JP6298960B2

JP6298960B2 - 抗腫瘍活性のあるペプチド及びその用途

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Publication number: JP6298960B2
Application number: JP2016513206A
Authority: JP
Inventors: 周建▲偉▼; 徐▲進▼; 李▲シュエン▼; 李▲愛▼萍
Original assignee: 周建偉
Priority date: 2013-05-14
Filing date: 2014-02-24
Publication date: 2018-03-28
Anticipated expiration: 2034-02-24
Also published as: US20160068570A1; US9745345B2; EP2998312A1; JP2016520071A; EP2998312A4; CN103239710B; CN103239710A; WO2014183491A1; EP2998312B1

Description

本発明は、抗腫瘍活性のあるペプチド及びその用途に係り、抗腫瘍薬物研究開発及び応用技術分野に属する。

申請者の調査によりますと、癌は全世界で人類死亡を招く第二大病因になったことである。悪性腫瘍は人類健康に危害を及ぼす最も危険な疾病の一つであり、中国では、腫瘍による死亡率がすべての病因の中で第一位にランクされ、17.9%を占めていて、それに加えて、発病率が上昇の成り行きを示している。有効的な抗腫瘍薬物と方法を探し、癌を徹底に攻め落とすことは、全世界医学界における最も重要な研究課題の一である。

腫瘍の治療は、総合治療の原則を強調し、化学療法はその中の一つの重要な手段である。近年、抗癌剤の研究は急速な発展を遂げ、幾つかの新型抗癌剤が現れ、腫瘍発生・発展の異なる環節に働きかけ、腫瘍患者の生存期間を効果的に延長し、それに加えて、生活品質を向上した。しかし、これと同時に多くの問題が現れた。腫瘍の耐薬性が絶えず強化されているので、抗癌剤の投薬量も絶えずに増加し、人体に対する毒性・副作用も大きく強化された。現有の研究の結果、化学薬品の治療効果及び腫瘍細胞耐薬性の発生が皆細胞内の幾つかの遺伝子表現レベルと関わるのを発見した。細胞内の幾らかの遺伝子の表現を制御することは、腫瘍細胞の耐薬性の発生抑制に役立ち、それに、化学薬品の治療効果を大きく改善し、人体に対する薬物の毒性.副作用を削減し、患者の生存品質を向上し、これでより多い腫瘍患者に福音を齎すことができる。

JWA遺伝子、即ち、ARL6IP5遺伝子(GenBank:AF070523.1, 1998。 LOCUS: AF070523，NM_006407)は、本特許発明者周建偉等により、培養した初代人気管と気管支上皮細胞から分離され、全トランス型レチノイン酸(ATRA)により誘導される遺伝子であり、一種の新しい細胞骨格結合タンパク質をエンコードする。本特許発明者は、長年にわたって課題組の成員を導いてずっとJWA遺伝子構造、機能及び相互関係を巡って研究を行い、一連の独創的な意義のある研究成果を取得した。(1)JWA遺伝子によりエンコードされるJWA蛋白が一種の新型微小管関連蛋白(MAPs)であり、当該蛋白が、微小管蛋白α及びβ亜粒子と結びつくことができ、それに加えて、環境物理化学要素(例えば冷ショック、熱ショックとタクソール等)に対する応答の中で、微小管タンパク質α及びβ亜粒子と同期化する動力学的変化(重合又は解重合)を表すことを率先に証明して提出した。（2）JWAタンパク質が細胞有糸分裂プロセスに参加し、それに加えて、微小管の動力学的安定性調節に働きかけることを発見した。（3）JWAタンパク質がMAPK信号チャネル及びマイクロフィラメントの解重合・再構築を通じて腫瘍細胞遊走を調節することを発見した。腫瘍細胞遊走は、腫瘍浸潤及び転移の必要な条件であり、腫瘍細胞の遊走能力も転移潜在能力と関わることを発見した。本特許発明者は、研究を行った結果、尾静脈を通じてJWA遺伝子表現欠陥のある人又はマウス悪性黒色腫細胞(A375、B16F10)をマウス体内に注入した後、形成した肺転移病巣が無負荷（注入無し）ラットより有意に高かったことを発見した。一方、in vitro 試験モデルでも、JWA遺伝子表現欠陥のある悪性黒色腫細胞株において、その遊走、侵襲と粘着能力が担体対照細胞よりも有意に高かったことを発見した。後続更なる仕組み研究で、JWA遺伝子による腫瘍細胞転移関連複数の悪性表現型に対する影響は、核転写因子Sp1に対する負の調節を通じて、さらにintegrin α_Vβ₃信号チャネル分子の活性を抑制することによって実現したことを証明した。

現有のJWAタンパク質関連研究によりますと、JWA遺伝子表現から取得したJWAタンパク質が腫瘍細胞の粘着、浸潤、転移及び腫瘍血管成長の抑制等の機能を有し、JWA タンパク質の大規模生産がやらざるを得ないことが分かる。しかしながら、本特許発明者は、実践研究において、現在宿主表現システムを使用すると、純化されたJWAタンパク質を取得し難く、当該方法で純化されたJWAタンパク質でIn vitroと in vivo 試験を実施する際の実行可能性が悪いことを発見した。

