KR20110093801A - 암의 저해제로서 ｍｕｃ-1 세포질 도메인 펩티드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 MUC1 세포질 도메인으로부터 펩티드 및 그를 위한 사용 방법을 제공한다. 이들 펩티드는 MUC1 올리고머화를 저해하여, 종양 세포 성장을 방지하고, 종양 세포 아포토시스 및 인 비보 종양 조직의 괴사를 유발한다.

Description

암의 저해제로서 ＭＵＣ-1 세포질 도메인 펩티드{MUC-1 cytoplasmic domain peptides as inhibitors of cancer}

발명의 배경

본 출원은 2008년 10월 17일 출원된 미국 가출원번호 제61/106,380호, 및 2009년 5월 11일 출원된 미국 가출원번호 제61/177,109호의 이익을 주장하며, 이들 두 출원의 전체 내용은 원용에 의하여 본 명세서에 포함된다.

1.발명의 분야

본 발명은 세포 성장(cell growth)의 조절, 더 구체적으로는 암 세포 성장의 조절에 관한 것이다. 특히, MUC1 세포질 도메인의 특정 영역으로부터 유래된 MUC1 펩티드는 MUC1 올리고머화 및 핵 이송을 저해하여, MUC1-발현 종양 세포의 저해 및 심지어 사멸을 야기하는 것으로 밝혀졌다.

2. 관련분야

뮤신(mucins)은 상피세포(epithelial cell)에서 주로 발현되는 광범위하게 O-글리코실화된 단백질이다. 상기 분비되고 막-결합된 뮤신은 독소, 미생물 및 외부 환경과 계면(interface)에서 일어나는 다른 형태의 스트레스에 의하여 유발된 손상으로부터 상피세포의 정단 경계(apical border)를 보호하는 물리적 장벽을 형성한다. 막통과 뮤신 1(transmembrane mucin 1: MUC1)은 그의 세포질 도메인을 통하여 세포의 내부에 신호를 보낼 수 있다. MUC1은 성게 정자 단백질-에테로키나제-아그린(sea urchin sperm protein-enterokinase-agrin: SEA) 도메인의 존재를 제외하고, 다른 막-결합 뮤신과 서열 상동성이 없다 (Duraisamy et al ., 2006). 이런 점에서, MUC1은 단일 폴리펩티드로서 번역된 후, 상기 SEA 도메인에서 자가절단이 일어난다 (Macao, 2006).

MUC1 N-말단 서브유니트(MUC1 N-terminal subunit: MUC1-N)는 O-글리코실화에 의하여 변형된 높은 비율의 세린 및 트레오닌을 가진 다양한 수의 직렬반복단위(tandem repeats)를 포함한다 (Siddiqui, 1988). MUC1-N은 세포의 당질피질(glycocalyx)을 넘어 연장하고 막통과 MUC1 C-말단 서브유니트 (transmembrane MUC1 C-terminal subunit: MUC1-C)와의 비공유 결합을 통하여 세포 표면에 고정되어 있다 (Merlo, 1989). MUC1-C은 58-아미노산 세포외 도메인, 28-아미노산 막통과 도메인 및 다양한 신호절단 분자와 상호작용하는 72-아미노산 세포질 도메인으로 구성된다 (Kufe, 2008). MUC1-N의 상기 보호적 물리적 장벽으로의 흘림(shedding)은 성장 및 생존을 부여하는 세포내 신호를 전달하는 잠재적 수용체 (putative receptor)로서 MUC1-C를 세포 표면에 남겨 두게 한다 (Ramasamy et al ., 2007; Ahmad et al ., 2007).

이용가능한 증거는 인간 암종이 종양생성능 (tumorigencity)을 촉진하는데 있어서 MUC1 기능을 이용한다는 것을 나타낸다. 이런 맥락에서, 형질전환 및 극성(polarity)의 손실과 함께, MUC1은 유방 및 다른 상피의 암종의 전체 세포 표면에 높은 수준으로 발현된다 (Kufe, 1984). 다른 연구는 MUC1의 과발현이 적어도 부분적으로 β-카테닌의 안정화를 통하여 (Huang et al ., 2005), 부착-비의존성 성장(anchorage-independent growth) 및 종양생성능 (Li et al ., 2003a; Raina et al ., 2004; Ren et al ., 2004; Wei et al ., 2005)을 부여한다는 것을 밝혔다. 더욱이, 정상 상피 세포에 대한 생존 기능 (survival function)과 일관되게, MUC1의 과발현이 암종 세포의 스트레스-유발된 아포토시스에 대한 저항성을 부여한다 (Ren et al ., 2004; Yin 및 Kufe, 2003; Yin et al ., 2004; Yin et al ., 2007).

정단 막(apical membrane)에의 제한의 상실은 상피성장인자수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR)와의 복합체의 형성 및 EGFR-매개된 신호전달의 공동활성화를 가능하게 한다 (Li et al ., 2001; Ramasamy et al ., 2007). 암종 세포에 의한 MUC1의 과발현은 또한 세포질 중 MUC1-C의 축적 및 이 서브유니트의 핵 (Li et al ., 2003b; Li et al ., 2003c) 및 미토콘드리아로의 타켓팅과 연관된다 (Ren et al ., 2004; Ren et al ., 2006). 중요하게도, MUC1-C의 올리고머화는 그의 핵 타켓팅 및 다양한 효과기(effector)와의 상호작용에 필수적이다 (Leng et al ., 2007). 예를 들면, 상기 MUC1-C 세포질 도메인 (MUC1-CD)은 c-Src (Li et al ., 2001), c-Abl (Raina et al ., 2006), 단백질 키나제 Cδ (Ren et al ., 2002) 및 글리코겐 신타제 키나제 3β (Li et al ., 1998)를 위한 기질로서 기능하고 Wnt 경로 효과기, β-카테닌 (Yamamoto et al ., 1997; Huang et al ., 2005), 및 p53 종양 억제자와 직접적으로 상호작용한다 (Wei et al ., 2005). 따라서, 올리고머화가 중요한 것처럼 보이지만, MUC1 올리고머 형성의 간섭이 종양 세포에 이로운 영향을 미칠 것이라는 직접적 증거는 없으며, 이것이 어떻게 이루어지는 지에 대하여는 더더욱 직접적 증거는 없다.

발명의 요약

따라서, 본 발명에 따르면, 4 연속 MUC1 잔기 이상 및 20 연속 MUC1 잔기 이하이고 서열 CQC (서열번호 4)를 포함하는 MUC1 펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 중의 MUC1-양성 종양 세포를 저해하는 방법으로서, CQC의 아미노-말단 시스테인은 천연 MUC-1 막통과 서열에 대응할 필요가 없는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의하여 그 NH₂-말단 상에서 덮혀진 것인 방법이 제공된다. 상기 펩티드는 5 연속 MUC1 잔기 이상, 6 연속 MUC1 잔기 이상, 7 연속 MUC1 잔기 이상, 8 연속 MUC1 잔기 이상을 포함할 수 있으며 상기 서열은 더 구체적으로 CQCR (서열번호 54), CQCRR (서열번호 50), CQCRRR (서열번호 51), CQCRRRR (서열번호 52), CQCRRK (서열번호 4), 또는 CQCRRKN (서열번호 53)을 포함할 수 있다. 상기 펩티드는 MUC1의 10 연속 잔기, 11 연속 잔기, 12 연속 잔기, 13 연속 잔기, 14 연속 잔기, 15 연속 잔기, 16 연속 잔기, 17 연속 잔기, 18 연속 잔기 또는 19 연속 잔기 이하를 포함할 수 있다. 상기 펩티드는 폴리-D-R, 폴리-D-P 또는 폴리-D-K와 같은, 세포 전달 도메인에 융합될 수 있다. 상기 펩티드는 모두 L 아미노산, 모두 D 아미노산, 또는 L 및 D 아미노산의 혼합(mix)을 포함할 수 있다.

상기 MUC1-양성 종양 세포는, 전립선 또는 유방 암종 세포와 같은 암종 세포, 백혈병 세포 또는 골수종 세포일 수 있다. 상기 투여하는 단계는 정맥내, 동맥내, 종양내, 피하, 국소(topical) 또는 복막내 투여, 또는 국소(local), 영역(regional), 전신, 또는 연속(continual) 투여를 포함할 수 있다. 상기 저해하는 단계는 상기 종양 세포의 성장 정지(growth arrest), 상기 종양 세포의 아포토시스 및/또는 상기 종양 세포를 포함하는 종양 조직의 괴사를 유발하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 개체는 인간일 수 있다.

