/H2O2，pH 6.8，pH6.8/H2O2)孵育2小时。胰蛋白酶消化并离心后，收集细胞并重悬于冷PBS中，然后用新鲜的4％多聚甲醛固定以进行流式细胞术分析。
为了评估DLNP，H2O2-NP和pH-NP在不同条件下(pH 7.4，pH 7.4/H2O2，pH 6.8，pH6.8/H2O2)的转染效率，采用编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的pDNA作为转染效率。用于转染研究的报告基因。在转染实验之前，将U87细胞以每孔2×104个细胞的密度接种到24孔板中一天。然后将相同量的DLNP，H2O2-NP和pH-NP(1μg pDNA)添加到细胞中，并在不同条件(pH 7.4，pH 7.4/H2O2，pH 6.8，pH 6.8/H2O2)孵育8小时，随后将培养基替换为0.5mL含10％FBS(v/v)的新鲜培养基，再培养48小时。将PEI25k/pDNA复合物用作阳性对照。实验结束时，将细胞用PBS冲洗。通过荧光显微镜(CX41，Olympus)观察到EGFP的表达。
实验结果如图2所示：双锁纳米粒子同对照组相比，在pHe/H2O2下的细胞摄取能力最强，基因转染效率最高。
实施例4：为双锁纳米粒子诱导肿瘤细胞死亡方面的应用。
将B16F10细胞以每孔5×104个细胞的密度接种到6孔板中一天。然后将等量的DLNP，H2O2-NP和pH-NP(3μg pDNA，Cas13a/cr#2＝1/1，m/m)添加到细胞中，并在完全培养基中于不同条件下培养(pH 7.4，pH 7.4/H2O2，pH 6.8，pH 6.8/H2O2)。孵育24小时后，将培养基替换为1.5mL含10％FBS(v/v)的新鲜培养基，再培养36h。然后收集处理过的细胞并在TRIzol试剂中裂解以获得总RNA。提取的RNA浓度通过Nanodrop(Thermo Scientific，美国)测定，并调整为100ng/μL。为了进行RNA变性凝胶电泳分析，首先将9μL RNA与1μL×10上样缓冲液混合，然后涡旋并离心，得到均匀的RNA混合物。之后，将混合物加载到1.0％琼脂糖凝胶的每个孔中，并在120V的恒定电压下运行25分钟。使用G：BOX F3凝胶成像系统分析RNA条带。
在暴露于纳米颗粒之前，将小鼠乳腺癌细胞4T1和小鼠胶质瘤细胞GL261以每孔5×104个细胞的密度接种到6孔板中培养一天。然后将新鲜制备的DLNP加入细胞中，并在不同条件(pH 7.4和pH 6.8/H2O2)下的完全培养基中孵育。孵育24小时后，将培养基替换为1.5mL含10％FBS(v/v)的新鲜培养基，再培养36h。然后收集细胞并在TRIzol试剂中裂解以获得总RNA。对RNA变性凝胶分析进行了类似的步骤。
对于DLNP的体外抗肿瘤研究，首先将细胞以每孔2×103个细胞的密度播种到96孔板中一天。然后将新鲜制备的DLNP(pcr#2)，DLNP(pCas13a)，DLNP，H2O2-NP和pH-NP(200ngpDNA/孔)添加到细胞中，并在不同条件下(pH 7.4，pH 7.4/H2O2，pH 6.8，pH 6.8/H2O2)。孵育24小时后，将培养基换成含有10％FBS(v/v)的新鲜培养基，再培养36小时。进行类似的程序进行细胞活力测定。
实验结果如图3所示：双锁纳米粒子同对照组相比，在pH 6.8/H2O2下，B16F10和GL261细胞中，存活率最低，且有明显的RNA切割。表明双锁纳米粒子pHe/H2O2的双特异性。
实施例5：双锁纳米粒子在小鼠中靶向肿瘤组织的应用；
为了研究DLNP的肿瘤富集能力，从中国医学科学院癌研究所的动物中心购买了6周龄的雌性C57BL/6小鼠。将1×106B16F10肿瘤细胞皮下注射到小鼠的右腹已建立黑色素荷瘤小鼠模型。七天后，将小鼠随机分为四组，并静脉注射200μL TOTO-3标记的PEI25k/pDNA复合物，DLNP，H2O2-NP和pH-NP(10μg pDNA)。注射后1小时，12小时和24小时对纳米颗粒的体内分布进行成像。
实验结果如图4所示：PEI25k/pDNA处理的小鼠中的荧光信号主要分布在肝脏中，并且在注射后24小时内在肿瘤组织中观察到的信号可忽略不计，这表明PEI25k/pDNA没有有效地到达肿瘤而是被肝脏迅速清除。相反，经pH-NP，H2O2-NP和DLNP处理的小鼠的肿瘤部位的荧光强度随时间增加，并在注射后12h达到最大值，表明pH-NP，H2O2-NP和DLNP可以有效逃避清除，并通过增强的通透性和保留(EPR)效应积聚在肿瘤中。更重要的是，24小时后只有DLNP处理的小鼠肿瘤中能观察到荧光信号，这表明DLNP在肿瘤组织中具有出色的富集和滞留能力。
实施例6：双锁纳米粒子在增强T细胞活性，T细胞浸润及抑制肿瘤生长方面的应用。
