ES2395028T3 - Péptidos del dominio citoplasmático de MUC-1 como inhibidores del cáncer - Google Patents

Abstract

Un método de inhibir una célula tumoral MUC1-positiva en un sujeto que comprende administrar adicho sujeto un péptido MUC1 de al menos 4 residuos consecutivos de MUC1 y no más de 20residuos consecutivos de MUC1 y comprendiendo la secuencia CQC (SEC. ID Nº:4), en la que lacisteína amino-terminal de CQC está cubierta en su extremidad NH2 terminal por al menos unresiduo aminoácido que no necesita corresponder a la secuencia nativa de MUC-1 transmembrana.

Description

Péptidos del dominio citoplasmático de MUC-1 como inhibidores del cáncer

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a la regulación del crecimiento celular, y más particularmente a la regulación del crecimiento celular canceroso. En particular, los péptidos MUC1 derivados de una región particular del dominio citoplasmático de MUC1 han demostrado inhibir la oligomerización de MUC1 y la translocación nuclear, causando la inhibición e incluso la muerte de células tumorales que expresan MUC1.

2. Técnica relacionada

Las mucinas son proteínas mayoritariamente O-glucosiladas que se expresan predominantemente por células epiteliales. Las mucinas secretadas y unidas a membrana forman una barrera física que protege los límites apicales de las células epiteliales del daño inducido por toxinas, microorganismos y otras formas de estrés que sucede en la superficie de contacto con el entorno externo. La mucina 1 transmembrana (MUC1) también puede proporcionar señalización al interior de la célula a través de su dominio citoplasmático. MUC1 no tiene similitud de secuencia con otras mucinas unidas a membrana, excepto por la presencia de un dominio de proteína-enteroquinasa-agrina (SEA) de esperma de erizo de mar (Duraisamy y col., 2006). A este respecto, MUC1 se traduce como un único polipéptido y después experimenta auto-escisión en el dominio SEA (Macao, 2006).

La subunidad N-terminal de MUC1 (MUC1-N) contiene cantidades variables de repeticiones en tándem con una elevada proporción de serinas y treoninas que se modifican por O-glucosilación (Siddiqui, 1988). MUC1-N se extiende más allá del glucocálix de la célula y se encuentra anclado a la superficie celular a través de unión no covalente a la subunidad C-terminal de MUC1 transmembrana (MUC1-C) (Merlo, 1989). MUC1-C consta de un dominio extracelular de 58 aminoácidos, un dominio transmembrana de 28 aminoácidos y un dominio citoplasmático de 72 aminoácidos que interacciona con diversas moléculas de señalización (Kufe, 2008). El vertido de MUC1-N en el interior de la barrera física protectora deja MUC1-C en la superficie celular como receptor putativo para transducir señales intracelulares que confieren crecimiento y supervivencia (Ramasamy y col., 2007; Ahmad y col., 2007).

Evidencias disponibles indican que carcinomas humanos han explotado la función MUC1 en promover la tumorigenicidad. En este contexto, con transformación y pérdida de polaridad, MUC1 se expresa a elevados niveles en la superficie celular completa en carcinomas de mama y otros epitelios (Kufe, 1984). Otros trabajos han demostrado que la sobreexpresión de MUC1 confiere crecimiento independiente de anclaje y tumorigenicidad (Li y col., 2003a; Raina y col., 2004; Ren y col., 2004; Wei y col., 2005), al menos en parte a través de la estabilización de !-catenina (Huang y col., 2005). Además, coherente con una función de supervivencia para células epiteliales normales, la sobreexpresión de MUC1 confiere resistencia a células de carcinoma a apoptosis inducido por estrés (Ren y col., 2004; Yin y Kufe, 2003; Yin y col., 2004; Yin y col., 2007).

La pérdida de restricción de la membrana apical permite la formación de complejos con el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y la co-activación de la señalización mediada por EGFR (Li y col., 2001; Ramasamy y col., 2007). La sobreexpresión de MUC1 por células de carcinoma también está asociada a la acumulación de MUC1-C en el citosol y al direccionamiento de esta subunidad al núcleo (Li y col., 2003b; Li y col., 2003c) y la mitocondria (Ren y col., 2004; Ren y col., 2006). De forma importante, la oligomerización de MUC1-C es necesaria para su direccionamiento nuclear y su interacción con diversos efectores (Leng y col., 2007). Por ejemplo, el dominio citoplasmático de MUC1 (MUC1-CD) funciona como sustrato para c-Src (Li y col., 2001), c-Abl (Raina y col., 2006), la proteína quinasa C∀ (Ren y col., 2002) y la glucógeno sintasa quinasa 3! (Li y col., 1998) e interacciona directamente con el efector de la vía Wnt, !-catenina (Yamamoto y col., 1997; Huang y col., 2005), y el supresor tumoral p53 (Wei y col., 2005). Por tanto, aunque parece que la oligomerización es importante, no ha habido evidencias directas de que la interferencia con la formación del oligómero MUC1 tuviera algún efecto beneficioso en las células tumorales, mucho menos cómo podría conseguirse esto.

Sumario de la invención

Por tanto, de acuerdo con una primera realización de la presente invención, se proporciona un péptido MUC1 de al menos 6 restos consecutivos de MUC1 y no más de 20 restos consecutivos de MUC1 y que comprende la secuencia CQCRRK, en la que la cisteína amino-terminal de CQCRRK está cubierta en su extremo NH2 por al menos un resto de aminoácido que no necesita corresponder con la secuencia transmembrana nativa de MUC1, para su uso en la inhibición de una célula tumoral MUC1 positiva en un sujeto. Dicho de otra manera, la primera realización de la presente invención proporciona el uso de un péptido MUC1 defino anteriormente en la fabricación de un medicamento para inhibir una célula tumoral MUC1 positiva en un sujeto. El péptido para su uso en la primera realización de la presente invención puede comprender al menos 7 restos consecutivos de MUC1, al menos 8 restos consecutivos de MUC1 y la secuencia puede comprender más específicamente CQCRRK (SEC ID Nº 4), o

CQCRRKN (SEC ID Nº 53). El péptido para su uso en la primera realización de la presente invención puede contener no más de 10 restos consecutivos, 11 restos consecutivos, 12 restos consecutivos, 13 restos consecutivos, 14 restos consecutivos, 15 restos consecutivos, 16 restos consecutivos, 17 restos consecutivos, 18 restos consecutivos o 19 restos consecutivos de MUC1. El péptido para su uso en la primera realización de la presente invención puede fusionarse a un dominio de liberación celular, tal como poli-D-R, poli-D-P o poli-D-K. El péptido para su uso en la primera realización de la presente invención puede comprender todo L aminoácidos, todo D aminoácidos, o una mezcla de L y D aminoácidos.

La célula tumoral MUC1 positiva que se inhibe de acuerdo con la primera realización de la presente invención puede ser una célula de carcinoma, una célula de leucemia o una célula de mieloma, tal como una célula de carcinoma de próstata o mama. El péptido puede, por ejemplo, usarse para inhibir una célula tumoral MUC1 positiva en un sujeto administrando el péptido al sujeto por administración intravenosa, intraarterial, intratumoral, subcutánea, tópica o intraperitoneal, o administración local, regional, sistémica o continua. La inhibición puede comprender inducir la detención del crecimiento de dicha célula tumoral, la apoptosis de dicha célula tumoral y/o la necrosis de un tejido tumoral que comprende dicha célula tumoral. El sujeto puede ser un ser humano.

El sujeto de la primera realización de la presente invención puede ser el destinatario de una segunda terapia antineoplásica. La segunda terapia antineoplásica puede ser cirugía, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia con toxinas, inmunoterapia, y crioterapia. La segunda terapia antineoplásica puede administrarse antes de dicho péptido, después de dicho péptido, o en el mismo momento que dicho péptido. El sujeto de la primera realización de la presente invención puede evaluarse para la expresión de MUC1 en una célula tumoral antes de la administración de dicho péptido y/o puede evaluarse el efecto de dicho péptido sobre la expresión de MUC1 en un tumor de dicho sujeto.

El péptido puede usarse para inhibir una célula tumoral MUC1 positiva en sujeto de acuerdo con la primera realización de la presente invención mediante la administración del péptido a 0,1-500 mg/kg/d, o 10-100 mg/kg/d. El péptido puede administrarse diariamente, por ejemplo, durante 7 días, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, un mes, 6 semanas, 8 semanas, dos meses, 12 semanas, o tres meses. El péptido puede administrarse semanalmente, por ejemplo, durante 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas, o 12 semanas.

En una segunda realización de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende

(a) un péptido MUC1 de al menos 6 restos consecutivos de MUC1 y no más de 20 restos consecutivos de MUC1 y que comprende la secuencia CQCRRK, en la que la cisteína amino-terminal de CQCRRK está cubierta en su extremo NH2 por al menos un resto de aminoácido que no tiene que corresponder con la secuencia transmembrana nativa de MUC1, y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable, tampón o diluyente. El péptido puede ser de al menos 7 u 8 restos consecutivos de MUC1. El péptido puede ser de no más de 10 restos consecutivos, 11 restos consecutivos, 12 restos consecutivos, 13 restos consecutivos, 14 restos consecutivos, 15 restos consecutivos, 16 restos consecutivos, 17 restos consecutivos, 18 restos consecutivos o 19 restos consecutivos de MUC1. El péptido puede fusionarse a un dominio de liberación celular, tal como poli-D-R, poli-D-P o poli-D-K. El péptido puede ser de al menos 8 restos de longitud, y al menos dos restos no adyacentes forman un puente a través de sus cadenas laterales. El puente puede comprender un enlazador, cadenas laterales químicamente modificadas, o grapado de hidrocarburo. Los enlazadores pueden comprender modificaciones que estabilicen una estructura alfa-helicoide de dicho péptido. El tampón puede comprender !-mercaptoetanol, glutatión o ácido ascórbico, u otro agente reductor que mantenga el péptido en un estado monomérico.

En una tercera realización de la presente invención, se proporciona un péptido MUC1 de al menos 6 restos consecutivos de MUC1 y no más de 20 restos consecutivos de MUC1 y que comprende CQCRRK, en la que la cisteína amino-terminal de CQCRRK está cubierta en su extremo NH2 por al menos un resto de aminoácido que no tiene que corresponder con la secuencia transmembrana nativa de MUC1. El péptido pueden ser 7 u 8 restos consecutivos de MUC1. El péptido pueden ser de no más de 10 restos consecutivos, 11 restos consecutivos, 12 restos consecutivos, 13 restos consecutivos, 14 restos consecutivos, 15 restos consecutivos, 16 restos consecutivos, 17 restos consecutivos, 18 restos consecutivos o 19 restos consecutivos de MUC1. El péptido puede fusionarse a un dominio de liberación celular, tal como poli-D-R, poli-D-P o poli-D-K.

También se proporciona, en una cuarta realización de la presente invención, el péptido MUC1 de la tercera realización de la presente invención, o una composición farmacéutica de acuerdo con la segunda realización de la presente invención, para su uso en medicina.

En una quinta realización de la presente invención, se proporciona un procedimiento in vitro para inhibir la oligomerización de MUC1 y el transporte nuclear en una célula que comprende poner en contacto una célula que expresa MUC1 con un péptido MUC1 de al menos 6 restos consecutivos de MUC1 y no más de 20 restos consecutivos de MUC1 y que comprende la secuencia CQCRRK, en la que la cisteína amino-terminal de CQCRRK está cubierta en su extremo NH2 por al menos un resto de aminoácido que no tiene que corresponder con la secuencia transmembrana nativa de MUC1. El péptido puede comprender al menos 7 restos consecutivos de MUC1, al menos 8 restos consecutivos de MUC1, y la secuencia puede comprender más específicamente CQCRRK, o CQCRRKN. El péptido puede contener no más de 10 restos consecutivos, 11 restos consecutivos, 12 restos consecutivos, 13 restos consecutivos, 14 restos consecutivos, 15 restos consecutivos, 16 restos consecutivos, 17 restos consecutivos, 18 restos consecutivos o 19 restos consecutivos de MUC1. El péptido puede fusionarse a un dominio de liberación celular, tal como poli-D-R, poli-D-P o poli-D-K. El péptido puede comprender todo L aminoácidos, todo D aminoácidos, o una mezcla de L y D aminoácidos.

5 La célula que expresa MUC1 que se inhibe de acuerdo con la quinta realización de la presente invención puede ser una célula tumoral, tal como una célula de carcinoma, una célula de leucemia o una célula de mieloma, tal como una célula de carcinoma de próstata o mama.

Una sexta realización de la presente invención proporciona un péptido MUC1 de al menos 6 restos consecutivos de MUC1 y no más de 20 restos consecutivos de MUC1 y que comprende la secuencia CQCRRK o KRRQCQ, en la que todos los restos de aminoácido de dicho péptido son D aminoácidos. El péptido puede comprender la secuencia KRRCQC (SEC ID Nº 49).

15 La célula cancerosa puede ser, por ejemplo, una célula de cáncer de mama, cáncer pulmonar, cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de estómago, cáncer hepático, cáncer óseo, cáncer hematológico, cáncer de tejido neural, melanoma, cáncer de ovario, cáncer testicular, cáncer de próstata, cáncer cervical, cáncer vaginal o cáncer de vejiga.

Aspectos preferidos de las realizaciones anteriores de la presente invención pueden incluir la eliminación de una célula cancerosa. Esto puede incluir realizar los usos de la presente invención descritos anteriormente antes, después o en el mismo momento que, exponer al sujeto a una o más terapias adicionales. Las terapias pueden ser, por ejemplo, una o más formas de radiación ionizante y/o uno o más agentes quimioterapéuticos. El uno o más agentes quimioterapéuticos pueden ser, por ejemplo, cisplatino, carboplatino, procarbacina, mecloretamina,

25 ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalán, clorambucilo, bisulfán, nitrosourea, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina, plicomicina, mitomicina, etopósido, verapamilo, podofilotoxina, tamoxifeno, taxol, transplatino, 5-fluorouracilo, vincristina, vinblastina, metotrexato, y un análogo de cualquiera de los mencionados anteriormente. También se contemplan como terapias de combinación terapia hormonal, inmunoterapia, terapia con toxinas, crioterapia y cirugía.

Se contempla que cualquier uso, procedimiento o composición descrita en el presente documento puede implementarse con respecto cualquier otro uso, procedimiento o composición descrita en el presente documento.

El uso de la palabra "uno" o "una" cuando se usan junto con el término "comprende" en la reivindicaciones y/o la

35 memoria descriptiva puede significar "uno", pero también es coherente con el significado de "uno o más", "al menos uno", y "uno o más de uno". La palabra "aproximadamente" significa más o menos el 5 % del número indicado.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención llegarán a ser evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones específicas de la invención, se dan solamente a modo de ilustración.

Breve descripción de las figuras

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente

45 ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede comprenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada.