상기 방법은 상기 개체에 제2 항암 요법(second anti-cancer therapy)을 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 제2 항암 요법은 수술, 화학요법, 방사성요법, 호르몬 요법, 독소 요법, 면역요법 및 냉동요법일 수 있다. 상기 제2 항암 요법은 상기 펩티드 전, 상기 펩티드 전 또는 상기 펩티드와 동시에 투여될 수 있다. 상기 방법은 상기 펩티드를 투여하기 전에 상기 개체의 종양 세포 중의 MUC1의 발현을 평가하는 단계를 더 포함할 수 있으며 및/또는 상기 방법은 상기 개체의 종양 세포 중의 MUC1의 발현에 대한 상기 펩티드의 영향을 평가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 펩티드는 0.1-500 mg/kg/d, 또는 10-100 mg/kg/d로 투여될 수 있다. 상기 펩티드는 매일, 예를 들면, 7 일, 2 주, 3 주, 4 주, 1 개월, 6 주, 8 주, 2 개월, 12 주, 또는 3 개월 동안 매일 투여될 수 있다. 상기 펩티드는 매주, 예를 들면, 2 주, 3 주, 4 주, 6 주, 8 주, 10 주, 또는 12 주 동안 매주 투여될 수 있다.

다른 구체예에서, (a) 4 연속 MUC1 잔기 이상 및 20 연속 MUC1 잔기 이하이고 서열 CQC를 포함하는 MUC1 펩티드로서, CQC의 아미노-말단 시스테인은 천연 MUC-1 막통과 서열에 대응할 필요가 없는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의하여 그 NH₂-말단 상에서 덮혀진 것인 MUC1 펩티드, 및 (b) 약학적으로 허용가능한 담체, 버퍼 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 상기 펩티드는 5, 6, 7 또는 8 연속 MUC1 잔기 이상인 것일 수 있다. 상기 펩티드는 MUC1의 10 연속 잔기, 11 연속 잔기, 12 연속 잔기, 13 연속 잔기, 14 연속 잔기, 15 연속 잔기, 16 연속 잔기, 17 연속 잔기, 18 연속 잔기 또는 19 연속 잔기 이하인 것일 수 있다. 상기 펩티드는, 폴리-D-R, 폴리-D-P 또는 폴리-D-K와 같은, 세포 전달 도메인 또는 HIV tat 세포 도입 도메인과 같은, 세포 도입 도메인 (cell transduction domain)에 융합될 수 있다. 상기 펩티드는 길이가 8 잔기 이상이고, 그들의 측쇄를 통한 브릿지로부터 2 비이웃 잔기 이상(at least two non-adjacent residues)일 수 있다. 상기 브릿지는 링커, 화학적으로 변형된 측쇄, 또는 탄화수소 스타플링(stapling)을 포함할 수 있다. 상기 링커는 상기 펩티드의 알파-나선 구조를 안정화시키는 변형을 포함할 수 있다. 상기 버퍼는 β-머캅토에탄올, 글루타티온 또는 아스코르브산, 또는 상기 펩티드를 모노머 상태로 유지시키는 다른 환원제를 포함할 수 있다.

또 다른 구체예에서, MUC1-발현 세포를 4 연속 MUC1 잔기 이상 및 20 연속 MUC1 잔기 이하이고 서열 CQC를 포함하는 MUC1 펩티드로서, CQC의 상기 아미노-말단 시스테인은 천연 MUC-1 막통과 서열에 대응할 필요가 없는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의하여 그 NH2-말단 상에서 덮혀진 것인 MUC1 폡티드와 접촉시키는 단계를 포함하고, 세포 중의 MUC1-올리고머화 및 핵 이송(transport)을 저해하는 방법이 제공된다. 상기 펩티드는 MUC1의 5 연속 잔기 이상, 6 연속 잔기 이상, 7 연속 잔기 이상, 8 연속 잔기 이상일 수 있으며, 상기 서열은 더 구체적으로 CQCR, CQCRR, CQCRRR, CQCRRRR, CQCRRK, 또는 CQCRRKN을 포함할 수 있다. 상기 펩티드는 MUC1의 10 연속 잔기, 11 연속 잔기, 12 연속 잔기, 13 연속 잔기, 14 연속 잔기, 15 연속 잔기, 16 연속 잔기, 17 연속 잔기, 18 연속 잔기 또는 19 연속 잔기 이하일 수 있다. 상기 펩티드는 폴리-D-R, 폴리-D-P 또는 폴리-D-K와 같은, 세포 전달 도메인에 융합될 수 있다. 상기 펩티드는 모두 L 아미노산, 모두 D 아미노산, 또는 L 및 D 아미노산의 혼합을 포함할 수 있다.

상기 MUC1-발현 세포는, 전립선 또는 유방 암종 세포와 같은, 암종 세포, 백혈병 세포 또는 골수종 세포와 같은, 종양 세포일 수 있다. 상기 종양 세포는 살아 있는 개체에 위치할 수 있다. 상기 살아 있는 개체는 인간 개체일 수 있다.

또 다른 구체예에서, 4 연속 MUC1 잔기 이상 및 20 연속 MUC1 잔기 이하이고 서열 CQC를 포함하는 MUC1 펩티드의 구조 및 MUC-1 결합 능력을 모사하는 펩티드 모사체(peptide mimetic)로서, CQC의 상기 아미노-말단 시스테인은 천연 MUC-1 막통과 서열에 대응할 필요가 없는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의하여 그 NH₂-말단 상에서 덮혀진 것인 펩티드 모사체가 제공된다. 다른 구체예는 3 연속 MUC1 잔기 이상 및 20 연속 MUC1 잔기 이하이고 서열 CQC를 포함하는 MUC1 펩티드로서, 상기 펩티드의 모든 아미노산 잔기는 D-아미노산인 MUC1 펩티드를 제공한다. 상기 펩티드는 서열 KRRCQC (서열번호 49)를 더 포함할 수 있다.

상기 암 세포는 예를 들면, 유방 암, 폐암, 결장암(colon cancer), 췌장암, 신장암(renal cancer), 위암, 간암, 골암(bone cancer), 혈액암(hematological cancer), 신경조직암, 흑색종(melanoma), 난소암, 고환암(testicular cancer), 전립선암, 자궁경부암(cervical cancer), 질암(vaginal cancer), 또는 방광 암 세포일 수 있다.

암 세포를 제거하는(killing) 방법이 또한 본 발명에 포함된다. 상기 방법은상기 기술된 방법을 수행하기 전, 후 또는 동시에, 상기 개체를 하나 이상의 추가적 요법(therapies)에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 요법은 예를 들면, 하나 이상의 형태의 이온화 조사(ionizing radiation) 및/또는 하나 이상의 화학요법제일 수 있다. 상기 하나 이상의 화학요법제는, 예를 들면, 시스플라틴, 카르보플라틴, 프로카르바진, 메클로에타민, 시클로포스파미드, 캄토테신, 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 비술판, 니트로스우레아(nitrosurea), 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 플리코마이신, 미토마이신, 에토포시드, 베람필(verampil), 포도필로톡신, 타목시펜, 탁솔, 트란스플라티눔, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 메토트렉세이트, 또는 상기한 것들 중 임의의 유사체 (analog)일 수 있다. 호르몬 요법, 면역요법, 독소 요법, 냉동요법(cryotherapy) 및 수술(surgery)이 또한 조합 요법으로서 고려된다.

본 명세서에 기술된 임의의 방법 또는 조성물은 본 명세서에 기술된 임의의 다른 방법 또는 조성물에 관하여 이행될 (implemented) 수 있는 것으로 고려된다.

청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는(comprising)"과 연관되어 사용되는 경우 단어 "a" 또는 "an"의 사용은 "하나(one)"를 의미할 수 있으나, 또한 "하나 이상(one or more)", "적어도 하나 (at least one)", 및 "하나 이상 (one or more than one)"의 의미와 일관된다. 단어 "약(about)"은 언급된 숫자의 플러스 또는 마이너스 5%를 의미한다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 잇점은 하기 상세한 설명으로부터 명백하게 될 것이다. 그러나, 본 발명의 정신 및 범위 내에서 다양한 변화(change) 및 변형(modification)이 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백하게 될 것이기 때문에, 상기 상세한 설명 및 특정한 실시예는 본 발명의 구체적 구체예를 나타내지만, 단지 예시적으로만 제공된다는 것이 이해되어야 한다.