为了研究DLNP在体内抑制肿瘤生长的能力，从中国医学科学院癌研究所的动物中心购买了第6周的雌性C57BL/6小鼠。将1×106B16F10肿瘤细胞皮下注射到小鼠的右腹(体积达到40-50mm3)，PBS，PEI25k/pDNA，DLNP/pCas13a-Null(表示为Null，每剂10μg Cas13apDNA，未加载cr#2)，DLNP，H2O2-NP和pH-NP(所有干预措施每剂量均含10μg pDNA，Cas13a/cr#2＝1/1，m/m)通过尾静脉注射施用于小鼠。为了建立CD8+T细胞耗竭模型，在实验期间每3-4天腹膜内注射每剂量300μg CD8a抗体(克隆：2.43，BioXcell，美国)。对于B16F10/4T1共负载模型，将4T1细胞(PD-L1阴性)预先接种在雌性C57BL/6小鼠的右侧腹中。接种4T1后7天，然后将B16F10(PD-L1阳性)细胞接种在左侧。B16F10接种后再过7天，对共生小鼠每3天静脉注射DLNP和PBS，持续16天。使用游标卡尺测量肿瘤，计算体积(V)为V＝d2×D/2，其中d为最短直径，D为最长直径，单位为mm。为了评估潜在的毒性，监测小鼠的体重减轻。当表现出健康受损的迹象或肿瘤体积超过2cm3时，对动物实施安乐死。
实验结果如图5所示：双锁纳米粒子具有明显的抑制肿瘤生长的效果，通过建立CD8+ T细胞耗竭模型，证明DLNP在体内抑制肿瘤生长的机制。4T1/B16F10共负载模型进一步证明了DLNP的PD-L1特异性。

Claims (2)

1.一种可限制激活CRISPR/Cas13a的双锁纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
1)PEI1.8k-HPBA/pDNA的合成，
以40的N/P比将编码CRISPR/Cas13a系统的质粒DNA与4-(羟甲基)苯基硼酸HPBA修饰的聚乙烯亚胺PEI1.8k-HPBA混合以形成多聚体PEI1.8k-HPBA/pDNA；
具体合成步骤如下：
首先将4-(羟甲基)苯基硼酸频哪醇酯与羰二咪唑CDI以摩尔比1:1.9溶解在超干二氯甲烷DCM中室温反应1h；随后将反应混合物用乙酸乙酯稀释，并用去离子水洗涤；有机相经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到CDI活化的频哪醇硼酸酯；然后将PEI1.8k溶解于超干DCM中的溶液中，依次加入CDI活化的频哪醇硼酸酯和4-二甲氨基吡啶DMAP，并在室温下搅拌2h；在室温下，用0.05N的盐酸溶液透析48小时，冻干得PEI1.8k-HPBA；
然后将PEI1.8k-HPBA溶解于10mM磷酸盐缓冲液PBS中配置1mg/ml的溶液，以40的N/P比将编码CRISPR/Cas13a系统的质粒DNA与PEI1.8k-HPBA混合以形成多聚体PEI1.8k-HPBA/pDNA；
2)双锁纳米粒子DLNP的制备，
将步骤1)合成的PEI1.8k-HPBA/pDNA与顺式乌头酸酐CA和葡庚糖酸钠脱水物SGD改性的聚(乙二醇)-b-聚赖氨酸mPEG113-b-Plys/SGD/CA按质量比1:10混合，获得双锁纳米粒子DLNP；
具体制备方法是：
首先将苄氧羰基-L-赖氨酸与三光气于四氢呋喃THF中在60℃下搅拌反应2h以制备苄氧羰基-L-赖氨酸酐Lys(Z)-NCA；随后将Lys(Z)-NCA与甲氧基封端，分子量为5000，末端为伯氨的聚乙二醇mPEG113-NH2以摩尔比1:150，溶解于N,N二甲基甲酰胺中；将反应混合物在35℃干燥氩气气氛下搅拌3天，然后在减压下蒸发溶剂，将得到的产物溶解在15ml的三氯甲烷中，然后沉淀到过量的冰乙醚中以获得mPEG-b-PLys(Z)；通过向mPEG-b-PLys(Z)溶液中添加氢溴酸将mPEG-b-PLys(Z)中的Z基团脱保护；用冷乙醚沉淀后，将产物重新溶解在DMF中，并通过0.22μm的Millipore过滤器过滤而纯化；将滤液在过量的乙醚中沉淀，得到mPEG113-b-PLys，收率60％；然后将产物在室温下真空干燥；
接下来用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS于4℃下对葡萄糖庚酸钠SGD进行活化，2h后将活化的SGD添加到上述制备的mPEG113-b-PLys溶液中并于4℃反应8h，然后用蒸馏水渗析并冷冻干燥，冻干获得mPEG113-b-PLys/SGD；
随后将mPEG113-b-Plys/SGD溶解在碳酸氢钠缓冲液中得到10mg/mL的溶液；同时，将顺乌头酸酐CA溶解在无水DMSO中，得到200mg/mL的母液，然后逐滴添加到mPEG113-b-Plys/SGD中；反应期间，使用200mM Na2CO3将溶液的pH值保持在8.0-8.5的范围内；反应后，通过透析除去未反应的CA，冻干获得mPEG113-b-PLys/SGD/CA；
最后将PEI1.8k-HPBA/pDNA与mPEG113-b-PLys/SGD/CA按质量比1:10混合，获得DLNP。
2.一种权利要求1所述方法制备的可限制激活CRISPR/Cas13a系统的双锁纳米粒子的应用，其特征是包括以下方面：
1)双锁纳米粒子在pHe/H2O2共存下限制激活CRISRP/Cas13a系统的应用；
2)双锁纳米粒子在细胞摄取和基因转染方面的应用；
3)双锁纳米粒子在非治疗目的的细胞RNA切割和肿瘤细胞杀伤方面的应用。
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