その上、申請者が知るところによりますと、インテグリン (integrin) が、細胞膜表面に広範に存在する糖タンパク質受容体ファミリーの分子であり、主に細胞と細胞外基質 (ECM) 間及び細胞と細胞間の粘着を仲介することになる。インテグリン分子がα及びβサブユニットにより非共有結合を通じて接続・構成された二量体分子であり、異なるα及びβサブユニットの組み合わせによりリガンドの特異性を決める。その中で、integrinα_Vβ₃の機能が特に重要である。integrinα_Vβ₃が多くの悪性腫瘍細胞表面で表現が高まるが、正常組織で表現が低い又は表現がなく、それに加えて、リガンド分子の中のアルギニン-グリシン-アスパラギン酸配列(RGD)により特異的に識別されることができる。

作用標的が細胞内にある多くの生体高分子が役割を果たす先決条件が細胞膜を貫通して細胞内に入ることであるが、ただし、生体膜の生体障壁作用が多くの生体高分子の細胞内への進入を阻止し、これで大きな程度でこれらの物質の治療分野への応用を制限した。従って、どのようにこれらの物質を導いて細胞膜を貫通することは、切実に解決する必要がある難題である。伝統的な案内方法は、操作が複雑で且つ効率が低く、それに細胞毒性又は免疫原性を有する等の欠点を持っている。細胞膜貫通ペプチド(cell penetrating peptide, CPP)は、受容体依存又は非受容体依存方式でエンドサイトーシスを仲介する短鎖ペプチドである。CPPのこの特性により、これが有効な運送キャリアになり、細胞内に自身で細胞膜を貫通できない各種の高分子生物活性物質を運送し、生物治療に一種の斬新な且つ有力なツールを提供する。今までの研究は下記のことを示唆する。CPPは、体外又は体内で、タンパク質、ペプチド類、オリゴヌク、レオチド、DNAs、プラスミド及びリポソーム等のような一連の生物活性分子を導き、各種の異なる組織・細胞に進入させ、各自の生物学的効果を発揮させる。その膜貫通特性は、細胞内外物質の膜貫通運送の研究に使用されると同時に、この特性により、CPPが潜在的に有効な生体分子運送キャリアとして、腫瘍治療における役割を果たす。CPP技術の発展に連れて、我々が複製可能なクローン分子を使用することによって、潜在的な長期影響を引き起こすことを避け、これで小分子標的薬物の研究開発プロセスを大きく速めることになる。

本発明が解決したい技術問題は下記の通りである。既存の技術問題に対して、JWAタンパク質アミノ酸配列から選別鑑定で取得され、抗腫瘍活性のある一種のポリペプチドを提供すること。これと同時に、当ポリペプチドの抗腫瘍薬物製造の用途も提供すること。

本発明の技術的な概念は次のとおりである。本特許発明者は、研究を行った結果、人工合成又は宿主表現システムによるJWAタンパク質表現の方法で、純化されたJWAタンパク質でIn vitro 及び in vivoモデルにおいて検討された当該タンパク質の生物学的機能を実現し難いことを考えている。これは、JWAタンパク質構造の中で、三つの膜貫通区がある原因又は今分かっていないその他の原因によるものである。発明者の推測によりますと、JWAタンパク質の生物学的活性がその一次構造における若干の連続的なアミノ酸残基に構成された何らかのタンパク質ドメインにより決められる可能性があり、又はその一次構造において隣接しないが、高級構造において隣接している若干のアミノ酸残基により決められる可能性がある。この基礎の上に、発明者は、引き続き更なる実践研究を行った結果、抗腫瘍活性のあるJWA機能ポリペプチドを選別・鑑定した。

本発明がその技術問題を解決する技術案は下記の通りである。ポリペプチドのアミノ酸配列がＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶで示されるものであり、即ち、

Ｉ：FPGSDRF；

ＩＩ：X-FPGSDRF；

ＩＩＩ：FPGSDRF-Z；

ＩＶ：X-FPGSDRF-Z；

その中で、アミノ酸Sがリン酸化修飾を受け、XとZがそれぞれアミノ酸又はアミノ酸配列である。

XがF、(R)₉、(R)₉-F、6-アミノカプロン酸、6-アミノカプロン酸-F、6-アミノカプロン酸-(R)₉と6-アミノカプロン酸-(R)₉-Fの何れかである。

ZがA、(G)_n-RGDとA-(G)_n-RGDの何れかである（nが≧０の整数である）。

好ましくは、前記nの取り得る値の範囲が0-10であることである。

好ましくは、前記ポリペプチドのN末端がアセチル化修飾を受け、C末端がアミド化修飾を受けたことである。

本発明も下記の事項を提出した。前記ポリペプチドの抗腫瘍薬物製造の用途。

好ましくは、前記腫瘍が悪性黒色腫又は胃癌であることである。

本発明のポリペプチド配列が短いので、大規模生産を実現し易い。低い投薬量の条件の下で著しい抗腫瘍活性を表し、化学薬品と一緒に使用すると、三酸化ヒ素（As₂O₃， ATO）のような血行改善薬による腫瘍細胞に対する毒性を強化できる。本発明のポリペプチドペアは正常な組織・細胞に対して毒性を持っていないので、広い応用前景を持っている。

