PT2352508E - Péptidos do domínio citoplasmático muc1 como inibidores de cancro - Google Patents

Description

ΕΡ2352508Β1

DESCRIÇÃO

PÉPTIDOS DO DOMÍNIO CITOPLASMÁTICO MUC1 COMO INIBIDORES DE

CANCRO

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da invenção

Esta invenção refere-se à regulação do crescimento celular e mais particularmente à regulação do crescimento de células cancerígenas. Em particular, foi demonstrado que os péptidos da MUC1 derivados de uma região particular do domínio citoplasmático MUC1 inibem a oligomerização da MUC1 e a translocação nuclear, causando inibição e até a morte de células tumorais que expressam MUC1. 2. Arte Relacionada

As mucinas são proteínas extensivamente O-glicosiladas que são expressas predominantemente pelas células epiteliais. As mucinas segregadas e ligadas à membrana formam uma barreira física que protege as fronteiras apicais das células epiteliais de lesão induzida pelas toxinas, microorganismos e outras formas de stress que ocorrem na interface com o ambiente externo. A mucina 1 transmembranar (MUC1) também pode assinalar para o interior da célula através do ser domínio citoplasmático. MUC1 não tem qualquer semelhança de sequência com outras mucinas ligadas à membrana, com exceção da presença do domínio de uma proteína enteroquinase-agrina do esperma do ouriço-do-mar (SEA) (Duraisamy et al., 2006). A esse respeito, MUC1 é traduzida como um polipéptido único e depois é sujeita a autoclivagem no domínio SEA (Macao, 2006). 1 ΕΡ2352508Β1 A subunidade N-terminal da MUC1 (MUC1-N) contém membros variáveis de repetições em tandem com uma elevada proporção de serinas e treoninas que são modificadas por 0-glicosilação (Siddiqui, 1988) . A MUC1-N estende-se para lá do glicocálice da célula e é presa à superfície da célula através de ligação não covalente à subunidade C-terminal transmembranar da MUC1 (MUC1-C) (Merlo, 1989). A MUC1-C consiste num dominio extracelular de 58 aminoácidos, um domínio transmembranar de 28 aminoácidos e um domínio citoplasmático de 72 aminoácidos que interage com diversas moléculas sinalizadoras (Kufe, 2008) . O esvaziamento de MUC1-N na barreira física protetora deixa a MUC1-C À superfície da célula como um suposto recetor para transduzir sinais intracelulares que conferem crescimento e sobrevivência (Ramasamy et al., 2007; Ahmad et al., 2007) . A evidência disponível indica que os carcinomas humanos exploraram a função da MUC1 na promoção da tumorigenicidade. Neste contexto, com transformação e perda de polaridade, a MUC1 é expressa em níveis elevados em toda a superfície da célula em carcinomas da mama e outros epitélios (Kufe, 1984). Outros estudos mostraram que a sobre-expressão da MUC1 confere crescimento independente da ancoragem e tumorigenicidade (Li et al., 2003a; Raina et al., 2004; Ren et al., 2004; Wei et al., 2005), pelo menos em parte através da estabilização da β-catenina (Huang et al., 2005) . Além disso, consistente com uma função de sobrevivência para células epiteliais normais, a sobre-expressão da MUC1 confere resistência de células de carcinoma a apoptose induzida pelo stress (Ren et al., 2004; Yin e Kufe, 2003; Yin et al., 2004; Yin et al., 2007) . A perda de restrição para a membrana apical permite a formação de complexos com o recetor do fator de crescimento 2 ΕΡ2352508Β1 epidérmico (EGFR) e co-ativação de sinalização mediada pelo EGFR (Li et al., 2001; Ramasamy et al., 2007) . A sobre- expressão da MUC1 por células de carcinoma também está associada com a acumulação da MUC1-C no citosol e com a direção desta subunidade para o núcleo (Li et al., 2003b;

Li et al., 2003c) e para a mitocôndria (Ren et al., 2004; Ren et al., 2006) . De forma importante, a oligomerização da MUC1-C é necessária pela sua direção nuclear e interação com diversos efetores (Leng et al., 2007). Por exemplo, o domínio citoplasmático MUC1-C (MUC1-CD) funciona como um substrato para c-Src (Li et al., 2001), c-Abl (Raina et al., 2006), proteína quinase Cõ (Ren et al., 2002) e glicogénio sintase quinase 3β (Li et al., 1998) e interage diretamente com a via Wnt efetora, β-catenina (Yamamoto et al., 1997; Huang et al., 2005) e o supressor de tumor p53 (Wei et al., 2005). Assim, enquanto que a oligomerização parece ser importante, não existe evidência direta de que a interferência com a formação de oligómero MUC1 teria quaisquer efeitos benéficos em células tumorais, muito menos como isto poderia ser realizado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Assim, em concordância com a primeira modalidade da presente invenção, é providenciado um péptido MUC1 de pelo menos 6 resíduos MUC1 consecutivos e não mais de 20 resíduos MUC1 consecutivos e compreendendo a sequência CQCRRK, em que a cisteína do amino-terminal de CQCRRK é coberta no seu terminal NH2 por pelo menos um resíduo de aminoácido que não precisa de corresponder à sequência transmembranar de MUC1 nativa, para utilização na inibição de uma célula de tumor positiva a MUC1 num sujeito. Colocando o tema de outra forma, a primeira modalidade da presente invenção providencia a utilização de um péptido MUC1, conforme definido anteriormente, no fabrico de um 3 ΕΡ2352508Β1 medicamento para inibir uma célula de tumor positiva a MUC1 num sujeito. 0 péptido para utilização na primeira modalidade da presente invenção pode compreender pelo menos 7 residuos MUC1 consecutivos, pelo menos 8 residuos MUC1 consecutivos e a sequência pode, mais especificamente, compreender CQCRRK (SEQ. ID N.° 4) ou CQCRRKN (SEQ. ID N.° 53) . 0 péptido para utilização na primeira modalidade da presente invenção consecutivos, 11 consecutivos, 13 consecutivos, 15 consecutivos, 17 não pode conter mais de 10 residuos residuos consecutivos, 12 residuos residuos consecutivos, 14 residuos residuos consecutivos, 16 residuos resíduos consecutivos, 18 resíduos consecutivos ou 19 resíduos consecutivos de MUC1. O péptido para utilização na primeira modalidade da presente invenção pode ser fundido com um domínio de entrega de célula, tal como poli-D-R, poli-D-P ou poli-D-K. O péptido para utilização na primeira modalidade da presente invenção pode compreender todos os aminoácidos L, todos os aminoácidos D ou uma mistura de aminoácidos L e D. A célula de tumor positiva a MUC1 que é inibida de acordo com a primeira modalidade da presente invenção pode ser uma célula de carcinoma, uma célula leucémica ou uma célula de mieloma, tal como uma célula de carcinoma da próstata ou da mama. 0 péptido pode, por exemplo, ser utilizado para inibir uma célula de tumor positiva a MUC1 num sujeito administrando o péptido a um sujeito por administração intravenosa, intra-arterial, intra-tumoral, subcutânea, tópica ou intraperitoneal ou administração local, regional, sistémica ou contínua. A inibição pode compreender a indução da paragem de crescimento de dita célula tumoral, apoptose de dita célula tumoral e/ou necrose de um tecido tumoral compreendendo dita célula tumoral. O sujeito pode ser um humano. 4 ΕΡ2352508Β1 0 sujeito da primeira modalidade da presente invenção pode ser o recetor de uma segunda terapêutica anti-cancro. A segunda terapêutica anti-cancro pode ser cirurgia, quimioterapêutica, radioterapêutica, terapêutica hormonal, terapêutica de toxinas, imunoterapêutica e crioterapêutica. A segunda terapêutica anti-cancro pode ser administrada antes de dito péptido, depois de dito péptido ou ao mesmo tempo que o dito péptido. 0 sujeito da primeira modalidade da presente invenção pode ser avaliado para a expressão de MUC1 numa célula tumoral antes de administrar dito péptido e/ou o efeito de dito péptido na expressão de MUC1 num tumor de dito sujeito pode ser avaliado. 0 péptido pode ser utilizado para inibir uma célula de tumor positiva a MUC1 num sujeito de acordo com a primeira modalidade da presente invenção por administração do péptido a 0,1-500 mg/kg/d ou 10-100 mg/kg/d. O péptido pode ser administrado diariamente, por exemplo, durante 7 dias, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, um mês, 6 semanas, 8 semanas, dois meses, 12 semanas ou 3 meses. O péptido pode ser administrado semanalmente, por exemplo, durante 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas ou 12 semanas.

Na segunda modalidade da presente invenção, é providenciada uma composição farmacêutica que compreende (a) um péptido MUC1 de pelo menos 6 resíduos MUC1 consecutivos e não mais de 20 resíduos MUC1 consecutivos e compreendendo a sequência CQCRRK, em que a cisteina do amino-terminal de CQCRRK é coberta no seu terminal NH2 por pelo menos um resíduo de aminoácido que não precisa de corresponder com a sequência transmembranar de MUC1 nativa e (b) um veículo, tampão ou diluente farmaceuticamente aceitável. O péptido pode ser pelo menos 7 ou 8 resíduos MUC1 consecutivos. O péptido não pode ter mais de 10 5 ΕΡ2352508Β1 resíduos consecutivos, 11 resíduos consecutivos , 12 resíduos consecutivos, 13 resíduos consecutivos i—1 resíduos consecutivos, 15 resíduos consecutivos , 16 resíduos consecutivos, 17 resíduos consecutivos 00 i—1 resíduos consecutivos ou 19 resíduos consecutivos de MUCl. 0 péptido pode ser fundido com um domínio de entrega de célula, tal como poli-D-R, poli-D-P ou poli-D-K. 0 péptido pode ter pelo menos 8 resíduos de comprimento e pelo menos dois resíduos não adjacentes de uma ponte através das suas cadeias laterais. A ponte pode compreender um ligante, cadeias laterais guimicamente modificadas ou grampeamento de hidrocarbono. Os ligantes podem compreender modificações gue estabilizam uma estrutura alfa-helical do dito péptido. 0 tampão pode compreender β-mercaptoetanol, glutationa ou ácido ascórbico ou outro agente redutor gue mantém o péptido num estado monomérico.

Numa terceira modalidade da presente invenção, é providenciado um péptido MUC1 de pelo menos 6 resíduos MUC1 consecutivos e não mais de 20 resíduos MUC1 consecutivos e compreendendo a sequência CQCRRK, em que a cisteina do amino-terminal de CQCRRK é coberta no seu terminal NH2 por pelo menos um resíduo de aminoácido que não precisa de corresponder com a sequência transmembranar de MUC1 nativa. O péptido pode ter pelo menos 7 ou 8 resíduos MUC1 consecutivos. 0 péptido não pode ter mais de 10 resíduos consecutivos, 11 resíduos consecutivos, 12 resíduos consecutivos, 13 resíduos consecutivos, 14 resíduos consecutivos, 15 resíduos consecutivos, 16 resíduos consecutivos, 17 resíduos consecutivos, 18 resíduos consecutivos ou 19 resíduos consecutivos de MUCl. 0 péptido pode ser fundido com um domínio de entrega de célula, tal como poli-D-R, poli-D-P ou poli-D-K.

Também é providenciado, numa quarta modalidade da 6 ΕΡ2352508Β1 presente invenção, o péptido MUC1 da terceira modalidade da presente invenção ou uma composição farmacêutica de acordo com a segunda modalidade da presente invenção, para utilização em medicina.

Numa quinta modalidade da presente invenção, é providenciado um método in vitro para inibir a oligomerização da MUC1 e transporte nuclear numa célula compreendendo contactar uma célula que expressa MUC1 com um péptido MUC1 de pelo menos 6 resíduos MUC1 consecutivos e não mais de 20 resíduos MUC1 consecutivos e compreendendo a sequência CQCRRK, em que a cisteína do amino-terminal de CQCRRK é coberta no seu terminal NH2 por pelo menos um resíduo de aminoácido que não precisa de corresponder com a sequência transmembranar da MUC1 nativa. O péptido pode compreender pelo menos 7 resíduos MUC1 consecutivos, pelo menos 8 resíduos MUC1 consecutivos e a sequência pode, mais especificamente, compreender CQCRRK ou CQCRRKN. O péptido não pode conter mais de 10 resíduos consecutivos, 11 resíduos consecutivos, 12 resíduos consecutivos, 13 resíduos consecutivos, 14 resíduos consecutivos, 15 resíduos consecutivos, 16 resíduos consecutivos, 17 resíduos consecutivos, 18 resíduos consecutivos ou 19 resíduos consecutivos de MUC1. 0 péptido pode ser fundido com um domínio de entrega de célula, tal como poli-D-R, poli-D-P ou poli-D-K. O péptido pode compreender todos os aminoácidos L, todos os aminoácidos D ou uma mistura de aminoácidos L e D. A célula que expressa MUC1 que é inibida de acordo com a quinta modalidade da presente invenção pode ser uma célula tumoral, tal como uma célula de carcinoma, uma célula leucémica ou uma célula de mieloma, tal como uma célula de carcinoma da próstata ou mama. 7 ΕΡ2352508Β1

Uma sexta modalidade da presente invenção providencia um péptido MUC1 de pelo menos 6 residuos MUC1 consecutivos e não mais de 20 residuos MUC1 consecutivos e compreendendo a sequência CQCRRK ou KRRQCQ, em que todos os residuos de aminoácidos de dito péptido são aminoácidos D. O péptido pode compreender a sequência KRRCQC (SEQ. ID N.° 49). A célula cancerígena pode ser, por exemplo, uma célula de cancro da mama, de cancro do pulmão, de cancro do cólon, de cancro pancreático, de cancro renal, de cancro do estômago, de cancro hepático, de cancro dos ossos, de cancro hematológico, de cancro do tecido neural, do melanoma, de cancro do ovário, de cancro testicular, de cancro da próstata, de cancro cervical, de cancro vaginal ou de cancro da bexiga.

Aspetos preferidos das modalidades da presente invenção previamente referidas, podem incluir a morte de uma célula cancerígena. Isto pode incluir, antes, depois ou ao mesmo tempo que se realizam as utilizações da presente invenção descritas anteriormente, expondo o sujeito a uma ou mais terapêuticas adicionais. As terapêuticas podem, por exemplo, uma ou mais formas de radiação ionizante e/ou um ou mais agentes quimioterapêuticos. O um ou mais agentes quimioterapêuticos podem ser, por exemplo, cisplatina, carboplatina, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalano, clorambucilo, bissulfano, nitrosureia, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, bleomicina, plicomicina, mitomicina, etoposida, verampilo, podofilotoxina, tamoxifeno, taxol, transplatina, 5-flurouracilo, vincristina, vinblastina, metotrexato ou um análogo de qualquer um dos previamente mencionados. Também estão contempladas como terapêuticas de combinação a terapêutica hormonal, imunoterapêutica, terapêutica de toxinas, crioterapêutica e cirurgia. 8 ΕΡ2352508Β1

Está contemplado que qualquer utilização, método ou composição descrito aqui pode ser implementado com respeito a qualquer outra utilização, método ou composição descrito aqui . A utilização da palavra "um" ou "uma" quando utilizada em conjunto com o termo "compreendendo" nas reivindicações e/ou a especificação pode significar "um," mas também é consistente com o significado de "um ou mais", "pelo menos um" e "um ou mais de um." As palavras "cerca de" significam mais ou menos 5% do número indicado.