Fig. 1A-D. El péptido MUC1/CQC bloquea la oligomerización de MUC1. (FIG. 1A) Se muestra la representación esquemática de la subunidad MUC1-C y la secuencia de 72 aminoácidos de MUC1-CD. Se sintetizaron los péptidos MUC1/CQC de 15 aminoácidos N-terminal (secuencia sombreada) y MUC1/AQA mutado con el dominio de transducción poli-dArg. (FIG. 1B) Se inmovilizó His-MUC1-CD (1,4 mg/ml) en un chip sensor en un BIAcore. Se inyectó MUC1/CQC sobre el chip a 10 #M. Se analizaron los datos de unión sin procesar por el software BIAevaluation versión 3.0 y se ajustaron a un modelo de unión de Languir 1:1. (FIG. 1C) Se incubó His-MUC1-CD purificado (1,5 mg/ml) con PBS, MUC1/CQC 200 #M o MUC1/AQA 200 #M durante 1 hora a temperatura

55 ambiente. Las proteínas se separaron en un gel de SDS-poliacrilamida no reductor y se analizaron por inmunotransferencia con anti-MUC1-C. (FIG. 1D) Se transfectaron de forma transitoria células 293 para que expresaran un vector vacío o GFP-MUC1-CD y Flag-MUG1-CD. A las 48 horas después de la transfección, las células se trataron con MUC1/CQC o MUC1/AQA 5 #M durante 3 días. Las células después se recogieron por inmunotransferencia con anti-MUC1-C (panel de la izquierda). Los lisados celulares completos también se precipitaron con anti-Flag y los precipitados se inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados (paneles de la derecha). FIG. 2A-C. El péptido MUC1/CQC bloquea la localización nuclear de MUC1-C. (FIG. 2A). Se incubaron células ZR-75-1 con péptido MUC1/CQC marcado con FITC 5 #M durante los tiempos indicados y después se analizaron por citometría de flujo. El índice de fluorescencia media (MFI) se incluye en cada uno de los paneles. (FIG. 2B-C)

65 Se incubaron células ZR-75-1 (FIG. 2B) y MCF-7 (FIG. 2C) en presencia de péptido MUC1/CQC o MUC1/AQA 5

#M durante 3 días. Los lisados celulares completos (WCL) (paneles de la izquierda) y los lisados nucleares (paneles de la derecha) se inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados. FIG. 3A-D. El péptido MUC1/CQC induce la detención en fase S y necrosis. Se trataron células ZR-75-1 (FIG. 2A-B) y MCF-7 (FIG. 2C-D) con MUC1/CQC o MUC1/AQA 5 #M durante 3 y 4 días. Las células se fijaron y analizaron para la distribución del ciclo celular por citometría de flujo (FIG. 2A y 2C). Se incluye en los paneles el porcentaje de células en las fases G1, S y G2/M. Las células también se tiñeron con ioduro de propidio y se analizaron por citometría de flujo para la necrosis (FIG. 2B y 2D). Se incluye en los paneles el porcentaje de células necróticas. FIG. 4A-E. Selectividad de MUC1/CQC para células cancerosas de mama que expresan MUC1. (FIG. 4A) Se infectaron de forma estable células ZR-75-1 con un lentivirus vacío (vector) o uno que expresaba ARNip de MUC1. Los lisados para las células infectadas se inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados. (FIG. 4B) Las células ZR-75-1/vector se dejaron sin tratar (diamantes), y las células ZR-75-1/vector (cuadrados) y ZR-751/ARNip de MUC1 (triángulos) se trataron con péptido MUC1/CQC 5 #M durante los tiempos indicados. Se determinó la cantidad de células viables por exclusión de azul de tripano. (FIG. 4C) Las células 293 se dejaron sin tratar (diamantes) y se trataron con MUC1/CQC (cuadrados) o MUC1/AQA (triángulos) 5 #M durante los tiempos indicados. Se determinó la cantidad de células viables por exclusión de azul de tripano. (FIG. 4D) Las células MCF-10A se dejaron sin tratar (panel de la izquierda) y se trataron con MUC1/CQC (panel central) o MUC1/AQA (panel de la derecha) 5 #M. A los 3 días, las células se analizaron para la distribución del ciclo celular. (FIG. 4E) Las células MCF-10A se dejaron sin tratar (diamantes), y se trataron con MUC1/CQC (cuadrados) o MUC1/AQA (triángulos) 5 #M durante los tiempos indicados. La cantidad de células viables se determinó por exclusión de azul de tripano. FIG. 5A-C. El péptido MUC1/CQC bloquea el crecimiento de xenoinjertos de tumor de mama ZR-75-1. (FIG. 5A) Se implantó a ratones Balb-c nu/nu hembra de cuatro a seis semanas de edad tapones de 17-!-estradiol. Después de 24 horas, se inyectaron por vía subcutánea células de cáncer de mama ZR-75-1 (incluidas en matrigel) en el costado. Cuando los tumores fueron de ~150 mm3, los ratones se emparejaron en grupos y se les inyectó por vía intraperitoneal PBS (control de vehículo; cuadrados rellenos), 50 mg/kg de péptido MUC1/AQA (péptido de control; cuadrados vacíos) o 10 mg/kg de péptido MUC1/CQC (triángulos rellenos) diariamente durante 21 días. Otro grupo se trató con 50 mg/kg de péptido MUC1/CQC diariamente durante 6 días (triángulos vacíos). Los ratones se pesaron dos veces a la semana y las mediciones del tumor se realizaron cada 4 días. (FIG: 5B y 5C). En el día 24 (asterisco), los tumores recogidos del grupo de control y el grupo tratado con 50 mg/kg/d x 6 días se tiñeron con H y E (FIG. 5B) y con un anticuerpo contra MUC1 (FIG. 5C). FIG. 6A-B. Efectos prolongados del péptido MUC1/CQC sobre tumores ZR-75-1. (FIG. 6A) A los ratones se les inyectó células ZR-75-1 como se describe en la leyenda de la FIG. 5A. Cuando los tumores fueron de ~275 mm3, los ratones se emparejaron en grupos y se les inyectó por vía intraperitoneal PBS (control de vehículo; cuadrados vacíos) o 30 mg/kg de péptido MUC1/CQC (cuadrados rellenos) diariamente durante 21 días. Los ratones de control se sacrificaron en el día 32 cuando los tumores alcanzaron ~1200 mm3. Los ratones tratados se controlaron hasta el día 52 cuando los tumores se recogieron para tinción con H y E (FIG. 6B). FIG. 7. MUC1 de 7 monómeros inhibe carcinoma de próstata. Se trataron células de carcinoma de próstata DU145 con los péptidos CQC corto (7 monómeros) 5 #M o CQC largo (15 monómeros) 5 #M durante 4 días. El crecimiento celular se midió por ensayo MTT. Los datos representan el porcentaje de inhibición del crecimiento en comparación con células no tratadas (control). FIG. 8. Secuencias de péptidos grapados MUC1-CD. FIG. 9A. Efectos del péptido MUC1-CD grapado sobre el crecimiento de células de carcinoma pulmonar no microcítico H1650. Para evaluar la sensibilidad a la inhibición de la función MUC1, se trataron células NSCLC H1650 con péptido grapado MUC1 CQC (GO-200-1B) 1 y 5 #M durante 7 días. El tratamiento de las células H1650 con GO-200-1B 5 #M se asoció con inhibición significativa del crecimiento y después una disminución en la cantidad de células. FIG. 9B. Efecto de GO-200-2B sobre la proliferación celular. Se cultivó la línea celular de carcinoma pulmonar no microcítico H-1975 en DMEM con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % con 100 unidades/ml de penicilina, 100 #g/ml de estreptomicina y 2 mmol/l de L-glutamina. Las células se volvieron a sembrar un día antes de los tratamientos. Las células se trataron con GO-200-2B 5 #M durante 3 días y se determinó la viabilidad celular por exclusión de azul de tripano. FIG. 10. Efecto de diferentes péptidos de la región CQC MUC1-CD sobre el crecimiento de células de carcinoma de mama dependiente de hormonas. Para determinar si la exposición a diferentes péptidos MUC1-CD que contienen la región CQC afecta al crecimiento, se trataron células de carcinoma de mama ZR-75-1 con 5 #M de diferentes péptidos durante 4 días y se controlaron para la proliferación celular. De forma significativa, hubo una inhibición sustancial del crecimiento en comparación con las células dejadas sin tratar. FIG. 11. Efecto de diferentes péptidos de la región CQC MUC1-CD sobre el crecimiento de células de carcinoma no microcítico. Se trataron células de carcinoma pulmonar no microcítico A549 con GO-203, GO-203-2 o GO203cyc 5 #M durante 7 días. La cantidad de células viables en el día 7 se determinó por exclusión de azul de tripano y se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento comparando el crecimiento celular de células no tratadas. FIG. 12. Efecto de diferentes péptidos de la región CQC MUC1-CD sobre el crecimiento de células de carcinoma no microcítico H1975. Se trataron células de carcinoma pulmonar no microcítico H1975 con 5 #M de diferentes péptidos de la región CQC MUC1-CD durante 6 días. La cantidad de células viables en el día 6 se determinó por exclusión de azul de tripano. Los resultados demuestran que el tratamiento de células H1975 con 5 #M de diferentes péptidos estaba asociado con una inhibición significativa del crecimiento. FIG. 13. Efecto de diferentes péptidos de la región CQC MUC1-CD sobre el crecimiento de células de carcinoma de mama triple negativo. Se trataron células de carcinoma de mama triple negativo MDA-MB-231 con 5 #M de

5 diferentes péptidos de la región CQC MUC1-CD durante 6 días. La cantidad de células viables en el día 6 se determinó por exclusión de azul de tripano. Los resultados demuestran que el tratamiento de células MDA-MB231 con diferentes péptidos estaba asociado con una inhibición significativa del crecimiento. FIG. 14. Efecto de péptidos GO-203 más cortos sobre la proliferación de células de cáncer de mama ZR-75-1. Se cultivaron células de cáncer de mama humano ZR-75-1 en RPMI1640 suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 %, 100 unidades/ml de penicilina, 100 #g/ml de estreptomicina. Las células se trataron con diferentes péptidos a 5 #M cada día durante 4 días y la viabilidad celular se determinó por exclusión de azul de tripano. En contraste con GO-210, el tratamiento de células de carcinoma de mama ZR-75-1 con GO-203 (SEC ID Nº 53), GO-207 (SEC ID Nº 4), GO-208 (SEC ID Nº 50) y GO-209 (SEC ID Nº 54) 5 #M cada día durante 4 días se asoció con inhibición significativa del crecimiento.

15 FIG. 15A-D. Efectos de GO-203 en combinación con diferentes fármacos antineoplásicos. Se expusieron células ZR-75-1 a las concentraciones indicadas de cisplatino (FIG. 15A), doxorrubicina (FIG. 15B), rh-TNF-∃ (FIG. 15C) y taxol (FIG. 15D) en solitario y en combinación con GO-203. El tratamiento fue secuencial para cisplatino, doxorrubicina y taxol donde las células se expusieron a estos agentes durante 72 horas seguido por el tratamiento con 5 #M de GO-203 durante 72 horas. En estudios con rh-TNF, las células se expusieron de forma concomitante a diferentes concentraciones de rh-TNF en solitario o en combinación con 5 #M de GO-203 durante 72 horas. Se usó el ensayo MTS para determinar la supervivencia celular. FIG. 16. GO-203 es aditivo o sinérgico con agentes antineoplásicos. Las representaciones gráficas mostradas muestran los índices de combinación frente a diferentes niveles de efecto (fracción afectada). El nivel de efecto se obtuvo tratando células con las combinaciones indicadas de fármacos antineoplásicos y GO-203.

Descripción de las realizaciones ilustrativas

I. La presente invención

MUC1 se ha estudiado extensivamente por los inventores y otros para averiguar su papel en el cáncer. Como se ha analizado anteriormente, MUC1 humano es una glucoproteína heterodimérica, traducida como un único polipéptido y escindido en subunidades N y C-terminales en el retículo endoplasmático (Ligtenberg y col., 1992; Macao y col., 2006; Levitin y col., 2005). La sobreexpresión aberrante de MUC1, hallada en la mayoría de carcinomas humanos (Kufe y col., 1984), confiere crecimiento independiente de anclaje y tumorigenicidad (Li y col., 2003a; Huang y col.,

35 2003; Schroeder y col., 2004; Huang y col., 2005). Otros estudios han demostrado que la sobreexpresión de MUC1 confiere resistencia a apoptosis inducida por estrés oxidativo y agentes antineoplásicos genotóxicos (Yin y Kufe, 2003; Ren y col., 2004; Raina y col., 2004; Yin y col., 2004; Raina y col., 2006; Yin y col., 2007).

La familia de mucinas ancladas y secretadas funciona proporcionando una barrera protectora de la superficie celular epitelial. Con daño a la capa epitelial, las estrechas uniones entre células adyacentes se alteran, y se pierda la polaridad ya que las células inician un programa de reparación inducido por heregulina (Vermeer y col., 2003). MUC1-N se desprende de la superficie celular (Abe y Kufe, 1989), dejando MUC1-C que funciona como transductor de señales de estrés ambiental al interior de la célula. A este respecto, MUC1-C forma complejos de superficie celular con miembros de la familia de receptores ErbB, y MUC1-C se dirige al núcleo en respuesta a estimulación de

45 heregulina (Li y col., 2001; Li y col., 2003c). MUC1-C también funciona integrando el receptor ErbB y las vías de señalización Wnt a través de interacciones directas entre el dominio citoplasmático de MUC1 (CD) y miembros de la familia de cateninas (Huang y col., 2005; Li y col., 2003c; Yamamoto y col., 1997; Li y col., 1998; Li y col., 2001; Li y Kufe, 2001). Otros estudios han demostrado que MUC1-CD se fosforila por la glucógeno sintasa quinasa 3!, c-Src, proteína quinasa C∀, y c-Abl (Raina y col., 2006; Li y col., 1998; Li y col., 2001; Ren y col., 2002).

Los mecanismos responsables del direccionamiento nuclear de MUC1-C son inciertos. Las proteínas que contienen una señal de localización nuclear (NLS) clásica se importan al núcleo uniéndose primero a importina ∃ y después, a su vez, importina ! (Weis, 2003). El complejo cargo-importina ∃/! se acopla al poro nuclear uniéndose a nucleoporinas y se transporta a través del poro mediante un mecanismo dependiente de Ran GTPasa. Las NLS

55 clásicas son monopartitas con un único grupo de 4-5 aminoácidos básicos o bipartitas con dos grupos de aminoácidos básicos separados por un enlazador de 10-12 aminoácidos. MUC1-CD contiene un motivo RRK que no se ajusta a una NLS monopartita prototípica (Hodel y col., 2002). Sin embargo, ciertas proteínas que contienen NLS no clásicas se transportan a través del poro nuclear uniéndose directamente a importina ! (Kau y col., 2004). La importina ! se asocia con varias nucleoporinas (Ryan y Wente, 2000), incluyendo Nup62, que se localiza en las caras tanto citoplasmática como nucleoplasmática de los complejos de poro nuclear (Percipalle y col., 1997). Otros estudios han indicado que la !-catenina se importa al núcleo mediante un mecanismo independiente de importina e independiente de nucleoporina (Suh y Gumbiner, 2003).

En 2006, los inventores informaron de que MUC1 se importa al núcleo mediante un mecanismo que implica la unión 65 a Nup62. También demostraron que MUC1 forma oligómeros a través de un motivo CQC en el dominio citoplasmático de MUC1 y que la oligomerización de MUC1 es necesaria para la importación nuclear. Por tanto, han ampliado este trabajo para abarcar una comprensión adicional del papel que el motivo CQC desempeña en la formación del oligómero. También han demostrado que péptidos cortos correspondientes a esta región son capaces de alterar la formación de oligómero MUC1, evitando el transporte al núcleo de células tumorales. Estos péptidos

5 son capaces de inhibir el crecimiento de células tumorales, así como de inducir la apoptosis en dichas células e incluso necrosis de tejido tumoral. Estos y otros aspectos de la invención se describen a continuación en detalle.