既知JWAタンパク質アミノ酸配列図である。下線部分は膜貫通区域であり、網掛け部は、最良の実施形態に関わるフラグメント部分である。その中で、各アルファベットが表すアミノ酸は下記の通りである。アラニンA、アルギニンR、アスパラギン酸D、グルタミンQ、グルタミン酸E、ヒスチジンH、イソロイシン酸I、グリシンG、アスパラギンN、ロイシンL、リジンK、メチオニンM、フェニルアラニンF、プロリンP、セリンS、スレオニンT、トリプトファンW、チロシンY、バリンV。本発明実施形態2における対照群とポリペプチドJWA-1（10 mg／kg）群の腫瘍形成対照図である。本発明実施形態2における腫瘍体積変化曲線図である。JWA1、JWA2及びJWA3は、それぞれ三つのJWA単一ペプチドを表し、pepは、三つのJWA単一ペプチドの同量な混合ペプチドを表す。矢印は、投薬時間を表し、＊はP＜0.05を表す。本発明実施形態2における腫瘍重量体重比の見取り図である。JWA1、JWA2及びJWA3は、それぞれ三つのJWA単一ペプチドを表し、pepは、三つのJWA単一ペプチドの同量な混合ペプチドを表す。＊は、P＜0.05 を示す。本発明実施形態2におけるマウス体重変化曲線図である。JWA1、JWA2及びJWA3は、それぞれ三つのJWA単一ペプチドを表し、pepは、三つのJWA単一ペプチドの同量な混合ペプチドを表す。本発明実施形態3における対照群、ナンセンス・ペプチド群とポリペプチドJWA-1（10 mg／kg）群の腫瘍形成対照図である。本発明実施形態3における腫瘍体積変化曲線図である。矢印は、投薬時間を表す。本発明実施形態3における腫瘍重量体重比の見取り図である。本発明実施形態3におけるマウス体重変化曲線図である。本発明実施形態4におけるナンセンス・ペプチド群、ポリペプチドJWA-1（10mg／kg）群、ポリペプチドJWA-4（10mg／kg）群、ポリペプチドJWA-5（10mg／kg）群とポリペプチドJWA-6（10mg／kg）群の腫瘍形成対照図である。本発明実施形態4における腫瘍体積変化曲線図である。矢印は、投薬時間を表し、＊はP＜0.05を表す。本発明実施形態4における腫瘍重量体重比の見取り図である。本発明実施形態4におけるマウス体重変化曲線図である。本発明実施形態5におけるナンセンス・ペプチド群、ポリペプチドJWA-6（50mg／kg）群、ポリペプチドJWA-6+RGD（10mg／kg）群とポリペプチドJWA-6+RGD（50mg／kg）群の腫瘍形成対照図である。本発明実施形態5における腫瘍体積変化曲線図である。矢印は、投薬時間を表す。本発明実施形態5における腫瘍重量体重比の見取り図である。本発明実施形態5におけるマウス体重変化曲線図である。本発明実施形態6における各ポリペプチドによるA375細胞に対する作用の24h結果図である。本発明実施形態6における各ポリペプチドによるA375細胞に対する作用の48h結果図である。本発明実施形態6における各ポリペプチドによるA375細胞に対する作用の72h結果図である。本発明実施形態6における各ポリペプチドによるB16細胞に対する作用の24h結果図である。本発明実施形態6における各ポリペプチドによるB16細胞に対する作用の48h結果図である。本発明実施形態6における各ポリペプチドによるB16細胞に対する作用の72h結果図である。本発明実施形態7における細胞の単独的なATO処理24h結果図である。＊＊はP＜0.01を表す。本発明実施形態7における細胞の単独的なATO処理48h結果図である。＊＊はP＜0.01を表す。本発明実施形態7におけるATO（0.5，1，2，5 μΜ）とポリペプチドJWA-1によるA375細胞に対する共同作用の24h結果図である。本発明実施形態7におけるATO（0.5，1，2 μΜ）とポリペプチドJWA-1によるA375細胞に対する共同作用の48h結果図である。本発明実施形態7におけるATO（1，2，5 μΜ）とポリペプチドJWA-6によるA375細胞に対する共同作用の24h結果図である。本発明実施形態7におけるATO（1，2 μΜ）とポリペプチドJWA-6によるA375細胞に対する共同作用の48h結果図である。本発明実施形態7において、WBでポリペプチドJWA-6単独によるA375細胞に対する処理状況及びATOと共同処理24h後のPARP1、caspase3表現状況図である。その中で、α-tublinが内部結合タンパク質である。本発明実施形態7において、WBでポリペプチドJWA-6単独によるB16細胞に対する処理状況及びATOと共同処理24h後のPARP1表現状況図である。その中で、α-tublinが内部結合タンパク質である。本発明実施形態8において、10 μM濃度の各CPP配列とJWA-6配列でSGC7901細胞に進入した後の蛍光強度の時間変化曲線である。本発明実施形態8において、異なる投薬量の各CPP配列とJWA-6配列でSGC7901細胞に3h働きかけて進入した後の蛍光強度の比較図である。本発明実施形態8において、異なる投薬量の各CPP配列でBGC803細胞に3h働きかけて進入した後の蛍光強度の比較図である。本発明実施形態8において、異なる投薬量の各CPP配列でHeLa細胞に3h働きかけて進入した後の蛍光強度の比較図である。本発明実施形態8において、異なる投薬量の各CPP配列でGES-1細胞に3h働きかけて進入した後の蛍光強度の比較図である。本発明実施形態9におけるフローサイトメトリーによる細胞アポトーシス測定結果図である。図37と対応する柱状グラフである。本発明実施形態9においてWBでPARP-1表現レベルを検定する結果図である。本発明実施形態9においてWBでアポトーシス関連分子を検定する変化図である。本発明実施形態9においてWBでPARP-1分子を検定する変化図である。

次に、具体的な実施形態と附図によって、さらに且つ詳細に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されない。