Outros objetos, caracteristicas e vantagens da presente invenção tornar-se-ão aparentes da seguinte descrição detalhada. Deveria ser entendido, contudo, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, enquanto indicam modalidades especificas da invenção, são fornecidos apenas a título ilustrativo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Os desenhos seguintes formam parte da presente especificação e são incluídos para demonstrar adicionalmente certos aspetos da presente invenção. A invenção pode ser melhor entendida por referência a um ou mais destes desenhos em combinação com a detalhada. FIGURAS 1A-D. Péptido MUC1/CQC bloqueia_a oligomerização da MUC1. (FIGURA IA) É mostrada a representação esquemática da subunidade MUC1-C e a sequência de 72 aminoácidos de MUC1-CD. Os 15 aminoácidos N-terminal (sequência a sombreado) MUC1/CQC e péptidos da MUC1/AQA mutados foram sintetizados com o domínio de transdução poli-dArg. (FIGURA 1B) His-MUCl-CD (1,4 mg/ml) foi imobilizado num chip de sensor num 9 ΕΡ2352508Β1 BIAcore. MUC1/CQC foi injetado sobre o chip a 10 μΜ. Os dados de ligação crús foram analisados pelo software BIAevaluation versão 3.0 e ajustados a um modelo de ligação de Languir 1:1. (FIGURA 1C) His-MUCl-CD purificado (1,5 mg/ml) foi incubado com PBS, 200 μΜ MUC1/CQC ou 200 μΜ MUC1/AQA durante 1 h à temperatura ambiente. As proteínas foram separadas num gel de SDS-poliacrilamida não redutor e analisadas com a técnica de imunoblot com anti-MUCl-C. (FIGURA 1D) 293 células foram transfetadas de forma transitória para expressar um vetor vazio ou GFP-MUC1-CD e Flag-MUCl-CD. Às 48 h depois da transfeção, as células foram tratadas com 5 μΜ MUC1/CQC ou MUC1/AQA durante 3 dias. As células foram então colhidas por imunoblot comanti-MUCI-C (painel da esquerda). Os lisados celulares completos também foram precipitados com anti-Flag e os precipitados foram imunoblotados com os anticorpos indicados (painéis da direita) . FIGURAS 2A-C. péptido MUC1/CQC bloqueia a localização nuclear de MUC1-C. (FIGURA 2A) Células ZR-75-1 foram incubadas com 5 μΜ de péptido MUC1/CQC rotulado com FITC durante os tempos indicados e depois analisadas por citometria de fluxo. O índice médio de fluorescência (MFI) é incluído em cada um dos painéis. (FIGURAS 2B-C) Células ZR-75-1 (FIGURA 2B) e MCF-7 (FIGURA 2C) foram incubadas na presença de 5 μΜ de péptido MUC1/CQC ou MUC1/AQA durante 3 dias. Os lisados celulares completos (WCL) (painéis da esquerda) e lisados nucleares (painéis da direita) foram imunoblotados com os anticorpos indicados. FIGURAS 3A-D. Péptido MUC1/CQC induz paragem da fase S e necrose. Células ZR-75-1 (FIGURAS 2A-B) e MCF-7 (FIGURAS 2C-D) foram tratadas com 5 μΜ de MUC1/CQC ou 10 ΕΡ2352508Β1 MUC1/AQA durante 3 e 4 dias. As células foram fixadas e analisadas durante a distribuição do ciclo celular por citometria de fluxo (FIGURAS 2A e 2C). A percentagem de células nas fases Gl, S e G2/M está incluida nos painéis. As células também foram coradas com iodeto de propidio e analisadas por citometria de fluxo para necrose (FIGURAS 2B e 2D) . A percentagem de células necróticas está incluida nos painéis. FIGURAS 4A-E. Seletividade de MUC1/CQC para células de cancro da mama que expressam a MUC1. (FIGURA 4A) Células ZR-75-1 foram infetadas de forma estável com um lentivirus vazio (vetor) ou um que expressa um siARN da MUC1. Os lisados para as células infetadas foram sujeitas a imunoblot com os anticorpos indicados. (FIGURA 4B) Células ZR-75-1/vetor foram deixadas por tratar (diamantes) e células ZR-75-l/vetor (quadrados) e células ZR-75-l/MUClsiRNA (triângulos) foram tratadas com 5 μΜ de péptido MUC1/CQC durante os tempos indicados. 0 número de células viáveis foi determinado por exclusão por azul de tripano. (FIGURA 4C) Células 293 foram deixadas por tratar (diamantes) e tratadas com 5 μΜ MUC1/CQC (quadrados) ou MUC1/AQA (triângulos) durante os tempos indicados. 0 número de células viáveis foi determinado por exclusão por azul de tripano. (FIGURA 4D) Células MCF-10A foram deixadas por tratar (painel da esquerda) e tratadas com 5 μΜ MUC1/CQC (painel do meio) ou MUC1/AQA (painel da direita). Aos 3 dias, as células foram analisadas para distribuição do ciclo celular. (FIGURA 4E) Células MCF-10A foram deixadas por tratar (diamantes) e tratadas com 5 μΜ MUC1/CQC (quadrados) ou MUC1/AQA (triângulos) durante os tempos indicados. 0 número de células viáveis foi determinado por exclusão por azul de tripano. 11 ΕΡ2352508Β1 FIGURAS 5A-C. Péptido MUC1/CQC bloqueia o crescimento de xenoenxertos de tumor da mama ZR-75-1. (FIGURA 5A) Ratinhos Balb-c nu/nu fêmeas com quatro a seis semanas de idade foram implantados com tampões de 17-p-estradiol. Após 24 h, células de cancro da mama ZR-75-1 (embebidas em matrigel) foram injetadas subcutâneamente no flanco. Quando os tumores tinham -150 mm3, os ratinhos foram reunidos de forma emparelhada em grupos e injetados por via intraperitoneal com PBS (controlo veiculo; quadrados fechados), 50 mg/kg de péptido MUC1/AQA (péptido controlo; quadrados abertos) ou 10 mg/kg de péptido MUC1/CQC (triângulos fechados) diariamente durante 21 dias. Outro grupo foi tratado com 50 mg/kg de péptido MUC1/CQC diariamente durante 6 dias (triângulos abertos). Os ratinhos foram pesados duas vezes por semana e as medições do tumor foram realizadas cada 4 dias. (FIGURAS 5B e 5C) . No dia 24 (asterisco), os tumores foram colhidos do grupo controlo e o grupo tratado com 50 mg/kg/d x 6 dias foram corados com H&E (FIGURA 5B) e com um anticorpo contra a MUC1 (FIGURA 5C). FIGURAS 6A-B. Efeitos prolongados do péptido MUC1/CQC m tumores de ZR-75-1. (FIGURA 6A) Os ratinhos foram injetados com células ZR-75-1, conforme descrito na legenda da FIGURA 5A. Quando os tumores tinham -275 mm3, os ratinhos foram reunidos de forma emparelhada em grupos e injetados por via intraperitoneal com PBS (controlo veículo; quadrados abertos) ou 30 mg/kg de péptido MUC1/CQC (quadrados fechados) diariamente durante 21 dias. Os ratinhos controlo foram sacrificados no dia 32 quando os tumores atingiram -1200 mm3. Os ratinhos tratados foram monitorizados até ao dia 52 quando os tumores foram colhidos para coloração com H&E (FIGURA 6B). 12 ΕΡ2352508Β1 FIGURA 7. MUC1 7-mer inibe o carcinoma da próstata. Células de carcinoma da próstata DU145 foram tratadas com 5 μΜ de péptidos CQC curtos (7-mer) ou 5 μΜ CQC longos (15-mer) durante 4 dias. 0 crescimento celular foi medido por ensaio MTT. Os dados representam a percentagem de inibição de crescimento comparada com as células não tratadas (controlo). FIGURA 8. Sequências de péptidos da MUC1-CD grampeados. FIGURA 9A. Efeitos do péptido MUC1-CD grampeado no crescimento de células do carcinoma de pulmão de células não pequenas H1650. Para avaliar a sensibilidade à inibição da função MUC1, células H1650 NSCLC foram tratadas com 1 e 5 μΜ de péptido MUC1 CQC grampeado (GO-200-1B) durante 7 dias. 0 tratamento de células H1650 com 5 μΜ GO-200-1B foi associado com uma inibição significativa do crescimento e, depois, com uma diminuição do número de células. FIGURA 9B. Efeito de GQ-200-2B na proliferação celular. A linha de células do carcinoma de pulmão de células não pequenas H-1975 foi crescida em DMEM com 10% soro bovino fetal desativado pelo calor com 100 unidades/mL de penicialina, 100 pg/ml estreptomicina e 2 mmol/L L-glutamina. As células foram re-semeadas um dia antes dos tratamentos. As células foram tratadas com 5 μΜ GO-200-2B durante 3 dias e a viabilidade celular foi determinada por exclusão por azul de tripano. FIGURA 10. Efeito de diferentes péptidos da MUC1-CD com região CQC no crescimento de células de carcinoma da mama dependentes de hormona. Para determinar se a exposição a diferentes péptidos da MUC1-CD contendo a região CQC afetam o crescimento, células de carcinoma 13 ΕΡ2352508Β1 da mama ZR-75-1 foram tratadas com 5 μΜ de diferentes péptidos durante 4 dias e monitorizadas para a proliferação celular. De forma significativa, houve uma inibição substancial do crescimento comparada com aquela observada nas células não tratadas. FIGURA 11. Efeito de diferentes péptidos da MUC1-CD com região CQC no crescimento de células do carcinoma de células não pequenas. Células do carcinoma de pulmão de células não pequenas A54 9 foram tratadas com 5 μΜ G0-203, GO-203-2 ou GO-203cyc durante 7 dias. O número de células viáveis ao dia 7 foi determinado por exclusão por azul de tripano e a percentagem de inibição de crescimento foi calculada comparando o crescimento celular das células não tratadas. FIGURA 12. Efeito de diferentes péptidos da MUC1-CD com região CQC no crescimento de células do carcinoma de células não pequenas H1975. Células do carcinoma de pulmão de células não pequenas H1975 foram tratadas com 5 μΜ de diferentes péptidos da MUC1-CD com região CQC durante 6 dias. O número de células viáveis ao dia 6 foi determinado por exclusão por azul de tripano. Os resultados demonstram que o tratamento das células H1975 com 5 μΜ de diferentes péptidos foi associado com inibição significativa do crescimento. FIGURA 13. Efeito de diferentes péptidos da MUC1-CD com região CQC no crescimento de células do carcinoma da mama negativas triplas. Células do carcinoma da mama negativas triplas MDA-MB-231 foram tratadas com 5 μΜ de diferentes péptidos da MUC1-CD com região CQC durante 6 dias. O número de células viáveis ao dia 6 foi determinado por exclusão por azul de tripano. Os resultados demonstram que o tratamento das células MDA- 14 ΕΡ2352508Β1 MB-231 com diferentes péptidos foi associado com inibição significativa do crescimento. FIGURA 14. Efeito de péptidos GQ-203 mais curtos na proliferação de células de cancro da mama ZR-75-1. Células de cancro da mama ZR-75-1 humanas foram crescidas em RPMI1640 suplementado com 10% soro bovino fetal desativado pelo calor, 100 unidades/ml de penicilina, 100 yg/ml de estreptomicina. As células foram tratadas com diferentes péptidos a 5 μΜ cada dia durante quatro dias e a viabilidade celular foi determinada por exclusão por azul de tripano. Em contraste com GO-210, o tratamento de células de carcinoma da mama ZR-75-1 com 5 μΜ GO-203 (SEQ. ID N.° 53), GO-207 (SEQ. ID N.° 4), GO-208 (SEQ. ID N.° 50) e GO-209 (SEQ. ID N.° 54) cada dia durante 4 dias foi associado com inibição significativa do crescimento. FIGURAS 15A-D. Efeitos de GO-203 em combinação com diferentes fármacos anti-cancro. Células ZR-75-1 foram expostas às concentrações indicadas de Cisplatina (FIGURA 15A), Doxorubicina (FIGURA 15B), rh-TNF-a (FIGURA 15C) e Taxol (FIGURA 15D) isoladas ou em combinação com GO-203. O tratamento foi sequencial para Cisplatina, Doxorubicina e Taxol onde as células foram expostas a estes agentes durante 72 h seguido de tratamento com 5 μΜ de GO-203 durante 72 h. Em estudos com rhTNF, as células foram expostas concomitantemente a diferentes concentrações de rh-TNF isolado e em combinação com 5 μΜ de GO-203 durante 72 h. O ensaio MTS foi utilizado para determinar a sobrevivência celular. FIGURA 16. GO-203 é aditivo ou sinérgico com agentes anti-cancro. Os gráficos mostram índices de combinação 15 ΕΡ2352508Β1 contra diferentes níveis efetores diferentes (fração afetada). 0 nível efetor foi obtido tratando as células com as combinações indicadas de fármacos anti-cancro e GO-203. DESCRIÇÃO DE MODALIDADES ILUSTRATIVAS I. A presente invenção A MUC1 foi estudada extensivamente pelos inventores e outros pelo seu papel no cancro. Conforme discutido anteriormente, a MUC1 humana é glicoproteína heterodimérica, traduzida como um único polipéptido e divida em subunidades N- e C-terminal no retículo endoplasmático (Ligtenberg et al., 1992; Macao et al., 2006; Levitin et al., 2005). A sobre-expressão aberrante da MUC1, como encontrada na maioria dos carcinomas humanos (Kufe et al., 1984), confere crescimento independente de ancoragem e tumorigenicidade (Li et al., 2003a; Huang et al., 2003; Schroeder et al., 2004; Huang et al., 2005). Outros estudos demonstraram que a sobre-expressão da MUC1 confere resistência à apoptose induzida por stress oxidativo e agentes anti -cancro genotóxicos (Yin e Kufe, 2003; Ren et al., 2004; Raina et al., 2004; Yin et al., 2004; Raina et al., 2006; Yin et al., 2007). A família de mucinas presas e segregadas funciona de maneira a providenciar uma barreira protetora da superfície celular epitelial. Danificando a camada epitelial, as junções apertadas entre células vizinhas são interrompidas e perde-se a polaridade à medida que as células iniciam um programa de reparação induzido pela heregulina (Vermeer et al., 2003) . A MUC1-N é derramada da superfície da célula (Abe e Kufe, 1989), deixando a MUC1-C funcionar como uma transdutor de sinais de stress ambiental para o interior da 16 ΕΡ2352508Β1 célula. A este respeito, a MUC1-C forma complexos de superfície da célula com membros da família do recetor ErbB e a MUC1-C é dirigida ao núcleo em resposta ao estímulo por heregulina (Li et al., 2001; Li et al., 2003c) . A MUC1-C também funciona integrando o recetor ErbB e vias de sinalização Wnt através de interações diretas entre o domínio citoplasmático MUC1 (CD) e membros da família catenina (Huang et al., 2005; Li et al., 2003c; Yamamoto et al., 1997; Li et al., 1998; Li et al., 2001; Li e Kufe, 2001) . Outros estudos demonstraram que a MUC1-CD é fosforilada pela glicogénio sintase quinase 3)3, c-Src, proteína quinase CS e c-Abl (Raina et al., 2006; Li et al., 1998; Li et al., 2001; Ren et al., 2002).

Os mecanismos responsáveis pela direção nuclear da MUC1-C são pouco claros. As proteínas que contêm um sinal de localização nuclear clássico (NLS) são importadas para o núcleo ligando primeiro à importina oí e depois, por sua vez, importina β (Weis, 2003) . O complexo cargo-importina α/β atraca-se ao poro nuclear ligando a nucleoporinas e é transportado através do poro por um mecanismo dependente da Ran GTPase. NLSs clássicos são monopartite com um único grupo de 4-5 aminoácidos básicos ou bipartite com dois grupos de aminoácidos básicos separados por um ligante de 10-12 aminoácidos. A MUC1-CD contém um motivo RRK que não se conforma com uma monopartite NLS prototípica (Hodel et al., 2002). Contudo, certas proteínas contendo NLSs não clássicos são transportados através do poro nuclear ligando diretamente a importina β (Kau et al., 2004) . A importina β associa-se com várias nucleoporinas (Ryan e Wente, 2000), incluindo Nup62, que está localizada em ambas as faces citoplasmática e nucleoplasmática dos complexos do poro nuclear (Percipalle et al., 1997). Outros estudos indicaram que a β-catenina é importada para o núcleo por um mecanismo independente da importina e nucleoporina (Suh e Gumbiner, 17 ΕΡ2352508Β1 2003).

Em 2006, os inventores reportaram que a MUC1 é importada para o núcleo por um mecanismo envolvendo a ligação a Nup62. Também demonstraram que a MUC1 forma oligómeros através de um motivo CQC no domínio citoplasmát ico MUC1 e que a oligomerização da MUC1 é necessária para a importação nuclear. Aqui, eles estenderam este trabalho para abranger um entendimento adicional do papel que o motivo CQC desempenha na formação de oligómeros. Também demonstraram que péptidos curtos correspondendo a esta região são capazes de interromper a formação de oligómeros MUC1, prevenindo o transporte para o núcleo de células tumorais. Estes péptidos são capazes de inibir o crescimento de célula tumoral, bem como induzir a apoptose em tais células e mesmo necrose do tecido tumoral. Estes e outros aspetos da invenção são descritos com detalhe a seguir. II. MUC1 A. Estrutura A MUC1 é uma glicoproteína tipo mucina que é expressa nas fronteiras apicais de células epiteliais segregadoras normais (Kufe et al., 1984) . A MUC1 forma um heterodímero seguindo-se a síntese como um único polipéptido e clivagem do precursor em duas subunidades no retículo endoplasmático (Ligtenberg et al., 1992). A clivagem pode ser mediada por

um processo autocatalítico (Levitan et al., 2005). A subunidade N-terminal da MUC1 com > 250 kDa (MUC1 N-ter, MUC1-N) contém números variáveis de repetições em tandem de 20 aminoácidos que são imperfeitas com variações altamente conservadas e são modificadas por glicanos O-ligados (Gendler et al., 1988; Siddiqui et al., 1988) . A MUC1-N é 18 ΕΡ2352508Β1 presa à superfície da célula por dimerização com a subunidade C-terminal com 23 kDa (MUC1 C-ter, MUC1-C), que inclui uma região extracelular com 58 aminoácidos, um domínio transmembranar com 28 aminoácidos e um domínio citoplasmát ico com 72 aminoácidos (CD; SEQ. ID N.° 1) (Merlo et al., 1989). A sequência da MUC1 humana é mostrada a seguir: GSVWQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFS AOSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCOCRRKNYGOLPIFPAR DTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAA TSANL (SEQ ID NO:2) A sequência a negrito indica o CD e a porção sublinhada é um péptido inibidor de oligómero (SEQ. ID N.° 3) descrito nos exemplos.