II. MUC1

10 A. Estructura

MUC1 es una glucoproteína tipo mucina que se expresa en los límites apicales de células epiteliales secretoras normales (Kufe y col., 1984). MUC1 forma un heterodímero después de su síntesis como un único polipéptido y de escindirse del precursor en dos subunidades en el retículo endoplasmático (Ligtenberg y col., 1992). La escisión 15 puede estar mediada por un proceso autocatalítico (Levitan y col., 2005). La subunidad MUC1 N-terminal de >250 kDa (MUC1 N-ter, MUC1-N) contiene cantidades variables de repeticiones en tándem de 20 aminoácidos que son imperfectas con variaciones altamente conservadas y que están modificadas por glucanos O-ligados (Gendler y col., 1988; Siddiqui y col., 1988). MUC1-N se ancla a la superficie celular por dimerización con la subunidad C-terminal de ~23 kDa (MUC1 C-ter, MUC1-C), que incluye una región extracelular de 58 aminoácidos, un dominio transmembrana

20 de 28 aminoácidos y un dominio citoplasmático de 72 aminoácidos (CD; SEC ID Nº 1) (Merlo y col., 1989). La secuencia de MUC1 humano se muestra a continuación:

GSVWQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFS

25 AQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGOLDIFPAR

DTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAA

TSANL (SEC ID Nº 2) 30 La secuencia en negrita indica el CD, y la parte subrayada es un péptido inhibidor de oligómero (SE ID Nº 3) descrito en los ejemplos.

Con la transformación de epitelios normales en carcinomas, MUC1 se sobreexpresa de forma aberrante en el citosol

35 y sobre la membrana celular completa (Kufe y col., 1984; Perey y col., 1992). MUC1 asociado a membrana celular se dirige a endosomas por endocitosis mediada por clatrina (Kinlough y col., 2004). Además, MUC1, pero no MUC1-N, se dirige al núcleo (Baldus y col., 2004; Huang y col., 2003; Li y col., 2003a; Li y col., 2003b; Li y col., 2003c; Wei y col., 2005; Wen y col., 2003) y la mitocondria (Ren y col., 2004).

40 B. Función

MUC1 interacciona con miembros de la familia del receptor de ErbB (Li y col., 2001b; Li y col., 2003c; Schroeder y col., 2001) y con el efector Wnt, !-catenina (Yamamoto y col., 1997). El receptor del factor de crecimiento epidérmico y c-Src fosforilan el dominio citoplasmático de MUC1 (MUC1-CD) en Y-46 y aumentan de este modo la unión de 45 MUC1 y !-catenina (Li y col., 2001a; Li y col., 2001b). La unión de MUC1 y !-catenina también está regulada por la glucógeno sintasa quinasa 3! y la proteína quinasa C∀ (Li y col., 1998; Ren y col., 2002). MUC1 se co-localiza con !catenina en el núcleo (Baldus y col., 2004; Li y col., 2003a; Li y col., 2003c; Wen y col., 2003) y co-activa la transcripción de genes diana Wnt (Huang y col., 2003). Otros estudios han demostrado que MUC1 también inhibe directamente p53 y regula la transcripción de genes diana p53 (Wei y col., 2005). De forma notable, la

50 sobreexpresión de MUC1 es suficiente para inducir el crecimiento independiente de anclaje y la tumorigenicidad (Huang y col., 2003; Li y col., 2003b; Ren y col., 2002; Schroeder y col., 2004).

La mayoría de las proteínas mitocondriales se codifican en el núcleo y se importan a la mitocondria por complejos de traslocación en las membranas mitocondriales externa e interna. Ciertas proteínas mitocondriales contienen

55 secuencias de direccionamiento mitocondrial N-terminales e interaccionan con Tom20 en la membrana mitocondrial externa (Truscott y col., 2003). Otras proteínas mitocondriales contienen secuencias de direccionamiento interno e interaccionan con el receptor Tom70 (Truscott y col., 2003). Recientes trabajos demostraron que las proteínas mitocondriales sin secuencias de direccionamiento interno se liberan a Tom70 mediante un complejo de HSP70 y HSP90 (Young y col., 2003).

III.

Péptidos MUC1

A.

Estructura

5 La presente invención contempla el diseño, producción y uso de diversos péptidos MUC1. Las características estructurales de estos péptidos son las siguientes. Primero, los péptidos no tienen más de 20 restos consecutivos de MUC1. Por tanto, la expresión "un péptido que tiene no más de 20 restos consecutivos", incluso cuando se incluye la expresión "que comprende", no puede entenderse que comprenda una cantidad mayor de restos consecutivos de MUC1. Segundo, los péptidos contendrán el motivo CQCRRK. Por tanto, los péptidos tendrán, como mínimo, estos

10 seis restos consecutivos del dominio MUC1-C. Tercero, los péptidos tendrán al menos un resto de aminoácido unido al extremo NH2-terminal del primer resto C en el motivo CQCRRK, de modo que el primer resto C esté "cubierto" por ese al menos un aminoácido unido al mismo. Este resto puede ser nativo para MUC1 (es decir, del dominio transmembrana), puede seleccionarse de forma aleatoria (cualquiera de los 20 aminoácidos de origen natural o análogos de los mismos), o puede ser parte de otra secuencia peptídica (por ejemplo, una secuencia de marca para

15 purificación, una secuencia estabilizadora, o un dominio de liberación celular).

En general, los péptidos tendrán 50 restos o menos, de nuevo, comprendiendo no más de 20 restos consecutivos de MUC1. La longitud global puede ser de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 restos. Se contemplan

20 intervalos de longitud de péptido de 6-50 restos, 7-50 restos, 7-25 restos, 6-20 restos, 7-20 restos, y 7-15 restos. La cantidad de restos consecutivos de MUC1 puede ser de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20. Se contemplan intervalos de restos consecutivos de 6-20 restos, 7-20 restos y 6-15 restos o 7-15 restos.

La presente invención puede utilizar aminoácidos en configuración L, aminoácidos en configuración D, o una mezcla

25 de los mismos. Aunque los L-aminoácidos representan la inmensa mayoría de aminoácidos hallados en las proteínas, se encuentran D-aminoácidos en algunas proteínas producidas por organismos marinos exóticos, tales como caracoles cono. También son componentes abundantes de las paredes celulares de péptidoglucano de las bacterias. La D-serina puede actuar como neurotransmisor en el cerebro. La convención L y D para la configuración de aminoácidos se refiere no a la actividad óptica del propio aminoácido, sino a la actividad óptica del isómero de

30 gliceraldehído a partir del cual puede sintetizarse teóricamente ese aminoácido (D-gliceraldehído es dextrorrotatorio; L-gliceraldehído es levorrotatorio).

Una forma de un péptido "todo D" es un péptido retro-inverso. La modificación retro-inverso de polipéptidos de origen natural implica el ensamblaje mediante síntesis de aminoácidos con estereoquímica de carbonos-∃ opuesta a la de

35 los correspondientes L-aminoácidos, es decir, D-aminoácidos en orden inverso con respecto a la secuencia peptídica nativa. Un análogo retro-inverso por tanto tiene extremos invertidos y dirección invertida de los enlaces peptídicos (NH-CO en lugar de CO-NH) manteniendo al mismo tiempo aproximadamente la topología de las cadenas laterales como en la secuencia peptídica nativa. Véase, la patente de Estados Unidos 6.261.569 incorporada en el presente documento por referencia.

40 Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención contempla la fusión o conjugación de un dominio de liberación celular (también llamado un vector de liberación celular, o dominio de transducción celular). Dichos dominios son bien conocidos en la técnica y se caracterizan en líneas generales como péptidos anfipáticos o catiónicos cortos y derivados peptídicos, que contienen a menudo múltiples restos de lisina y arginina (Fischer,

45 2007). Son de particular interés las secuencias poli-D-Arg y poli-D-Lys (por ejemplo, restos dextrorrotatorios, ocho restos de longitud), mientras que otros se muestran en la siguiente Tabla 1.

TABLA 1 PÉPTIDOS CDD/CTD SEC ID Nº

QAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE 5 RQIKIWFQNRRMKWKK 6 RRMKWKK 7 RRWRRWWRRWWRRWRR 8 RGGRLSYSRRRFSTSTGR 9 YGRKKRRQRRR 10 RKKRRQRRR 11 YARAAARQARA 12 RRRRRRRR 13 KKKKKKKK 14 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKXIL 15 LLILLRRRIRKQANAHSK 16 SRRHHCRSKAKRSRHH 17 NRARRNRRRVR 18 RQLRIAGRRLRGRSR 19 KLIKGRTPIKFGK 20 RRIPNRRPRR 21

KLALKLALKALKAALKLA 22 KLAKLAKKLAKLAK 23 GALFLGFLGAAGSTNGAWSQPKKKRKV 24 KETWWETWWTEWSQPKKKRKV 25 GALFLGWLGAAGSTMGAKKKRKV 26 MGLGLHLLVLAAALQGAKSKRKV 27 AAVALLPAVLLALLAPAAANYKKPKL 28 MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP 29 LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP 30 DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPXPD 31 PPPPPPPPPPPPPP 32 VRLPPPVRLPPPVRLPPP 33 PRPLPPPRPG 34 SVRRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPP 35 TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK 36 GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS 37 KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK 38 ALWMTLLKKVLKAAAKAALNAVLVGANA 39 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ 40 INLKALAALAKKIL 41 GFFALIPKIISSPLPKTLLSAVGSALGGSGGQE 42 LAKWALKQGFAKLKS 43 SMAQDIISTIGDLVKWIIQTVNXFTKK 44 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKQRIKDFLANLVPRTES 45 LKKLLKKLLKKLLKKLLKKL 46 KLKLKLKLKLKLKLKLKL 47 PAWRKAFRWAWRMLKKAA 48

También como se ha mencionado anteriormente, se contemplan péptidos modificados para su uso in vivo por la adición, en los extremos amino y/o carboxilo terminales, de un agente de bloqueo para facilitar la supervivencia del péptido in vivo. Esto puede ser útil en aquellas situaciones en que los extremos peptídicos tienden a degradarse por 5 proteasas antes de la captación celular. Dichos agentes de bloqueo pueden incluir, sin limitación, secuencias peptídicas adicionales relacionadas o no relacionadas que pueden unirse a los restos amino y/o carboxilo terminales del péptido a administrar. Estos agentes pueden añadirse de forma química durante la síntesis del péptido, o por tecnología de ADN recombinante por procedimientos habituales en la técnica. Como alternativa, pueden unirse agentes de bloqueo tales como ácido piroglutámico u otras moléculas conocidas en la técnica a los restos amino y/o

10 carboxilo terminales.

B. Síntesis

Será ventajoso producir péptidos usando las técnicas de síntesis en fase solida (Merrifield, 1963). Son bien

15 conocidas para los especialistas en la técnica otras técnicas de síntesis peptídica (Bodanszky y col., 1976; Peptide Synthesis, 1985; Solid Phase Peptide Synthelia, 1984). Los grupos protectores apropiados para su uso en dichas síntesis se encontrarán en los textos anteriores, así como en Protective Groups in Organic Chemistry, 1973. Estos procedimientos de síntesis implican la adición secuencial de uno o más restos de aminoácido o restos de aminoácido protegidos adecuados a una cadena peptídica en crecimiento. Normalmente, el grupo amino o carboxilo

20 del primer resto de aminoácidos se protege mediante un grupo protector adecuado que se pueda retirar de forma selectiva. Se utiliza un grupo protector diferente que se pueda retirar de forma selectiva para aminoácidos que contienen un grupo lateral reactivo, tal como lisina.

Usando síntesis en fase sólida como ejemplo, el aminoácido protegido o derivatizado se une a un soporte solido

25 inerte a través de su grupo carboxilo o amino no protegido. El grupo protector del grupo amino o carboxilo después se retira de forma selectiva y se mezcla el siguiente aminoácido en la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o carboxilo) adecuadamente protegido y se hace reaccionar con el resto ya unido al soporte sólido. El grupo protector del grupo amino o carboxilo después se retira de este resto de aminoácido recién añadido, y después se añade el siguiente aminoácido (adecuadamente protegido), y etc. Después de haber unido todos los aminoácidos

30 deseados en la secuencia apropiada, se retira de forma secuencial o concurrente cualquier grupo protector restante de grupo terminal y lateral (y el soporte sólido), para proporcionar el péptido final. Los péptidos de la invención están preferentemente desprovistos de aminoácidos benzilados y metilbenzilados. Dichos restos de grupo protector pueden usarse en el transcurso de la síntesis, pero se retiran antes de usar los péptidos. Pueden ser necesarias reacciones adicionales, como se describe en otra parte, para formar enlaces intramoleculares para restringir la

35 conformación.

A parte de los 20 aminoácidos convencionales que pueden usarse, existe una inmensa cantidad de aminoácidos "no convencionales". Dos de estos pueden especificarse por el código genético, pero son bastante raros en las proteínas. La selenocisteína se incorpora en algunas proteínas en un codón UGA, que es normalmente un codón de parada. La pirrolisina se usa por algunas arqueobacterias metanogénicas en enzimas que usan para producir metano. Está codificada por el codón UAG. Ejemplos de aminoácidos no convencionales que no se encuentran en proteínas incluyen lantionina, ácido 2-aminoisobutírico, deshidroalanina y el neurotransmisor ácido gammaaminobutírico. Los aminoácidos no convencionales a menudo existen como intermedios en las vías metabólicas para

5 aminoácidos convencionales -por ejemplo existen ornitina y citrulina en el ciclo de la urea, parte del catabolismo de aminoácidos. Los aminoácidos no convencionales se forman habitualmente a través de modificaciones de aminoácidos convencionales. Por ejemplo, la homocisteína se forma a través de la vía de trans-sulfuración o mediante la desmetilación de metionina mediante el metabolito intermedio S-adenosil metionina, mientras que la hidroxiprolina se forma mediante una modificación post-traduccional de prolina.

C. Enlazadores

Pueden usarse enlazadores o agentes reticulantes para fusionar péptidos MUC1 con otras secuencias proteicas. Los reactivos reticulantes bifuncionales se han usado extensivamente para diversos fines incluyendo la preparación 15 de matrices de afinidad, la modificación y estabilización de diversas estructuras, la identificación de sitios de unión en ligandos y receptores, y estudios estructurales. Se ha demostrado que los reactivos homobifuncionales que portan dos grupos reactivos idénticos son muy eficaces en inducir reticulación entre macromoléculas idénticas y diferentes o subunidades de una macromolécula, y ligamiento de ligandos polipeptídicos a sus sitios de unión específicos. Los reactivos heterobifuncionales contienen dos grupos funcionales diferentes. Aprovechando la ventaja de las reactividades diferenciales de los dos grupos funcionales diferentes, la reticulación puede controlarse de forma tanto selectiva como secuencial. Los reactivos reticulantes bifuncionales pueden dividirse de acuerdo con la especificidad de sus grupos funcionales, por ejemplo, grupos amino-, sulfhidrilo-, guanidino-, indol-, o carboxiloespecíficos. De estos, los reactivos dirigidos a grupos amino libres han llegado a ser especialmente populares a causa de su disponibilidad en el mercado, facilidad de síntesis y las suaves condiciones de reacción en las que

25 pueden aplicarse. La mayoría de los reactivos reticulantes heterobifuncionales contiene un grupo amina primariareactivo y un grupo tiol-reactivo.