JWAタンパク質には、188アミノ酸が含まれていて、その具体的な配列図は図１で示すようである。本特許発明者は、JWAタンパク質の膜貫通区域以外の部分に対して、一連の無作為なポリペプチド配列フラグメントを設計し、それに現有の方法（例えばFmoc法等）で合成してから、選別及び鑑定を行う。下記の実施形態は、選別と鑑定プロセスに対する詳細な説明であり、活性のあるポリペプチドを除いて、幾つかの代表的な非活性ポリペプチドを選び、但し、研究プロセスがこれらのポリペプチドだけ係ることを表さない。

ポリペプチドの設計と合成

本実施形態で設計・合成したポリペプチドは、表1で示すようであり、その中で、JWA 1、JWA 2とJWA-3で選択したアミノ酸配列が図1での網掛け部と一致している。

実施形態1で設計・合成したポリペプチド配列

以上ポリペプチド配列は、合成時そのN末端でアセチル化修飾を行っても良く、それに加えて、C末端でアミド化修飾を行うことによって、ポリペプチドの快速分解を防止しても良い。

JWA-1、JWA-2、JWA-3で抗腫瘍活性のあるペプチドを選別する

対数成長期の人悪性黒色腫A375細胞を取り、無菌条件の下で5×10⁶／200μl細胞懸濁液に調製し、それぞれ200μlで各BALB／cの裸のマウス背側の皮下に接種する。電子ノギスで移植腫の長径と短径を測定する。下記の公式、即ち、腫瘍体積(TV)=1／2×長径×短径²で、腫瘍の大きさを計算する。腫瘍が約100mm³に成長した後、マウスを無作為にサブグループに分ける。

各グループのマウス腫瘍に、それぞれJWA-1、JWA-2 、JWA-3、及び三種のポリペプチドの等量な混合物Pepを注射し、採用する注射剤量がそれぞれ25mg／kgと10mg／kgである。陰性対照群に等量な無菌PBSを注射する。ポリペプチド注射群と対照群に対して、一日（48h）を置いて投薬し、連続に5回注射する。毎回投薬時にマウス体重及び腫瘍径を測定する。実験終止後マウスを殺してから腫瘍体を分離して腫瘍重量を測定する。

結果は、図2〜図5で示すようであり、対照群(PBS)と比べて、ペプチド JWA-1 10 mg／kg 処理群において裸のマウスの皮下腫瘍成長の抑制効果が一番著しく、それに加えて、腫瘍重量体重比も一番小さいであった(P＜0.05)。

その上、各群間マウス平均体重に統計学的差異がなく、それに、全体的な実験観察期間で、マウスの薬物毒性反応が見つからなかった。

悪性黒色腫は、一種の悪性程度が十分高い腫瘍であるが、本実施形態結果によりますと、10mg／kg投薬量のポリペプチドJWA-1の腫瘍内注射が人悪性黒色腫A375細胞の裸のマウスの異なる種の移植腫瘍成長を著しく抑制できることである。

ポリペプチドJWA-1が最も良い抗腫瘍効果を果たす投薬量を選別し、それに加えて、ポリペプチドのリン酸化有無による抗腫瘍作用に対する影響を検討する

本実施形態の目的は、JWAポリペプチドと腫瘍抑制との投薬量効果関係を明確にすることである。

本実施形態の中で、A375細胞BALB／c裸のマウス背側皮下の腫瘍接種操作方法は実施形態2と同じ。

それぞれ低投薬量(5mg／kg)、中投薬量(10mg／kg)と高投薬量(15mg／kg)のペプチドJWA-1を採用し、腫瘍内注射の方式で人悪性黒色腫A375細胞を接種した前記同バッチのBALB／c裸のマウスを処理する。これと同時に、無菌PBSを注射する陰性対照群及び10mg／kgノンセンス・ポリペプチド注射群と設立する（ノンセンス・プチド群又はnon-pepと略称し、所用ポリペプチドの配列がSEQ ID No：15：6-アミノ酢酸-EEMQRR、N末端でアセチル化修飾を行い、C末端でアミド化修飾を行う）。ノンセンス・ポリペプチド群を設立する目的は、JWAポリペプチドが特異性腫瘍抑制効果を有するか観察することである。

ポリペプチドJWA-1でのSリン酸化による抗腫瘍作用に対する影響を検証する為に、前記実験に未リン酸化のポリペプチドJWA-7注射群を追加し、投薬量為が10mg／kgである。

各群に一日を置いて投薬し、連続に5回注射する。これと同時にマウス体重と腫瘍径を測定する。実験終止後マウスを殺してから腫瘍体を分離して腫瘍重量を測定する。

結果は、図6〜図9で示すようであり、10mg／kgのポリペプチドJWA-1注射群が著しい腫瘍抑制効果を表し、但し、投薬量増加に連れて効果の強化成り行きが見つからず、低い投薬量5mg／kgのポリペプチドJWA-1の注射群効果が10mg／kg群の効果と相似していた。この非投薬量依存の原因を究明しなかったが、ペプチドJWA-1が裸のマウスでの移植腫瘍の成長を抑制できることを再度検証した。

一方、ノンセンス・ポリペプチド群（non-pep）、ポリペプチドJWA-7注射群は、皆腫瘍抑制効果を表さなかった。ポリペプチドJWA-7注射群の結果から見ますと、ポリペプチドJWA-1でのSリン酸化が当該ポリペプチドの抗腫瘍作用の必要な条件であることが分かった。後続研究で非リン酸化ポリペプチドの作用を考える必要がない。

ポリペプチドJWA-1選別の為の最も短い機能単位

本実施形態の目的は下記の通りである。ポリペプチドJWA-1が長さ短縮後相似する抗腫瘍効果を有しているか検討すること。

このために、本実施形態は、ポリペプチドJWA-4、JWA-5とJWA-6を採用し、これらのポリペプチドは、JWA-1の基礎の上にN、C両側からそれぞれ3、2、1個のアミノ酸を削減する。