Com transformação do epitélio normal em carcinomas, a MUC1 é sobre-expressa de forma aberrante no citosol e sobre toda a membrana celular (Kufe et al., 1984; Perey et al., 1992) . A MUC1 associada com a membrana celular é dirigida aos endossomas por endocitose mediada pela clatrina (Kinlough et al., 2004) . Além disso, a MUC1-C, mas não a MUC1-N, é dirigida para o núcleo (Baldus et al., 2004;

Huang et al., 2003; Li et al., 2003a; Li et al., 2003b; Li et al., 2003c; Wei et al., 2005; Wen et al., 2003) e para a mitocôndria (Ren et al., 2004). B. Função A MUC1 interage com membros da família do recetor ErbB (Li et al., 2001b; Li et al., 2003c; Schroeder et al., 2001) e com o efetor Wnt, β-catenina (Yamamoto et al., 1997). 0 recetor do fator de crescimento epidérmico e c-Src fosforilam o domínio citoplasmático MUC1 (MUC1-CD) em Y-46 19 ΕΡ2352508Β1 e aumentam, assim, a ligação de MUC1 e β-catenina (Li et al., 2001a; Li et al., 2001b) . A ligação de MUC1 e β-catenins também é regulada por glicogénio sintase quinase 3β e pela proteína quinase Cõ (Li et al., 1998; Ren et al., 2002) . A MUC1 co-localiza-se com β-catenina no núcleo (Baldus et al., 2004; Li et al., 2003a; Li et al., 2003c; Wen et al., 2003) e co-ativa a transcrição dos genes alvo de Wnt (Huang et al., 2003). Outros estudos mostraram que a MUC1 também se liga diretamente a p53 e regula a transcrição dos genes alvo de p53 (Wei et al., 2005) . Notavelmente, a sobre-expressão da MUC1 é suficiente para induzir o crescimento independente da ancoragem e tumorigenicidade (Huang et al., 2003; Li et al., 2003b; Ren et al., 2002; Schroeder et al., 2004). A maioria das proteínas mitocondriais são codificadas no núcleo e são importadas para as mitocôndrias por complexos de translocação nas membranas mitocondriais exterior e interior. Ceratas proteínas mitocondriais contêm sequências alvo mitocondriais N-terminal e interagem com Tom20 na membrana mitocondrial exterior (Truscott et al., 2003) . Outras proteínas mitocondriais contêm sequências alvo internas e interagem com o recetor Tom70 (Truscott et al., 2003) . Um estudo recente mostrou que as proteínas mitocondriais sem sequências alvo internas são entregues a Tom70 por um complexo de HSP70 e HSP90 (Young et al., 2003). III. Péptidos da MUC1 A. Estrutura A presente invenção contempla o desenho, produção e utilização de vários péptidos da MUC1. As características estruturais destes péptidos são como se segue. Primeiro, os 20 ΕΡ2352508Β1 péptidos não têm mais de 20 resíduos consecutivos da MUC1. Assim, o termo "um péptido com não mais de 20 resíduos consecutivos," mesmo quando incluindo o termo "compreendendo," não pode ser entendido como compreendendo um número superior de resíduos da MUC1 consecutivos. Em segundo lugar, os péptidos conterão o motivo CQCRRK. Assim, os péptidos terão, no mínimo, estes seis resíduos consecutivos do domínio MUC1-C. Em terceiro lugar, os péptidos terão pelo menos um residuo de aminoácido anexo ao lado NH2-terminal do primeiro resíduo C no motivo CQCRRK, de tal modo que o primeiro resíduo C está "coberto" por esse pelo menos um aminoácido anexo a ele. O resíduo pode ser nativo a MUC1 1 (isto é, do domínio transmembranar) , pode ser selecionado aleatoriamente (qualquer um dos 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente ou análogos dos mesmos) ou pode ser parte de outra sequência peptídica (por exemplo, uma sequência tag para purificação, uma sequência estabilizadora ou um domínio de entrega de célula).

Em geral, os péptidos terão 50 resíduos ou menos, de novo, compreendendo não mais de 20 resíduos consecutivos da MUC1. O comprimento total pode ser 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 resíduos. São contemplados intervalos de comprimento de péptido de 6-50 resíduos, 7-50 resíduos, 7-25, resíduos, 6-20 resíduos, 7-20 resíduos e 7-15 resíduos. O número de resíduos da MUC1 consecutivos pode ser 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20. São contemplados intervalos de resíduos consecutivos de 6-20 resíduos, 7-20 resíduos e 6-15 resíduos ou 7-15 resíduos. A presente invenção pode utilizar aminoácidos com uma configuração L, aminoácidos com uma configuração D ou uma 21 ΕΡ2352508Β1 mistura dos mesmos. Enquanto que os aminoácidos L representam a grande maioria dos aminoácidos encontrados nas proteínas, os aminoácidos D são encontrados em algumas proteínas produzidas por organismos marinhos exóticos, tais como os gastrópodes do género Conus. Também são componentes abundantes das paredes celulares do peptidoglicano das bactérias. A D-serina pode atuar como um neurotransmissor no cérebro. A convenção L e D para a configuração dos aminoácidos não se refere à atividade ótica do aminoácido em si, mas antes à atividade ótica do isómero do gliceraldeído a partir do qual esse aminoácido pode, em teoria, ser sintetizado (D-gliceraldeído é dextrógiro; L-gliceraldeído é levógiro).

Uma forma de um péptido "todo-D" é um péptido retro-inverso. A modificação retro-inversa de polipéptidos que ocorrem naturalmente envolve a reunião sintética de aminoácidos com estereoquímica α-carbono oposta à dos aminoácidos L correspodentes, isto é, aminoácidos D em ordem inversa em relação à sequência peptídica nativa. Um análogo retro-inverso reverteu, assim, os terminais e reverteu a direção das ligações peptídicas (NH-CO em vez de CO-NH) enquanto manteve aproximadamente a topologia das cadeias laterais como na sequência peptídica nativa. Ver Patente U.S. 6 261 569, incorporada aqui por referência.

Conforme mencionado anteriormente, a presente invenção contempla fundir ou conjugar um domínio de entrega de célula (também designado um vetor de entrega de célula ou domínio transdutor de célula) . Tais domínios são bem conhecidos na arte e caracterizam-se, em geral, como sendo péptidos antipáticos ou catiónicos curtos e derivados de péptido, muitas vezes contendo múltiplos resíduos de lisina e arginina (Fischer, 2007). De particular interesse são as sequências poli-D-Arg e poli-D-Lys (por exemplo, resíduos 22 ΕΡ2352508Β1 dextrógiros, oito resíduos de comprimento), enquanto outros são mostrados no Quadro 1, a seguir. QUADRO 1 PÉPTIDOS CDD/CTD_SEQ. ID N.s QAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE 5 RQIKIWF QNRRMKWKK 6 RRMKWKK 7 RRWRRWWRRWWRRWRR 8 RGGRL SYS RRRF S T S T GR 9 Y GRKKRRQRRR 10 RKKRRQRRR 11 Y ARAAARQARA 12 RRRRRRRR 13 KKKKKKKK 14 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKXIL 15 LLILLRRRIRKQANAHSK 16 SRRHHCRSKAKRSRHH 17 NRARRNRRRVR 18 RQLRIAGRRLRGRSR 19 KLIKGRTPIKFGK 20 RRIPNRRPRR 21 KLALKLALKALKAALKLA 22 KLAKLAKKLAKLAK 23 GALFLGFLGAAGSTNGAWSQPKKKRKV 24 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV 25 GALFLGWLGAAGSTMGAKKKRKV 26 MGLGLHLLVLAAALQGAKSKRKV 27 AAVALLPAVLLALLAPAAANYKKPKL 28 MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP 29 LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP 30 DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPXPD 31 PPPPPPPPPPPPPP 32 VRLPPPVRLPPPVRLPPP 33 23 ΕΡ2352508Β1 PRPLPPPRPG 34 SVRRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPP 35 TRS SRAGLQFPVGRVHRLLRK 36 GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS 37 KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK 38 ALWMTLLKKVLKAAAKAALNAVLVGANA 3 9 GIGAVLKVLT TGLPALISWIKRKRQQ 4 0 INLKALAALΑΚΚIL 41 GFFALIPKIISSPLPKTLLSAVGSALGGSGGQE 42 LAKWALKQGFAKLKS 43 SMAQDIISTIGDLVKWIIQTVNXFTKK 44 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKQRIKDFLANLVPRTES 45 LKKLLKKLLKKLLKKLLKKL 4 6 KLKLKLKLKLKLKLKLKL 47 P AWRKAF RWAWRMLKKAA 4 8

Também conforme mencionado previamente, são contemplados péptidos modificados para utilização in vivo pela adição, nas extremidades amino e/ou carboxilo terminal, de um agente bloqueador para facilitar a sobrevivência do péptido in vivo. Isto pode ser útil naquelas situações em que os terminais do péptido tendem a ser degradados por proteases antes da absorção celular. Tais agentes bloqueadores podem incluir, sem limitação, sequências peptídicas adicionais relacionadas ou não relacionadas que podem ser anexas aos resíduos amino e/ou carboxilo terminal do péptido a ser administrado. Estes agentes podem ser adicionados quer quimicamente durante a síntese do péptido ou por tecnologia de ADN recombinante por métodos familiares na arte. Em alternativa, os agentes bloqueadores, tais como o ácido piroglutâmico ou outras moléculas conhecidas na arte podem ser anexas aos resíduos amino e/ou carboxilo terminal. 24 ΕΡ2352508Β1 B. Síntese

Será vantajoso produzir péptidos utilizando as técnicas sintéticas de fase sólida (Merrifield, 1963). Outras técnicas de síntese de péptidos são bem conhecidas daqueles habilitados na arte (Bodanszky et al., 1976; Peptide Synthesis, 1985; Solid Phase Peptide Synthelia, 1984) . Grupos protetores apropriados para utilização em tais sínteses serão encontrados nos textos anteriores, bem como em Protective Groups in Organic Chemistry, 1973. Estes métodos sintéticos envolvem a adição sequencial de um ou mais resíduos de aminoácidos ou resíduos de aminoácidos protegidos adequados a uma cadeia peptídica em crescimento. Normalmente, quer o grupo amino ou carboxilo do primeiro resíduo de aminoácido está protegido por um grupo protetor seletivamente removível adequado. Um grupo protetor seletivamente removível diferente é utilizado para aminoácidos contendo um grupo lateral reativo, tal como lisina.

Utilizando a síntese de fase sólida como um exemplo, o aminoácido protegido ou derivado é anexo a um suporte sólido inerte através do seu grupo carboxilo ou amino desprotegido. 0 grupo protetor do grupo amino ou carboxilo é depois removido seletivamente e o aminoácido seguinte na sequência com o grupo complementar (amino ou carboxilo) adequadamente protegido é misturado e reagido com o resíduo já anexo ao suporte sólido. 0 grupo protetor do grupo amino ou carboxilo é depois removido do seu resíduo de aminoácido recentemente adicionado e o aminoácido seguinte (adequadamente protegido) é depois adicionado e assim sucessivamente. Depois de todos os aminoácidos desejados terem sido ligados na sequência adequada, qualquer terminal restante e grupos protetores do grupo lateral (e suporte sólido) são removidos sequencial ou simultaneamente, para 25 ΕΡ2352508Β1 providenciar o péptido final. Os péptidos da invenção estão preferencialmente desprovidos de aminoácidos benzilados ou metilbenzilados. Tais frações de grupos protetores podem ser utilizadas no decorrer da síntese, mas são removidas antes dos péptidos serem utilizados. Podem ser necessárias reações adicionais, conforme descrito noutro lugar, para formar ligações intramoleculares para restringir a conformação.

Além dos 20 aminoácidos convencionais que podem ser utilizados, existe um número vasto de aminoácidos "não convencionais". Dois deles podem ser especificados pelo código genético, mas são relativamente raros nas proteínas. A selenocisteína é incorporada em algumas proteínas num codão UGA, que é normalmente um codão de terminação. A pirrolisina é utilizada por alguns archaea metanogénicos em enzimas que eles utilizam para produzir metano. É codificado com o codão UAG. Exemplos de aminoácidos não convencionais que não são encontrados em proteínas incluem lantionina, ácido 2-aminoisobutírico, dehidroalanina e o neurotransmissor ácido gama-aminobutítico. Os aminoácidos não convencionais ocorrem, com frequência, como intermediários nas vias metabólicas para aminoácidos convencionais - por exemplo ornitina e citrulina ocorrem no ciclo da ureia, parte do catabolismo aminoacídico. Os aminoácidos não convencionais são normalmente formados através de modificações a aminoácidos convencionais. Por exemplo, a homocisteína é formada através da via de transsulfuração ou por desmetilação da metionina através do metabolito intermediário S-adenosilo metionina, enquanto a hidroxiprolina é feita por uma modificação pós-translacional da prolina. 26 ΕΡ2352508Β1 C. Ligantes

Os ligantes ou agentes reticulados podem ser utilizados para fundir péptidos da MUC1 a outras sequências proteicas. Reagentes reticulados bifuncionais foram extensivamente utilizados para uma variedade de fins incluindo a preparação de matrizes de afinidade, modificação e estabilização de estruturas diversas, identificação de locais de ligação do ligando e recetor e estudos estruturais. Os reagentes homobifuncionais que transportam dois grupos funcionais idênticos provaram ser altamente eficientes na indução de reticulação entre macromoléculas ou subunidades idênticas e diferentes de uma macromolécula e ligação de ligandos polipeptidicos aos seus locais de ligação específicos. Os reagentes heterobifuncionais contêm dois grupos funcionais diferentes. Ao tirar partido das reatividades diferentes dos dois grupos funcionais diferentes, a reticulação pode ser controlada tanto seletiva como sequencialmente. Os agentes reticulados bifuncionais podem ser divididos de acordo com a especificidade dos seus grupos funcionais, por exemplo, grupos amino, sulfhidrilo, guanidino, indol ou carboxilo específicos. Destes, os reagentes dirigidos a grupos amino livres tornaram-se particularmente populares por causa da sua disponibilidade comercial, facilidade de síntese e condições de reação moderadas sob as quais podem ser aplicadas. Uma maioria de reagentes reticulados heterobifuncionais contém um grupo amino reativo primário e um grupo reativo tiol.

Noutro exemplo, os reagentes reticulados heterobifuncionais e métodos de utilizar os reagentes reticulados são descritos na Patente U.S. 5 889 155, especificamente incorporados aqui por referência na sua totalidade. Os reagentes reticulados combinam um resíduo de 27 ΕΡ2352508Β1 hidrazida nucleofílico com um resíduo de maleimida eletrofílico, permitindo a união num exemplo, de aldeídos em tiois livres. 0 reagente reticulado pode ser modificado para reticular vários grupos funcionais e é, por isso, útil para reticular polipéptidos. Nos casos em que um péptido particular não contém um resíduo passível para um dado reagente reticulado na sua sequência nativa, podem ser utilizadas alterações de aminoácidos sintéticas ou genéticas conservadoras na sequência primária.

Outra utilização de ligantes no contexto de péptidos como terapêuticos é a designada tecnologia "Péptido grampeado" da Aileron Therapeutics. A abordagem geral para "grampear" um péptido é que dois resíduos chave dentro do péptido são modificados por anexação dos ligantes através das cadeias laterais dos aminoácidos. Uma vez sintetizados, os ligantes são ligados através de um catalisador, criando, assim, uma ponte que restringe fisicamente o péptido na sua forma α-helical nativa. Além de ajudar a reter a estrutura nativa necessária para interagir com uma molécula alvo, esta conformação também providencia estabilidade contra as peptidases bem como propriedades permeadoras de célula. As Patentes U.S. 7 192 713 e 7 183 059, que descrevem esta tecnologia, são pela presente incorporadas por referência. Ver também Schafmeister et al., Journal of the American Chemical Society, 2000. 122(24): páginas 5891-5892. D. Desenho, Variantes e Análogos A presente invenção centra-se em péptidos que compreendem a sequência CQCRRK. Tendo identificado esta estrutura chave na formação de oligómero da MUC1, os inventores também contemplam que as variantes da sequência CQCRRK pode ser empregue. Por exemplo, certos aminoácidos não naturais que satisfazem as restrições estruturais da 28 ΕΡ2352508Β1 sequência CQC podem ser substituídos sem uma perda e talvez com uma melhoria na função biológica. Além disso, os presentes inventores também contemplam que compostos estruturalmente semelhantes podem ser formulados para imitar as porções chave do péptido ou polipéptidos da presente invenção. Tais compostos, que podem ser designados péptidomiméticos, podem ser utilizados da mesma forma que os péptidos da invenção e, portanto, são também equivalentes funcionais.