예시적 구체예의 설명

I.본 발명

MUC1는 그의 암에서의 역할에 대하여 본 발명자들 및 다른 연구자들에 의하여 광범위하게 연구되어 왔다. 상기한 바와 같이, 인간 MUC1은 헤테로다이머성 당단백질이며, 단일 폴리펩티드로 번역되어 소포체에서 N- 및 C-말단 서브유니트로 절단된다 (Ligtenberg et al ., 1992; Macao et al ., 2006; Levitin et al ., 2005). 대부분의 인간 암종에서 발견된 바와 같은 (Kufe et al ., 1984), 비정상적 MUC1의 과발현은 부착-비의존성 성장 및 종양생성능을 부여한다 (Li et al ., 2003a; Huang et al ., 2003; Schroeder et al ., 2004; Huang et al ., 2005). 다른 연구들은 MUC1의 과발현이 산화적 스트레스 및 유전독성 (genotoxic) 항암제에 의하여 유발된 아포토시스에 대한 저항성을 부여한다는 것을 입증하였다 (Yin 및 Kufe, 2003; Ren et al ., 2004; Raina et al ., 2004; Yin et al ., 2004; Raina et al ., 2006; Yin et al ., 2007).

고정되고 분비된 뮤신 (tethered and secreted mucins) 패밀리는 상피 세포 표면의 보호 장벽(protective barrier)을 제공하는데 기능을 한다. 상피층의 손상과 함께, 이웃하는 세포 사이의 밀착결합(tight junctions)은 파괴되고, 극성(polarity)은 세포가 헤레귤린-유발된 수복 프로그램을 개시함에 따라 상실된다 (Vermeer et al ., 2003). MUC1-N은 상기 세포 표면으로부터 흘려지고(shed) (Abe 및 Kufe, 1989), MUC1-C은 남겨져 세포의 내부에 환경적 스트레스 신호의 트란스듀서로서 기능을 한다. 이런 점에서, MUC1-C는 ErbB 수용체 패밀리의 구성원과 세포 표면 복합체를 형성하며, MUC1-C는 헤레귤린 자극에 반응하여 핵으로 타켓팅된다 (Li et al ., 2001; Li et al ., 2003c). MUC1-C은 또한 MUC1 세포질 도메인 (CD) 및 카테닌 패밀리의 구성원 사이의 직접적 상호작용을 통하여 ErbB 수용체 및 Wnt 신호전달 경로를 통합하는데 기능을 한다 (Huang et al ., 2005; Li et al ., 2003c; Yamamoto et al ., 1997; Li et al ., 1998; Li et al ., 2001; Li 및 Kufe, 2001). 다른 연구들은 MUC1-CD가 글리코겐 신타제 키나제 3β, c-Src, 단백질 키나제 Cδ 및 c-Abl에 의하여 인산화된다는 것을 입증하였다 (Raina et al ., 2006; Li et al ., 1998; Li et al ., 2001; Ren et al., 2002).

MUC1-C의 핵 타켓팅에 대한 기작은 명확하지 않다. 통상적 핵 국재화 신호 (classical nuclear localization signal: NLS)를 포함한 단백질들은 먼저 임포르틴(importin) α에 결합하고, 다음으로, 차례로 임포르틴 β에 결합함으로써 핵으로 유입된다 (Weis, 2003). 상기 카고(cargo)-임포르틴 α/β 복합체는 뉴클레오포린(nucleoporins)에 결합함으로써 핵공(nuclear pore)에 도킹하고 Ran GTPase에 의존적인 기작에 의하여 핵공을 통하여 이송된다. 통상적 NLS (classical NLSs)는 4-5 염기성 아미노산의 단일 클러스터를 갖는 일부분(monopartite) 또는 10-12 아미노산의 링커에 의하여 분리된 염기성 아미노산의 2개 클러스터를 갖는 이부분(bipartite)이다. MUC1-CD는 전형적 일부분 NLS에 일치하지 않는 RRK 모티프를 포함한다 (Hodel et al ., 2002). 그러나, 비통상적 NLS를 포함한 특정 단백질들은 임포르틴 β에 직접적으로 결합함으로써 핵공을 통하여 이송된다 (Kau et al ., 2004). 임포르틴 β는 핵공 복합체의 세포질면 및 핵질(nucleoplasmic)면 모두 상에 위치하는 (Percipalle et al ., 1997), Nup62를 포함한, 여러 뉴클레오포린에 결합한다 (Ryan 및 Wente, 2000). 다른 연구들은 β-카테닌이 임포르틴- 및 뉴클레오포린-비의존적 기작에 의하여 핵으로 유입된다는 것을 나타내었다.(Suh 및 Gumbiner, 2003).

2006년에, 발명자들은 MUC1이 Nup62에 결합하는 것에 관련된 기작에 의하여 핵으로 유입된다는 것을 보고하였다. 그들은 또한 MUC1이 MUC1 세포질 도메인 중의 CQC 모티프를 통하여 올리고머를 형성하고, MUC1 올리고머화가 핵 유입에 필수적이라는 것을 입증하였다. 여기서, 그들은 이 연구를 확장하여 상기 CQC 모티프가 올리고머 형성에 관여한다는 역할의 추가적 이해를 포함시켰다. 그들은 또한 이 영역에 해당하는 짧은 펩티드가 MUC1 올리고머 형성을 파괴할 수 있고, 종양 세포의 핵 내로의 이송을 방지한다는 것을 입증하였다. 이들 펩티드는 종양 세포 성장을 저해할 수 있을 뿐만 아니라 그러한 세포 중의 아포토시스를 유발하고 심지어는 종양 조직의 괴사를 유발할 수 있다. 본 발명의 이들 및 다른 양상은 이하 보다 상세하게 설명된다.

II . MUC1

A.구조

MUC1은 정상 분비성 상피 세포의 정단 경계 상에 발현되는 뮤신-타입 당단백질이다 (Kufe et al ., 1984). MUC1은 단일 폴리펩티드로 합성되고 이 전구체가 소포체에서 2개의 서브유니트로 절단된 후 헤테로다이머를 형성한다 (Ligtenberg et al., 1992). 상기 절단은 자가촉매적 과정에 의하여 매개될 수 있다 (Levitan et al., 2005). 상기 >250 kDa MUC1 N-말단 (MUC1 N-ter, MUC1-N) 서브유니트는 고도로 보존된 변이(highly conserved variations)에 의하여 불완전하고 O-연결된 글리칸에 의하여 변형된 변하는 수의 20-아미노산 직렬적 반복단위(tandem repeats)를 포함한다 (Gendler et al ., 1988; Siddiqui et al ., 1988). MUC1-N은 58-아미노산 세포외 영역, 28-아미노산 막통과 도메인 및 72-아미노산 세포질 도메인 (CD; 서열번호 1)을 포함하는, ~23 kDa C-말단 서브유니트 (MUC1 C-ter, MUC1-C)에 의한 다이머화에 의하여 세포 표면에 고정된다 (tethered) (Merlo et al ., 1989). 인간 MUC1 서열은 아래에 나타내었다:

상기 볼드 서열은 CD를 나타내고, 밑줄친 부분은 실시예에 기재된 올리고머-저해 펩티드 (서열번호 3)이다.

정상 상피의 암종으로의 형질전환과 함께, MUC1은 세포질 내 및 전체 세포막에 걸쳐서 비정상적으로 과발현된다 (Kufe et al ., 1984; Perey et al ., 1992). 세포막-결합된 MUC1은 클라트린-매개된 세포내이입 (clathrin-mediated endocytosis)에 의하여 엔도좀에 타켓팅된다 (Kinlough et al ., 2004). 또한, MUC1-C은 핵 (Baldus et al ., 2004; Huang et al ., 2003; Li et al ., 2003a; Li et al ., 2003b; Li et al ., 2003c; Wei et al ., 2005; Wen et al., 2003) 및 미토콘드리아 (Ren et al ., 2004)로 타켓팅되지만, MUC1-N은 그렇지 않다.