それぞれ10mg／kgのポリペプチドJWA-1、JWA-4、JWA-5、JWA-6を採用して、人悪性黒色腫A375細胞を接種した前記同バッチのBALB／c裸のマウスを処理する。これと同時に、10mg／kgのノンセンス・ポリペプチド群を設立する（non-pep、所用ポリペプチドの配列が実施形態3と同じ）。

各群に一日を置いて投薬し、連続に腫瘍内で5回注射する。これと同時にマウス体重と腫瘍径を測定する。実験終止後マウスを殺してから腫瘍体を分離して腫瘍重量を測定する。

結果は、図10〜図13で示すようであり、ポリペプチドJWA-6は、ポリペプチドJWA-1と相似する腫瘍抑制効果、ひどいのになると、より良い腫瘍抑制効果を表す。但し、ポリペプチドJWA-4、JWA-5は、一定の効き目を有しているが、JWA-6より著しく低い。この結果から見ると、ポリペプチドJWA-6がポリペプチドJWA-1選別の為の最も短い機能単位であることが分かる。

ポリペプチドJWA-6を活性センターとし、それにintegrinα_Vβ₃を特異に識別する機能ポリペプチドを選別する

実施形態2〜4で、JWA機能ポリペプチドの腫瘍抑制効果が腫瘍内への直接的なポリペプチド注射の結果であることを観察した。薬物臨床応用時に腫瘍内の直接的な注射を実現し難いことを考えて、腹腔注射の方法に変更して、JWA機能ポリペプチドが相変わらず良好な腫瘍抑制効果を有するか観察する。

現有の技術によれば、integrinα_Vβ₃が、悪性黒色腫を含む多くの悪性腫瘍細胞表面で表現が高まるが、RGD 配列がintegrinα_Vβ₃を特異に識別できるので、本実施形態は、JWA-6の基礎の上に、腹腔注射方法で更にRGD配列が接続するポリペプチドの中から、腫瘍抑制作用のある機能ポリペプチドを選別する。

本実施形態で設計・合成したポリペプチドはJWA-6+RGDであり、その配列がSEQ ID No:8であり、即ち、6-アミノカプロン酸-FPGSDRF-GGGG-RGD、その中でアミノ酸Sがリン酸化修飾を受けた。その上、当該ポリペプチド配列は、合成時そのN末端でアセチル化修飾を行っても良く、それに加えて、C末端でアミド化修飾を行うことによって、ポリペプチドの快速分解を防止しても良い。

本実施形態の中で、腫瘍接種モデルは、重度免疫欠陥SEQ ID No:8マウスを選び、人悪性黒色腫A375皮下の腫瘍接種操作方法は実施形態2と同じ。移植腫瘍体積が約100mm³になった後、無作為にマウスをサブグループに分け、四つの処理群に分ける。

腹腔注射後腫瘍局所に到着するポリペプチド投薬量を考えて、本実施例は、この前の実施形態で使用した10mg／kgポリペプチドの基礎の上に、50mg／kg群を追加する。それに加えて、同様な50mg／kg投薬量の単純なJWA-6ポリペプチドを標的性腫瘍抑制効果とする対照群を設置し、その上に、50mg／kgノンセンス・ポリペプチド群でJWA機能ポリペプチドの特異性腫瘍抑制効果を比較する。

その後、それぞれ腹腔に、50mg／kgのポリペプチドJWA-6、10mg／kgのポリペプチドJWA-6+RGD、50mg／kgのペプチドJWA-6+RGD、50mg／kgのノンセンス・ポリペプチド（non-pep、所用ポリペプチドの配列が実施形態3と同じ）を注射する。各群に一日を置いて投薬し、連続に5回注射する。これと同時にマウス体重と腫瘍径を測定する。実験終止後マウスを殺してから腫瘍体を分離して腫瘍重量を測定する。

結果は、図14〜図17で示すようであり、腹腔内投与によって、50mg／kgのポリペプチドJWA-6、10mg／kgのポリペプチドJWA-6+RGDは皆一定の腫瘍抑制効果を示した。これと同時に、50mg／kgのポリペプチドJWA-6+RGDは著しい腫瘍抑制効果を示した。

その上、各群間マウス平均体重に統計学的差異がなく、それに、全体的な実験観察期間で、マウスのこの三種のポリペプチドに対する如何なる薬物毒性反応が見つからなかった。

本実施形態の中で、JWA-6とRGD配列の間に4 G（グリシン）を追加した。その目的は、腫瘍抑制活性のあるJWA-6ポリペプチドが、RGDの腫瘍細胞表面への結合後一定の自由活動スペースを持つようにすることである。これで、JWA-6ペプチドの生物学的効果を高めることである。本特許発明者は、研究を行った結果、JWA-6及びRGD配列の間に、Gの挿入数量が変化可能で、0以上であっても良いが、好ましくは10以下であることが分かる。

まず、RGD 配列を含む下記のポリペプチドを設計・合成する。

RGD配列を含むポリペプチド

この後、本実施形態前記方法で担癌マウスを取得し、それにサブグループに分けた後、七つの注射グループを設立し、それぞれ腹腔に、ポリペプチドJWA-6+RGD、JWA-6+RGD0、JWA-6+RGD1、JWA-6+RGD3、JWA-6+RGD7、JWA-6+RGD10、及びノンセンス・ポリペプチド（non-pep、所用ポリペプチドの配列が実施形態3と同じ）を注射し、投薬量が皆50mg／kg である。各群に一日を置いて投薬し、連続に5回注射する。これと同時にマウス体重と腫瘍径を測定する。第1回投薬の当日を第1日とし、それに12日で実験を終止し、マウスを殺してから腫瘍体を分離して腫瘍重量を測定する。