En otro ejemplo, se describen reactivos reticulantes heterobifuncionales y procedimientos para usar los reactivos reticulantes en la patente de Estados Unidos 5.889.155, incorporada específicamente en el presente documento por referencia en su totalidad. Los reactivos reticulantes combinan un resto nucleófilo de hidrazida con un resto electrófilo de maleimida, que permiten el acoplamiento, en un ejemplo, de aldehídos con tioles libres. El reactivo reticulante puede modificarse para que reticule diversos grupos funcionales y por tanto es útil para reticular polipéptidos. En casos en que un péptido particular no contiene un resto susceptible a un reactivo reticulante dado en su secuencia nativa, pueden utilizarse cambios genéticos o de síntesis conservativos de aminoácidos en la

35 secuencia primaria.

Otro uso de los enlazadores en el contexto de los péptidos como agentes terapéuticos es la llamada tecnología de "péptido grapado" de Aileron Therapeutics. El enfoque general para "grapar" un péptido es que dos restos clave dentro del péptido se modifican mediante unión de enlazadores a través de las cadenas laterales de aminoácidos. Una vez sintetizados, los enlazadores se conectan a través de un catalizador, creando de este modo un puente que limita físicamente al péptido en su forma ∃-helicoide nativa. Además de ayudar a retener la estructura nativa necesaria para interaccionar con una molécula diana, esta conformación también proporciona estabilidad frente a peptidasas así como propiedades de penetración celular. Las patentes de Estados Unidos 7.192.713 y 7.183.059, que describen esta tecnología, se incorporan en la presente por referencia. Véase también Schafmeister y col.,

45 Journal of the American Chemical Society, 2000, 122(24): pág. 5891-5892.

D. Diseño, variantes y análogos

La presente invención se centra en péptidos que comprenden la secuencia CQCRRK. Habiendo identificado esta estructura clave en la formación del oligómero MUC1, los inventores también contemplan que pueden emplearse variantes de la secuencia CQCRRK. Por ejemplo, ciertos aminoácidos no naturales que satisfacen las restricciones estructurales de la secuencia CQC pueden sustituirse sin una pérdida, y quizás con una mejora en, la función biológica. Además, los presentes inventores también contemplan que pueden formularse compuestos estructuralmente similares para imitar las partes clave del péptido o polipéptidos de la presente invención. Dichos

55 compuestos, que pueden denominarse peptidomiméticos, pueden usarse del mismo modo que los péptidos de la invención y, por tanto, también son equivalentes funcionales.

Ciertos miméticos que imitan elementos de estructura proteica secundaria y terciaria se describen en Johnson y col. (1993). El fundamento subyacente detrás del uso de peptidomiméticos es que el propósito principal de la estructura peptídica de las proteínas es orientar las cadenas laterales de los aminoácidos de tal modo que se faciliten las interacciones moleculares, tales como aquellas de anticuerpo y/o antígeno. Un peptidomimético por tanto se diseña para permitir interacciones moleculares similares a la molécula natural.

Se han desvelado en la técnica procedimientos para generar estructuras específicas. Por ejemplo, se desvelan

65 miméticos de ∃-hélice en las patentes de Estados Unidos 5.446.128; 5.710.245; 5.840.833; y 5.859.184. Se describen procedimientos para generar giros ! y protuberancias ! restringidas conformacionalmente, por ejemplo, en

las patentes de Estados Unidos 5.440.013; 5.618.914; y 5.670.155. Otros tipos de giros miméticos incluyen giros inversos y giros %. Los miméticos de giro inverso se desvelan en las patentes de Estados Unidos 5.475.085 y 5.929.237, y los miméticos de giro % se describen en las patentes de Estados Unidos 5.672.681 y 5.674.976.

Como se usa en el presente documento, "modelado molecular" significa análisis cuantitativo y/o cualitativo de la estructura y función de la interacción física proteína-proteína basado en información estructural tridimensional y modelos de interacción proteína-proteína. Esto incluye modelos convencionales dinámicos moleculares de base numérica y de minimización de energía, modelos gráficos informáticos interactivos, modelos de mecánica molecular modificada, modelos de geometría de distancia y otros modelos de restricción basados en estructura. El modelado molecular normalmente se realiza usando un ordenador y puede optimizarse adicionalmente usando procedimientos conocidos. Los programas informáticos que usan datos de cristalografía de ratos X son particularmente útiles para diseñar dichos compuestos. Pueden usarse programas tales como RasMol, por ejemplo, para generar modelos tridimensionales. Programas informáticos tales como INSIGHT (Accelrys, Burlington, MA), GRASP (Anthony Nicholls, Columbia University), Dock (Molecular Design Institute, University of California en San Francisco), y Auto-Dock (Accelrys) permiten una manipulación adicional y la capacidad de introducir nuevas estructuras. Los procedimientos pueden implicar la etapa adicional de generar en un dispositivo de salida un modelo de la estructura 3-D del compuesto. Además, los datos 3-D de los compuestos candidatos pueden compararse con una base de datos informática de, por ejemplo, estructuras 3-D.

Los compuestos de la invención también pueden diseñarse de forma interactiva a partir de información estructural de los compuestos descritos en el presente documento usando otras técnicas de diseño/modelado basadas en estructura (véase, por ejemplo, Jackson, 1997; Jones y col., 1996). Los compuestos candidatos después pueden ensayarse en ensayos convencionales conocidos para los especialistas en la técnica. Se describen ensayos ejemplares en el presente documento.

La estructura 3-D de macromoléculas biológicas (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, y lípidos) puede determinarse a partir de datos obtenidos mediante diversas metodologías. Estas metodologías, que se han aplicado de forma muy eficaz para la evaluación de la estructura 3-D de proteínas, incluyen: (a) cristalografía de rayos X; (b) espectroscopía por resonancia magnética nuclear (RMN); (c) análisis de las restricciones de distancia física formadas entre sitios definidos en una macromolécula, por ejemplo, reticulaciones químicas intramoleculares entre restos en una proteína (por ejemplo, documento PCT/US00/14667, cuya divulgación se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad), y (d) procedimientos de modelado molecular basados en un conocimiento de la estructura primaria de una proteína de interés, por ejemplo, técnicas de modelado de homología, algoritmos de enhebrado, o modelado de estructura ab initio usando programas informáticos tales como MONSSTER (Modeling Of New Structures from Secondary and Tertiary Restraints) (véase, por ejemplo, la solicitud internacional Nº PCT/US99/11913, cuya divulgación se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad). También pueden emplearse otras técnicas de modelado molecular de acuerdo con la presente invención (por ejemplo, Cohen y col., 1990; Navia y col., 1992), cuyas divulgaciones se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad). Todos estos procedimientos produces datos que son susceptibles a análisis informático. Otros procedimientos espectroscópicos que también pueden ser útiles en el procedimiento de la invención, pero que no proporcionan por el momento detalles estructurales a nivel atómico acerca de biomoléculas, incluyen espectroscopía de absorbancia de luz ultravioleta/visible y de fluorescencia y dicroísmo circular. Un procedimiento preferido de análisis es cristalografía de rayos X. A continuación se proporcionan descripciones del este procedimiento y de espectroscopía por RMN.

Cristalografía de rayos X. La cristalografía de rayos X se basa en la difracción de radiación X de una longitud de onda característica por nubes de electrones que rodean los núcleos atómicos en un cristal de una molécula o complejo molecular de interés. La técnica usa cristales de macromoléculas biológicas purificadas o complejos moleculares (pero estos frecuentemente incluyen componentes disolventes, co-factores, sustratos, u otros ligandos) para determinar la resolución atómica cercana de los átomos que componen la macromolécula biológica particular. Un pre-requisito de resolver la estructura 3-D por cristalografía de rayos X es un cristal bien ordenado que difractará los rayos X fuertemente. El procedimiento dirige un haz de rayos X sobre una serie repetitiva y regular de muchas moléculas idénticas de modo que los rayos X se difractan desde la serie en un patrón a partir del cual puede recuperarse la estructura de una molécula individual. Los cristales bien ordenados de, por ejemplo, moléculas de proteína globular son objetos grandes, esféricos o elipsoides con superficies irregulares. Los cristales contienen grandes canales entre las moléculas individuales. Estos canales, que normalmente ocupan más de la mitad del volumen del cristal, están llenos con moléculas desordenadas de disolvente, y las moléculas de proteína están en contacto entre sí en solamente unas pocas regiones pequeñas. Esta es una razón por la cual estructuras de proteínas en cristales son generalmente iguales que aquellas de proteínas en solución.

A continuación se describen procedimientos para obtener las proteínas de interés. La formación de cristales depende de varios parámetros diferentes, incluyendo pH, temperatura, la concentración de la macromolécula biológica, la naturaleza del disolvente y el precipitante, así como la presencia de iones añadidos o ligandos de la proteína. Pueden necesitarse muchos experimentos de cristalización rutinarios para seleccionar todos estos parámetros para las combinaciones que den un cristal adecuado para análisis de difracción de rayos X. Los robots de cristalización pueden automatizar y acelerar el trabajo de configurar de forma reproducible una gran cantidad de

experimentos de cristalización (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.790.421, cuya divulgación se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad).

La cristalización de polipéptidos sucede en soluciones en que la concentración de polipéptido excede su solubilidad máxima (es decir, la solución de polipéptido está supersaturada). Dichas soluciones pueden restaurarse al equilibrio reduciendo la concentración de polipéptido, preferentemente a través de precipitación de cristales de polipéptido. A menudo puede inducirse la cristalización de polipéptidos a partir de soluciones supersaturadas añadiendo agentes que alteran las cargas superficiales del polipéptido o perturban la interacción entre el polipéptido y el volumen de agua para promover asociaciones que conduzcan a la cristalización.

Las cristalizaciones generalmente se realizan entre 4 ºC y 20 ºC. A menudo se usan sustancias conocidas como "precipitantes" para disminuir la solubilidad del polipéptido en una solución concentrada formando una capa de escasa precipitación energéticamente desfavorable alrededor de las moléculas de polipéptido (Weber, 1991). Además de los precipitantes, a veces se añaden otros materiales a la solución de cristalización de polipéptido. Estos incluyen tampones para ajustar el pH de la solución y sales para reducir la solubilidad del polipéptido. Se conocen diversos precipitantes en la técnica e incluyen los siguientes: etanol, 3-etil-2-4 pentanodiol, y muchos de los poliglicoles, tales como polietilenglicol (PEG). Las soluciones de precipitación pueden incluyen, por ejemplo, PEG 4000 al 13-24 %, sulfato de amonio al 5-41 %, y cloruro sódico 1,0-1,5 M, y un pH que varía de 5,0-7,5. Otros aditivos pueden incluir Hepes 0,1 M, butanol 2-4 %, acetato sódico 20-100 mM, ácido cítrico 50-70 mM, fosfato sódico 120-130 mM, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) 1 mM, y ditiotreitol (DTT) 1 mM. Estos agentes se preparan en tampones y se añaden gota a gota en diversas combinaciones al tampón de cristalización. Las proteínas a cristalizar pueden modificarse, por ejemplo, por fosforilación o usando un mimético de fosfato (por ejemplo, tungstato, cacodilato, o sulfato).

Los procedimientos de cristalización de polipéptidos habitualmente usados incluyen las siguientes técnicas: discontinua, gota colgante, inicio con semilla, y diálisis. En cada uno de estos procedimientos, es importante promover la cristalización continuada después de la nucleación manteniendo una solución supersaturada. En el procedimiento discontinuo, el polipéptido se mezcla con precipitantes para conseguir la supersaturación, y el recipiente se precinta y se deja apartado hasta que aparecen cristales. En el procedimiento de diálisis, el polipéptido se retiene en una membrana de diálisis precintada que se coloca en una solución que contiene precipitante. El equilibrio a través de membrana aumenta las concentraciones de polipéptido y precipitante, causando de este modo que el polipéptido alcance niveles de supersaturación.

En la técnica preferida de gota colgante (McPherson, 1976), se crea una mezcla inicial de polipéptido añadiendo un precipitante a una solución concentrada de polipéptido. Las concentraciones de polipéptido y precipitantes son tales que en esta forma inicial, el polipéptido no cristaliza. Se coloca una pequeña gota de esta mezcla sobre un portaobjetos de vidrio que se invierte y suspende sobre un depósito de una segunda solución. El sistema entonces se precinta. Normalmente, la segunda solución contiene una concentración mayor de precipitante u otro agente de deshidratación. La diferencia en las concentraciones de precipitante causa que la solución de proteína tenga una mayor presión de vapor que la segunda solución. Como el sistema que contiene las dos soluciones está precintado, se establece un equilibrio, y el agua de la mezcla de polipéptido se transfiere a la segunda solución. Este equilibrio aumenta la concentración de polipéptido y precipitante en la solución de polipéptido. A la concentración crítica de polipéptido y precipitante, puede formarse un cristal del polipéptido.

Otro procedimiento de cristalización introduce un sitio de nucleación en una solución concentrada de polipéptido. Generalmente, se prepara una solución concentrada de polipéptido y se introduce un cristal de siembra del polipéptido en esta solución. Si las concentraciones del polipéptido y cualquier precipitante son correctas, el cristal de siembra proporcionará un sitio de nucleación alrededor del cual se forma un cristal más grande.

Otro procedimiento más de cristalización es un procedimiento de electrocristalización en que se hace uso de los momentos dipolares de las macromoléculas de proteína que se auto-alinean en la capa de Helmholtz adyacente a un electrodo (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.597.457, cuya divulgación se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad).

Algunas proteínas pueden ser recalcitrantes a la cristalización. Sin embargo, están disponibles varias técnicas para los especialistas en la técnica para inducir la cristalización. Por ejemplo, la eliminación de segmentos flexibles de polipéptido en el extremo amino o carboxilo terminal de la proteína puede facilitar la producción de muestras cristalinas de proteína. La eliminación de dichos segmentos puede hacerse usando técnicas de biología molecular o tratamiento de la proteína con proteasas tales como tripsina, quimotripsina, o subtilisina.

En experimentos de difracción, se recoge un haz estrecho y paralelo de rayos X de la fuente de rayos X y se dirige al cristal para producir haces difractados. Los haces primarios incidentes causan daño tanto a la macromolécula como a las moléculas de disolvente. El cristal, por lo tanto, se enfría (por ejemplo, hasta entre -220 ºC y -50 ºC) para prolongar su vida útil. El haz primario debe golpear el cristal desde muchas direcciones para producir todas las posibles manchas de difracción, de modo que el cristal se rota en el haz durante el experimento. Las manchas difractadas se graban en una película o se registran por un detector electrónico. La película expuesta tiene que

digitalizarse y cuantificarse en un dispositivo de escaneo, mientras que los detectores electrónicos envían las señales que detectan directamente a un ordenador. Los detectores electrónicos de área reducen significativamente el tiempo necesario para recoger y medir datos de difracción. Cada haz de difracción, que se registra como una mancha en la película o la placa detectora, se define por tres propiedades: la amplitud, que se mide a partir de la intensidad de la mancha; la longitud de onda, que se establece por la fuente de rayos X; y la fase, que se pierde en experimentos de rayos X. Las tres propiedades son necesarias para todos los haces difractados para determinar las posiciones de los átomos que dan lugar a los haces difractados. Un modo para determinar las fases se llama remplazo isomorfo múltiple (MIR), que requiere la introducción de dispersores exógenos de rayos X (por ejemplo, átomos pesados tales como átomos de metal) en la celda unitaria del cristal. Para una descripción más detallada de MIR, véase la patente de Estados Unidos 6.093.573 (columna 15) cuya divulgación se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.