B. 기능

MUC1은 ErbB 수용체 패밀리의 구성원 (Li et al ., 2001b; Li et al ., 2003c; Schroeder et al ., 2001) 및 Wnt 효과기, β-카테닌 (Yamamoto et al ., 1997)과 상호작용한다. 상피성장인자수용체(epidermal growth factor receptor) 및 c-Src는 Y-46에서 MUC1 세포질 도메인 (MUC1-CD)을 인산화하여 MUC1 및 β-카테닌의 결합을 증가시킨다 (Li et al ., 2001a; Li et al ., 2001b). MUC1 및 β-카테닌의 결합은 또한 글리코겐 신타제 키나제 3β 및 단백질 키나제 Cδ에 의하여 조절된다 (Li et al ., 1998; Ren et al ., 2002). MUC1는 β-카테닌과 함께 핵에 공동국재화되고 (Baldus et al ., 2004; Li et al ., 2003a; Li et al ., 2003c; Wen et al., 2003), Wnt 표적 유전자의 전사를 공동활성화시킨다 (Huang et al ., 2003). 다른 연구들은 MUC1이 또한 p53에 직접 결합하고, p53 표적 유전자의 전사를 조절한다는 것을 밝혔다 (Wei et al ., 2005). 뚜렷하게도, MUC1의 과발현은 부착-비의존성 성장 및 종양생성능을 유도하기에 충분하다 (Huang et al ., 2003; Li et al ., 2003b; Ren et al ., 2002; Schroeder et al ., 2004).

대부분의 미토콘드리아 단백질은 핵에서 코딩되고, 외부 및 내부 미토콘드리아 막의 전치 복합체 (translocation complexes)에 의하여 미토콘드리아로 유입된다. 특정 미토콘드리아 단백질은 N-말단 미토콘드리아 타켓팅 서열을 포함하고, 외부 미토콘드리아 막의 Tom20과 상호작용한다 (Truscott et al ., 2003). 다른 미토콘드리아 단백질은 내부 타켓팅 서열을 포함하고, Tom70 수용체와 상호작용한다 (Truscott et al ., 2003). 최근 연구는 내부 타켓팅 서열이 없는 미토콘드리아 단백질은 HSP70 및 HSP90의 복합체에 의하여 Tom70으로 전달된다는 것을 밝혔다 (Young et al ., 2003).

III . MUC1 펩티드

A. 구조

본 발명은 다양한 MUC1 펩티드의 설계, 생산 및 용도를 고려한다. 이들 펩티드의 구조적 특징은 다음과 같다. 첫째, 상기 펩티드는 MUC1의 20 연속 잔기 이하를 갖는다. 따라서, 용어 "20 연속 잔기 이하를 갖는 펩티드 (a peptide having no more than 20 consecutive residues)"는, 심지어 용어 "포함하는 (comprising)"을 포함하는 경우라도, 더 많은 수의 연속 MUC1 잔기를 포함하는 것으로 이해될 수 없다. 둘때, 상기 펩티드는 CQC 모티프를 포함할 것이며, 또한 CQCR 모티프, CQCRR 모티프 및 CQCRRK 모티프를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 펩티드는 최소한, MUC1-C 도메인의 이들 세 연속 잔기를 가질 것이다. 셋째, 상기 펩티드는 상기 CQC 모티프의 첫번째 C 잔기의 NH₂-말단 측에 부착된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가지고 있어, 상기 첫번째 C 잔기는 거기에 부착된 상기 하나 이상의 아미노산에 의하여 "덮혀져 (covered)" 있게 될 것이다. 이 잔기는 MUC1에 천연적일 수 있고 (즉, 막통과 도메인으로부터 유래된), 무작위적으로 선택될 수 있으며 (20 천연-존재의 아미노산 또는 그의 유사체 중 임의의 것), 또는 다른 펩티드 서열의 부분일 수 있다 (예를 들면, 정제를 위한 tag 서열, 안정화 서열, 또는 세포 전달 도메인).

일반적으로, 상기 펩티드는 50 잔기 이하일 것이고, 다시 MUC1의 20 연속 잔기 이하를 포함할 것이다. 상기 전체 길이는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 잔기일 수 있다. 4-50 잔기, 5-50 잔기, 6-50 잔기, 7-50 잔기, 7-25, 잔기, 4-20 잔기, 5-20 잔기, 6-20 잔기, 7-20 잔기, 및 7-15 잔기의 펩티드 길의 범위가 고려된다. 연속 MUC1 잔기의 수는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20일 수 있다. 4-20 잔기, 5-20 잔기, 6-20 잔기, 7-20 잔기 및 4-15 잔기, 5-15 잔기, 6-15 잔기 또는 7-15 잔기의 연속 잔기의 범위가 고려된다.

본 발명은 L-배향 (configuration) 아미노산, D-배향 아미노산, 또는 그들의 혼합물을 이용할 수 있다. L-아미노산이 단백질에서 발견된 대부분의 아미노산을 나타내지만, D-아미노산은 원뿔 달팽이 (cone snails)와 같은 별난 바다에 사는 개체(exotic sea-dwelling organisms)에 의하여 생산된 일부 단백질에서 발견된다. 그들은 또한 박테리아의 펩티도글리칸 세포벽의 풍부한 성분이다. D-세린은 뇌에서 신경전달물질로서 작용할 수 있다. 아미노산 배치에 대한 L 및 D 약속 (convention)은 상기 아미노산의 광학 활성을 나타내는 것이 아니라, 아미노산이 그로부터 이론적으로 합성되어질 수 있는 글리세르알데히드의 이소머의 광학 활성을 나타낸다 (D-글리세르알데히드는 우선성(dextrorotary)이며; L-글리세르알데히드는 좌선성(levorotary)이다).

"모두-D (all-D)" 펩티드의 한 형태는 레트로-인베르소 (retro-inverso) 펩티드이다. 천연-존재 폴리펩티드의 레트로-인베르소 변형은 대응되는 L-아미노산의 α-탄소 입체화학에 반대되는 α-탄소 입체화학을 가진 아미노산, 즉 D-아미노산을 천연 펩티드 서열에 대하여 역순으로 합성 조립 (synthetic assemblage)하는 것과 관련된다. 따라서, 레트로-인베르소 유사체는 펩티드 결합의 역 말단(reversed termini) 및 역 방향 (reversed direction) (CO-NH가 아닌 NH-CO)을 갖지만 천연 펩티드 서열에서와 같이 측쇄의 토폴로지는 대략적으로 유지하고 있다. 원용에 의하여 본 명세서에 포함되어진, 미국특허 제6,261,569호 참조.

상기한 바와 같이 본 발명은 세포 전달 도메인 (또한 세포 전달 벡터 (cell delivery vector), 또는 세포 도입 도메인 (cell transduction domain)이라고도 함)을 융합 또는 접합하는 것을 고려한다. 그러한 도메인은 당업계에 잘 알려져 있으며, 일반적으로 짧은 양쪽성 또는 양이온성 펩티드 및 펩티드 유도체, 종종 복수의 라이신 및 아르기닌 잔기를 포함하는 것으로서 특징지워진다 (Fischer, 2007). 특히 관심을 끄는 것은 폴리-D-Arg 및 폴리-D-Lys 서열 (예, 길이가 8 잔기인, 우선성 잔기들)이며, 다른 것들은 아래 표 1에 나타내었다.

또한 상기한 바와 같이, 아미노- 및/또는 카르복실-말단 (terminal end)에 상기 펩티드의 인 비보 생존을 촉진하기 위한 차단제의 첨가에 의하여 인 비보 사용을 위하여 변형된 펩티드가 고려된다. 이는 세포 섭취 전에 프로테아제에 의하여 상기 펩티드 말단이 분해되는 경향이 있는 상황들에서 유용할 수 있다. 그러한 차단제는 투여되어질 상기 펩티드의 아미노 및/또는 카르복실 말단 잔기에 부착될 수 있는 추가적 관련된 또는 관련되지 않은 펩티드 서열일 수 있으며, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이들 차단제는 상기 펩티드의 합성 중에 화학적으로, 또는 당업계에 익숙한 방법에 의한 재조합 DNA 기술에 의하여 부가될 수 있다. 대안적으로, 폴리글루탐산 또는 당업계에 알려진 다른 분자들과 같은 차단제가 상기 아미노 및/또는 카르복실 말단 잔기에 부착될 수 있다.