Certos miméticos que imitam elementos de estrutura proteica secundária e terciária estão descritos em Johnson et al. (1993) . 0 aumento subjacente à utilização de miméticos peptídicos é que a espinha dorsal peptídica das proteínas existe principalmente para orientar as cadeias laterais de aminoácidos de forma a facilitar as interações moleculares, tais como aqueles de anticorpo e/ou antigénio. Um mimético peptídico é, assim, desenhado para permitir interações moleculares semelhantes à molécula natural. Métodos para gerar estruturas específicas foram revelados na arte. Por exemplo, miméticos α-hélice são revelados nas Patentes U.S. 5 446 128; 5 710 245; 5 840 833 e 5 859 184. Métodos para gerar β-voltas e β-saliências conformacionalmente restritas são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. 5 440 013; 5 618 914 e 5 670 155. Outros tipos de voltas miméticas incluem voltas inversas e □-voltas. Miméticos de voltas inversas são revelados nas Patentes U.S. 5 475 085 e 5 929 237 e miméticos D-voltas são descritos nas Patentes U.S. 5 672 681 e 5 674 976.

Conforme utilizado aqui, "modelação molecular" significa análise quantitativa e/ou qualitativa da estrutura e função da interação física proteína-proteína com base em informação estrutural tridimensional e modelos 29 ΕΡ2352508Β1 de interação proteína-proteína. Isto inclui dinâmica molecular baseada em números convencional e modelos de minimização de energia, modelos gráficos de computador interativos, modelos mecânicos moleculares modificados, geometria de distância e outros modelos de restrição com base na estrutura. A modelação molecular é realizada tipicamente utilizando um computador e pode ser ainda otimizada utilizando métodos conhecidos. Os programas de computador que utilizam dados de cristalografia por raios X são particularmente úteis para desenhar tais compostos. Programas como RasMol, por exemplo, podem ser utilizados para gerar modelos tridimensionais. Os programas de computador como INSIGHT (Accelrys, Burlington, MA) , GRASP (Anthony Nicholls, Universidade de Columbia), Dock (Instituto de Desenho Molecular, Universidade da Califórnia em San Francisco) e Auto-Dock (Accelrys) permitem manipulação adicional e a possibilidade de introduzir novas estruturas. Os métodos podem envolver a etapa adicional de exportar para um dispositivo de saída de dados um modelo da estrutura 3-D do composto. Além disso, os dados 3-D dos compostos candidatos podem ser comparados com uma base de dados informática de, por exemplo, estruturas 3-D.

Compostos da invenção também podem ser desenhados interativamente a partir de informação estrutural dos compostos descritos aqui utilizando outras técnicas de modelação/desenho baseadas na estrutura (ver, por exemplo, Jackson, 1997; Jones et al., 1996). Compostos candidatos podem então ser testados em ensaios convencionais familiares daqueles habilitados na arte. Ensaios exemplares são descritos aqui. A estrutura 3-D das macromoléculas biológicas (por exemplo, proteínas, ácidos nucleicos, hidratos de carbono e lípidos) pode ser determinada a partir de dados obtidos por 30 ΕΡ2352508Β1 uma variedade de metodologias. Estas metodologias, gue foram aplicadas mais eficazmente na avaliação da estrutura 3-D de proteínas, incluem: (a) cristalografia de raios x; (b) espetroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN); (c) análise das restrições de distância física formadas entre locais definidos numa macromolécula, por exemplo, reticulações químicas intramoleculares entre resíduos numa proteína (por exemplo, PCT/US00/14667, a revelação da qual é incorporada aqui por referência na sua totalidade) e (d) métodos de modelação molecular baseados num conhecimento da estrutura primária de uma proteína de interesse, por exemplo, técnicas de modelação de homologia, algoritmos de enfiamento ou modelação de estrutura ab initio utilizando programas de computador como MONSSTER (Modeling Of New Structures from Secondary and T^ertiary Restraints) (ver, por exemplo, Pedido Internacional N.° PCT/US99/11913, a revelação da qual é incorporada aqui por referência na sua totalidade). Outras técnicas de modelação molecular também podem ser empregues de acordo com esta invenção (por exemplo, Cohen et al., 1990; Navia et al., 1992), as revelações das quais são incorporadas aqui por referência na sua totalidade). Todos estes métodos produzem dados que são passíveis de análise informática. Outros métodos espetroscópicos que também podem ser úteis no método da invenção, mas que não providenciam atualmente detalhe estrutural de nível atómico sobre as biomoléculas, incluem dicroísmo circular e espetroscopia de absorvância de luz ultravioleta/visivel e de fluorescência. Um método preferido de análise é a cristalografia de raios X. Descrições deste procedimento e de espetroscopia de RMN são providenciados a seguir.

Cristalografia de raios X. A cristalografia de raios X é baseada na difração de radiação x de um comprimento de onda caracteristico por nuvens de eletrões que rodeiam os 31 ΕΡ2352508Β1 núcleos atómicos num cristal de uma molécula ou complexo molecular de interesse. A técnica utiliza cristais de macromoléculas biológicas purificadas ou complexos moleculares (mas estes frequentemente incluem componentes solventes, co-fatores, substratos ou outros ligandos) para determinar resolução quase atómica dos átomos que constituem a macromolécula biológica particular. Um pré-requisito para resolver a estrutura 3-D por cristalografia de raios X é um cristal bem ordenado que difratará fortemente os raios x. 0 método dirige um feixe de raios x para um conjunto repetido, regular de muitas moléculas idênticas de modo que os raios x são difratados do conjunto num padrão a partir do qual a estrutura de uma molécula individual pode ser recuperada. Cristais bem ordenados de, por exemplo, moléculas proteicas globulares são grandes, objetos esféricos ou elipsoidais com superfícies irregulares. Os cristais contêm grandes canais entre as moléculas individuais. Estes canais, que normalmente ocupam mais de metade do volume do cristal, são preenchidos com moléculas solventes desordenadas e as moléculas proteicas estão em contacto umas com as outras em apenas algumas regiões pequenas. Esta é uma razão pela qual as estruturas das proteínas nos cristais são geralmente as mesmas que as das proteínas em solução. Métodos de obter as proteínas de interesse são descritos a seguir. A formação de cristais depende de um número de parâmetros diferentes, incluindo pH, temperatura, a concentração da macromolécula biológica, a natureza do solvente e precipitante, bem como a presença de iões ou ligandos da proteína adicionados. Muitas experiências de cristalização rotineiras podem ser necessárias para classificar todos estes parâmetros para as combinações que originam um cristal adequado para análise de difração de raios x. Robots de cristalização podem automatizar e 32 ΕΡ2352508Β1 acelerar o trabalho de estabelecer de forma reproduzível um grande número de experiências de cristalização (ver, por exemplo, Patente U.S. 5 790 421, a revelação da qual é incorporada aqui por referência na sua totalidade). A cristalização dos polipéptidos ocorre em soluções nas quais a concentração do polipéptido excede o seu máximo de solubilidade (isto é, a solução do polipéptido está supersaturada). Tais soluções podem ser restauradas para o equilíbrio reduzindo a concentração do polipéptido, preferencialmente através de precipitação dos cristais do polipéptido. Com frequência, a cristalização dos polipéptidos pode ser induzida a partir de soluções supersaturadas adicionando agentes que alteram as cargas da superfície do polipéptido ou perturbam a interação entre o polipéptido e volume de água para promover associações que conduzem à cristalização.

As cristalizações são geralmente executadas entre 4°C e 20°C. As substâncias conhecidas como "precipitantes" são, com frequência, utilizadas para diminuir a solubilidade do polipéptido numa solução concentrada formando uma camada escassa precipitante desfavorável energeticamente à volta das moléculas do polipéptido (Weber, 1991). Além dos precipitantes, outros materiais são, por vezes, adicionados à solução de cristalização do polipéptido. Estes incluem tampões para ajustar o pH da solução e sais para reduzir a solubilidade do polipéptido. Vários precipitantes são conhecidos na arte e incluem os seguintes: etanol, 3-etil-2-4 pentanodiol e muitos dos poliglicóis, tais como polietilenoglicol (PEG). As soluções precipitantes podem incluir, por exemplo, 13-24% PEG 4000, 5-41% sulfato de amónio e 1,0-1,5 M cloreto de sódio e um pH que oscila de 5,0-7,5. Outros aditivos podem incluir 0,1 M Hepes, 2-4% butanol, 20-100 mM acetato de sódio, 50-70 mM ácido 33 ΕΡ2352508Β1 cítrico, 120-130 mM fosfato de sódio, 1 mM ácido etileno diamina tetraacético (EDTA) e 1 mM ditiotreitol (DTT). Estes agentes são preparados em tampões e são adicionados gota a gota em várias combinações ao tampão de cristalização. As proteínas que vão ser cristalizadas podem ser modificadas, por exemplo, por fosforilação ou utilizando um mímico fosfato (por exemplo, tungstato, cacodilato ou sulfato). Métodos de cristalização de polipéptidos vulgarmente utilizados incluem as seguintes técnicas: em série, gota suspensa, iniciação de semente e diálise. Em cada um destes métodos, é importante promover a cristalização continuada após a nucleação mantendo uma slução supersaturada. No método em série, o polipéptido é misturado com precipitantes que atingem a super-saturação e o vaso é selado e colocado a repousar até os cristais aparecerem. No método da diálise, o polipéptido é retido numa membrana de diálise selada que é colocada numa solução que contém precipitante. 0 equilíbrio por toda a membrana aumenta as concentrações do polipéptido e do precipitante, fazendo, assim, com que o polipéptido atinja níveis de supersaturação.

Na técnica de gota suspensa preferida (McPherson, 1976), é criada uma mistura inicial de polipéptido adicionando um precipitante a uma solução de polipéptido concentrada. As concentrações do polipéptido e precipitantes são tais que nesta forma inicial, o polipéptido não cristaliza. Uma pequena gota desta mistura é colocada numa lâmina de vidro que é invertida e suspensa sobre um reservatório de uma segunda solução. O sistema é então selado. Tipicamente, a segunda solução contém uma concentração mais elevada de precipitante ou outro agente desidratante. A diferença nas concentrações do precipitante 34 ΕΡ2352508Β1 faz com que a solução proteica tenha uma pressão de vapor mais elevada do que a segunda solução. Uma vez que o sistema que contém as duas soluções está selado, é estabelecido um equilíbrio e a água da mistura de polipéptido é transferida para a segunda solução. Este equilíbrio aumenta a concentração do polipéptido e do precipitante na solução do polipéptido. À concentração crítica do polipéptido e do precipitante, pode formar-se um cristal do polipéptido.

Outro método de cristalização introduz um local de nucleação numa solução de polipéptido concentrada. Em geral, é preparada uma solução de polipéptido concentrada e um cristal semente do polipéptido é introduzido nesta solução. Se as concentrações do polipéptido e de quaisquer precipitantes estiverem corretas, o cristal semente providenciará um local de nucleação à volta do qual se forma um cristal maior.

Ainda outro método de cristalização é um método de eletrocristalização no qual a utilização é feita dos momentos de dipolo de macromoléculas proteicas que se auto-alinham na camada Helmholtz adjacente a um elétrodo (ver, por exemplo, Patente U.S. 5 597 457, a revelação da qual é incorporada aqui por referência na sua totalidade).

Algumas proteínas podem ser recalcitrantes à cristalização. Contudo, estão disponíveis várias técnicas ao artesão habilitado para induzir a cristalização. Por exemplo, a remoção de segmentos flexíveis do polipéptido na extremidade amino ou carboxilo terminal da proteína pode facilitar a produção de amostras proteicas cristalinas. A remoção de tais segmentos pode ser realizada utilizando técnicas de biologia molecular ou tratamento da proteína com proteases, tais como tripsina, quimiotripsina ou 35 ΕΡ2352508Β1 subtilisina.

Em experiências de difração, um feixe estreito e paralelo de raios x é tomado da fonte de raios x e dirigido para o cristal para produzir feixes difratados. Os feixes primários acidentais podem causar dano tanto à macromolécula como às moléculas solventes. 0 cristal é, portanto, arrefecido (por exemplo, para entre -220°C e -50°C) para prolongar o seu tempo de vida. O feixe primário tem de atingir o cristal a partir de muitas direções para produzir todas as manchas de difração possíveis, pelo que o cristal é rodado no feixe durante a experiência. As manchas difratadas são registadas num filme ou por um detetor eletrónico. O filme exposto tem de ser digitalizado e quantificado num dispositivo de digitalização, enquanto que os detetores eletrónicos se alimentam de sinais que detetam diretamente para um computador. Os detetores de área eletrónicos reduzem significativamente o tempo necessário para recolher e medir os dados de difração. Cada feixe de difração, que é registado como uma mancha num filme ou numa placa detetora, é definido por três propriedades: a amplitude, que é medida a partir da intensidade da mancha; o comprimento de onda, que é definido pela fonte de raios x e a fase, que é perdida nas experiências de raios x. Todas estas três propriedades são necessárias para todos os feixes difratados de modo a determinar as posições dos átomos dando origem aos feixes difratados. Uma forma de determinar as fases é chamada de Substituição Isomórfica Múltipla (MIR), que requer a introdução de dispersores de raios x exógenos (por exemplo, átomos pesados tais como átomos de metal) na célula unitária do cristal. Para uma descrição mais detalhada da MIR, ver Patente U.S. 6 093 573 (coluna 15) , a revelação da qual é incorporada aqui por referência na sua totalidade. 36 ΕΡ2352508Β1

As coordenadas atómicas referem-se às coordenadas Cartesianas (posições x, y e z) derivadas de equações matemáticas envolvendo sínteses de Fourier dos dados derivados de padrões obtidos através da difração de um feixe monocromático de raios x pelos átomos (centros dispersores) da macromolécula biológica de interesse na forma de cristal. Os dados de difração são utilizados para calcular mapas de densidade de eletrões de unidades repetidas no cristal (célula unitária). Os mapas de densidade de eletrões são utilizados para estabelecer as posições (coordenadas atómicas) de átomos individuais dentro da célula unitária de um cristal. Os valores absolutos das coordenadas atómicas relatam relações espaciais entre átomos porque os valores absolutos atribuídos às coordenadas atómicas podem ser alterados por movimento rotacional e/ou translacional ao longo dos eixos x, y e/ou z, em conjunto ou separadamente, enquanto mantêm as mesmas relações espaciais relativas entre átomos. Portanto, uma macromolécula biológica (por exemplo, uma proteína) cujo conjunto de valores absolutos das coordenadas atómicas pode ser ajustado rotacionalmente ou translacionalmente para coincidir com um conjunto de valores pré-determinados de uma análise de outra amostra é considerada ter as mesmas coordenadas atómicas que aquela obtida de outra amostra.

Detalhes adicionais sobre cristalografia de raios X podem ser obtidos a partir do Pedido co-pendente U.S. N.° 2005/0015232, Patente U.S. 6 093 573 e Pedidos Internacionais N.°s PCT/US99/18441, PCT/US99/11913 e PCT/US00/03745. As revelações de todos estes documentos de patente são incorporadas aqui por referência na sua totalidade.

Espetroscopia de RMN. Enquanto que a cristalografia de 37 ΕΡ2352508Β1 raios X requer cristais únicos de uma macromolécula de interesse, as medições por RMN são realizadas em solução em condições quase fisiológicas. Contudo, as estruturas derivadas de RMN não são tão detalhadas como as estruturas derivadas de cristais.

Enquanto que a utilização da espetroscopia de RMN foi até relativamente recentemente limitada pela elucidação da estrutura 3-D de moléculas relativamente pequenas (por exemplo, proteínas de 100-150 resíduos de aminoácidos), avanços recentes incluindo rotulagem isotópica da molécula de interesse e espetroscopia otimizada de relaxação transversa (TROSY) permitiram que a metodologia fosse estendida à análise de moléculas muito maiores, por exemplo, proteínas com um peso molecular de 110 kDa (Wider, 2000) . A RMN utiliza radiação de rádio-frequência para examinar o ambiente dos núcleos atómicos magnéticos num campo magnético homogéneo pulsado com uma frequência rádio específica. Os pulsos perturbam a magnetização nuclear desses átomos com núcleos de giro não nulo. Sinais de domínio temporais provisórios são detetados à medida que o sistema regressa ao equilíbrio. Transformação de Fourier do sinal provisório num domínio de frequência produz um espetro de RMN unidimensional. Picos nestes espetros representam mudanças químicas dos vários núcleos ativos. A mudança química de um átomo é determinada pelo seu ambiente eletrónico local. Experiências de RMN bidimensionais podem providenciar informação sobre a proximidade de vários átomos na estrutura e no espaço tridimensional. As estruturas proteicas podem ser determinadas realizando um número de experiências de RMN bi (e, por vezes, tri ou tetra) dimensionais e utilizando a informação resultante como restrições numa série de simulações de dobragem de 38 ΕΡ2352508Β1 proteínas .