Las coordenadas atómicas se refieren a coordenadas cartesianas (posiciones x, y, y z) derivadas de ecuaciones matemáticas que implican síntesis de Fourier de los datos derivados de patrones obtenidos mediante difracción de un haz monocromático de rayos X por los átomos (centros de dispersión) de la macromolécula biológica de interés en forma cristalina. Los datos de difracción se usan para calcular mapas de densidad electrónica de unidades repetitivas en el cristal (celda unitaria). Los mapas de densidad electrónica se usan para establecer las posiciones (coordenadas atómicas) de átomos individuales dentro de la celda unitaria de un cristal. Los valores absolutos de coordenadas atómicas expresan relaciones espaciales entre átomos porque los valores absolutos atribuidos a coordenadas atómicas pueden cambiarse por movimiento de rotación y/o traslación a lo largo de los ejes x, y, y/o z, en conjunto o por separado, manteniendo al mismo tiempo las mismas relaciones espaciales relativas entre los átomos. Por tanto, se considera que una macromolécula biológica (por ejemplo, una proteína) cuya serie de valores de coordenadas atómicas absolutas pueden ajustarse por rotación o traslación para coincidir con una serie de valores previos determinados de un análisis de otra muestra, tiene las mismas coordenadas atómicas que aquellas obtenidas de la otra muestra.

Pueden obtenerse detalles adicionales sobre cristalografía de rayos X de la solicitud de Estados Unidos Nº 2005/0015232 en trámite con la presente, la patente de Estados Unidos 6.093.573 y las solicitudes internacionales Nº PCT/US99/18441, PCT/US99/11913, y PCT/US00/03745. Las divulgaciones de todos estos documentos de patente se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.

Espectroscopía de RMN. Mientras que la cristalografía de rayos X requiere cristales individuales de una macromolécula de interés, las mediciones de RMN se realizan en solución en condiciones casi fisiológicas. Sin embargo, las estructuras obtenidas por RMN no son tan detalladas como las estructuras obtenidas de cristales.

Aunque el uso de espectroscopía de RMN estaba limitado hasta hace relativamente poco a la dilucidación de la estructura 3-D de moléculas relativamente pequeñas (por ejemplo, proteínas de 100-150 restos de aminoácido), los recientes avances incluyendo el marcaje isotópico de la molécula de interés y la espectroscopía de relajación transversal optimizada (TROSY), han permitido que la metodología se extienda al análisis de moléculas mucho más grandes, por ejemplo, proteínas con un peso molecular de 110 kDa (Wider, 2000).

La RMN usa radiación de radiofrecuencia para examinar el entorno de núcleos atómicos magnéticos en un campo magnético homogéneos pulsado con una radiofrecuencia específica. Los pulsos perturban la magnetización nuclear de aquellos átomos con núcleos de espín no cero. Las señales de dominio de tiempo transitorio se detectan según el sistema vuelve al equilibrio. La transformación de Fourier de la señal transitoria en un dominio de frecuencia produce un espectro unidimensional de RMN. Los picos en estos espectros representan desplazamientos químicos de los diversos núcleos activos. El desplazamiento químico de un átomo se determina mediante su entorno electrónico local. Los experimentos bidimensionales de RMN pueden proporcionar información acerca de la proximidad de diversos átomos en la estructura y en el espacio tridimensional. Las estructuras proteicas pueden determinarse realizando varios experimentos bi-(y a veces 3-o 4-) dimensionales de RMN y usando la información resultante como restricciones en una serie de simulaciones de plegamiento proteico.

Puede encontrarse más información sobre espectroscopía de RMN incluyendo descripciones detalladas de cómo los datos sin procesar obtenidos de un experimento de RMN pueden usarse para determinar la estructura 3-D de una macromolécula en: Protein NMR Spectroscopy, Principles and Practice, (1996); Gronenborn y col. (1990); y Wider (2000), supra., cuyas descripciones de todos ellos se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.

También son de interés los compuestos peptidomiméticos que se diseñan en base a las secuencias de aminoácidos de compuestos de la invención que son péptidos. Los compuestos peptidomiméticos son compuestos sintéticos que tienen un "motivo" de conformación tridimensional que es sustancialmente igual que la conformación tridimensional de un péptido seleccionado. El motivo peptídico proporciona al compuesto peptidomimético la capacidad de inhibir la oligomerización de MUC1. Los compuestos peptidomiméticos pueden tener características adicionales que potencian su utilidad in vivo, tal como permeabilidad celular aumentada y semi-vida biológica prolongada. Los peptidomiméticos normalmente tienen una estructura que es parcial o completamente no peptídica, pero con grupos laterales que son idénticos a los grupos laterales de los restos de aminoácido que existen en el péptido sobre el que

se basa el peptidomimético. Se conocen en la técnica varios tipos de enlaces químicos, por ejemplo, enlaces éster, tioéster, tioamida, retroamida, carbonilo reducido, dimetileno y cetometileno, que son generalmente sustitutos útiles para enlaces peptídicos en la construcción de peptidomiméticos resistentes a proteasa.

IV.

Terapias

A.

Formulaciones farmacéuticas y vías de administración

Cuando se contemplan aplicaciones clínicas, será necesario preparar composiciones farmacéuticas en una forma apropiada para la aplicación pretendida. Generalmente, esto implicará preparar composiciones que estén esencialmente libres de pirógenos, así como otras impurezas que pudieran ser perjudiciales para los seres humanos

o animales.

Generalmente se deseará emplear sales apropiadas y tampones para volver a los vectores de suministro estables y permitir su captación por células diana. También se emplearán tampones cuando se introduzcan células recombinantes en un paciente. Las composiciones acuosas de la presente invención comprenden una cantidad eficaz del vector para las células, disuelta o dispersada en un vehículo farmacéuticamente aceptable o medio acuoso. Dichas composiciones también se mencionan como inóculos. La expresión "farmacéuticamente o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen reacciones adversas, alérgicas, u otras reacciones negativas cuando se administran a un animal o un ser humano. Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional es incompatible con los vectores o células de la presente invención, se contempla su uso en composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse ingredientes activos suplementarios en las composiciones.

Las composiciones activas de la presente invención pueden incluir preparaciones farmacéuticas clásicas. La administración de estas composiciones de acuerdo con la presente invención será mediante cualquier vía común siembre que el tejido diana esté disponible mediante esa vía. Dichas vías incluyen vía oral, nasal, bucal, rectal, vaginal o tópica. Como alternativa, la administración puede ser por inyección ortotópica, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, o intravenosa. Dichas composiciones normalmente se administrarían como composiciones farmacéuticamente aceptables, descritas supra. Es de particular interés la administración intratumoral directa, la perfusión de un tumor, o la administración local o regional a un tumor, por ejemplo, en la vasculatura local o regional o el sistema linfático, o en un lecho tumoral resecado.

Los compuestos activos también pueden administrarse por vía parenteral o intraperitoneal. Pueden prepararse soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación improvisada de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la medida que existe una fácil capacidad de inyectado. Debe ser estable en condiciones de fabricación y almacenamiento y conservarse frente la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse mediante el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según lo necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio básico de dispersión y los otros ingredientes requeridos entre aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son técnicas secado al vacío y secado por congelación que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional desde una solución de los mismos filtrada a esterilidad previamente.

Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida que cualquier medio convencional o agente sea incompatible con

5 el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse ingredientes activos suplementarios en las composiciones.

Para administración oral, los polipéptidos de la presente invención pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de enjuagues bucales no ingeribles y dentífricos. Un enjuague bucal puede prepararse incorporando el ingrediente activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado, tal como solución de borato sódico (solución de Dobell). Como alternativa, el ingrediente activo puede incorporarse en un enjuague antiséptico que contiene borato sódico, glicerina y bicarbonato potásico. El ingrediente activo también puede dispersarse en dentífricos, incluyendo: geles, pastas, polvos y suspensiones. El ingrediente activo puede añadirse en una cantidad terapéuticamente eficaz a una pasta dentífrica que puede incluir agua, aglutinantes, abrasivos, agentes

15 aromatizantes, agentes espumantes, y humectantes.

Las composiciones de la presente invención pueden formularse en una forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden obtenerse de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio, amonio, calcio, o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.

Tras la formulación, las soluciones se administrarán de un modo compatible con la formulación de dosificación y en

25 tal cantidad que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en diversas formas de dosificación tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármaco y similares. Para administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe tamponarse adecuadamente si fuera necesario y el diluyente líquido primero tiene que volverse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En este sentido, los medios acuosos estériles que pueden emplearse serán conocidos para los especialistas en la técnica a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosificación podría disolverse en 1 ml de solución isotónica de NaCl y añadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences," 15ª Edición, páginas 1035-1038 y 15701580). Será necesario que suceda alguna variación en la dosificación dependiendo de la afección del sujeto a tratar.

35 La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para administración a seres humanos, las preparaciones deben cumplir normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza según lo rebutido por la FDA Office of Biologics standards.

B. Tipos de cáncer y sujetos

Las células cancerosas para las cuales pueden aplicarse los usos médicos y procedimientos in vitro de la presente invención incluyen generalmente cualquier célula que exprese MUC1, y más particularmente, que sobre-exprese MUC1. Una célula cancerosa apropiada puede ser una célula de cáncer de mama, cáncer pulmonar, cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer óseo, cáncer hematológico

45 (por ejemplo, leucemia o linfoma), cáncer de tejido neural, melanoma, cáncer de ovario, cáncer testicular, cáncer de próstata, cáncer cervical, cáncer vaginal, o cáncer de vejiga. Además, los usos médicos de la invención pueden aplicarse a un amplio intervalo de especies, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos (por ejemplo, monos, babuinos, o chimpancés), caballos, ganado vacuno, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos, conejos, cobayas, jerbos, hámsters, ratas, y ratones.

C. Usos médicos

Los péptidos o análogos que inhiben la formación de oligómero de MUC1 son generalmente útiles como agentes terapéuticos o profilácticos anti-neoplásicos. Pueden administrarse a sujetos mamíferos (por ejemplo, pacientes

55 humanos con cáncer de mama) en solitario o junto con otros fármacos y/o radioterapia. Los compuestos también pueden administrarse a sujetos que son genética y/o ambientalmente (debido a, por ejemplo, factores fisiológicos y/o ambientales) susceptibles a cáncer, por ejemplo, sujetos con un historial familiar de cáncer (por ejemplo, cáncer de mama), sujetos con inflamación crónica o sometidos a estrés crónico, o sujetos que están expuestos a condiciones carcinogénicas ambientales naturales o no naturales (por ejemplo, exposición excesiva a la luz solar, carcinógenos industriales, o tabaquismo).

Cuando los usos de la presente invención se aplican a sujetos con cáncer, antes de la administración de un compuesto, el cáncer puede ensayarse opcionalmente para la expresión de MUC1 (expresión de la proteína MUC1

o el ARNm de MUC1) mediante procedimientos conocidos en la técnica. De este modo, los sujetos pueden

65 identificarse como que tienen un cáncer que expresa o sobre-expresa MUC1. Dichos ensayos pueden realizarse in vitro sobre células cancerosas obtenidas de un sujeto. Como alternativa, pueden realizarse técnicas de imagen in

vivo usando, por ejemplo, anticuerpos radiomarcados específicos para MUC1. Además, pueden ensayarse fluidos corporales (por ejemplo, sangre u orina) de sujetos con cáncer para niveles elevados de proteína MUC1 o fragmentos de proteína MUC1.

La dosificación requerida depende de la elección de la vía de administración; la naturaleza de la formulación; la naturaleza de la enfermedad del paciente; el tamaño del sujeto, el peso, área superficial, edad, y sexo; otros fármacos que se estén administrando; y el criterio del médico. Las dosificaciones adecuadas están en el intervalo de 0,0001 mg/kg -100 mg/kg. Son de esperar amplias variaciones en la dosificación necesaria en vista de la diversidad de compuestos disponibles y las diferentes eficacias de las diversas vías de administración. Por ejemplo, se esperaría que la administración oral requiriera dosificaciones mayores que la administración por inyección intravenosa. Pueden ajustarse variaciones en estos niveles de dosificación usando rutinas empíricas convencionales para la optimización como se comprende bien en la técnica. Las administraciones pueden ser únicas o múltiples (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20, 50, 100, 150, o más veces). La encapsulación del polipéptido en un vehículo adecuado de suministro (por ejemplo, micropartículas poliméricas o dispositivos implantables) puede aumentar la eficacia del suministro, particularmente para suministro oral.

V. Terapias de combinación

La resistencia de células tumorales a agentes que dañan el ADN representa un problema principal en oncología clínica. Un objetivo de la investigación actual sobre el cáncer es hallar modos de mejorar la eficacia de quimio-y radioterapia. Un modo es combinando dichas terapias tradicionales con terapia génica. En el contexto de la presente invención, se contempla que la terapia con péptido MUC1 pudiera usarse de forma similar junto con intervención quimioterapéutica, radioterapéutica, o inmunoterapéutica.

Para eliminar células, inhibir el crecimiento celular, inhibir la metástasis, inhibir la angiogénesis o revertir o reducir de otro modo el fenotipo maligno de las células tumorales, usando los usos médicos, procedimientos in vitro y composiciones de la presente invención, generalmente se pondría en contacto una célula diana con un péptido MUC1 y al menos una terapia diferente. Estas terapias se proporcionarían en una cantidad combinada eficaz para eliminar o inhibir la proliferación de la célula. Este proceso puede implicar poner en contacto las células con los agentes/terapias al mismo tiempo. Esto puede conseguirse poniendo en contacto la célula con una única composición o formulación farmacológica que incluya ambos agentes, o poniendo en contacto la célula con dos composiciones o formulaciones distintas, al mismo tiempo, en el que una composición incluye el péptido MUC1 y la otra incluye el agente.

Como alternativa, el tratamiento con MUC1 pueden preceder o seguir al otro tratamiento en intervalos que varían de minutos a semanas. En realizaciones en las que el otro tratamiento y el péptido MUC1 se aplican por separado a la célula, generalmente se aseguraría que no expirara un periodo de tiempo significativo entre el momento de cada suministro, de modo que la terapias aún serían capaces de ejercer un efecto ventajosamente combinado sobre la célula. En dichos casos, se contempla que se pondría en contacto la célula con ambas modalidades en aproximadamente 12-24 horas entre sí, en aproximadamente 6-12 horas entre sí, o con un tiempo de retardo de sólo aproximadamente 12 horas. En algunas situaciones, puede ser deseable prolongar el periodo de tiempo para el tratamiento de forma significativa; sin embargo, donde transcurren varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) entre las administraciones respectivas.

También es concebible que se desee más de una administración del péptido MUC1 o la otra terapia. Pueden emplearse diversas combinaciones, donde el péptido MUC1 es "A," y la otra terapia es "B," como se ejemplifica a continuación:

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/B

A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/A

A/A/AB B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/A/B

Se contemplan otras combinaciones. De nuevo, para conseguir eliminar células, se suministran ambas terapias a una célula en una cantidad combinada eficaz para eliminar la célula.