B. 합성

고상 합성 기법을 이용하여 펩티드를 생산하는 것이 이로울 것이다 (Merrifield, 1963). 다른 펩티드 합성 기법은 당업자에게 잘 알려져 있다 (Bodanszky et al ., 1976; Peptide Synthesis, 1985; Solid Phase Peptide Synthelia, 1984). 그러한 합성에 사용하기 위한 적절한 보호기는 상기한 문서들 (texts) 및 Protective Groups in Organic Chemistry, 1973에서 찾을 수 있을 것이다. 이들 합성 방법은 성장하는 펩티드 사슬에 하나 이상의 아미노산 잔기 또는 적당한 보호된 아미노산 잔기의 순차적으로 첨가하는 것과 관련된다. 통상적으로, 첫번째 아미노산 잔기의 아미노 또는 카르복실기는 적절한, 선택적으로 제거가능한 보호기에 의하여 보호된다. 상이한, 선택적으로 제거가능한 보호기가 라이신과 같은, 반응성 측쇄기를 포함한 아미노산을 위하여 사용된다.

예로서 고상 합성을 사용하여, 상기 보호된 또는 유도체화된 아미노산은 그의 보호되지 않은 카르복실 또는 아미노기를 통하여 불활성 고체 지지체에 부착된다. 다음으로, 상기 아미노 또는 카르복실기의 보호기는 선택적으로 제거되고 적당하게 보호된 보충적 (아미노 또는 카르복실) 기를 가진 상기 서열 중의 다음 아미노산을 혼합하고 상기 고체 지지체에 이미 부착된 상기 잔기와 반응시킨다. 다음으로, 상기 아미노 또는 카르복실기의 상기 보호기는 이 새로 첨가된 아미노산 잔기로부터 제거되고, 다음으로 (적절하게 보호된) 다음 아미노산이 첨가된다. 모든 원하는 아미노산이 적절한 서열에 연결된 후, 임의의 남아 있는 말단 및 측쇄 기 보호기 (및 고체 지지체)는 순차적으로 또는 동시에 제거되어, 최종 펩티드를 제공한다. 본 발명의 상기 펩티드는 바람직하게는 벤질화된 또는 메틸벨질화된 아미노산이 없다. 그러한 보호 모이어티는 합성의 과정에서 사용될 수 있으나, 상기 펩티드가 사용되기 전에 제거된다. 다른 곳에 기술된 바와 같이, 구조 (conformation)을 한정하기 위하여 분자내 결합 (linkage)을 형성하기 위하여 추가적 반응이 필요할 수 있다.

사용될 수 있는 20 표준 아미노산 외에, 많은 수의 "비표준 (non-standard)" 아미노산이 있다. 이들 중 두 개는 유전 코드에 의하여 특정될 수 있으나, 단백질에서 거의 드물다. 셀레노시스테인은, 통상적으로 정지 코도인 UGA 코돈에서 일부 단백질에 삽입된다. 폴리라이신은 메탄을 생성하기 위하여 사용하는 효소 중에 메탄생성 고세균(archaea)에 의하여 사용된다. 그것은 코돈 UAG에 의하여 코딩된다. 단백질에는 발견되지 않는 비표준 아미노산의 예는 란티오닌(lanthionine), 2-아미노이소부티르산, 데히드로알라닌 및 신경전달물질 감마-아미노부티르산을 포함한다. 비표준 아미노산은 표준 아미노산을 위한 대사 경로에서 중간체로서 종종 존재한다-예를 들면, 오르니틴과 시트룰린은 아미노산 이화의 부분인 요소 회로에 존재한다. 비표준 아미노산은 보통은 표준 아미노산에 대한 변형을 통하여 형성된다. 예를 들면, 호모시스테인은 중간체 대사산물 S-아데노실 메티오닌을 통한 메티오닌의 트란스황화 경로(transsulfuration pathway) 또는 탈메틸화에 의하여 형성되고, 히드록시프롤린은 프롤린의 번역후 변형에 의하여 만들어진다.

C. 링커

링커 또는 가교제가 MUC1 펩티드를 다른 단백질성 서열에 융합시키기 위하여 사용될 수 있다. 이관능성 가교제는 친화성 마트릭스의 준비, 다양한 구조의 변형 및 안정화, 리간드 및 수용체 결합 부위의 확인 및 구조적 연구를 포함한 다양한 목적을 위하여 광범위하게 사용되어 왔다. 두 개의 동일한 관능기를 갖는 호모이관능성 시약은 동일 및 상이한 거대분자 또는 거대분자의 서브유니트 사이의 가교를 유도하는데, 및 폴리펩티드 리간드를 그의 특이적 결합 부위에 연결하는데 고도로 효율적인 것으로 입증되었다. 헤테로이관능성 시약은 두 개의 상이한 관능기를 포함한다. 상기 두 개의 상이한 관능기의 분별적 반응성을 이용함으로써, 가교는 선택적으로 및 순차적으로 제어될 수 있다. 상기 이관능성 가교제는 그들 관능기의 특이성에 따라 분류될 수 있으며, 예를 들면, 아미노-, 술피드릴(sulfhydryl)-, 구아니도-, 인돌-, 또는 카르복실-특이적기로 분류될 수 있다. 이들 중, 유리 아미노기에 대한 시약은 상업적 이용가능성, 합성의 용이 및 적용될 온화한 반응 조건으로 인하여 특히 인기 있게 되었다. 대부분의 헤테로이관능성 가교제는 일차 아민-반응성 기 및 티올-반응성 기를 포함한다.

다른 예에서, 헤테로이관능성 가교제 및 상기 가교제를 이용하는 방법은, 그 전체로서 원용에 의하여 본 명세서에 특이적으로 포함되어진, 미국 특허 제5,889,155호에 기재되어 있다. 상기 가교제는 친핵성 히드라지드 잔기를 친전자성 말레이미드 잔기와 조합하여, 일 실시예에서, 알데히드를 유리 티올에 결합할 수 있게 한다. 상기 가교제는 변형되어 다양한 관능기를 가교할 수 있으며, 따라서 폴리펩티드를 가교하기 위하여 사용된다. 특정 펩티드가 천연 서열 중에 주어진 가교제와 적합하지 않은 잔기를 포함하는 경우에, 일차 서열 중에 보존적 유전적 또는 합성적 아미노산 변화가 이용될 수 있다.

치료제로서 펩티드의 맥락에서 링커의 다른 용도는 Aileron Therapeutics 사의 소위 "스타플드 펩티드 (Stapled Peptide)" 기술이다. 펩티드를 스타플링(stapling)하는 일반적 접근법은 상기 펩티드 내의 두 개의 핵심 잔기가 아미노산 측쇄를 통하여 링커를 부착함으로써 변형되는 것이다. 일단 합성되면, 상기 링커는 촉매를 통하여 연결되어, 상기 펩티드의 그의 천연 α-나선 모양으로 물리적으로 한정하는 브릿지 (bridge)를 생성한다. 표적 분자와 상호작용하는데 필요한 천연 구조를 유지하도록 돕는데 더하여, 이 구조는 또한 펩티다제에 대한 안정성 및 세포 투과 특성을 제공한다. 미국특허 제7,192,713호 및 제7,183,059호는 이 기술을 기술하고 있으며, 원용에 의하여 본 명세서에 포함되어진다. 또한, Schafmeister et al .,Journal of the American Chemical Society,2000.122(24): p. 5891-5892 참조.

D. 설계, 변이체 및 유사체

본 발명은 상기 서열 CQC를 포함하는 펩티드에 촛점을 두고 있다. MUC1 올리고머 형성에서 이 핵심 구조를 확인하였기 때문에, 본 발명자들은 상기 CQC 서열의 변이체(variant)가 이용될 수 있다는 것을 고려한다. 예를 들면, 상기 CQC 서열의 구조적 제한사항을 충족하는 특정 비천연 아미노산이 생물학적 기능의 상실 없이, 아마도 그의 개선과 함께 치환될 수 있다. 또한, 본 발명자들은 구조적으로 비슷한 화합물이 본 발명의 펩티드 또는 폴리펩티드의 핵심 부분을 모사하게 위하여 만들어질 (formulated) 수 있다는 것을 고려한다. 펩티드모사체들(peptidomimetics)로 명명될 수 있는, 그러한 화합물은 본 발명의 상기 펩티드와 같은 방식으로 사용될 수 있으며, 따라서 기능적 등가물 (functional equivalents)이다.