Mais informação sobre espetroscopia de RMN incluindo descrições detalhadas de como os dados brutos obtidos de uma experiência de RMN pode ser utilizados para determinar a estrutura 3-D de uma macromolécula pode ser encontrada em: Protein NMR Espectroscopy, Principies and Practice, (1996); Gronenborn et al. (1990); e Wider (2000), supra., as revelações de todas as quais são incorporadas aqui por referência na sua totalidade.

Também de interesse são os compostos peptidomiméticos que são desenhados com base em sequências de aminoácidos de compostos da invenção que são péptidos. Compostos peptidomiméticos são compostos sintéticos com um "motivo" de conformação tridimensional que é substancialmente a mesma que a conformação tridimensional de um péptido selecionado. O motivo péptido providencia o composto peptidomimético com a capacidade de inibir a oligomerização da MUC1. Os compostos péptidomiméticos podem ter características adicionais que aumentam a sua utilidade in vivo, tais como permeabilidade celular aumentada e meia-vida biológica prolongada. Os péptidomiméticos têm tipicamente uma espinha dorsal que é, parcialmente ou completamente, um não péptido, mas com grupos laterais que são idênticos os grupos laterais dos resíduos de aminoácidos que ocorrem no péptido no qual o péptidomimético é baseado. Vários tipos de ligações químicas, por exemplo, ligações éster, tioéster, tioamida, retroamida, carbonilo reduzido, dimetileno e quetometileno, são conhecidos na arte como sendo substitutos geralmente úteis de ligações pepetídicas na construção de péptidomiméticos resistentes a proteases. 39 ΕΡ2352508Β1 IV. Terapêuticas A. Formulações farmacêuticas e vias de administração

Onde as aplicações clínicas são contempladas, será necessário preparar composições farmacêuticas numa forma apropriada para o pedido pretendido. Em geral, isto acarretará preparar composições que são essecialmente livres de pirogénios, bem como de outras impurezas que poderiam ser prejudiciais para humanos ou animais.

Uma pessoa desejará em geral empregar sais e tampões apropriados para tornar os vetores de entrega estáveis e permitir a absorção de células alvo. Os tampões também poderão ser empregues quando as células recombinantes são introduzidas num paciente. Composições aquosas da presente invenção compreendem uma quantidade eficaz do vetor para as células, dissolvida ou dispersa num veículo farmaceuticamente aceitável ou meio aquoso. Tais composições também são referidas como inoculações. A frase "farmaceuticamente ou farmacologicamente aceitável" refere-se a entidades moleculares e composições que não produzem reações adversas, alérgicas ou outras desfavoráveis quando administradas a um animal ou a um humano. Conforme utilizado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui todo e qualquer solvente, meios de dispersão, agentes de revestimento, antibacterianos e antifúngicos, agentes retardadores isotónicos e de absorção e afins. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecida na arte. Exceto até onde como qualquer meio ou agente convencional é incompatível com os vetores ou células da presente invenção, a sua utilização em composições terapêuticas é contemplada. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. 40 ΕΡ2352508Β1

As composições ativas da presente invenção podem incluir preparações farmacêuticas clássicas. A administração destas composições de acordo com a presente invenção será através de qualquer via comum desde que o tecido alvo esteja disponível através desta via. Tais vias incluem a via oral, nasal, bucal, retal, vaginal ou tópica. Em alternativa, a administração pode ser por injeção ortotópica, intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa. Tais composições seriam normalmente administradas como composições farmaceuticamente aceitáveis, descritas supra. De interesse particular é a administração intratumoral direta, perfusão de um tumor ou administração local ou regional a um tumor, por exemplo, na vasculatura local ou regional ou sistema linfático ou na cama de um tumor ressequido.

Os compostos ativos também podem ser administrados por via parentérica ou intraperitoneal. As soluções dos compostos ativos como base livre ou sais farmacologicamente aceitáveis podem ser preparadas em água adequadamente misturadas com um tensioativo, tal como hidroxipropilcelulose. Também podem ser preparadas disperses em glicerol, polietilenoglicóis liquidos e misturas dos mesmos e em óleos. Em condições normais de armazenamento e utilização, estas preparações contêm um conservante para prevenir o crescimento dos microorganismos.

As formas farmacêuticas adequadas para utilização injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, a forma tem de ser estéril e tem de ser fluida na medida em que existe injetabilidade fácil. Tem de ser estável nas condições de fabrico e armazenamento e tem de ser 41 ΕΡ2352508Β1 preservado contra a ação contaminante de microorganismos, tais como bactérias e fungos. 0 veiculo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol liguido e afins), misturas adequadas dos mesmos e óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento, tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através da utilização de tensioativos. A prevenção da ação dos microorganismos pode ser efetuada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e afins. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser efetuada pela utilização nas composições de agentes retardadores da absorção, por exemplo, monostearato de alumínio e gelatina. São preparadas soluções injetáveis estéreis incorporando os compostos ativos na quantidade necessária no solvente apropriado com vários de outros ingredientes enumerados acima, conforme requerido, seguido de esterilização filtrada. Em geral, as dispersões são preparadas incorporando os vários ingredientes ativos esterilizados num veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários desses enumerados acima. No caso dos pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são técnicas de secagem a vácuo e liofilização que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma solução previamente estéril-filtrada do mesmo.

Conforme utilizado aqui, "veículo farmaceuticamente 42 ΕΡ2352508Β1 aceitável" inclui todo e qualquer solvente, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores e absorção e afins. A utilização de tais meios e agentes para substâncias ativas farmacêuticas é bem conhecida na arte. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o ingrediente ativo, a sua utilização nas composições terapêuticas é contemplada. Também podem ser incorporados ingredientes ativos suplementares nas composições.

Para administração oral os polipéptidos da presente invenção podem ser incorporados com excipientes e utilizados na forma de enxaguantes bucais e dentríficos não ingeríveis. Um enxaguante pode ser preparado incorporando o ingrediente ativo na quantidade necessária num solvente apropriado, tais como uma solução de borato de sódio (solução de Dobell). Em alternativa, o ingrediente ativo pode ser incorporado numa lavagem anti-sética contendo borato de sódio, glicerina e bicarbonato de potássio. 0 ingrediente ativo também pode ser disperso em dentríficos, incluindo: géis, pastas, pós e pastas fluídas. 0 ingrediente ativo pode ser adicionado numa quantidade terapeuticamente eficaz a uma pasta dentrífica que pode incluir água, ligantes, abrasivos, agentes aromatizantes, agentes espumantes e humidificadores.

As composições da presente invenção podem ser formuladas numa forma neutra ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácidos (formados com os grupos amino livrs da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos hidroclorídrico ou fosfórico ou tais ácidos orgânicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico e afins. Sais formados com os grupos carboxilo livres também 43 ΕΡ2352508Β1 podem ser derivados a partir de bases inorgânicos tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou ferro e tais bases orgânicos como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaina e afins.

No momento da formulação, as soluções serão administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em tal quantidade de modo a ser terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas numa variedade de formas de dosagem tais como soluções injetáveis, cápsulas de libertação do fármaco e afins. Para administração parentérica numa solução aquosa, por exemplo, a solução deveria ser adequadamente tamponada se necessário e o diluente liquido primeiro trnado isotónico com suficiente solução salina ou glicose. Estas soluções aquosas particulares são especificamente adequadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. Nesta conexão, meios aquosos estéreis que podem ser empregues serão conhecidos daqueles habilitados na arte à luz da presente revelação. Por exemplo, uma dosagem poderia ser dissolvida em 1 ml de solução de NaCl isotónica e ou adicionada a 1000 ml de fluido hipodermóclise ou injetado no local proposto de infusão, (ver, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences," 15a Edição, páginas 1035-1038 e 1570-1580). Alguma variação na dosagem ocorrerá necessariamente dependendo da condição do sujeito a ser tratada. A pessoa responsável pela administração determinará, em qualquer evento, a dose apropriada para o sujeito individual. Além disso, para administração humana, as preparações deveriam cumprir os padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza, conforme requerido pelo Gabinete de Padrões Biológicos da FDA. 44 ΕΡ2352508Β1 B. Tipos de cancro e sujeitos Células cancerígenas às quais utilizações médicas e métodos in vitro da presente invenção podem ser aplicados incluem, em geral, qualquer célula que expressa a MUC1 e mais particularmente, que sobre-expressa a MUC1. Uma célula cancerígena apropriada pode ser uma célula de cancro da mama, de cancro do pulmão, de cancro do cólon, de cancro pancreático, de cancro renal, de cancro do estômago, de cancro hepático, de cancro ósseo, de cancro hematológico (por exemplo, leucemia ou linfoma), de cancro de tecido neural, de melanoma, de cancro ovárico, de cancro testicular, de cancro da próstata, de cancro cervical, de cancro vaginal ou de cancro da bexiga. Além disso, as utilizações médicas da invenção podem ser aplicadas a uma ampla gama de espécies, por exemplo, humanos, primatas não humanos (por exemplo, macacos, babuínos ou chimpanzés) , cavalos, gado bovino, porcos, ovlhas, cabras, cães, gatos, coelhos, cobaias, gerbos, hamsters, ratazanas e ratinhos. C. Utilizações médicas Péptidos ou análogos que inibem a formação de oligómero da MUC1 são geralmente úteis como terapêuticos ou profiláticos anti-cancro. Podem ser administrados a sujeitos mamíferos (por exemplo, pacientes humanos com cancro da mama) isolados ou em conjunto com outros fármacos e/ou radioterapêutica. Os compostos também podem ser administrados a sujeitos que são geneticamente e/ou ambientalmente (devido a, por exemplo, fatores fisiológicos e/ou ambientais) suscetíveis de cancro, por exemplo, sujeitos com um historial familiar de cancro (por exemplo, cancro da mama), sujeitos com inflamação crónica ou sujeitos a stress crónico ou sujeitos que são expostos a condições carcinogénicas ambientais naturais ou não 45 ΕΡ2352508Β1 naturais (por exemplo, exposição excessiva à luz solar, carcinogénios industriais ou fumo do tabaco).

Quando as utilizações da presente invenção são aplicadas a sujeitos com cancro, antes da administração de um composto, o cancro pode, opcionalmente, ser testado para a expressão de MUC1 (expressão da proteína MUC1 ou ARNm da MUC1) or método conhecidos na arte. Desta forma, os sujeitos podem ser identificados como tendo um cancro que expressa ou sobre-expressa a MUC1. Tais testes podem ser realizados in vitro em células cancerígenas obtidas a partir do sujeito. Em alternativa, podem ser realizadas técnicas de tomografia in vivo utiliando, por exemplo, anticorpos radiomarcados específicos para a MUC1. Além disso, fluídos corporais (por exemplo, sangue ou urina) de sujeitos com cancro podem ser testados para níveis elevados da proteína MUC1 ou fragmentos da proteína MUC1. A dosagem requerida depende da escolha da via de administração; a natureza da formulação; a natureza da doença do paciente; o tamanho, peso, área de superfície, idade e sexo do sujeito; outros fármacos sendo administrados; e o julgamento do médico de serviço. Dosagens adequadas estão no intervalo de 0,0001 mg/kg - 100 mg/kg. Espera-se que haja variações amplas na dosagem necessária dada a variedade de compostos disponíveis e das diferentes eficiências das várias vias de administração. Por exemplo, seria de esperar que a administração oral precise de dosagens mais elevadas do que a administração por injeção intravenosa. As variações nestes níveis de dosagem podem ser ajustadas utilizando retinas empíricas convencionais para otimização, como é bem entendido na arte. As administrações podem ser únicas ou múltiplas (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20, 50, 100, 150 ou mais vezes). A encapsulação do polipéptido num veículo de 46 ΕΡ2352508Β1 entrega adequado (por exemplo, micropartículas poliméricas ou dispositivos implantáveis) pode aumentar a eficiência da entrega, particularmente da entrega oral. V. Terapêuticas de combinação A resistência da célula tumoral a agentes deletérios do ADN representa um grande problema na oncologia clinica. Um objetivo da atual pesquisa sobre o cancro é encontrar formas de melhorar a eficácia da quimio e radioterapêuticas. Uma forma é combinando tais terapêuticas tradicionais com terapêutica génica. No contexto da presente invenção, está contemplado que a terapêutica com péptido da MUCl poderia ser utilizada de forma semelhante em conjunto com a intervenção quimioterapêutica, radioterapêutica ou imunoterapêutica.

Para matar células, inibir o crescimento celular, inibir as metástases, inibir a angiogénese ou, de outra forma, reverter ou reduzir o fenótipo maligno das células tumorais, utilizando a sutilizações médicas, métodos e composições in vitro da presente invenção, uma pessoa contactaria, em geral, uma célula alvo com um péptido da MUCl e pelo menos uma outra terapêutica. Estas terapêuticas seriam providenciadas numa quantidade combinada eficaz para matar ou inibir a proliferação da célula. Este processo pode envolver contactar as células com os agentes/terapêuticas ao mesmo tempo. Isto pode ser conseguido contactando a célula com uma única composição ou formulação farmacológica que inclui ambos agentes contactando a célula com duas composições ou formulações distintas, ao mesmo tempo, em que uma composição inclui inclui o péptido da MUCl e a outra inclui o agente.

Em alternativa, o tratamento da MUCl pode preceder ou 47 ΕΡ2352508Β1 seguir o outro tratamento por intervalos que oscilam de minutos a semanas. Em modalidades onde o outro tratamento e o péptido da MUC1 são aplicados separadamente à célula, uma pessoa assegurariaque não é ultrapassado, em geral, um período significativo de tempo entre o tempo de cada entrega, de modo que as terapêuticas continuariam disponíveis para exercer um efetio combinado vantajoso na célula. Em tais casos, está contemplado que se contactaria a célula com ambas modalidades num intervalo de cerca de 12-24 horas uma da outra, num intervalo de cerca de 6-12 horas uma da outra ou com um tempo de atraso de apenas cerca de 12 horas. Em algumas situações, pode ser desejável estender significativamente o período de tempo para tratamento; contudo, onde passam vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) a várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) entre as respetivas administrações. É também concebível que mais de uma administração tanto do péptido da MUC1 como de outra terapêutica será desejada. Várias combinações podem ser empregues, onde o péptido da MUC1 é "A, " e a outra terapêutica é "B, " conforme exemplificado a seguir:

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A A/A/AB B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B

Outras combinações são contempladas. De novo, para conseguir a morte das células, ambas as terapêuticas são entregues a uma célula numa quantidade combinada eficaz para matar a célula.

Agentes ou fatores adequados para utilização numa terapêutica combinada incluem qualquer composto químico ou método de tratamento que induz a danificação do ADN quando aplicado a uma célula. Tais agentes e fatores incluem radiação e ondas que induzem a danificação do ADN tais como, irradiação γ, raios X, irradiação UV, micro-ondas, 48 ΕΡ2352508Β1 emissões eletrónicas e afins. Pretende-se que uma variedade de compostos químicos, também descritos como "quimioterapêuticos" ou "agentes genotóxicos," sejam para utilização nos métodos de tratamento combinados revelados aqui. Ao tratar cancros de acordo com a invenção, contactar-se-iam as células tumorais com um agente além da construção de expressão. Isto pode ser conseguido irradiando o local do tumor localizado com radiação, tal como raios X, luz UV, raios γ ou mesmo micro-ondas. Em alternativa, as células tumorais podem ser contactadas com o agente administrando ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica. Várias classes de agentes quimioterapêuticos são comtempladas para utilização com, em combinação com, péptidos da presente invenção. Por exemplo, antagonistas do recetor do estrogénio seletivo ("SERMs"), tais como Tamoxifeno, 4-hidroxi Tamoxifeno (Afimoxfene), Falsodex, Raloxifeno, Bazedoxifeno, Clomifeno, Femarelo, Lasofoxifeno ou meloxifeno e Toremifeno.

Os agentes quimioterapêuticos contemplados para serem para utilização incluem, por exemplo, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C. A invenção também abrange a utilização de uma combinação de um ou mais agentes deletérios do ADN, sejam baseados em radiação ou compostos reais, tais como a utilização de raios X com cisplatina ou a utilização de cisplatina com etopósido. 0 agente pode ser preparado e utilizado como uma composição terapêutica combinada ou kit, combinando-o com um péptido da MUC1, conforme descrito anteriormente. A proteína de choque térmico 90 é uma proteína reguladora encontrada em muitas células eucariontes. Demonstrou-se que os inibidores da HSP90 são úteis no 49 ΕΡ2352508Β1 tratamento de cancro. Tais inibidores incluem Geldanamicina, 17-(Aliamino)-17-demetoxigeldanamicina, PU-H71 e Rifabutina.