Los agentes o factores adecuados para su uso en una terapia combinada incluyen cualquier compuesto químico o procedimiento de tratamiento que induzca daño en el ADN cuando se aplica a una célula. Dichos agentes y factores incluyen radiación y ondas que inducen daño en el ADN tales como, radiación %, rayos X, radiación UV, microondas, emisiones electrónicas, y similares. Se pretende que diversos compuestos químicos, también descritos como "agentes quimioterapéuticos" o "agentes genotóxicos", sean de uso en los procedimientos de tratamiento combinado desvelados en el presente documento. En el tratamiento del cáncer de acuerdo con la invención, se pondrían en contacto las células tumorales con un agente además de la construcción de expresión. Esto puede conseguirse irradiando el sitio localizado del tumor con radiación tal como rayos X, luz UV, rayos % o incluso microondas. Como alternativa, las células tumorales pueden ponerse en contacto con el agente administrando al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica. Se contemplan diversas clases de agentes quimioterapéuticos para su uso en combinación con péptidos de la

presente invención. Por ejemplo, antagonistas selectivos del receptor de estrógenos ("SERM"), tales como Tamoxifeno, 4-hidroxi Tamoxifeno (Afimoxfeno), Falsodex, Raloxifeno, Bazedoxifeno, Clomifeno, Lasofoxifeno Femarelle, Ormeloxifeno, y Toremifeno.

Los agentes quimioterapéuticos contemplados para ser de uso, incluyen, por ejemplo, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C. La invención también abarca el uso de una combinación de uno o más agentes que dañan el ADN, ya sean basados en radiación o compuestos reales, tales como el uso de rayos X con cisplatino o el uso de cisplatino con etopósido. El agente puede prepararse y usarse como una composición terapéutica combinada, o kit, combinándolo con un péptido MUC1, como se ha descrito anteriormente.

La proteína de choque térmico 90 es una proteína reguladora hallada en muchas células eucariotas. Los inhibidores de HSP90 han demostrado ser útiles en el tratamiento del cáncer. Dichos inhibidores incluyen Geldanamicina, 17(Alilamino)-17-demetoxigeldanamicina, PU-H71 y Rifabutina.

También se conciben agentes que reticulan directamente el ADN o forman aductos. Pueden usarse agentes tales como cisplatino, y otros agentes alquilantes del ADN. El cisplatino se ha usado ampliamente para tratar el cáncer, con dosis eficaces usadas en aplicaciones clínicas de 20 mg/m2 durante 5 días cada tres semanas para un total de tres ciclos. El cisplatino no se absorbe por vía oral y por lo tanto debe suministrarse mediante inyección intravenosa, subcutánea, intratumoral o intraperitoneal.

Los agentes que dañan el ADN también incluyen compuestos que impiden la replicación del ADN, la mitosis y segregación cromosómica. Dichos compuestos quimioterapéuticos incluyen Adriamicina, también conocida como Doxorrubicina, Etopósido, Verapamil, Podofilotoxina, y similares. Usados ampliamente en un entorno clínico para el tratamiento de neoplasias, estos compuestos se administran a través de inyecciones intravenosas en embolada a dosis que varían de 25-75 mg/m2 a intervalos de 21 días para Doxorrubicina, hasta 35-50 mg/m2 para etopósido intravenoso o el doble de la dosis intravenosa por vía oral. También se contemplan inhibidores de microtúbulos, tales como taxanos. Estas moléculas son diterpenos producidos por las plantas del género Taxus, e incluyen paclitaxel y docetaxel.

Los inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico, tales como Iressa, mTOR, la diana de mamífero de rapamicina, también conocida como proteína 12 de unión a FK506-proteína 1 asociada a rapamicina (FRAP1) es una serina/treonina proteína quinasa que regula el crecimiento celular, la proliferación celular, la motilidad celular, la supervivencia celular, la síntesis de proteínas, y la transcripción. Por lo tanto se contempla la rapamicina y análogos de la misma ("rapálogos") para su uso en terapia de combinación del cáncer de acuerdo con la presente invención.

Otra terapia posible de combinación con los péptidos reivindicados en el presente documento es TNF-∃ (factor de necrosis tumoral-alfa), una citoquina implicada en la inflamación sistémica y un miembro de un grupo de citoquinas que estimulan la reacción en fase aguda. El papel principal de TNF es en la regulación de células inmunes. El TNF también es capaz de inducir la muerte celular apoptótica, de inducir inflamación, y de inhibir la tumorigénesis y la replicación viral.

Los agentes que alteran la síntesis y fidelidad de los precursores y subunidades de ácido nucleico también conducen a daño en el ADN. Por tanto se han desarrollado varios precursores de ácido nucleico. Son particularmente útiles agentes que han experimentado ensayo extensivo y están fácilmente disponibles. Por tanto, se usan preferentemente agentes tales como 5-fluorouracilo (5-FU), por tejido neoplásico, haciendo a este agente particularmente útil para abordar células neoplásicas. Aunque es bastante tóxico, el 5-FU, es aplicable en una amplia gama de vehículos, incluyendo tópicos, sin embargo se usa habitualmente administración intravenosa con dosis que varían de 3 a 15 mg/kg/día.

Otros factores que causan daño en el ADN y se han usado de forma extensiva incluyen lo que habitualmente se conoce como rayos %, rayos X, y/o el suministro dirigido de radioisótopos a células tumorales. También se contemplan otras formas de factores que dañan el ADN tales como microondas y radiación UV. Lo más probable es que todos estos factores realizan una amplia gana de daño al ADN, sobre los precursores del ADN, la replicación y reparación del ADN, y el ensamblaje y mantenimiento de los cromosomas. Los intervalos de dosificación para rayos X varían de dosis diarias de 50 a 200 roentgen durante periodos prolongados de tiempo (3 a 4 semanas), a dosis únicas de 2000 a 6000 roentgen. Los intervalos de dosificación para radioisótopos varían ampliamente, y dependen de la semi-vida del isótopo, la potencia y tipo de radiación emitida, y la captación por las células neoplásicas.

Se remite a los especialistas en la técnica a "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ª Edición, capítulo 33, en particular las páginas 624-652. Será necesario que suceda alguna variación en la dosificación dependiendo de la afección del sujeto a tratar. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Además, para administración a seres humanos, las preparaciones deben cumplir normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza según lo requerido por la FDA Office of Biologics standards.

Los inventores proponen que el suministro local o regional de péptidos MUC1 a paciente con cáncer será muy eficaz

para tratar la enfermedad clínica. Asimismo, la quimio-o radioterapia puede dirigirse a una región particular afectada del cuerpo del sujeto. Como alternativa, puede ser apropiado el suministro regional o sistémico de la construcción de expresión y/o el agente en ciertas circunstancias, por ejemplo, cuando haya sucedido metástasis extensiva.

Además de combinar terapias con MUC1 con quimio-y radioterapias, también se contempla la combinación con inmunoterapia, terapia hormonal, terapia con toxinas y cirugía. En particular, se pueden emplear terapias dirigidas tales como Avastina, Erbitux, Gleevec, Herceptina y Rituxan.

También debe señalarse que cualquiera de las terapias anteriores puede demostrar ser útil en sí misma en el tratamiento del cáncer.

VI. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones particulares de la invención. Los especialistas en la técnica deben apreciar que las técnicas desveladas en los siguientes ejemplos representan técnicas descubiertas por el inventor para que funcionen bien en la práctica de la invención, y por tanto puede considerarse que constituyen modos particulares de su práctica. Sin embargo, los especialistas en la técnica deben apreciar, a la luz de la presente divulgación, que pueden hacerse muchos cambios en las realizaciones específicas que se desvelan y aún obtener un resultado parecido o similar sin alejarse del espíritu y alcance de la invención.

Ejemplo 1-Materiales y métodos

Cultivo celular. Se cultivaron las líneas celulares de cáncer de mama humano ZR-75-1, ZR-75-1/vector, ZR-751/ARNip de MUC1 (Ren y col., 2004) en medio RPMI1640 suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (HI-FBS), 100 U/ml de penicilina, y 100 #g/ml de estreptomicina (Invitrogen) en una incubadora humidificada a 37 ºC y CO2 al 5 %. Se cultivaron células de cáncer de mama humano MCF-7 y células 293 en medio de Eagle modificado por Dulbecco con HI-FBS al 10 %, antibióticos y L-glutamina 2 mM. Se cultivaron células epiteliales de mama humana MCF-10A en medio de crecimiento de células epiteliales mamarias (MEGM; Lonza). Las células se trataron con los péptidos MUC1/CQC o MUC1/AQA sintetizados por el MIT Biopolimer Laboratory, Cambridge, MA. La variabilidad se determinó por exclusión de azul de tripano.

Inmunoprecipitación y análisis de inmunotransferencia. Se prepararon lisados de células completas y nucleares como se ha descrito (Leng y col., 2007). Las proteínas solubles se sometieron a inmunoprecipitación con anti-Flag (Sigma, St. Louis, MO). Los inmunoprecipitados y proteínas solubles se analizaron por inmunotransferencia con anti-His (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-GFP (Millipore, Danvers, MA), anti-Flag, anti-MUC1-C (Ab1; NeoMarkers, Fremont, CA), anti-lamina B (EMD La Jolla, CA) o anti-!-actina (Sigma). La reactividad se detectó con anticuerpos secundarios conjugados a peroxidada de rábano rusticano y quimioluminiscencia.

Transfección celular. Se transfectaron células 293 con vectores que expresan GFP, GFP-MUC1-CD o Flag-MUC1-CD en presencia de Lipofectamina como se ha descrito (Leng y col., 2007).

Captación de péptidos. Las células se incubaron con péptido MUC1/CQC marcado con FITC (MIT Biopolimer Laboratory), se lavaron con PBS fría, se fijaron en paraformaldehído al 1 %/PBS y se analizaron para la fluorescencia por citometría de flujo.

Análisis de la distribución del ciclo celular, apoptosis y necrosis. Las células se recogieron, se lavaron con PBS, se fijaron con etanol al 80 %, y se incubaron en PBS que contenía 40 #g/ml de RNasa y 40 #g/ml de yoduro de propidio durante 30 min. a 37 ºC. La distribución del ciclo celular se determinó por citometría de flujo. Se evaluó el contenido de ADN sub-G1 por tinción de las células fijadas en etanol y permeabilizadas con tampón citrato con yoduro de propidio y control por citometría de flujo como se ha descrito (Yin y col., 2007). Para la evaluación de la necrosis, las células se incubaron con 1 #g/ml de yoduro de propidio/PBS durante 5 min. a temperatura ambiente y después se controlaron por citometría de flujo como se ha descrito (Yin y col., 2007).

Modelo de xenoinjerto de tumor de mama humano. Se implantó por vía subcutánea a ratones hembra Balb-c nu/nu (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), de 4-6 semanas de edad que pesaban 18-22 gramos, tapones de 17-!-estradiol (0,72 mg; Innovative Research, Sarasota, FL) usando una pistola de trocar. Después de 24 h, se inyectaron por vía subcutánea 1 x 107 ZR-75-1 células incluidas en Matri-Gel (BD Biosciences) en el costado. Cuando los tumores fueron detectables a &150 mm3 (Cohorte 1) o 275 mm3 (Cohorte 2), los ratones se emparejaron en grupos de tratamiento y control. Cada grupo contenía 5 ratones, cada uno de los cuales se marcó en la oreja y se le hizo un seguimiento durante todo el estudio. La dosificación inicial se administró en el momento del emparejamiento (día 1). Se les administró diariamente solución salina tamponada con fosfato (vehículo), péptido MUC1/CQC y péptido MUC1/AQA por inyección intraperitoneal. Los ratones se pararon dos veces a la semana, y las mediciones del tumor se realizaron usando calibres cada 4 días. El volumen del tumor (V) se calculó usando la fórmula V = W2 x L/2, donde W y L son los diámetros más pequeño y más grande, respectivamente. En el momento del sacrificio, se prefundió a los ratones con solución salina y después formalina tamponada con fosfato por

administración cardiaca. Se escindieron los tumores, se fijaron por inmersión durante 4 h, se deshidrataron a través de una serie graduada de etanoles, y se procesaron para inclusión rutinaria en parafina. Los tumores se evaluaron por tinción con H y E y tinción con inmunoperoxidasa con anti-MUC1 como se ha descrito (Kufe, 1984).

Fármacos y citoquinas. Se adquirieron cisdiaminadicloroplatino (II), Doxorrubicina (adriamicina), Taxol (Paclitaxel) de Sigma (St. Louis, MO). Se adquirió rh-TNF-alfa de Promega (Madison, WI). El péptido GO-203 se sintetizó por Anaspec Inc.

Ensayos de citotoxicidad in vitro y combinación. Las células se sembraron en una placa de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos (Fisher) a 1000 células por pocillo para un experimento de 6 días o a 3000 células por pocillo para un experimento de 3 días. Las células después se cultivaron durante 24 h. Los fármacos antineoplásicos y GO-203 se diluyeron a las concentraciones indicadas y se añadieron a las células. Se añadió GO-203 (5 #mol/l) cada 24 h durante 72 h. La viabilidad celular se determinó añadiendo reactivo MTS a las células y leyendo la absorbancia a 490 nm por un lector de microplaca.

Análisis de los datos. Los valores de CI50 para todos los fármacos anti-neoplásicos se determinaron por análisis de regresión no lineal usando Graphpad Prism (GraphPad Software, San Diego CA). Se usó el programa informático CombiTool (versión 2.001, IMB Jena Biocomputing Group) para calcular el índice de combinación dentro de un intervalo de dosis en presencia de 5 #mol/l de GO-203.

Ejemplo 2 -Resultados

Efectos del péptido MUC1/CQC sobre la formación de oligómero de MUC1. El dominio citoplasmático de MUC1 (MUC1-CD) contiene un motivo CQC que es necesario para la formación de oligómeros y la localización nuclear (Leng y col., 2007). Para determinar si puede diseñarse una molécula pequeña para bloquear la oligomerización, los inventores sintetizaron un péptido derivado de la región N-terminal de MUC1-CD que contiene el motivo CQC (péptido MUC1/CQC; FIG. 1A). Se incluyó un dominio de transducción poli D-arginina en la síntesis para facilitar la entrada del péptido en las células (Fischer, 2007) (FIG. 1A). Como control, se sintetizó un péptido similar en que el motivo CQC estaba alterado en AQA (péptido MUC1/AQA; FIG. 1A). Para evaluar la unión de los péptidos a MUC1-CD, los inventores inmovilizaron MUC1-CD marcado con His a un chip sensor BIAcore. El péptido MUC1/CQC se unía a His-MUC1-CD con una constante de disociación (Kd) de 30 nM (FIG. 1B), que es similar a la obtenida con oligómeros MUC1-CD (Leng y col., 2007). En contraste, no hubo unión aparente del péptido MUC1/AQA (datos no mostrados). MUC1-CD marcado con His purificado forma oligómeros detectados por electroforesis en geles de poliacrilamida (FIG. 1C). La incubación de His-MUC1-CD con el péptido MUC1/CQC disminuía sustancialmente la formación de oligómero y aumentaba los monómeros (FIG. 1C). Además, la incubación con el péptido MUC1/AQA tenía poco efecto, sino ninguno (FIG. 1C). Para evaluar los efectos sobre la oligomerización de MUC1 in vivo,se transfectaron células 293 con vectores que expresaban GFP-MUC1-CD y Flag-MUC1-CD (FIG. 1D, izquierda). Los complejos de GFP-MUC1-CD y Flag-MUC1-CD fueron detectables por coprecipitación de lisados de células no expuestas a péptido (FIG. 1D, derecha). En concierto con los resultados in vitro, la incubación de las células 293 transfectadas con el péptido MUC1/CQC se asoció a alteración de la interacción entre Flag-MUC1-CD y GFP-MUC1-CD (FIG. 1D, derecha). Además, el péptido MUC1/AQA no tenía efecto aparente (FIG. 1D, derecha). Estos resultados indican que el péptido MUC1/CQC se une a MUC1-CD y bloquea la formación de oligómeros de MUC1-CD in vitro y en células.