단백질 2차 및 3차 구조의 요소를 모사하는 특정 모사체(mimetics)가 Johnson et 　 al . (1993)에 기술되어 있다. 펩티드 모사체 (mimetcis)의 사용의 이면에 있는 논리는 단백질의 펩티드 골격은, 항체 및/또는 항원의 분자적 상호작용과 같은, 분자적 상호작용을 촉진하는 방식으로 아미노산 측쇄를 배열하기 위하여 주로 존재한다는 것이다. 따라서, 펩티드 모사체는 천연 분자와 비슷한 분자적 상호작용을 허용하도록 설계된다.

특정한 구조를 생성하기 위한 방법은 당업계에 개시되어 있다. 예를 들면, α-나선 (α-helix) 모사체는 미국특허 5,446,128; 5,710,245; 5,840,833; 및 5,859,184에 개시되어 있다. 구조적으로 (conformationaly) 제한된 β-턴 (turn) 및 β-벌지(bulge)를 생성하는 방법은 예를 들면, 미국특허 5,440,013; 5,618,914; 및 5,670,155에 기술되어 있다. 다른 타입의 모사체 턴은 역-턴 및 γ-턴을 포함한다. 역 턴 모사체는 미국특허 5,475,085 및 5,929,237에 개시되어 있고, γ-턴 모사체는 미국특허 5,672,681 및 5,674,976에 개시되어 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "분자 모델링 (molecular modeling)"은 3차원적 구조 정보 및 단백질-단백질 상호작용 모델에 기초한 단백질-단백질 물리적 상호작용의 구조 및 기능의 정량적 및/또는 정성적 분석을 의미한다. 이는 전통적 수치-기반 분자 동력학(dynamic) 및 에너지 최소화 모델, 상호작용성 (interactive) 컴퓨터 그래픽 모델, 변형된 분자 역학 (mechanics) 모델, 거리 기하학 및 다른 구조-기반 한정 (contraint) 모델을 포함한다. 분자 모델링은 일반적으로 컴퓨터를 이용하여 수행되며, 알려진 방법을 사용하여 더 최적화될 수 있다. X-선 결정분석(crystallography) 데이터를 이용하는 컴퓨터 프로그램이 그러한 화합물을 설계하는데 특히 유용하다. RasMol과 같은 프로그램이, 예를 들면, 3차원 모델을 생성하기 위하여 사용될 수 있다. INSIGHT (Accelrys, Burlington, MA), GRASP (Anthony Nicholls, Columbia University), Dock (Molecular Design Institute, University of California at San Francisco), 및 Auto-Dock (Accelrys)과 같은 컴퓨터 프로그램이 새로운 구조를 도입하기 위한 추가적 조작 및 능력을 가능하게 한다. 상기 방법은 상기 화합물의 3-D 구조의 모델을 출력 장치에 출력하는 추가적 단계를 포함할 수 있다. 또한, 후보 화합물의 상기 3-D 데이터는 컴퓨터 데이터베이스, 예를 들면, 3-D 구조의 컴퓨터 데이터베이스와 비교될 수 있다.

본 발명의 화합물은 또한 다른 구조-기반 설계/모델링 기법을 사용하여 본 명세서에 기술된 상기 화합물의 구조적 정보로부터 상호작용적으로 (interactively) 설계될 수 있다 (예를 들면, Jackson, 1997; Jones et al ., 1996 참조). 다음으로, 후보 화합물은 당업자에게 익숙한 표준 분석 (assay)에서 시험될 수 있다. 예시적 분석이 본 명세서에 기술되어 있다.

생물학적 거대분자 (예, 단백질, 핵산, 탄수화물, 및 지질)의 3-D 구조는 다양한 방법에 의하여 얻어진 데이터로부터 결정될 수 있다. 단백질의 3-D 구조의 평가에 가장 효과적으로 적용되었던, 이들 방법은 (a) X-선 결정분석; (b) 핵자기 공명 (NMR) 분광분석; (c) 거대분자 상의 정의된 부위 사이에 형성된 물리적 거리 한정사항 (contrainst)의 분석, 예, 단백질 상의 잔기들 사이의 분자내 화학적 가교 (예, 원용에 의하여 그 개시 내용이 전체로서 본 명세서에 포함되어지는, PCT/US00/14667), 및 (d) 관심 단백질의 1차 구조의 지식에 기반한 분자 모델링 방법, 예, 상동성 모델링 기법, 트레딩 알고리듬 (threading algorithms), 또는 MONSSTER (Modeling Of New Structures from Secondary and Tertiary Restraints)와 같은 컴퓨터 프로그램을 이용한 초기 구조 모델링(ab initio structure modeling) (예, 원용에 의하여 그 개시 내용이 전체로서 본 명세서에 포함되어지는, International Application No. PCT/US99/11913 참조)을 포함한다. 다른 분자 모델링 기법이 또한 본 발명에 따라서 이용될 수 있다 (예, 원용에 의하여 그 개시 내용이 전체로서 본 명세서에 포함되어지는, Cohen et al ., 1990; Navia et al., 1992). 모든 이들 방법은 컴퓨터 분석에 적합한 데이터를 산출한다. 본 발명의 방법에 또한 유용할 수 있으나, 생물분자에 대하여 원자 수준 구조적 상세 사항을 현재 제공하고 있지는 않는 다른 분광학적 방법은 원편광 이색성 분광분석 (circular dichroism) 및 형광 및 자외선/가시광선 흡광도 분광분석 (spectroscopy)을 포함한다. 바람직한 분석의 방법은 X-선 결정분석이다. 이 과정 및 NMR 분광분석에 대한 설명이 이하 제공된다.

X-선 결정분석 (X- ray crystallography ). X-선 결정분석은 분자 또는 분자 복합체의 결정 중의 원자핵 주변의 전자 구름에 의한 특성 파장 (characteristic wavelength)의 X-선의 회절에 기초한다. 이 기법은 특정한 생물학적 거대분자를 구성하는 원자들의 거의 원자 해상 (near atomic resolution)을 결정하기 위하여 정제된 생물학적 거대분자 또는 분자 복합체의 결정(그러나, 이들은 종종 용매 화합물, 보조인자(co-factor), 기질 또는 다른 리간드를 포함한다)을 이용한다. X-선 결정분석에 의하여 3-D 구조를 해상하기 위한 전제조건은 X-선을 강하게 회절시킬 질서정연한 결정 (well-ordered crystal)이다. 상기 방법은 많은 동일한 분자의 규칙적, 반복적 어레이 상에 X-선의 빔을 조사하여 X-선이 개별 분자의 구조가 탐색되어질 (retrieve) 수 있는 패턴으로 상기 어레이로부터 회절하도록 한다. 예를 들면, 구형 단백질 분자의 질서정연한 결정은 불규칙한 표면을 가진 크고, 구형 (spherical) 또는 타원형 물체이다. 상기 결정은 개별 분자들 사이에 큰 채널을 포함한다. 이들 채널, 보통 상기 결정의 부피의 반이상을 차지하는 이들 채널은 무질서한 (disordered) 용매 분자로 채워져 있고, 상기 단백질 분자는 단지 몇몇 작은 영역 (a feww small regions)에서 서로 접촉하고 있다. 이것이 결정 중의 단백질의 구조가 일반적으로 용액 중의 단백질의 구조와 왜 동일한지에 대한 한 가지 이유이다.

원하는 단백질을 얻는 방법은 아래에 기술되어 있다. 결정의 형성은 pH, 온도, 생물학적 거대분자의 농도, 용매 및 침전제의 성질, 첨가된 이온 또는 단백질의 리간드의 존재를 포함한, 많은 상이한 파라미터에 의존한다. 많은 통상적 결정화 실험은 X-선 회절 분석에 적합한 결정을 만들어 줄 조합을 위하여 모든 이들 파라미터를 탐색하는 것이 요구될 수 있다. 결정화 로봇은 많은 수의 결정화 실험을 구성하는 작업을 재현가능하게 자동화하고 속도를 높이게 할 수 있다 (예, 원용에 의하여 그 개시 내용이 본 명세서에 포함되어지는, 미국특허 5,790,421 참조).

폴리펩티드 결정화는 폴리펩티드 농도가 그의 용해도 최대를 넘어서는 용액 중에서 일어난다 (즉, 상기 폴리펩티드 용액은 과포화되어 있다). 그러한 용액은 폴리펩티드 농도를 감소시킴으로써, 바람직하게는 폴리펩티드 결정의 침전을 통하여 평형으로 회복될 수 있다. 종종 폴리펩티드는 결정화에 이르게 하는 결합 (association)을 촉진하기 위하여 상기 폴리펩티드 표면 전하를 변경시키거나 상기 폴리펩티드와 벌크 물 사이의 상호작용을 교란시키기 위한 작용제를 첨가함으로써, 과포화 용액으로부터 결정화되도록 유도될 수 있다.