スペースの限りで、具体的な実験データをリストしていない。実験データにより、RGD配列とJWA-6の間のグリシン数量が0-10である場合、ポリペプチドの抗腫瘍活性に影響を与えないことが分かる。

ポリペプチドJWA-1、JWA-5、JWA-6によるin vitro実験における人悪性黒色腫A375細胞とマウス悪性黒色腫B16F10細胞活性に対する影響

本実施形態の目的は、JWA機能ポリペプチドによるin vitro実験における黒色腫細胞活性に対する影を検討することである。

対数成長期のB16-F10又はA375細胞を取り、5×10³個／穴の密度で96穴板に均一に接種し、24h壁貼り培養後、異なる投薬量（0、5、10、25、50μΜ）のポリペプチドJWA-1、JWA-5、JWA-6、又はノンセンス・ポリペプチド（non-pep、所用ポリペプチドの配列が実施形態3と同じ）に交換し、それぞれ24、48、72h細胞を処理する。観察時間が終止する時、96穴内の元の培養液を吸い取り、毎穴に、CCK-8試薬と新培養液体積比1：10の比例の混合液を入れ、2h后450nmで吸光値を測定し、未処理群と対比する百分比に換算する。各群に四つの平行サンプルを設置し、この実験を3回繰り返す。

結果は、図18〜図23で示すようであり、対照群と比較して単純なペプチドJWA-1、JWA-5、JWA-6の体外条件の下で、A375及びB16-F10という二種の細胞に作用した後、これらのペプチドによる細胞活性に及ぼす影響が見つからなかった。

ポリペプチドJWA-1、JWA-6によるAs₂O₃（ATO）と共同作用の下で、人悪性黒色腫A375細胞アポトーシスに対する影響

実施形態6の結果によりますと、単純JWA機能ポリペプチドで人悪性黒色腫A375細胞を処理すると、細胞毒性が発生しなかったことが分かる。in vivo試験の複雑性がin vitro実験と完全に同等していないことを考えた。本特許発明者がリードした課題組は前期研究を行った結果、JWA遺伝子がATOにより誘導されるアポトーシスで重要な調節効果を果たし、それに加えて、高表現JWA遺伝子がATOにより誘導される腫瘍細胞アポトーシスを著しく強化でき、その上、MAPK 信号チャネルがこれに参加しているのを考える。したがって、本実施形態の目的は下記の通りである。JWA機能ポリペプチドとATOとの共同応用により、ATOにより誘導される悪性黒色腫アポトーシスの効果を強化できるか検討すること。

まず、ATOでA375細胞を処理する際の投与量と時間を確定する。通常の方法で対数成長期にあるA375細胞を消化し、5×10³個／穴の密度で96穴板に均一に接種し、24h壁貼り培養後ATOに交換し、それぞれ以5、10、25、50μΜの投薬量で細胞に24、48h作用し、その結果、5μΜ ATOでA375細胞を24h処理した後、細胞活性が約40%下がったことが分かる(図24)。ATOの異なる投薬量で細胞を48h処理した後、細胞抑制率が100%(図25)位になったことが分かる。したがって、濃度が5μΜ以下であるATOで細胞を24h処理し、後続共同投薬の投薬量及び時間の参考とする。

ATOの細胞作用時間及び投薬量を確定した後、50、100、200、500μΜポリペプチドJWA-1、JWA-6及び0.5、1、2、5 μΜ ATOと共同にA375細胞を24と48h処理した後、細胞活性を検定した結果、JWA-1とATOとの相乗効果が見つからなかった(図26と27)。但し、ポリペプチドJWA-6とATOとの共同応用により、A375細胞に明らかな毒性を齎したのを発見した(図28と図29)。

これと同時に、ATOとポリペプチドJWA-6との共同作用によるアポトーシス関連タンパク質表現に対する影響を検定する。通常の方法で対数成長期にあるA375細胞を消化し、5×10⁵の細胞量で60mm細胞シャーレに均一に接種し、異なる投薬量のATOで単独に細胞を24h処理し、異なる投薬量のポリペプチドJWA-6と共同に細胞を24h処理した後、0.18ml RIPA(0.5% PMSFを含む)の細胞溶解物を入れてタンパク質を受け取り、12000gで15min遠心を行った後、上澄み液を取り、タンパク質濃度を測定し、それに加えて、タンパク質を煮る。検出した分子量の大きさによって、適当な濃度のボリアクリルアミドゲルを選んでタンパク質電気泳動を行い、穴毎に70μgタンパク質を入れ、電気泳動条件は、60V 30min、90V、1-1.5hとする。電気泳動完成後、半乾式転動方法で膜を転動し、タンパク質をゲルからPVDF膜に転送する。膜転動完了後、5%脱脂ミルクを常温の下で1-2h密封し、TBST （0.1% Tween20を含む）で3回膜を洗い、毎回5分間で、4℃の状況の下で相応な抗体を孵化して夜を過ごす。翌日で、TBST （0.1% Tween20を含む）で3回膜を洗い、毎回5分間で、室温で二次抗体を孵化し、TBST （0.1% Tween 20を含む）で8回膜を洗い、毎回5分間である。ECL発光液を滴加し、露光を行う。