El péptido MUC1/CQC bloquea el direccionamiento de MUC1-C al núcleo. Las células de cáncer de mama humano ZR-75-1 y MCF-7 sobre-expresan MUC1 endógeno, y por tanto representan modelos potenciales para evaluar los efectos del péptido MUC1/CQC (Ramasamy y col., 2007). Para evaluar la captación, las células ZR-75-1 se incubaron con péptido FITC-MUC1/CQC 5 #M (FIG. 2A). A las 2 h, el análisis de las células por citometría de flujo mostró un aumento sustancial en la intensidad de fluorescencia con una media (MFI) de 145 (FIG. 2A). Se identificaron aumentos adicionales en MFI a las 6 y 24 h (FIG. 2A). La oligomerización de MUC1-C es necesaria para su importación nuclear (Leng y col., 2007). El tratamiento de células ZR-75-1 con el péptido MUC1/CQC o MUC1/AQA no tuvo efecto sobre los niveles celulares de MUC1-C (FIG. 2B). Sin embargo, en concierto con los efectos sobre la oligomerización, el tratamiento con el péptido MUC1/CQC, y no el péptido MUC1/AQA, se asoció con disminuciones en los niveles nucleares de MUC1-C (FIG. 2B). Se observaron efectos similares en células MCF7 con regulación negativa de los niveles nucleares de MUC1-C en respuesta al tratamiento con el péptido MUC1/CQC (FIG. 2C). Estos hallazgos indican que el péptido MUC1/CQC bloquea la oligomerización de MUC1-C y de este modo el direccionamiento de MUC1-C al núcleo.

El péptido MUC1/CQC bloquea el crecimiento e induce necrosis. Para determinar si el péptido MUC1/CQC afecta al crecimiento, se trataron células ZR-75-1 con MUC1/CQC 5 #M durante 72 h y se controlaron para la distribución del ciclo celular. De forma significativa, hubo una detención sustancial en fase S en comparación con células dejadas sin tratar o tratadas con el péptido MUC1/AQA (FIG. 3A). En 96 h, se disminuyó la población en fase S, potencialmente a través del agotamiento por muerte celular (FIG. 3A). Hubo poca acumulación, sino ninguna, de células con contenido de ADN sub-G1 para apoyar la inducción de apoptosis (FIG. 3A). Sin embargo, el tratamiento de células ZR-75-1 con el péptido MUC1/CQC, y no el péptido MUC1/AQA, se asoció con la inducción de necrosis, que fue detectable a las 72 h y más prominente a las 96 h (FIG. 3B). Las células MCF-7 respondieron de forma

similar al péptido MUC1/CQC con detención del crecimiento en fase S (FIG. 3C) y la inducción de necrosis (FIG. 3D). Estos hallazgos indican que el péptido MUC1/CQC inhibe el crecimiento e induce necrosis de células de cáncer de mama humano.

Especificidad del péptido MUC1/CQC para células de carcinoma que expresan MUC1. Para determinar si el péptido MUC1/CQC tiene actividad selectiva contra células de carcinoma de mama que sobre-expresan MUC1 endógeno, los inventores trataron células ZR-75-1 que estaban silenciadas de forma estable para la expresión de MUC1 con un ARNip de MUC1 (FIG. 4A). En contraste con la detención del crecimiento y muerte de las células de control ZR-75-1/vector, el péptido MUC1/CQC tuvo sustancialmente menos efecto sobre las células ZR-75-1/ARNip de MUC1 (FIG. 4B). Además, el péptido MUC1/CQC no tuvo efecto aparente sobre el crecimiento de células 293 MUC1-negativas (FIG. 4C). También se realizaron estudios sobre la línea de células epiteliales mamarias no transformadas MCF-10A (Muthuswamy, 2001; Soule, 1990), que expresa MUC1, pero a niveles inferiores que los hallados en células ZR-75-1 y MCF-7 (Ahmad y col., 2007). De forma notable, en contraste con las células ZR-75-1 y MCF-7, el péptido MUC1/CQC no tuvo efecto sobre la distribución del ciclo celular (FIG. 4D) y crecimiento (FIG. 4E) de MCF-10A. Estos hallazgos indican que el péptido MUC1/CQC tiene actividad selectiva contra células de carcinoma de mama que sobre-expresan MUC1 endógeno.

El péptido MUC1/CQC inhibe la tumorigenicidad in vivo. Para determinar si la administración del péptido MUC1/CQC está asociada con efectos en el peso corporal, se inyectó por vía intraperitoneal (IP) a cinco ratones desnudos (nu/nu) hembra una vez cada día a una dosis de 50 mg/kg. La administración del péptido durante 11 días no tuvo efecto aparente sobre el peso de los ratones individuales. Además, no hubo efecto posterior sobre el peso corporal durante los siguientes 28 días después de detener la administración de MUC1/CQC (datos no mostrados). Para evaluar la actividad anti-tumoral, se implantaron células ZR-75-1 (1 x 107) por vía subcutánea en los costados de ratones desnudos. Después de 12 días, los ratones que albergaban tumores de aproximadamente 150 mm3 se trataron con el péptido MUC1/CQC a dosis de 10 y 50 mg/kg/día. Como controles, los ratones se trataron con vehículo solamente o con el péptido MUC1/AQA. La administración del péptido MUC1/CQC a 10 mg/kg/día x 21 días ralentizó el crecimiento en comparación con lo obtenido con el péptido MUC1/AQA dado a 50 mg/kg/día (FIG. 5A). Además, la administración del péptido MUC1/CQC a 50 mg/kg/día bloqueó el crecimiento durante los 7 días iniciales del tratamiento (FIG. 5A). Por consiguiente, se detuvo el tratamiento y se controló a los ratones para el rebrote. De forma significativa, no hubo crecimiento detectable de los tumores durante los siguientes 17 días (FIG. 5A). Para evaluar en parte la base para la actividad, se examinaron los tumores recogidos de los ratones de control y tratados por histopatología. Los tumores de los ratones tratados con MUC1/CQC (10 y 50 mg/kg) eran marcadamente necróticos en comparación con los de ratones tratados con el vehículo o el péptido MUC1/AQA (FIG. 5B y datos no mostrados). De forma notable, sin embargo, también fueron detectables células tumorales alrededor de las áreas de necrosis (FIG. 5B). También se tiñeron secciones de los tumores con un anticuerpo contra MUC1. El tratamiento con el péptido MUC1/CQC se asoció con una marcada regulación negativa de la expresión de MUC1 en comparación con los tumores de control y aquellos tratados con el péptido MUC1/AQA (FIG. 5C y datos no mostrados).

También se realizaron estudios sobre tumores más grandes (&275 mm3) (FIG. 6A). La administración del péptido MUC1/CQC a una dosis intermedia de 30 mg/kg/día x 21 días se asoció con la detención del crecimiento tumoral (FIG. 6A). Además, no hubo rebrote aparente durante los siguientes 31 días después del tratamiento (FIG. 6A), lo que indica adicionalmente que el péptido MUC1/CQC es eficaz en detener el crecimiento tumoral. Los tumores recogidos en el día 52 mostraron extensivas áreas de necrosis (FIG. 6B) y regulación negativa de la expresión de MUC1. Estos hallazgos indican que el péptido MUC1/CQC regula negativamente la expresión de MUC1 y está asociado con la inducción de necrosis y detención prolongada del crecimiento tumoral.

Péptidos grapados de CQC C-terminal de MUC1. Las interacciones intracelulares proteína-proteína que gobiernan muchas vías biológicas están frecuentemente mediadas por estructuras de ∃-hélice de proteínas. Los péptidos helicoides también pueden impedir o estabilizar las interacciones proteína-proteína. Los péptidos helicoides nativos tienen inconvenientes importantes como agentes terapéuticos a causa de su baja potencia, su inestabilidad y su suministro ineficaz a las células. Recientes estudios han demostrado que estos problemas podrían superarse mediante una modificación química de péptidos ∃-helicoides llamada grapado de hidrocarburos.

Los inventores usaron la secuencia peptídica endógena C terminal de MUC1 (AIVYLIALAVCQCRRKNYG) y generaron dos péptidos ∃-helicoides, GO-200-1B y GO-200-2B usando grapado de hidrocarburos:

GO-200-1B: Ac-AIVYL-S5-ALA-S5-CQCRRKNYG-NH2

GO-200-2B: Ac-AKKYL-S5-ALA-S5-CQC-S5-RKNY-NH2

Para determinar si la exposición a GO-200-1B afecta al crecimiento de células de carcinoma pulmonar no microcítico, se trataron células H-1650 con GO-200-1B 1 y 5 #M durante 7 días y se controlaron para el crecimiento. Los resultados demuestran que el tratamiento de células con GO-200-1B 5 #M estaba asociado con inhibición significativa del crecimiento (FIG. 9A). Además, otra línea celular de carcinoma pulmonar no microcítico, H-1975, se trató con GO-200-2B 5 #M durante 3 días y se controló para el crecimiento celular así como la muerte celular. Los resultados demuestran que el tratamiento de células H-1975 con GO-200-2B durante 3 días estaba asociado con más del 80 % de inhibición de la proliferación celular. Además, GO-200-2B también se asoció con inducción significativa de muerte celular (FIG. 9B). Estos hallazgos indican que los péptidos grapados de MUC1-C son eficaces en la inducción de la detención del crecimiento y la muerte de células cancerosas humanas MUC1positivas.

5 Análogos de GO-203. Los recientes estudios de los inventores han demostrado que un péptido C-terminal MUC1 (CQCRRKNYGQLDIFP) es activo en la inhibición del crecimiento de múltiples líneas celulares de carcinoma. También han demostrado que un péptido MUC1-C-terminal más corto, CQCRRKN, también es activo en la eliminación de células tumorales. Sin embargo, estos péptidos MUC1-C-terminales constan de L-aminoácidos. De forma importante, los péptidos con L-aminoácidos tienen susceptibilidad a degradación por enzimas proteolíticas, mientras que aquellos que contienen D-aminoácidos han demostrado ser más estables. Por consiguiente, han generado una forma toda-dextro del péptido MUC1 C-terminal más corto descrito anteriormente, en que los Laminoácidos se cambiaron a D-aminoácidos (GO-203). Además, para determinar los restos mínimos de aminoácidos de la región C-terminal de MUC1 que son necesarios para retener la actividad de eliminación celular, también han

15 generado muchas versiones diferentes de GO-203 que se describen en la FIG. 8.

Se cultivaron múltiples líneas celulares tumorales (carcinoma de mama dependiente de hormonas ZR-75-1; carcinoma de mama triple-negativo MDA-MB-231; carcinoma pulmonar no microcítico A549; carcinoma pulmonar no microcítico H-1975) en RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 %, 100 unidades/ml de penicilina y 100 #g/ml de estreptomicina y 2 mmol/l de L-glutamina. Las células se trataron por separado con 5 #M de diferentes análogos de GO-203 (FIG. 8) durante 3 a 7 días y se determinó la viabilidad por exclusión de azul de tripano. Se comparó la proliferación de diferentes líneas celulares con células tratadas con vehículo solamente. Los resultados demuestran que el tratamiento de múltiples líneas celulares tumorales con 5 #M de diferentes análogos de GO-203 estaba asociado con inhibición significativa del crecimiento (FIG. 10-14).

25 Terapia de combinación. Los valores del índice de combinación (CI) generados por el programa CombiTool se representaron frente a la fracción afectada por la combinación de fármaco. Los valores de CI eran cercanos a 1 para cisplatino y GO-203, lo que indica interacción aditiva. Los valores de CI obtenidos para Doxorrubicina (25, 50, 100, 200 nM), Taxol (25, 50, 100 nM) y TNF (10, 20, 40 ng/ml) con GO-203 fueron menores de 1, lo que supone un fuerte efecto aditivo o sinergia (FIG. 15A-D y 16).

Ejemplo 3 -Discusión

El péptido MUC1/CQC bloquea la oligomerización de MUC1. La sobre-expresión de MUC1 es suficiente para la

35 inducción del crecimiento independiente de anclaje y la tumorigenicidad (Li y col., 2003a; Huang y col., 2003; Huang y col., 2005). De forma notable, sin embargo, la función transformante de MUC1 se anula por mutación del motivo CQC en el dominio citoplasmático en AQA (Leng y col., 2007). MUC1 forma oligómeros y el motivo CQC es necesario para esta oligomerización (Leng y col., 2007). Además, la formación de oligómeros es necesaria para dirigir la subunidad MUC1-C al núcleo (Leng y col., 2007). Otras funciones de la subunidad MUC1-C, tales como la activación de las vías Wnt/!-catenina e IKK!∋NF-(B, también son dependientes de la formación de oligómeros MUC1-C (datos no publicados). En base a estos hallazgos, los inventores razonaron que la alteración de la oligomerización de MUC1 mediante una molécula pequeña tendría potencial para bloquear la función transformante de MUC1. En ese contexto, sintetizaron un péptido derivado de MUC1 que contiene el motivo CQC y un dominio de liberación celular poli-Arg para entrar en las células. Estudios iniciales con este péptido MUC1/CQC mostraron que

45 inhibe la oligomerización de MUC1-CD in vitro. Como se ha mostrado previamente por análisis BIAcore, MUC1-CD forma dímeros con una constante de disociación (Kd) de 33 nM (Leng y col., 2007). El péptido MUC1/CQC se unía de forma similar a MUC1-CD con una Kd de 30 nM. Además, la demostración de que el péptido MUC1/AQA tiene poco efecto, sino ninguno, sobre la oligomerización de MUC1 proporcionó respaldo para la dependencia en el motivo CQC. MUC1/CQC, y no MUC1/AQA, también era eficaz en bloquear la oligomerización de MUC1-CD en células. Estos hallazgos por tanto indicaron que el péptido MUC1/CQC podría usarse para alterar la oligomerización de MUC1 y de este modo potencialmente la función MUC1 en células de carcinoma de mama humano.