결정화는 일반적으로 4℃ 내지 20℃ 사이에서 수행된다. "침전제 (precipitants)"로 알려진 물질이, 상기 폴리펩티드 분자 주변의 에너지적으로 불리한 침전 제거 층 (energetically unfavorable precipitating depleted layer)을 형성함으로써, 농축된 용액 중의 상기 폴리펩티드의 용해도를 감소시키기 위하여 종종 사용된다 (Weber, 1991). 침전제에 더하여, 다른 물질이 종종 상기 폴리펩티드 결정화 용액에 첨가된다. 이들은 상기 용액의 pH를 조정하기 위한 버퍼 및 상기 폴리펩티드의 용해도를 낮추기 위한 염을 포함한다. 다양한 침전제가 당업계에 알려져 있으며, 다음의 것이 포함된다: 에탄올, 3-에틸-2-4 펜탄디올, 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은, 많은 폴리글리콜. 상기 침전 용액은 예를 들면, 13-24% PEG 4000, 5-41% 암모늄 술페이트, 및 1.0-1.5 M 소듐 클로리드, 및 5.0-7.5의 pH를 포함할 수 있다. 다른 첨가제는 0.1 M Hepes, 2-4% 부탄올, 20-100 mM 소듐 아세테이트, 50-70 mM 시트르산, 120-130 mM 소듐 포스페이트, 1 mM 에틸렌 디아민 테트라아세트산 (EDTA), 및 1 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol) (DTT)을 포함할 수 있다. 이들 작용제는 버퍼 중에 준비되고 상기 결정화 버퍼에 다양한 조합으로 방울방울 첨가된다. 결정화될 단백질은 예를 들면, 인산화 또는 포스페이트 모사체 (예, 텅스테이트, 카코딜레이트 또는 술페이트)에 의하여 변형될 수 있다.

흔히 사용되는 폴리펩티드 결정화 방법은 아래 기법을 포함한다: 뱃치, 현적 (hanging drop), 씨드 개시 및 투석. 이들 방법 각각에서, 과포화 용액을 유지함으로써 핵화(nucleation) 후 계속된 결정화를 촉진하는 것이 중요하다. 뱃치 방법에서, 폴리펩티드는 침전제와 혼합되어 과포화를 달성하고 용기를 밀봉하여 결정이 나타날 때까지 둔다. 투석 방법에서, 폴리펩티드는 침전제를 포함하는 용액 중에 위치된 밀봉된 투석 막 중에 보류된다. 상기 막을 가로지르는 평형이 상기 폴리펩티드 및 침전제 농도를 증가시켜, 상기 폴리펩티드가 과포화 수준에 이르게 한다.

바람직한 현적 기법 (McPherson, 1976)에서, 초기 폴리펩티드 혼합물은 침전제를 농축된 폴리펩티드 용액에 첨가함으로써 만들어진다. 상기 폴리펩티드 및 침전제의 농도는, 이 초기 형태에서 상기 폴리펩티드가 결정화하지 않도록 하는 농도이다. 이 혼합물의 작은 방울이 제2 용액의 저장고 위에 뒤집어 지고 매달려 있는(inverted and suspended) 유리 슬라이드 상에 위치된다. 그후 상기 시스템은 밀봉된다. 전형적으로, 상기 제2 용액은 높은 농도의 침전제 또는 다른 탈수화제를 포함한다. 상기 침전제 농도의 차이는 상기 단백질 용액이 상기 제2 용액에 비하여 높은 증기압을 갖도록 한다. 상기 두 용액을 포함하는 상기 시스템은 밀봉되어 있기 때문에, 평형이 이루어지고, 상기 폴리펩티드 혼합물로부터 물이 상기 제2 용액으로 이동한다. 이 평형은 상기 폴리펩티드 용액 중의 상기 폴리펩티드 및 침전제 농도를 높힌다. 상기 폴리펩티드 및 침전제의 임계 농도에서, 상기 폴리펩티드의 결정이 형성될 수 있다.

결정화의 다른 방법은 핵화 부위를 상기 농축된 폴리펩티드 용액 내로 도입한다. 일반적으로, 농축된 폴리펩티드 용액이 만들어지고, 상기 폴리펩티드의 씨드 결정이 이 용액 내로 도입된다. 상기 폴리펩티드 및 임의의 침전제의 농도가 맞다면, 상기 씨드 결정은 그 주위에 더 큰 결정을 형성되는 핵화 부위를 제공할 것이다.

결정화의 또 다른 방법은 전극에 인접한 헬름홀츠 층 (Helmholtz layer) 중에 자가 정렬하는 단백질 거대분자의 쌍극자 모멘트를 이용하는 전기결정화이다 (예, 원용에 의하여 그 개시 내용이 명세서에 포함되어지는, 미국특허 5,597,457 참조).

일부 단백질은 결정화에 저항성일 수 있다. 그러나, 결정화를 유도하기 위하여 여러 방법이 숙련자에게 이용될 수 있다. 예를 들면, 단백질의 아미노 또는 카르복실 말단에서 유연한 폴리펩티드 세그멘트 (flexible polypeptide segment)의 제거는 결정성 단백질 시료의 생산을 촉진할 수 있다. 그러한 세그멘트의 제거는 분자 생물학적 기법 또는 트립신, 키모트립신 또는 서브틸리신과 같은 프로테아제에 의한 상기 단백질의 처리에 의하여 이루어질 수 있다.

회절 실험에서, X-선 원천으로부터 좁고 평행한 X-선의 빔을 취하고, 상기 결정으로 향하게 하여 회절된 빔을 생산한다. 상기 도입되는 1차 빔은 상기 거대분자 및 용매 분자에 손상을 야기한다. 그러므로, 상기 결정은 수명을 연장하기 위하여 냉각된다 (예, -220℃ 내지 -50℃까지). 상기 1차 빔은 모든 가능한 회절 지점(spot)을 생산하기 위하여 많은 방향으로부터 상기 결정을 때려야 하고, 그래서 결정은 실험 동안 빔 중에서 회전된다. 상기 회절된 지점은 필름 상에 기록되거나 전자적 검출기에 의하여 기록된다. 상기 노출된 필름은 스캔 장치 중에서 디지털화되고 정량화되어야 하며, 상기 전자적 검출기는 검출하는 신호를 컴퓨터에 직접적으로 입력하여야 한다. 전자적 영역 검출기는 회절된 데이터를 수집하고 측정하는데 걸리는 시간을 현저하게 감소시킨다. 상기 필름 또는 검출기 플레이트 상에서 지점으로 기록된, 각 회절 빔은 3개 특성에 의하여 정의된다: 상기 지점의 강도로부터 측정되는, 진폭 (amplitude); X-선 원천에 의하여 정하여지는, 파장; 및 X-선 실험에서 상실되는 상(phase). 모든 3개 특성은 상기 회절된 빔을 일으키는 원자들의 위치를 결정하기 위하여 상기 회절된 빔의 모두에 대하여 필요하다. 상기 상을 결정하는 한 방법은, 외래 X-선 산란물(scatter) (예, 금속 원자와 같은 무거운 원자들)을 상기 결정의 단위 세포 (unit cell) 내에 도입하는 것이 요구되는, 복수 이소형 치환 (Multiple Isomorphous Replacement: MIR)이라 불리는 것이다. MIR에 대한 보다 상세한 설명에 대하여는, 원용에 의하여 그 개시 내용이 전체로서 본 명세서에 포함되어지는, 미국특허 6,093,573 (15열) 참조.

원자 좌표는 결정형 중의 관심 생물학적 거대분자의 원자들 (산란 센터)에 의한 X-선의 단파장 빔 (monochromatic beam)의 회절을 통하여 얻어진 패턴으로부터 유래된 데이터의 푸리에 합성을 포함한 수학적 방정식으로부터 유래된 직교 좌표 (x,y, 및 z 위치)를 나타낸다. 회절 데이터는 상기 결정 중의 반복 단위 (단위 세포)의 전자 밀도 지도를 계산하기 위하여 사용된다. 전자 밀도 지도는 결정의 단위 세포 내의 개별 원자의 위치들 (원자 좌표)을 확립하기 위하여 사용된다. 원자들 사이의 동일한 상대적 공간 관계를 유지하면서, 원자 좌표에 할애된 절대값은 x,y, 및/또는 z 축을 따라, 함께 또는 개별적인, 회전 및/또는 직선이동 (translational movement)에 의하여 변화될 수 있기 때문에, 원자 좌표의 절대 값은 원자들 사이의 공간적 관계를 부여한다. 따라서, 그의 절대적 원자 좌표 값의 집합(set)이 다른 시료의 분석으로부터 얻어진 이전에 결정된 값들의 집합과 일치되도록 회전적으로 또는 직선적으로 (translationally) 조정될 수 있는, 생물학적 거대분자 (예, 단백질)는 상기 다른 시료로부터 얻어진 것들과 동일한 원자 좌표를 갖는 것으로 간주된다.