Também são contemplados agentes que reticulam diretamente o ADN ou formam adutos. Podem ser utilizados agentes tais como cisplatina e outros agentes alquilantes do ADN. A cisplatina tem sido amplamente utilizada para tratar cancro, com doses eficazes utilizadas em aplicações clínicas de 20 mg/m2 durante 5 dias cada três semanas durante um total de três cursos. A cisplatina não é absorvida oralmente e, portanto, tem de ser entregue por injeção intravenosa, subcutânea, intratumoral ou intraperitoneal.

Agentes que danificam o ADN também incluem compostos que interferem com a replicação do ADN, mitose e segregação cromossómica. Tais compostos quimioterapêuticos incluem adriamicina, também conhecida como Doxorubicina, Etoposido, Verapamil, Podofilotoxina e afins. Amplamente utilizados num cenário clínico para o tratamento de neoplasmas, estes compostos são administrados através de injeções bólus intravenosas a doses que oscilam de 25-75 mg/m2 em intervalos de 21 dias para a Doxorubicina, a 35-50 mg/m2 para o etoposido por via intravenosa ou o dobro da dose intravenosa se for administrada oralmente. Também são contemplados inibidores de microtúbulos, tais como taxanos. Estas moléculas são diterpenos produzidos pelas plantas do género Taxus e incluem paclitaxel e docetaxel.

Inibidores do recetor do fator de crescimento epidérmico, tais como Iressa, mTOR, o alvo mamífero da rapamicina, também conhecida como proteína 1 (FRAP1) associada a 12-rapamicina de ligação a FK506 é uma proteína serina/treonina quinase que regula o crescimento celular, a 50 ΕΡ2352508Β1 proliferação celular, a mobilidade celular, a sobrevivência celular, a síntese proteica e a transcrição. A rapamicina e análogos da mesma ("rapálogos") estão, portanto, contemplados para utilização em terapêutica de cancro de combinação de acordo com a presente invenção.

Outra terapêutica de combinação possível com os péptidos reivindicados aqui é TNF-α (fator-alfa de necrose tumoral), uma citocina envolvida na inflamação sistémica e um membro de um grupo de citocinas que estimulam a reação de fase aguda. 0 papel principal da TNF é na regulação das células imunes. 0 TNF também é capaz de induzir a morte cellular apoptótica, de induzir a inflamação e de inibir a tumorogénese e a replicação virai.

Agentes que interrompem a síntese e fidelidade dos precursores e subunidades dos ácidos nucleicos também conduzem à danificação do ADN. Como tal, foi desenvolvido um número de precursores dos ácidos nucleicos. Particularmente úteis são agentes que foram sujeitos a teste extensivos e que estão prontamente disponíveis. Como tal, agentes tais como 5-fluorouracilo (5-FU), são preferencialmente utilizados pelo tecido neoplástico, tornando este agente particularmente útil para dirigir para as células neoplásticas. Apesar de ser bastante tóxico, o 5-FU é aplicável numa grande variedade de veículos, incluindo a administração tópica, sendo, contudo, a administração intravenosa com doses que oscilam de 3 a 15 mg/kg/dia vulgarmente utilizada.

Outros fatores que causam danificação do ADN e que foram utilizados extensivamente incluem os vulgarmente conhecidos como raios γ, raios x e/ou a entrega dirigida de radioisótopos a células tumorais. Outras formas de fatores deletérios de ADN também são contempladas, tais como micro- 51 ΕΡ2352508Β1 ondas e irradiação UV. 0 mais provável é que todos estes fatores produzam um dano amplo ao ADN, aos precursores do ADN, à replicação e reparação do ADN e à montagem e manutenção dos cromossomas. Intervalos de dosagem para raios x oscilam entre doses diárias de 50 a 200 Rõntgen para periodos de tempo prolongados (3 a 4 semanas), a doses únicas de 2000 a 6000 Rõntgen. Intervalos de dosagem para radioisótopos variam grandemente e dependem da meia-vida do isótopo, da força e do tipo de radiação emitida e da absorção pelas células neoplásticas. O artesão habilitado é remetido para "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15a Edição, capitulo 33, em particular páginas 624-652. Ocorrerá necessariamente alguma variação na dosagem dependendo da condição do sujeito a ser tratado. A pessoa responsável pela administração determinará, em qualquer evento, a dose apropriada para o sujeito individual.

Além disso, para administração humana, as preparações deveriam cumprir os padrões de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e de pureza, conforme requerido pelo Gabinete dos Padrões Biológicos da FDA.

Os inventores propõem que a entrega local ou regional dos péptidos da MUC1 a pacientes com cancro será muito eficiente para tratar a doença clínica. Do mesmo modo, a quimio ou radioterapêuticas podem ser dirigidas a uma região particular afetada do corpo do sujeito. Em alternativa, a entrega regional ou sistémica da construção de expressão e/ou o agente podem ser apropriados em certas circunstâncias, por exemplo, onde metástases extensivas ocorreram.

Além de combinar a terapêutica MUC1 com a quimio e radioterapêuticas, também está contemplado a combinação com 52 ΕΡ2352508Β1 a imunoterapêutica, terapêutica hormonal, terapêutica de toxinas e cirurgia. Em particular, podem-se empregar terapêuticas dirigidas tais como Avastina, Erbitux, Gleevec, Herceptina e Rituxano.

De notar que qualquer uma das terapêuticas mencionadas podem provar ser úteis por elas próprias para tratar cancro. VI. Exemplos

Os exemplos seguintes são incluídos para demonstrar modalidades particulares da invenção. Deveria ser apreciado por aqueles habilitados na arte que as técnicas reveladas nos exemplos que seguem representam técnicas descobertas pelo inventor que funcionam bem na prática da invenção e, portanto, podem ser consideradas como constituindo modos particulares para a sua prática. Contudo, aqueles habilitados na arte deveriam, à luz da presente revelação, apreciar que podem ser feitas muitas alterações nas modalidades especificas que são reveladas e obter, ainda assim, um resultado afim ou semelhante sem abandonar o espirito e âmbito da invenção. EXEMPLO 1- Materials e métodos

Cultura de células. Linhas de células de cancro da mama humano ZR-75-1, ZR-75-l/vetor, ZR-75-l/MUClARNsi (Ren et ai., 2004) foram crescidas em meio RPMI1640 suplementado com 10% soro bovino fetal desativado pelo calor (HI-FBS), 100 U/ml penicilina e 100 pg/ml estreptomicina (Invitrogen) numa incubadora humif içada a 37 °C e 5% C02. Células de cancro da mama humano MCF-7 e células 293 foram crescidas em meio Eagle modificado por Dulbecco com 10% HI-FBS, antibióticos e 2 mM L-glutamina. Células epiteliais da mama 53 ΕΡ2352508Β1 humanas MCF-10A foram crescidas em meio de crescimento de células epiteliais mamárias (MEGM; Lonza). As células foram tratadas com os péptidos MUC1/CQC ou MUC1/AQA sintetizados pelo MIT Biopolimer Laboratory, Cambridge, MA. A viabilidade foi determinada por exclusão por azul de tripano.

Imunoprecipitação e análise Imunoblot. Foram preparados células inteiras e lisados nucleares conforme descrito (Leng et ai., 2007) . As proteínas solúveis foram sujeitas a imunoprecipitação com anti-Flag (Sigma, St. Louis, MO) . Os imunoprecipitados e as proteínas solúveis foram analisadas por imunoblot com anti-His (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) , anti-GFP (Millipore, Danvers, MA), anti-Flag, anti-MUCl-C (Abl; NeoMarkers, Fremont, CA), anti-lamina B (EMD, La Jolla, CA) ou antί-β-actina (Sigma). A reatividade foi detetada com anticorpos segundos de raiz-forte conjugados com peroxidase e quimioluminescência.

Transfeção celular. Células 293 foram transfetadas com vetores que expressam GFP, GFP-MUC1-CD ou Flag-MUCl-CD na presença de Lipofectamina conforme descrito (Leng et al., 2007).

Absorção de péptido. As células foram incubadas com péptido MUC1/CQC rotulado com FITC (MIT Biopolimer Laboratory), lavadas com PBS frio, fixadas em 1% paraformaldeído/PBS e analisadas para a fluorescência por citometria de fluxo.

Análise da distribuição do ciclo, apoptose e necrose celular. As células foram colhidas, lavadas com PBS, fixadas com 80% etanol e incubadas em PBS contendo 40 mg/ml RNAse and 40 pg/ml iodeto de propídio durante 30 min a 37°C. A distribuição do ciclo celular foi determinada por 54 ΕΡ2352508Β1 citometria de fluxo. 0 conteúdo em ADN da Sub-Gl foi avaliado corando células permeabilizadas com tampão de citrato e fixas em etanol com iodeto de propídio e monitorizando por citometria de fluxo conforme descrito (Yin et al., 2007) . Para avaliação da necrose, as células foram incubadas com 1 pg/ml de iodeto de propídio/PBS durante 5 min à temperatura ambiente e depois monitorizadas por citometria de fluxo conforme descrito (Yin et al., 2007) .

Modelo de xeno-enxerto de tumor mamário humano.

Ratinhos fêmea Balb-c nu/nu (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) , com 4-6 semanas de idade, pesando 18-22 gramas, foram implantados subcutâneamente com tampões de 17-p-estradiol (0,72 mg; Innovative Research, Sarasota, FL) utilizando uma pistola Trocar. Após 24 h, 1 x 107 de células ZR-75-1 embebidas em Matri-Gel (BD Biosciences) foram injetadas subcutâneamente no flanco. Quando os tumores foram detetáveis a ~150 mm3 (Coorte 1) ou 275 mm3 (Coorte 2), os ratinhos foram emparelhados e distribuídos entre grupos controlo e de tratamento. Cada grupo continha 5 ratinhos, cada um dos quias foi marcado com uma etiqueta na orelha e monitorizado ao longo do estudo. A dosagem inicial foi administrada no momento do emparelhamento (dia 1). Solução salina tamponada com fosfato (veículo), péptido MUC1/CQC e péptido MUC1/AQA foram administrados diariamente por injeção intraperitoneal. Os ratinhos foram pesados duas vezes por semana e foram tomadas medições do tumor utilizando calibres cada 4 dias. O volume do tumor (V) foi calculado utilizando a fórmula V = W2 x L/2, onde W e L são os diâmetros mais pequenos e maiores, respetivamente. No momento do sacrifício, os ratinhos foram perfusados com 55 ΕΡ2352508Β1 solução salina e depois com formalina tamponada com fosfato por administração cardiaca. Os tumores foram excisados, fixados em imersão durante 4 h, desidratados através de uma série graduada de etanóis e processados pela técnica de rotina de embebimento em parafina. Os tumores foram avaliados por coloração H&E e para imunoperoxidase por coloração com anti-MUCl conforme descrito (Kufe, 1984). Fármacos e citocinas. Cisdiaminedicloroplatina (II), Doxorubicina (adriamicina) , Taxol (Paclitaxel) foram comprados da Sigma (St. Louis, MO). rh-TNF-alfa foi comprado da Promega (Madison, WI) . 0 péptido GO-203 foi sintetizado pela Anaspec Inc.

Citotoxicidade in vitro e ensaios de combinação. As células foram semeadas numa placa de microtitulo de fundo raso com 96 poços (Fisher) com 1000 células por poço numa experiência durante 6 dias ou a 3000 s por poço numa experiência durante 3 dias. As células foram depois cultivadas durante 24 h. Fármacos anti-cancro e GO-203 foram diluídos às concentrações indicadas e adicionados às células. GO-203 (5 pmol/L) foi adicionado cada 24 h durante 72 h. A viabilidade celular foi determinada adicionando reagente MTS às células e lendo a absorvância a 490 nm por um leitor de microplacas.

Análise dos dados. Os valores lC5o para todos os fármacos anti-cancro foram determinados por análise de regressão não linear utilizando Graphpad Prism (Software GraphPad, San Diego CA). O programa de computador CombiTool (versão 2.001, IMB Jena Biocomputing Group) foi utilizado para calcular o índice de combinação num intervalo de dosagem na presença de 5 pmol/L GO-203. EXEMPLO 2 - Resultados 56 ΕΡ2352508Β1

Efeitos do péptido MUCl/CQC na formação do oligómero MUC1. 0 domínio citoplasmático da MUC1 (MUC1-CD) contém um motivo CQC que é necessário para a formação de oligómeros e localização nuclear (Leng et al., 2007). Para determinar se uma molécula pequena pode ser desenhada para bloquear a oligomerização, os inventores sintetizaram um péptido derivado da região N-terminal da MUC1-CD que contém o motivo CQC (péptido MUCl/CQC; FIGURA IA) . Um domínio de transdução da poli D-arginina foi incluído na síntese para facilitar a entrada do péptido nas células (Fischer, 2007) (FIGURA IA) . Como um controlo, foi sintetizado um péptido semelhante no qual o motivo CQC foi alterado para AQA (péptido MUC1/AQA; FIGURA IA) . Para avaliar a ligação dos péptidos a MUC1-CD, os inventores imobilizaram a MUC1-CD etiquetada com His a um chip sensor BIAcore. O péptido MUCl/CQC ligou-se a His-MUCl-CD com uma constante de dissociação (Kd) de 30 nM (FIGURA 1B) , o que é semelhante ao obtido com oligómeros MUC1-CD (Leng et al., 2007). POr oposição, não houve ligação aparente do péptido MUC1/AQA (dados não mostrados). A MUC1-CD etiquetada com His purificada forma oligómeros conforme detetado por eletroforese em géis de poliacrilamida (FIGURA 1C) . A incubação de His-MUCl-CD com o péptido MUCl/CQC diminuiu substancialmente a formação de oligómeros e aumentou os monómeros (FIGURA 1C) . Além disso, a incubação com o péptido MUC1/AQA teve pouco, se é que algum, efeito (FIGURA 1C) . Para avaliar os efeitos na oligomerização da MUC1 in vivo, células 293 foram transfetadas com vetores que expressam GFP-MUC1-CD e Flag-MUCl-CD (FIGURA 1D, esquerda). Complexos de GFP-MUC1-CD e Flag-MUCl-CD foram detetáveis por co-precipitação dos lisados a partir de células não expostas ao péptido (FIGURA 1D, direita). Em concordância com os resultados in vitro, a incubação das células 293 transfetadas com péptido MUCl/CQC foi associada com a 57 ΕΡ2352508Β1 interrução da interação entre Flag-MUCl-CD e GFP-MUC1-CD (FIGURA 1D, direita). Além disso, o péptido MUC1/AQA não teve qualquer efeito aparente (FIGURA 1D, direita). Estes resultados indicam que o péptido MUC1/CQC se liga a MUC1-CD e bloqueia a formação de oligómeros MUC1-CD in vitro e nas células. Péptido MUC1/CQC bloqueia a direção de MUC1-C para o núcleo. Células de cancro da mama humano ZR-75-1 e MCF-7 sobre-expressam MUC1 endógeno e, portanto, representam modelos potenciais para avaliar os efeitos do péptido MUC1/CQC (Ramasamy et al., 2007). Para avaliar a absorção, as células ZR-75-1 foram incubadas com 5 μΜ de péptido FITC-MUC1/CQC (FIGURA 2A) . Às 2 h, a análise das células por citometria de fluxo mostrou um aumento substancial na intensidade de fluorescência com uma média (MFI) de 145 (FIGURA 2A). Aumentos adicionais na MFI foram identificados às 6 e 24 h (FIGURA 2A) . A oligomerização da MUC1-C é necessária pela sua importação nuclear (Leng et ai., 2007). O tratamento das células ZR-75-1 com o péptido MUC1/CQC ou MUC1/AQA não teve qualquer efeito nos níveis celulares de MUC1-C (FIGURA 2B). Contudo, em consonância com os efeitos na oligomerização, o tratamento com o péptido MUC1/CQC, e não com o MUC1/AQA, foi associado com diminuições nos níveis nucleares de MUC1-C (FIGURA 2B). Efeitos semelhantes foram observados em células MCF-7 com regulação para suprimir os níveis nucleares de MUC1-C em resposta ao tratamento com o péptido MUC1/CQC (FIGURA 2C). Estes resultados indicam que o péptido MUC1/CQC bloqueia a oligomerização da MUC1-C e dirige, assim, a MUC1-C para o núcleo. Péptido MUC1/CQC bloqueia o crescimento e induz a necrose. Para determinar se o péptido MUC1/CQC afeta o crescimento, células ZR-75-1 foram tratadas com 5 μΜ de 58 ΕΡ2352508Β1 MUC1/CQC durante 72 h e monitorizadas durante a distribuição do ciclo celular. De forma significativa, houve uma paragem substancial na fase S quando comparado com a das células por tratar ou tratadas com o péptido MUC1/AQA (FIGURA 3A) . Às 96 h, a população em fase S foi diminuída, potencialmente através da fricção pela morte celular (FIGURA 3A) . Não houve praticamente, se alguma, acumulação de células com conteúdo em ADN da sub-Gl para suportar a indução da apoptose (FIGURA 3A) . Contudo, o tratamento das células ZR-75-1 com o péptido MUC1/CQC, e não com o MUC1/AQA, foi associado com a indução de necrose, que foi detetável às 72 h e mais proeminente às 96 h (FIGURA 3B) . As células MCF-7 responderam de forma semelhante ao péptido MUC1/CQC com paragem do crescimento na fase S (FIGURA 3C) e com a indução da necrose (FIGURA 3D). Estes resultados indicam que o péptido MUC1/CQC inibie o crescimento e induz a necrose das células de cancro da mama humano.