Western Blotの実験検定結果によりますと、未処理群及び単独ATO応用群と比べて、ATOとポリペプチドJWA-6共同投薬群の中で、caspase3スプライセオソームとPARP1スプライセオソームが著しく増加した。ATOとポリペプチドJWA-6との共同作用の後、さらにアポトーシス仕組みを起動し、A375細胞のアポトーシスを促進することを示唆する(図30)。また、B16細胞においてPARP1変更も(図31)見つかった。

JWA機能ポリペプチドを携帯して細胞内に入らせる細胞貫通ペプチド（CPP）を選別する。

JWA機能ポリペプチドが有効に腫瘍細胞を貫通するようにする為に、まず四つのクラシックなものCPPを選ぶ。即ち、R9、TAT、pep-1、2K(表3参照)及び唯一のブランク対照とするJWA-1を取る。細胞モデル上で、腫瘍細胞に進入することに、効率が一番高いCPP及び最適作用濃度と最も良い作用時間を選別する。

SGC7901胃癌細胞モデルで、CPPが細胞に進入してから3hの時、蛍光値が一番強いであるのを発見した。但し、濃度が20μMである場合、蛍光値が平衡になる。その中で、R9がその他の群との差異が最も著しいである(図32と図33)。さらに、BGC803、Hela細胞及び正常な胃上皮細胞GES-1で皆同じ効果があると確認した(図34、35、36)。

したがって、後続実験で効果が比較的に最も良いR9だけ選んで、JWA機能ポリペプチドを細胞内に携帯するCPPとして、機能を発揮する。

CPP配列

蛍光顕微鏡の下でポリペプチドが細胞に入ったか直接に観察する為に、以上各配列及びJWA-1のN末端が皆FITC修飾を受け、C末端が皆アミド化修飾を受けた。

CPP配列のあるJWA機能ポリペプチドとAs₂O₃（ATO）と共同作用の下で、腫瘍細胞アポトーシスに対する影響

したがって、本実施形態の目的は下記の通りである。CPP配列のあるJWA機能ポリペプチドが細胞に入った後、直接に腫瘍細胞アポトーシスを誘導できるか、又は薬物により誘導される腫瘍細胞アポトーシスを促進できるか検討すること。

SGC7901細胞に対して、6グループの異なる処理方式を行うよう設計する。フラグ対照群、トランスフェクションFlag-control群、トランスフェクションFlag-JWA群、トランスフェクションFlag-JWAとATO共同処理群、ATO処理群、ポリペプチドCPP-1とATO共同処理群。各群で24h処理した後、Annexin V-PE／PIフローサイトメトリーで細胞アポトーシスを測定し、それに加えて、Western BlotでPARP1のレベルを検定する。

その中で、Flag-JWAがJWA遺伝子付き再構築表現プラスミドである。Flag-controlは、対照とする遺伝子無しプラスミドである。ポリペプチドCPP-1の配列がSEQ ID No:13であり、即ち、6-アミノカプロン酸-(R)₉-FFPGSDRFAであり、その中で、アミノ酸Sがリン酸化修飾を受けた。

細胞トランスフェクション群：リポソーム介在(Lipofectamine 2000)試薬キットを採用する。SGC7901細胞をパンクレアチンで消化した後、10%胎児ウシ血清を含む抗生物質無しDMEM培地で希釈し、それに、速く且つ均一で6穴板の各穴に入れ、24時間以内でトランスフェクションを行い、Flag-control 4μg／穴とFlag-JWA 4μg／穴で事前加熱血清無し抗生物質DMEM培地を250μl入れ、リポソームに、10%μl／穴の比例で血清無し抗生素無しDMEM培地を250 μl入れ、室温で5min孵化した後、両管を均一に混合し、引き続き室温で20 min放置する。その期間で、皿にある培地を吸い取り、2ml血清あり抗生物質無しDMEM培地に交換する。混合物500μlを各皿に入れ、5h後血清あり抗生物質無しDMEM培地に交換して引き続き24h培養する。

トランスフェクション・プラスミッド＋ ATO 処理群:トランスフェクション方法は同上である。5h後、ATO 5μMを含む血清あり抗生素無しDMEM培地に交換して引き続き24h培養する。

ポリペプチドCPP-1＋ATO処理群:SGC7901細胞をパンクレアチンで消化した後、DMEM完全培地で希釈し、それに、速く且つ均一で35mm皿に入れ、5%CO2培養ボックス内で37℃孵化により、重合度が約80%にする。ポリペプチドJWA-1-CPP作動液20μm、ATO作動液5μmを配置する。まずポリペプチドCPP-1で細胞を3h処理した後、ATO作動液に交換して、細胞を24h処理する。

正常な細胞において、ホスファチジルセリン(PS)が細胞膜脂質二層の内側だけ分布し、アポトーシスの早期で、細胞膜の中でのホスファチジルセリン(PS)由が脂質フィルムの内側から外側にひっくり返る。Annexin Vは、一種の分子量が35^~36kDであるCa²⁺依存性レシチン結合蛋白であり、ホスファチジルセリンと高い親和力を持つので、細胞外側ばく露するホスファチジルセリンを通じて、アポトーシス早期細胞の細胞膜と結びつくことができる。Annexin Vに対してフルオレセインPE標記を行う。標記したAnnexin Vを蛍光プローブとし、蛍光顕微鏡又はフローサイトメトリーで細胞アポトーシスの発生を検出できる。7-AAD(7-amino-actinomycin D)は、一種の核酸染料であり、正常な細胞膜を通すことができないが、細胞アポトーシスと細胞死亡プロセスに連れて、細胞膜の7-AADに対する透過性が段々増え、細胞アポトーシス中のDNAの制御可能な分解と結びつき、適切な波長の激発の下で、明るい赤色蛍光を出すことができ、7-AADで標記されるDNAの強度によって、細胞を三つの群に分ける。7-AAD蛍光が強い場合、死亡細胞であり、7AAD蛍光が弱い場合、アポトーシス細胞であり、7-AAD蛍光強度を検定できない場合、正常な活力の細胞である。