Selectividad del péptido MUC1/CQC por células de carcinoma que sobre-expresan MUC1. Los dominios de liberación celular, tales como poli-D-Arg, y sus conjugados entre en las células, al menos en gran parte, por

55 endocitosis y después tienen que alcanzar su diana pretendida (Fischer, 2007). La entrada del péptido MUC1/CQC en células de cáncer de mama ZR-75-1 fue fácilmente detectable y persistió durante al menos 24 h. De forma significativa y coherente con la dependencia del direccionamiento nuclear de MUC1 en la oligomerización (Leng y col., 2007), la captación del péptido MUC1/CQC se asoció con regulación negativa de los niveles de MUC1-C en el núcleo. Se obtuvieron resultados similares con células de cáncer de mama MCF-7, lo que indica que esta respuesta al péptido MUC1/CQC no es específico de célula. Además y de forma notable, la exposición de estas células a MUC1/CQC, y no a MUC1/AQA, se asoció con detención del crecimiento y la inducción de necrosis. Es de importancia que MUC1/CQC induzca muerte mediante un mecanismo dependiente de la expresión de su diana pretendida o que sea una citotoxina no específica. En ese contexto, el silenciamiento de MUC1 en células ZR-75-1 anuló los efectos citotóxicos de MUC1/CQC. En contraste, la exposición de células epiteliales mamarias MCF-10A

65 no malignas al péptido MUC1/CQC tuvo poco efecto. Estos hallazgos indican que la sensibilidad al péptido MUC1/CQC es dependiente de la sobre-expresión de MUC1 y una función de MUC1 asociada con el fenotipo maligno. El péptido MUC1/CQC por tanto parece tener una actividad dominante-negativa que es selectiva para células de carcinoma que sobre-expresan MUC1.

Actividad anti-tumoral del péptido MUC1/CQC. Los dominios de liberación celular se están usando para

5 suministrar cargas terapéuticas (Fischer, 2007). Sin embargo, como con cualquiera de estos agentes, una cuestión primordial es si el péptido MUC1/CQC puede suministrarse in vivo con un índice terapéutico eficaz, que tenga actividad anti-tumoral y un perfil de toxicidad aceptable. En la resolución de esta cuestión, los inventores descubrieron que la administración del péptido MUC1/CQC a 10 y 30 mg/kg/día durante 21 días se toleraba bien sin aparentes toxicidades agudas. También descubrieron que el tratamiento a estas dosis era eficaz en anular el crecimiento tumoral. Estos resultados estaban en contraste con la administración del péptido MUC1/AQA a 50 mg/kg/día durante 21 días, que no tenía actividad anti-tumoral. Además y de forma algo sorprendente, no hubo evidencias de rebrote tumoral después de dosificar a 30 mg/kg/día durante 21 días. La administración del péptido MUC1/CQC a 50 mg/kg/día durante 7 días también demostró que el crecimiento tumoral permanece detenido durante periodos prolongados después del tratamiento. Estos resultados se explican, al menos en parte, por el

15 hallazgo de que el tratamiento con el péptido MUC1/CQC está asociado con la inducción de necrosis tumoral.

La actividad in vitro del oligómero de 7 monómeros de MUC1/CQC es tan potente como el oligómero de 15 monómeros de MUC1/CQC. En base a estos hallazgos, se anticiparía que el oligómero de 7 monómeros de MUC1/CQC también será tan activo como un agente anti-tumoral en modelos de tumor in vivo.

Todas las composiciones y/o procedimientos desvelados y reivindicados en el presente documento pueden prepararse y ejecutarse sin experimentación excesiva a la luz de la presente divulgación. Aunque las composiciones y procedimientos de la presente invención se han descrito en términos de realizaciones preferidas, será evidente para los especialistas en la técnica que pueden aplicarse variaciones a las composiciones y/o procedimientos y en

25 las etapas o en la secuencia de etapas del procedimiento descrito en el presente documento.

VII. Referencias

Las siguientes referencias, en la medida en que proporcionan detalles ejemplares de procedimiento u otros detalles suplementarios a los expuestos en el presente documento, se incorporan específicamente en el presente documento por referencia:

Patente de Estados Unidos 5.440.013 Patente de Estados Unidos 5.446.128 35 Patente de Estados Unidos 5.475.085 Patente de Estados Unidos 5.597.457 Patente de Estados Unidos 5.618.914 Patente de Estados Unidos 5.670.155 Patente de Estados Unidos 5.672.681 Patente de Estados Unidos 5.674.976 Patente de Estados Unidos 5.710.245 Patente de Estados Unidos 5.790.421 Patente de Estados Unidos 5.840.833 Patente de Estados Unidos 5.859.184

45 Patente de Estados Unidos 5.889.155 Patente de Estados Unidos 5.929.237 Patente de Estados Unidos 6.093.573 Patente de Estados Unidos 6.261.569 Solicitud de patente de Estados Unidos 2005/0015232 Abe y Kufe, Cancer Res., 49(11):2834-2839, 1989. Ahmad y col., Nat. Cell Biol., 9:1419-1427, 2007. Baldus y col., Clin. Cancer Res., 10(8): 2790-2796, 2004. Bodanszky y col., J. Antibiot., 29(5):549-53, 1976. Cohen y col., J. Med. Chem., 33:883-894, 1990.

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55 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> DONALD, KUFE W. KHARBANDA, SURENDER

<120> PÉPTIDOS DEL DOMINIO CITOPLASMÁTICO DE MUC-1 COMO INHIBIDORES DEL CÁNCER

<130> GENU:022WO

<140> DESCONOCIDO 65 <141>

<150> 61/177.109

<151>

<150> 61/106.380

<151> 5

<160> 62

<170> PatentIn versión 3.5 10 <210> 1

<211> 72

<212> PRT

<213> Artificial 15 <220>

<223> Péptido sintético

<400> 1

<210> 2

<211> 159

<212> PRT 25 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

30 <400> 2

<210> 3

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético 10

<400> 3

15 <210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

20 <220>

<223> Péptido sintético

<400> 4

5 <210> 5

<211> 34

<212> PRT

<213> Artificial

10 <220>

<223> Péptido sintético

<400> 5

<210> 6

<211> 16

<212> PRT 20 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

25 <400> 6

30

<210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial

35

<220> <223> Péptido sintético

<400> 7

40 45

<210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Péptido sintético

50

<400> 8

<210> 9

<211> 18 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético 10

<400> 9

15 <210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

20 <220>

<223> Péptido sintético

<400> 10

<210> 11

<211> 9

<212> PRT 30 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

35 <400> 11

<210> 12 40 <211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 45 <223> Péptido sintético

<400> 12

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 13

<210> 14

<211> 8 10 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético 15

<400> 14

20 <210> 15

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial

25 <220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> misc_feature 30 <222> (25)..(25)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 15

<210> 16

<211> 18

<212> PRT 40 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

45 <400> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 17

<210> 18

<211> 11 10 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético 15

<400> 18

20 <210> 19

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

25 <220>

<223> Péptido sintético

<400> 19

<210> 20

<211> 13

<212> PRT 35 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

40 <400> 20

<210> 21 45 <211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 50 <223> Péptido sintético

<400> 21

<210> 22

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 22

10

<210> 23

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

15

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 23

20

<210> 24

<211> 27 25 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético 30

<400> 24

35 <210> 25

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

40 <220>

<223> Péptido sintético

<400> 25

<210> 26

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 26

<210> 27

<211> 23

<212> PRT 15 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

20 <400> 27

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 30 <223> Péptido sintético

<400> 28

35

<210> 29

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

40

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 29

45

<210> 30

<211> 24 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético 10

<400> 30

15 <210> 31

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial

20 <220>

<223> Péptido sintético

<220>

<221> misc_feature 25 <222> (24)..(24)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 31

<210> 32

<211> 14

<212> PRT 35 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

40 <400> 32

<210> 33 45 <211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 33

<210> 34

<211> 10 10 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético 15

<400> 34

20 <210> 35

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

25 <220>

<223> Péptido sintético

<400> 35

<210> 36

<211> 21

<212> PRT 35 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

40 <400> 36

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 37

<210> 38

<211> 37 10 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético 15

<400> 38

20 <210> 39

<211> 28

<212> PRT

<213> Artificial

25 <220>

<223> Péptido sintético

<400> 39

<210> 40

<211> 26

<212> PRT 35 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

40 <400> 40

<210> 41

<211> 14 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético 10

<400> 41

15 <210> 42

<211> 33

<212> PRT

<213> Artificial

20 <220>

<223> Péptido sintético

<400> 42

<210> 43

<211> 15

<212> PRT 30 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

35 <400> 43

<210> 44 40 <211> 27

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 45 <223> Péptido sintético

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(23)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural

<400> 44

<210> 45

<211> 41 10 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético 15

<400> 45

20 <210> 46

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

25 <220>

<223> Péptido sintético

<400> 46

<210> 47

<211> 18

<212> PRT 35 <213> Artificial

<220>

<223> Péptido sintético

40 <400> 47

<210> 48

<211> 18 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223>

Péptido sintético 10

<400> 48

<210> 56

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>

Péptido sintético 55

15

<210> 49 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial

20

<220> <223> Péptido sintético

<400> 49

25

30

<210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Péptido sintético

35

<400> 50

40

<210> 51 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial

45

<220> <223> Péptido sintético

<400> 51

50

<210> 52

<211> 7 <212> PRT <213> Secuencia artificial

5

<220> <223> Péptido sintético

<400> 52

10

15

<210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia artificial

<220> <223> Péptido sintético

20

<400> 53

25

<210> 54 <211> 4 <212> PRT <213> Secuencia artificial

30

<220> <223> Péptido sintético

<400> 54

35 40

<210> 55 <211> 19 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Péptido sintético

45

<400> 55

<211>

17 50 <212> PRT

<400> 56

<210> 57

<211> 15 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético 10

<400> 57

15 <210> 58

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Péptido sintético

<400> 58

<210> 59

<211> 7

<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

35 <400> 59

<210> 60 40 <211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 45 <223> Péptido sintético

<400> 60

<210> 61

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

<400> 61

<210> 62

<211> 69

10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Péptido sintético

15

<400> 62

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composición farmacéutica que comprende (a) un péptido MUC1 de al menos 6 restos consecutivos de MUC1 y no más de 20 restos consecutivos de MUC1 y que comprende la secuencia CQCRRK, en el que la cisteína amino

   5 terminal de CQCRRK está cubierta en su extremo NH2 por al menos un resto de aminoácido que no tiene que corresponder con la secuencia transmembrana nativa de MUC1, y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable, tampón o diluyente.

2. 2.

   La composición de la reivindicación 1, en la que dicho péptido es de al menos 7 residuos consecutivos de MUC1.

3. 3.

   La composición de la reivindicación 1, en la que dicho péptido comprende no más de 10 restos consecutivos, 11 restos consecutivos, 12 restos consecutivos, 13 restos consecutivos, 14 restos consecutivos, 15 restos consecutivos, 16 restos consecutivos, 17 restos consecutivos, 18 restos consecutivos o 19 restos consecutivos de MUC1.

4. 4.

   La composición de cualquier reivindicación anterior, en la que dicho péptido está fusionado a un dominio de liberación celular.

5. 5.

   La composición de la reivindicación 4, en la que dicho dominio de liberación celular es poli-D-R, poli-D-P o poli-D-

   K.
6. 6. Un péptido MUC1 definido por cualquier reivindicación anterior.
7. 7. Un péptido MUC1 definido por cualquier reivindicación anterior, o composición farmacéutica de acuerdo con 25 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en medicina.

8. 8.

   Un péptido MUC1 definido por cualquier reivindicación anterior, o composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en la inhibición de una célula tumoral MUC1-positiva en un sujeto.

9. 9.

   Uso de un péptido MUC1 definido por cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la fabricación de un medicamento para inhibir una célula tumoral MUC1-positiva en un sujeto.

   35 10 El péptido MUC1 o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, o el uso de la reivindicación 9, en el que la administración al sujeto comprende administración intravenosa, intra-arterial, intratumoral, subcutánea, tópica, intraperitoneal, local, regional, sistémica o continua.

10. 11.

    El péptido MUC1 o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, o el uso de la reivindicación 9, en el que la inhibición comprende inducir detención del crecimiento de dicha célula tumoral, apoptosis de dicha célula tumoral y/o necrosis de un tejido tumoral que comprende dicha célula tumoral.

11. 12.

    El péptido MUC1 o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, o el uso de la reivindicación 9, en el que el sujeto es el destinatario de una segunda terapia anti-neoplásica, tal como cirugía,

    45 quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, terapia con toxinas, inmunoterapia y crioterapia y, por ejemplo, el sujeto recibe la segunda terapia anti-neoplásica antes de, después de, o al mismo tiempo que, la administración del péptido MUC1 o composición farmacéutica.
12. 13. El péptido MUC1 o composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el péptido MUC1 o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con 7 u 8, o el uso de la reivindicación 9, en el que el péptido MUC1 se presenta en una formulación farmacológica que incluye tanto el péptido MUC1 como un agente quimioterapéutico, agente radioterapéutico, agente inmunoterapéutico, agente para terapia hormonal o agente para terapia con toxinas.

    55 14. El péptido MUC1 o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, o el uso de la reivindicación 9, en el que dicho péptido se administra a 0,1-500 mg/kg/día, preferentemente a 10-100 mg/kg/día.

13. 15.

    El péptido MUC1 o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, o el uso de la reivindicación 9, en el que dicho péptido se administra diariamente, preferentemente diariamente durante 7 días, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, un mes, 6 semanas, 8 semanas, dos meses, 12 semanas o 3 meses.

14. 16.

    El péptido MUC1 o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, o el uso de la reivindicación 9, en el que dicho péptido se administra semanalmente, preferentemente semanalmente durante 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas o 12 semanas.

15. 17.

    El péptido MUC1 o composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, el péptido MUC1 o

    composición farmacéutica para su uso de acuerdo con 7 u 8, o el uso de la reivindicación 9, en el que dicho péptido comprende todos los L aminoácidos, todos los D aminoácidos o una mezcla de L y D aminoácidos.

16. 18.

    El péptido MUC1 o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, o el uso de la

    5 reivindicación 9, en el que la expresión de MUC1 en una célula tumoral de dicho sujeto se ha evaluado antes de administrar dicho péptido o composición farmacéutica y opcionalmente dicho sujeto se ha identificado como que tiene un cáncer que expresa o sobre-expresa MUC1.
17. 19. El péptido MUC1 o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, o el uso de la

    10 reivindicación 9, en el que se evalúa el efecto de dicho péptido sobre la expresión de MUC1 en una célula tumoral de dicho sujeto.
18. 20. Un procedimiento in vitro para inhibir la oligomerización y el transporte nuclear de MUC1 en una célula que

    comprende poner en contacto una célula que expresa MUC1 con un péptido MUC1 definido por cualquiera de las 15 reivindicaciones 1 a 6.
19. 21. El procedimiento in vitro de la reivindicación 20, en el que la célula que expresa MUC1 es una célula tumoral MUC1-positiva.

    20 22. El péptido MUC1 o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8 o cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19 dependientes de la reivindicación 8, o el uso de la reivindicación 9 o cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19 dependientes de la reivindicación 9, en el que dicho sujeto es un ser humano.
20. 23. El péptido MUC1 o composición farmacéutica de la reivindicación 8 o cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19

    25 o 22 dependientes de la reivindicación 8, el uso de la reivindicación 9 o cualquiera de las reivindicaciones 10-19 o 22 dependientes de la reivindicación 9, o el procedimiento de la reivindicación 21, en el que la célula tumoral MUC1positiva es una célula de carcinoma, una célula de leucemia o una célula de mieloma, por ejemplo una célula de carcinoma de próstata o mama.

    30 24. Un péptido MUC1 de al menos 6 restos consecutivos de MUC1 y no más de 20 restos consecutivos de MUC1 y que comprende la secuencia CQCRRK o KRRCQC, en el que todos los restos de aminoácido de dicho péptido son D-aminoácidos.
21. 25. El péptido de la reivindicación 24, que comprende la secuencia de KRRCQC. 35