Especificidade do péptido MUC1/CQC por células de carcinoma que expressam a MUCl. Para determinar se o péptido MUC1/CQC tem atividade seletiva contra células de carcinoma mamárias que sobre-expressam MUCl endógena, os inventores trataram células ZR-75-1 que são silenciadas de forma estável para a expressão MUCl com um MUClARNsi (FIGURA 4A). Ao contrário da paragem de crescimento e morte das células controlo ZR-75-1/vetor, o péptido MUC1/CQC teve substancialmente menos efeito nas células ZR-75-l/MUClARNsi (FIGURA 4B). Além disso, o péptido MUC1/CQC não teve qualquer efeito aparente no crescimento das células 293 negativas a MUCl (FIGURA 4C). Também foram realizados estudos na linha de células epiteliais mamárias não transformadas MCF-10A (Muthuswamy, 2001; Soule, 1990), que expressam MUCl, mas a níveis inferiores aos encontrados nas células ZR-75-1 e MCF-7 (Ahmad et al., 2007). Notavelmente, 59 ΕΡ2352508Β1 em contraste com as células ZR-75-1 e MCF-7, o péptido MUC1/CQC não teve qualquer efeito na distribuição do ciclo celular de MCF-10A (FIGURA 4D) e no crescimento (FIGURA 4E). Estes resultados indicam que o péptido MUC1/CQC mostrou atividade seletiva contra células de carcinoma mamário que sobre-expressam a MUC1 endógena. Péptido MUC1/CQC inibe a tumorigenicidade in vivo.

Para determinar se a administração do péptido MUC1/CQC está associado com efeitos no peso corporal, cinco ratinhos fêmea nude (nu/nu) foram injetados por via intraperitoneal (IP) uma vez por dia a uma dose de 50 mg/kg. A administração do péptido ao longo de 11 dias não teve qualquer efeito aparente no peso dos ratinhos individuais. Além disso, não houve qualquer efeito subsequente no peso corporal ao longo dos 28 dias seguintes após a paragem da administração de MUC1/CQC (dados não mostrados). Para avaliar a atividade anti-tumoral, células ZR-75-1 (1 x 107) foram implantadas subcutâneamente nos flancos dos ratinhos nude. Após 12 dias, os ratinhos com tumores de aproximadamente 150 mm3 foram tratados com o péptido MUC1/CQC a doses de 10 e 50 mg/kg/d. Como controlos, os ratinhos foram tratados com veiculo apenas ou com o péptido MUC1/AQA. A administração do péptido MUC1/CQC a 10 mg/kg/d x 21 dias atrasou o crescimento quando comparado com o obtido com o péptido MUC1/AQA dado a 50 mg/kg/d (FIGURA 5A) . Além disso, a administração do péptido MUC1/CQC a 50 mg/kg/d bloqueou o cresimento ao longo dos 7 dias iniciais de tratamento (FIGURA 5A) . Consequentemente, o tratamento foi interrompido e os ratinhos foram monitorizados para novo crescimento. De forma significativa, não houve crescimento detetável dos tumores ao longo dos 17 dias seguintes (FIGURA 5A). Para avaliar em parte a base para a atividade, os tumores colhidos de ratinhos controlo e tratados foram examinados por histopatologia. Os tumores 60 ΕΡ2352508Β1 dos ratinhos tratados com MUC1/CQC (10 e 50 mg/kg) estavam marcadamente necróticos quando comparados com os ratinhos tratados com o veiculo ou com o péptido MUC1/AQA (FIGURA 5B e dados não mostrados). Notavelmente, contudo, as células tumorais também foram detetáveis à volta das áreas de necrose (FIGURA 5B) . Também foram coradas secções dos tumores com um anticorpo contra a MUC1. O tratamento com o péptido MUC1/CQC foi associado com uma regulação marcada para suprimir a expressão da MUC1 quando comparada com a dos tumores controlo e com aqueles tratados com o péptido MUC1/AQA (FIGURA 5C e dados não mostrados).

Também foram realizados estudos em tumores maiores (~275 mm3) (FIGURA 6A). A administração do péptido MUC1/CQC a uma dose intermédia de 30 mg/kg/d x 21 dias foi associada com paragem do crescimento tumoral (FIGURA 6A). Além disso, não houve novo crescimento aparente ao longo dos 31 dias seguintes depois do tratamento (FIGURA 6A) , o que indica, ainda, que o péptido MUC1/CQC é eficaz na paragem do crescimento tumoral. Os tumores colhidos ao dia 52 exibiram áreas extensas de necrose (FIGURA 6B) e regulação para suprimir a expressão da MUC1. Estes resultados indicam que o péptido MUC1/CQC regula suprimindo a expressão da MUC1 e está associado com a indução de necrose e paragem prolongada do crescimento tumoral. Péptidos grampeados CQC ao C-terminal da MUC1. As interações proteína-proteina intracelulares que regem muitas vias biológicas são frequentemente mediadas pelas estruturas em α-hélice de proteínas. Os péptidos helicais também podem interferir com, ou estabilizar, as interações proteína-proteína. Os péptidos helicais nativos têm grandes 61 ΕΡ2352508Β1 falhas como agentes terapêuticos por causa da baixa potência, instabilidade e entrega ineficiente às células. Estudos recentes têm mostrado gue estes problemas poderiam ser ultrapassados por uma modificação química dos péptidos α-helicais designada como grampeamento com hidrocarbono.

Os inventores utilizaram uma sequência peptídica endógena do C terminal da MUC1 (AIVYLIALAVCQCRRKNYG) e

geraram dois péptidos α-helicais, GO-200-1B e GO-200-2B utilizando grampeamento com hidrocarboneto: GO-200-1B: Ac-AIVYL-S5-ALA-S5-CQCRRKNYG-NH2 GO-200-2B: Ac-AKKYL-S5-ALA-B5-CQC-S5-RKNY-NH2

Para determinar se a exposição a GO-200-1B afeta o crescimento de células de carcinoma de pulmão de células não pequenas, células H-1650 foram tratadas com 1 e 5 μΜ de GO-200-1B durante 7 dias e monitorizadas para crescimento. Os resultados demonstram que o tratamento das células com 5 μΜ de GO-200-1 B foi associado com inibição significativa do crescimento (FIGURA 9A) . Além disso, outras linhas de células de carcinoma de pulmão de células não pequenas, H-1975, foram tratadas com 5 μΜ de GO-200-2B durante 3 dias e monitorizadas para crescimento celular, bem como para morte celular. Os resultados demonstram que o tratamento das células H-1975 com GO-200-2B durante 3 dias foi associado com mais de 80% de inibição da proliferação celular. Além disso, GO-200-2B também foi associada com indução significativa da morte celular (FIGURA 9B) . Estes resultados indicam que os péptidos grampeados da MUC1-C são eficazes na indução da paragem de crescimento e morte de células de cancro positivas a MUC1 humanas.

Análogos GO-203. Os estudos recentes dos inventores mostraram que a MUC1 C-terminal péptido (CQCRRKNY-GQLDIFP) está ativa na inibição do crescimento de múltiplas linhas de células de carcinoma. Também demonstraram que um péptido 62 ΕΡ2352508Β1 da MUCl-C-terminal mais curto, CQCRRKN, também está ativo na morte de células tumorais. Contudo, estes péptidos MUCl-C-terminal consistem em aminoácidos L. Mais importante, os péptidos com aminoácidos L são suscetíveis a degradação por enzimas proteolíticas, ao passo que se demonstrou que os que contêm aminoácidos D são mais estáveis. Consequentemente, geraram uma forma toda-dextra do péptido da MUCl-C-terminal mais curto previamente mencionado, no qual os aminoácidos L foram alterados para aminoácidos D (GO-203). Além disso, para determinar os resíduos de aminoácidos mínimos da região C-terminal da MUC1 que são precisos para reter a atividade de morte das células, também geraram muitas versões diferentes da GO-203 conforme descrito na FIGURA 8. Múltiplas linhas de células tumorais (Carcinoma mamário dependente de hormonas ZR-75-1; Carcinoma mamário triplo-negativo MDA-MB-231; Carcinoma de pulmão de não pequenas A549; Carcinoma de pulmão de células não pequenas H-1975) foram crescidas em RPMI-1640 suplementado com 10% soro bovino fetal desativado pelo calor, 100 unidades/mL penicilina e 100 pg/mL estreptomicina e 2 mmol/L L-glutamina. As células foram tratadas separadamente com 5 μΜ de diferentes análogos de GO-203 (FIGURA 8) durante 3 a 7 dias e a viabilidade foi determinada por exclusão por azul de tripano. A proliferação das diferentes linhas de células foi comparada com células tratadas com veículo apenas. Os resultados demonstram que o tratamento de múltiplas linhas de células tumorais com 5 μΜ de diferentes análogos de GO-203 foi associado com inibição significativa do crescimento (FIGURAS 10-14).

Terapêutica de combinação. Os valores do índice de combinação (Cl) gerados pelo programa CombiTool foram representados num gráfico contra a fração afetada pela 63 ΕΡ2352508Β1 combinação do fármaco. Os valores do IC aproximaram-se de 1 para a Cisplatina e GO-203, indicando uma interação aditiva. Os valores do IC obtidos para Doxorubicina (25, 50, 100, 200 nM) , Taxol (25, 50, 100 nM) e TNF (10,20,40 ng/ml) com GO-203 foram inferiores a 1, o que suporta um forte efeito aditivo ou sinergia (FIGURAS 15A-D e 16). Exemplo 3 - Discussão

Péptido MUC1/CQC bloqueia a oligomerização da MUC1. A sobre-expressão da MUC1 é suficiente para a indução de crescimento independente da ancoragem e tumorigenicidade (Li et al., 2003a; Huang et al., 2003; Huang et al., 2005). Notavelmente, contudo, a função transformadora da MUC1 é anulada pela mutação do motivo CQC no domínio citoplasmático em AQA (Leng et al., 2007) . A MUC1 forma oligómeros e o motivo CQC é necessário para esta oligomerização (Leng et al., 2007). Além disso, a formação de oligómeros é necessária para dirigir a subunidade da MUC1-C para o núcleo (Leng et al., 2007). Outras funções da subunidade da MUC1-C, tais como ativação das vias Wnt/β-catenina e IKKb->NF-kB, também estão dependentes da formação de oligómeros da MUC1-C (dados não publicados). Com base nestes resultados, os inventores chegaram à conclusão que a interrução da oligomerização da MUC1 por uma pequena molécula teria o potencial de bloquear a função transformadora da MUC1. Nesse contexto, eles sintetizaram o péptido derivado da MUC1 que contém o motivo CQC e um domínio de entrega da célula poli-Arg para entrada nas células. Estudos preliminares com este péptido MUC1/CQC mostraram que inibe a oligomerização da MUC1-CD in vitro. Conforme mostrado previamente pela análise BIAcore, a MUC1-CD forma dimeros com uma constante de dissociação (Kd) de 33 nM (Leng et al., 2007). O péptido MUC1/CQC liga-se de forma semelhante a MUC1-CD com uma Kd de 30 nM. Além disso, a demonstração de que o péptido MUC1/AQA tem pouco, se 64 ΕΡ2352508Β1 algum, efeito na oligomerização da MUC1 providenciou suporte para a dependência no motivo CQC. MUC1/CQC, e não MUC1/AQA, também foi eficaz em bloguear a oligomerização da MUC1-CD nas células. Estes resultados indicaram, assim, que o péptido MUC1/CQC poderia ser utilizado para interromper a oligomerização da MUC1 e potencialmente, assim, a função da MUC1 nas células de carcinoma mamário humano.

Seletividade do péptido MUCl/CQC para células de carcinoma que sobre-expressam a MUC1. Os domínios de entrega de célula, tais como poli-D-Arg e os seus conjugados, entram nas células, pelo menos em grande parte, por endocitose e depois precisam de atingir o seu alvo pretendido (Fischer, 2007). A entrada do péptido MUCl/CQC nas células de cancro da mama ZR-75-1 foi rapidamente detetada e persistiu durante, pelo menos, 24 h. De forma significativa e consistente com a direção nuclear da MUC1 dependente da oligomerização (Leng et al., 2007), a absorção do péptido MUCl/CQC foi associada com regulação para suprimir os níveis da MUC1-C no núcleo. Resultados semelhantes foram obtidos com células de cancro da mama MCF-7, indicando que esta resposta ao péptido MUCl/CQC não é específica da célula. Além disso e notavelmente, a exposição destas células a MUCl/CQC, e não MUC1/AQA, foi associada com paragem do crescimento e com a indução da necrose. De importência é se a MUCl/CQC induz a morte por um mecanismo dependente da expressão do seu alvo pretendido ou é uma citotoxina não específica. Nesse contexto, silenciar a MUC1 em células ZR-75-1 anulou os efeitos citotóxicos da MUCl/CQC. Por oposição, a exposição de células epiteliais mamárias MCF-10A não malignas ao péptido MUCl/CQC teve pouco efeito. Estes resultados indicam que a sensibilidade ao péptido MUCl/CQC depende a sobre-expressão da MUC1 e uma função da MUC1 associada com o fenótipo maligno. O péptido MUCl/CQC parece, assim, ter uma 65 ΕΡ2352508Β1 atividade negativa dominante que é seletiva para células de carcinoma que sobre-expressam a MUC1.

Atividade anti-tumoral do péptido MUCl/CQC. Os domínios de entrega de célula estão a ser utilizados para entregar cargas terapêuticas (Fischer, 2007) . Contudo, como com qualquer um destes agentes, um problema prioritário é se o péptido MUCl/CQC pode ser entregue in vivo com um índice terapêutico eficaz, que é atividade anti-tumoral e um perfil de toxicidade aceitável. Ao resolver este problema, os inventores verificaram que a administração do péptido MUCl/CQC a 10 e 30 mg/kg/d durante 21 dias foi bem tolerada sem toxicidades agudas aparentes. Também verificaram que o tratamento nestas doses foi eficaz em anular o crescimento do tumor. Estes resultados contrastaram com a administração do péptido MUC1/AQA a 50 mg/kg/d durante 21 dias, que não tiveram qualquer atividade anti-tumoral. Além disso, e de uma forma algo surpreendente, não houve evidência de novo crescimento do tumor depois de dosagem a 30 mg/kg/d durante 21 dias. A administração do péptido MUCl/CQC a 50 mg/kg/d durante 7 dias também demonstrou que o crescimento tumoral permanece parado por períodos longos de tempo após o tratamento. Estes resultados são explicados, pelo menos em parte, pela observação de que o tratamento com o péptido MUCl/CQC está associado com a indução da necrose tumoral. A atividade in vitro da MUCl/CQC 7-mer é tão potente quanto a da MUC 1/CQC 15-mer. Com base nestes resultados, é de esperar que a MUCl/CQC 7-mer também estará ativa como um agente anti-tumor em modelos tumorais in vivo.