各処理群の処理が完了した後、まず細胞をパンクレアチンで消化し、それに細胞懸濁液に製作した後、Annexin V-PE／7-AADで染色を行い、フローサイトメトリーで細胞アポトーシスを測定し、結果は、図37で示すようである。前記結果をGraphpad prism 5で作図すると、柱状グラフを得る(図38)。結果によりますと、トランスフェクションFlag-JWA群とトランスフェクションFlag-control群の間に、細胞アポトーシス率の統計学差異がない。ポリペプチドCPP-1とATOとの共同作用群の細胞アポトーシス率が最高55.76%であり、トランスフェクションFlag-JWA群とATOとの共同作用群(細胞アポトーシス率32.87%)より高く、それに加えて、単純なATO処理群(細胞アポトーシス率24.69%)より高い。

本実施例の前記と同じ処理方式でSGC7901細胞を処理し、実施形態7Western blot方法を参照して実験を行う。Western blotの結果によりますと、ペプチドCPP-1とATO の共同作用群のPARP-1スプライセオソームの表現量がその他の群より高かったことが分かる（図39）。細胞のアポトーシス率が最高であるのを示唆し、Annexin V-PE／7-AADフローサイトメトリー検定結果と一致している。以上の結果から、ポリペプチドCPP-1がATOにより誘導される腫瘍細胞アポトーシスを促すことができることが分かる。

その後、本特許発明者は、ペプチドCPP-JWA-6単独にA375とSGC7901細胞を処理する条件及びATOと共同に処理する条件のもとで、細胞アポトーシスに対する影響を引き続き研究した。ポリペプチドCPP-JWA-6の配列がSEQ ID No:14であり、即ち、6-アミノカプロン酸-(R)9-FPGSDRFであり、その中でアミノ酸Sがリン酸化修飾を受けた。

ペプチドCPP-JWA-6が20、50μΜで単独にA375細胞に作用する条件及びATO（5μΜ）と共同に作用する場合（図40）、又はSGC7901（図41）細胞に作用する場合、24h後タンパク質を収集し、本発明実施形態7のWestern blot方法を参照して、アポトーシス関連分子変化を検定する。

結果によりますと、ペプチドCPP-JWA-6は、50μΜ以内で自身でPARP-1の変化を引き起こさない。ATOの単独な応用状況と比べて、ポリペプチドCPP-JWA-6とATOが共同に作用した後、caspase3とPARP-1スプライセオソームが明らかに増加し、ポリペプチドCPP-JWA-6が同様に、ATOにより誘導される腫瘍細胞アポトーシスを促すことができることが分かる。

ポリペプチドJWA-6を活性遺伝子座とする機能ポリペプチドを選別する

本実施形態の目的は下記の通りである。ポリペプチドJWA-6の基礎の上に、複数の組み合わせ配列で機能ポリペプチドを選別する。

本実施例で採用する移植腫マウスは実施形態2と同じ、実験方法も実施形態2と同じ、腫瘍内注射方式を採用し、各ポリペプチドの投薬量が皆10mg／kgである。これと同時に、ノンセンス・ポリペプチド群を設立する（non-pep、所用ポリペプチドの配列が実施形態3と同じ）。

各ペプチッド配列は、表4に示すようである。

複数の組み合わせのポリペプチド配列

スペースの限りで、ここで具体的な実験データをリストしていない。実験データにより、ポリペプチドJ1〜J57は皆抗腫瘍活性を有することが分かる。

前記実施形態を除いて、本発明におけるその他の実施方式を採用しても良い。如何なる等同な置換又は等価な文書返還により形成した技術案（その中で、単純にポリペプチドを使用する又はポリペプチドと化学薬品との共同使用方案を含む，）は、皆本発明要求の保護範囲に属する。

Claims

ポリペプチドのアミノ酸配列がＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶで示されるものであり、即ち、
Ｉ：FPGSDRF；
ＩＩ：X-FPGSDRF；
ＩＩＩ：FPGSDRF-Z；
ＩＶ：X-FPGSDRF-Z；
となり、その中で、アミノ酸Sがリン酸化修飾を受け、XとZがそれぞれアミノ酸又はアミノ酸配列であり、
XがF、(R)₉、(R)₉-F、6-アミノカプロン酸、6-アミノカプロン酸-F、6-アミノカプロン酸-(R)₉と6-アミノカプロン酸-(R)₉-Fの何れかであり、
ZがA、(G)_n-RGDとA-(G)_n-RGDの何れかである（nが≧０の整数である）ことを特徴とする抗腫瘍活性のある一種のペプチド。
前記nの取り得る値の範囲が0-10であることを特徴とする請求項1記載の抗腫瘍活性のあるペプチド。
前記ポリペプチドのN末端がアセチル化修飾を受け、C末端がアミド化修飾を受けたことを特徴とする請求項2記載の抗腫瘍活性のあるペプチド。
請求項1〜3の何れかに記載の抗腫瘍活性のあるペプチドの抗腫瘍薬物製造に使用される用途。
前記腫瘍が悪性黒色腫又は胃癌であることを特徴とする請求項4記載の用途。