Todas as composições e/ou métodos revelados e reivindicados aqui podem ser realizados e executados sem experimentação indevida à luz da presente revelação. Embora 66 ΕΡ2352508Β1 as composições e métodos desta invenção tenham sido descritos em termos das modalidades preferidas, será aparente para aqueles habilitados na arte que podem ser aplicadas variações às composições e/ou aos métodos e às etapas ou à sequência de etapas do método descrito aqui. VII. Referências

As referências seguintes, na medida em que providenciam procedimento exemplar ou outros detalhes suplementares aos apresentados aqui, são especificamente incorporadas aqui por referência:

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SURENDER CITOPLASMÁTICO MUC1

COMO <141> 16- 10- 2009 <150> 61/ 177 . 109 <151> 11- 05- 2009 <150> 61/ 106 .380 <151> 17- 10- 2008 <160> 62 >> Patentln versão <210> 1 <211> 72 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 1 70 ΕΡ2352508Β1

Cys Gin Cys Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gin Leu Asp Ile Phe Pro Ala 15 10 15

Arg Asp Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His 20 25 30

Gly Arg Tyr Vai Pro Pro Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys 35 40 45

Vai Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala 50 55 60

Vai Ala Ala Thr Ser Ala Asn Leu 65 70 <210> 2 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 2 71 ΕΡ2352508Β1

Gly Ser Vai Vai Vai Gin Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile 15 10 15

Asn Vai His Asp Vai Glu Thr Gin Phe Asn Gin Tyr Lys Thr Glu Ala 20 25 30

Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Vai Ser Vai Ser Asp Vai 35 40 45

Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gin Ser Gly Ala Gly Vai Pro Gly Trp Gly 50 55 60

Ile Ala Leu Leu Vai Leu Vai Cys Vai Leu Vai Ala Leu Ala Ile Vai 65 70 75 80

Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Vai Cys Gin Cys Arg Arg Lys Asn Tyr Gly 85 90 95

Gin Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr His Pro Met Ser Glu 100 105 110

Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr Vai Pro Pro Ser Ser Thr 115 120 125

Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Vai Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser 130 135 140 145 150 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido sintético <400> 3

Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Vai Ala Ala Thr Ser Ala Asn Leu

Cys Gin Cys Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gin Leu Asp Ile Phe Pro 1 5 10 15 72 ΕΡ2352508Β1 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <400> 4

Cys Gin C^ Ar(3 *** L^s 1 b <210> 5 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido sintético <400> 5

Gin Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr 15 10 15

Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro 20 25 30

Vai Glu <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido sintético <400> 6

Arg Gin Ile Lys Ile Trp Phe Gin Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 7 <211> 7 73 ΕΡ2352508Β1 ΕΡ2352508Β1 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 7

Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <400> 8

Arg Arg Trp Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Arg Arg 15 10 15 <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 9

Ser Thr 15

Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr 15 10

Gly Arg <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético 74 ΕΡ2352508Β1 <4 Ο 0> 10

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 15 10 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 11 Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg 1 5 Arg Arg <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido sintético <4 0 0> 12 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gin Ala Arg 1 5 10 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 13 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 14 <211> 8 75 ΕΡ2352508Β1 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <400> 14

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 1 5 <210> 15 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido sintético <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223>Xaa pode ser qualquer aminoácido de origem natural <400> 15

Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys He Asn Leu 15 10 15

Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Xaa Ile Leu 20 25 <210> 16 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <400> 16

Leu Leu Ile Leu Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gin Ala Asn Ala His 15 10 15

Ser Lys 76 ΕΡ2352508Β1 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 17 Ser Arg Arg His His Cys Arg Ser Lys Ala Lys Arg Ser Arg His Hi 1 5 10 15 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 18 Asn Arg Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Vai Arg 1 5 10 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 19 Arg Gin Leu Arg Ile Ala Gly Arg Arg Leu Arg Gly Arg Ser Arg 1 5 10 15 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético 77 ΕΡ2352508Β1 <4 0 0> 20 Lys Leu Ile Lys Gly Arg Thr Pro Ile Lys Phe Gly Lys 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 21 Arg Arg Ile Pro Asn Arg Arg Pro Arg Arg 1 5 10 <210> 22 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 22 Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu 1 5 10 15 Leu . Ala <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 23

Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys 15 10 78 ΕΡ2352508Β1 <210> 24 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 24 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe 1 5 Ala Trp Ser Gin Pro Lys Lys 20 <210> 25 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 25 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr 1 5 Lys Lys Arg Lys Vai 20 <210> 26 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 26 10 15 25 10 15 79 ΕΡ2352508Β1

Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly ®er T^r Gly 15 10 15

Ala Lys Lys Lys Arg Lys Vai 20 <210> 27 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido sintético <400> 27

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Ala Lys Ser Lys Arg Lys Vai 20 <210> 28 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 28

Ala Ala Vai Ala Leu Leu Pro Ala Vai Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 15 10 15

Ala Ala Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu 20 25 <210> 29 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético 80 ΕΡ2352508Β1 <4Ο0> 29

Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Vai Thr Met Trp 15 10 15

Thr Asp Vai Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro 20 25 <210> 30 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <400> 30

Leu Gly Thr Tyr Thr Gin Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gin 15 10 15

Thr Ala Ile Gly Vai Gly Ala Pro <210> 31 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <220> <221> misc_feature <222> (24) .. (24) <223>Xaa pode ser qualquer aminoácido de origem natural <400> 31

Asp Pro Lys Gly Asp Pro Lys Gly Vai Thr Vai Thr Vai Thr Vai Thr 15 10 15

Vai Thr Gly Lys Gly Asp Pro Xaa Pro Asp 20 25 <210> 32 81 ΕΡ2352508Β1 <211> 14

<212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <400> 32

Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro- Pro Pro Pro Pro Pro Pro 15 10 <210> 33 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <400> 33

Vai Arg Leu Pro Pro Pro Vai Arg Leu Pro Pro Pro Vai Arg Leu Pro 1 5 10 Pro 1 Pro <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 34 Pro Arg Pro Leu Pro Pro Pro Arg Pro Gly 1 5 10 <210> 35 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <22 0> 82 ΕΡ2352508Β1 <223> Péptido sintético <400> 35

Ser Vai Arg Arg Arg Pro Arg Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro 1 5 10 15

Pro Pro Phe Phe Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg Ile Pro Pro 20 25 30 <210> 36 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 36

Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gin Phe Pro Vai Gly Arg Vai His 15 10 15

Arg Leu Leu Arg Lys 20 <210> 37 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <400> 37

Gly ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe 1 5 10 15

Vai Gly Glu Ile Met Asn Ser 20 <210> 38 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial 83 ΕΡ2352508Β1 <22 0> <223> Péptido sintético <400> 38

Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Vai Gly Gin Asn Ile Arg 15 10 15

Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Vai Ala Vai Vai Gly Gin Ala 20 25 30

Thr Gin Ile Ala Lys 35 <210> 39 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido sintético <4 0 0> 39

Ala Leu Trp Met Thr Leu Leu Lys Lys Vai Leu Lys Ala Ala Ala Lys 15 10 15

Ala Ala Leu Asn Ala Vai Leu Vai Gly Ala Asn Ala 20 25 <210> 40 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 40

Gly He Gly Ala Vai Leu Lys Vai Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 15 10 15

Ile Ser Trp Ile Lys 20

Arg

Lys Arg Gin Gin 25 84 ΕΡ2352508Β1 <210> <211> <212> <213> 41 14 PRT Artificial <220> <223> Péptido sintético <400> 41

Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 15 10 <210> <211> <212> <213> 42 33 PRT Artificial <220> <223> Péptido sintético <400> 42

Gly Phe Phe Ala Leu lie Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Pro Lys 15 10 15

Thr Leu Leu Ser Ala Vai Gly Ser Ala Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gin 20 25 30 Glu <210> <211> <212> <213> 43 15 PRT Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 43

Leu Ala Lys Trp Ala Leu Lys Gin Gly Phe Ala Lys Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> <211> 44 27 85 ΕΡ2352508Β1 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <22 0> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223>Xaa pode ser qualquer aminoácido de origem natural <400> 44

Ser Met Ala Gin Asp Ile Ile Ser Thr Ile Gly Asp Leu Vai Lys T^p 15 10 15 /-

Ile lie Gin Thr Vai Asn Xaa Phe Thr Lys Lys 20 25 <210> 45 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético <400> 45

Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu 15 10 15

Phe Lys Arg Ile Vai Gin Arg Ile Lys Gin Arg Ile Lys Asp Phe Leu 20 25 30

Ala Asn Leu Vai Pro Arg Thr Glu Ser 35 40 <210> 46 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Péptido sintético 86 ΕΡ2352508Β1 <4Ο0> 46

Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Lys Leu 15 10 15

Leu Lys Lys Leu 20 <210> 47 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido sintético <400> 47

Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu 15 10 15

Lys Leu <210> 48 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido sintético <400> 48

Pro Ala Trp Arg Lys Ala Phe Arg Trp Ala Trp Arg Met Leu Lys Lys 15 10 15

Ala Ala <210> 49 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido sintético 87 ΕΡ2352508Β1 <4Ο0> 49

Lys Arg Arg Cys Gin Cys 1 5 <210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 50 Cys Gin Cys Arg Arg 1 5 <210> 51 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 51 Cys Gin Cys Arg Arg Arg 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 52

Cys Gin Cys Arg Arg Arg Arg 1 5

<210> 53 <211> 7 <212> PRT 88 ΕΡ2352508Β1 <213> Sequência artificial <220> <223> Péptido sintético <4 0 0> 53 Cys Gin Cys Arg Arg Lys Asn 1 5 <210> 54 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 54 Cys Gin Cys Arg 1 <210> 55 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 55 Ala Ile Vai Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Vai Cys Gin Cys Arg Arg Lys 1 5 10 15

Asn Tyr Gly <210> 56 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Péptido sintético 89 ΕΡ2352508Β1 <4Ο0> 56

Ala Ile Vai Tyr Leu Ala Leu Ala Cys Gin Cys Arg Arg Lys Asn Tyr 15 10 15

Gly <210> 57 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 57

Arg Lys Asn Tyr 15

Ala Lys Lys Tyr Leu Ala Leu Ala Cys Gin Cys 1 5 10 <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 58

Cys Gin Cys Arg Arg Lys Asn Arg 1 5 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 59

Asn Lys Arg Arg Cys Gin Cys 1 5 90 ΕΡ2352508Β1 <210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 60

Ala Gin Ala Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gin Leu Asp Ile Phe Pro 15 10 15 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 61

Ala Gin Ala Arg Arg Lys Asn 1 5 <210> 62 <211> 69 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido sintético <4 0 0> 62 91 ΕΡ2352508Β1

Cys Gin Cys Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gin Leu Asp Ile Phe Pro Ala 15 10 15

Arg Asp Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His 20 25 30

Gly Arg Tyr Vai Pro Pro Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys 35 40 45

Vai Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu Tyr Thr Asn Pro Ala Vai 50 55 60

Ala Ala Ala Ser Leu 65 92 ΕΡ2352508Β1

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição us 6261569 B [0033] [0123] us 5889155 A [0040] [0123] us 7192713 B [0041] us 7183059 B [0041] us 5446128 A [0044] [0123] us 5710245 A [0044] [0123] us 5840833 A [0044] [0123] us 5859184 A [0044] [0123] us 5440013 A [0044] [0123] us 5618914 A [0044] [0123] us 5670155 A [0044] [0123] us 5475085 A [0044] [0123] us 5929237 A [0044] [0123] us 5672681 A [0044] [0123] us 5674976 A [0044] [0123] us 0014667 W [0047] [0123] us 9911913 W [0047] [0059] us 5790421 A [0049] [0123] us 5597457 A [0055] [0123] us 6093573 A [0057] [0059] us 20050015232 A [0059] [0 us 9918441 W [0059] [0123] us 0003745 W [0059] [0123] us 61177109 B [0124] us 61106380 B [0124] 93 ΕΡ2352508Β1

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Lisboa, 14 de Maio de 2014 97

Claims (25)

1. ΕΡ2352508Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição farmacêutica que compreende (a) um péptido MUC1 de pelo menos 6 resíduos MUC1 consecutivos e não mais de 20 resíduos MUC1 consecutivos e compreendendo a sequência CQCRRK, em que a cisteína do amino-terminal de CQCRRK é coberta no seu terminal NH2 por pelo menos um resíduo de aminoácido que não precisa de corresponder com a sequência transmembranar de MUC1 nativa e (b) um veículo, tampão ou diluente farmaceuticamente aceitável.
2. 2. A composição da reivindicação 1, em que dito péptido tem pelo menos 7 resíduos MUC1 consecutivos.
3. 3. A composição da reivindicação 1, em que dito péptido não compreende mais de 10 resíduos consecutivos, 11 resíduos consecutivos, 12 resíduos consecutivos, 13 resíduos consecutivos, 14 resíduos consecutivos, 15 resíduos consecutivos, 16 resíduos consecutivos, 17 resíduos consecutivos, 18 resíduos consecutivos ou 19 resíduos consecutivos de MUC1.
4. 4. A composição de qualquer reivindicação anterior, em que dito péptido é fundido com um domínio de entrega de célula.
5. 5. A composição da reivindicação 4, em que dito domínio de entreqa de célula é poli-D-R, poli-D-P ou poli-D-K.
6. 6. Um péptido MUC1, conforme definido por qualquer reivindicação anterior.
7. 7. Um péptido MUC1, conforme definido por qualquer reivindicação anterior ou composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, para utilização 1 ΕΡ2352508Β1 em medicina.
8. 8. Um péptido MUC1, conforme definido por qualquer reivindicação anterior ou composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, para utilização na inibição de uma célula de tumor positiva a MUC1 num sujeito.
9. 9. Utilização de um péptido MUC1, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, no fabrico de um medicamento para inibir uma célula de tumor positiva a MUC1 num sujeito.
10. 10. O péptido MUC1 ou composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 8 ou a utilização da reivindicação 9, em que a administração ao sujeito compreende administração intravenosa, intra-arterial, intra-tumoral, subcutânea, tópica, intraperitoneal, local, regional, sistémica ou continua.
11. 11. O péptido MUC1 ou composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 8 ou a utilização da reivindicação 9, em que inibir compreende induzir a paragem de crescimento de dita célula tumoral, apoptose de dita célula tumoral e/ou necrose de um tecido tumoral compreendendo dita célula tumoral.
12. 12. O péptido MUC1 ou composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 8 ou a utilização da reivindicação 9, em que o sujeito é o recetor de uma segunda terapêutica anti-cancro, tal como cirurgia, quimioterapêutica, radioterapêutica, terapêutica hormonal, terapêutica de toxinas, imunoterapêutica e crioterapêutica e, por exemplo, o sujeito recebe a segunda terapêutica 2 ΕΡ2352508Β1 anti-cancro antes de, depois ou ao mesmo tempo que a administração do péptido MUC1 ou composição farmacêutica.
13. 13. 0 péptido MUC1 ou composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o péptido MUC1 ou composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 7 ou 8 ou a utilização da reivindicação 9, em que o péptido MUC1 é apresentado numa formulação farmacológica que inclui ambos péptido MUC1 e um agente quimioterapêutico, um agente radioterapêutico, um agente imunoterapêutico, um agente para terapêutica hormonal ou um agente para terapêutica de toxinas.
14. 14. 0 péptido MUC1 ou composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 8 ou a utilização da reivindicação 9, em que dito péptido é administrado a 0,1-500 mg/kg/d, preferencialmente a 10-100 mg/kg/d.
15. 15. O péptido MUC1 ou composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 8 ou a utilização da reivindicação 9, em que dito péptido é administrado diariamente, preferencialmente diariamente durante 7 dias, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, um mês, 6 semanas, 8 semanas, dois meses, 12 semanas ou 3 meses.
16. 16. O péptido MUC1 ou composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 8 ou a utilização da reivindicação 9, em que dito péptido é administrado semanalmente, preferencialmente semanalmente durante 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas ou 12 semanas.
17. 17. O péptido MUC1 ou composição farmacêutica de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, o péptido MUC1 ou composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 3 ΕΡ2352508Β1 7 ou 8 ou a utilização da reivindicação 9, em que dito péptido compreende todos os aminoácidos L, todos os aminoácidos D ou uma mistura de aminoácidos L e D.
18. 18. 0 péptido MUC1 ou composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 8 ou a utilização da reivindicação 9, em que a expressão de MUC1 numa célula tumoral de dito sujeito foi avaliada antes de administrar dito péptido ou composição farmacêutica e, opcionalmente, dito sujeito foi identificado como tendo um cancro que expressa ou sobre-expressa MUC1.
19. 19. 0 péptido MUC1 ou composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 8 ou a utilização da reivindicação 9, em que o efeito de dito péptido na expressão de MUC1 numa célula tumoral de dito sujeito é avaliado.
20. 20. Um método in vitro de inibir a oligomerização da MUCI e transporte nuclear numa célula que compreende contactar uma célula que expressa MUCI com um péptido MUCI, conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
21. 21. O método in vitro da reivindicação 20, em que a célula que expressa MUCI é uma célula de tumor positiva a MUCI.
22. 22. O péptido MUCI ou composição farmacêutica para utilização de acordo com a reivindicação 8 ou qualquer uma das reivindicações 10 a 19 como dependente da reivindicação 8 ou da utilização da reivindicação 9 ou qualquer uma das reivindicações 10 a 19 como dependentes da reivindicação 9, em que dito sujeito é um humano.
23. 23. O péptido MUCI ou composição farmacêutica da reivindicação 8 ou qualquer uma das reivindicações 10 a 19 4 ΕΡ2352508Β1 ou 22 como dependentes da reivindicação 8, a utilização da reivindicação 9 ou qualquer uma das reivindicações 10-19 ou 22 como dependentes da reivindicação 9 ou o método da reivindicação 21, em que a célula tumoral positiva MUC1 é uma célula de carcinoma, uma célula leucémica ou uma célula de mieloma, por exemplo uma célula de carcinoma da próstata ou mama.
24. 24. Um péptido MUC1 com pelo menos 6 resíduos MUC1 consecutivos e não mais de 20 resíduos MUC1 consecutivos e compreendendo a sequência CQCRRK ou KRRCQC, em que todos os resíduos de aminoácidos de dito péptido são aminoácidos D.
25. 25. O péptido da reivindicação 24, compreendendo a sequência de KRRCQC. Lisboa, 14 de Maio de 2014 5