X-선 결정분석에 대한 더 상세한 사항은 함께 계류 중인 미국 출원번호 2005/0015232, 미국특허 6,093,573 및 국제 출원 번호 PCT/US99/18441, PCT/US99/11913, 및 PCT/US00/03745로부터 얻을 수 있다. 모든 이들 특허 문서의 개시 내용은 원용에 의하여 그 전체로서 본 명세서에 포함된다.

NMR 분광분석. X-선 결정분석은 관심 거대분자의 단일 결정이 요구되지만, NMR 측정은 거의 생리적 조건 (near physiological conditions)의 용액 중에서 이루어진다. 그러나, NMR-유래 구조는 결정-유래 구조만큼 상세하지 않다.

NMR 분광분석은 상대적으로 최근까지 상대적으로 작은 분자 (예, 100-150 아미노산 잔기의 단백질)의 3-D 구조를 밝히는데 한정되었으나, 분자의 동위원소 표지 및 횡 이완-최적화 분광분석 (transverse relaxation-optimized spectroscopy: TROSY)을 포함한 최근의 진전은 상기 방법이 더 큰 분자, 예, 분자량 110 kD의 단백질의 분석에까지 확장되도록 하였다 (Wider, 2000).

NMR은 특정 라디오파로 펄스된 균질한 자기장 중의 자기적 원자핵의 환경을 조사하기 위하여 자디오파 (radio-frequency radiation)를 사용한다. 상기 펄스는 영이 아닌 스핀을 갖는 핵을 가진 원자의 핵 자기를 동요시킨다. 상기 시스템이 평형으로 되돌아 감에 따라 임시적 시간 도메인 신호 (transient time domain signal)가 검출된다. 상기 임시적 신호의 주파수 도메인으로의 푸리에 변환은 1차원 NMR 스펙트럼을 생성한다. 이 스펙트럼 중의 피크가 다양한 활성 핵의 화학적 시프트를 나타낸다. 2차원 NMR 실험은 상기 구조에서 및 3차원 공간에서 다양한 원자들의 근접성에 대한 정보를 제공한다. 단백질 구조는 많은 2-차원 (및 때때로 3- 또는 4-차원) NMR 실험을 수행하고 얻어진 정보를 일련의 단백질 접힘 모사(simulation)에 한정사항으로 이용함으로써 결정될 수 있다.

NMR 실험으로부터 어떻게 원천 데이터 (raw data)가 거대분자의 3-D 구조를 결정하는데 사용될 수 있는지에 대한 상세한 설명을 포함한 NMR 분광분석에 대한 더 많은 정보는, 모든 문헌의 개시 내용이 그 전체로서 원용에 의하여 본 명세서에 포함되는, Protein NMR Spectroscopy, Principles 및 Practice, (1996); Gronenborn et al .(1990); 및 Wider (2000), supra.에서 발견할 수 있다.

또한, 관심의 대상인 것은 펩티드인 본 발명의 화합물의 아미노산에 기초하여 설계된 펩티드모사 화합물 (peptidomimetic compounds)이다. 펩티드모사 화합물은 선택된 펩티드의 3차원 구조와 실질적으로 동일한 3차원 구조 (conformatin) "모티프"를 가진 합성 화합물이다. 상기 펩티드는 모티프는 MUC1의 올리고머화를 저해할 수 있는 능력을 가진 펩티드모사 화합물을 제공한다. 펩티드모사 화합물은 증가된 세포 투과성 및 길어진(prolonged) 생물학적 반감기와 같은, 그의 인 비보 활성을 증진시키는 추가 특성을 가질 수 있다. 펩티드모사체는 전형적으로, 부분적으로 또는 전체적으로 비-펩티드인 골격을 가지고 있지만, 상기 펩티드모사체가 기초된 펩티드 중에 존재하는 아미노산 잔기들의 측쇄 기와 동일한 측쇄 기를 갖는다. 여러 타입의 화학적 결합, 예를 들면, 에스테르, 티오에스테르, 티오아미드, 레트로아미드, 환원된 카르보닐 (reduced carbonyl), 디메틸렌 및 케토메틸렌 결합이 프로테아제-저항성 펩티드모사체의 구성(construction)에서 펩티드 결합에 대한 일반적으로 유용한 치환물(substitutes)이라는 것은 당업계에 알려져 있다.

IV . 요법 ( therapies )

A. 약학적 제형 및 투여 경로

임상 적용이 고려되는 경우, 의도된 적용에 적합한 형태의 약학적 조성물을 제조하는 것이 필요하다. 일반적으로, 이는 필수적으로 발열물질 (pyrogen), 및 인간 또는 동물에게 유해할 수 있는 다른 불순물질이 없는 조성물을 제조하는 것을 수반할 것이다.

사람은 일반적으로 전달 벡터가 안정하게 되고 표적 세포에 의하여 섭취될 수 있도록 하기 위하여 적절한 염 및 버퍼를 이용하려 할 것이다. 버퍼는 또한 재조합 세포가 환자 내로 도입되는 경우 이용될 것이다. 본 발명의 수성 조성물은, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 수성 매질에 용해되거나 분산된, 세포에 대한 효과적인 양의 벡터를 포함한다. 그러한 조성물은 또한 접종물 (inocula)이라고도 한다. 어구 "약학적으로 또는 약리학적으로 허용가능한 (pharmaceutically or pharmacologically acceptable)"은 동물 또는 인간에게 투여되는 경우 불리한(adverse), 알러지, 또는 다른 원하지 않은 반응을 일으키지 않는 분자 개체(entities) 및 조성물을 말한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "약학적으로 허용가능한 담체 (pharmaceutically acceptable carrier)"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질을 위하여 그러한 매질 및 작용제를 사용하는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적 매질 또는 작용제가 본 발명의 벡터 또는 세포와 적합하지 않은 것을 제외하고는, 치료적 조성물에 그들을 사용하는 것이 고려된다. 또한 보조적 활성 성분이 상기 조성물에 포함될 수 있다.

본 발명의 상기 활성 조성물은 전통적 약학적 준비물 (preparations)을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 이들 조성물의 투여는 표적 조직이 그 경로를 통하여 이용가능한 한 임의의 통상적 경로를 통하여 될 수 있다. 그러한 경로는, 경구, 비강, 부칼, 직장, 질, 또는 국소 (topical) 경로를 포함한다. 대안적으로, 투여는 오로토토픽(orthotopic), 피내(intradermal), 피하, 근육내, 복막내, 또는 정맥내 주사에 의하여 될 수 있다. 그러한 조성물은 상기한 바와 같이, 약학적으로 허용가능한 조성물로서 정상적으로 투여될 것이다. 특히 관심의 대상인 것은 직접 종양 내 투여, 종양의 관류, 또는 종양에 국소적 (local) 또는 영역적 (regional) 투여, 예를 들면, 국소적 (local) 또는 영역적 혈관 (vasculature) 또는 림프 시스템 내, 또는 잘려진 종양 베드(resected tumor bed)에 투여하는 것이다.

상기 활성 화합물은 또한 비경구 (parenterally) 또는 복막내로 투여될 수 있다. 유리 염기 또는 약학적으로 허용가능한 염으로서 상기 활성 화합물의 용액은, 히드록시프로필셀룰로즈와 같은, 계면활성제와 적절하게 혼합된 물 중에 제조될 수 있다. 분산물 (dispersions)이 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 그들의 혼합물 및 오일 중에 또한 제조될 수 있다. 통상의 저장 및 사용 조건하에서, 이들 준비물은 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 포함한다.

주사용에 적합한 약학적 제형은 멸균 주사 용액 또는 분산물의 즉석 제조를 위하여 멸균 수성 용액 또는 분산물 및 멸균 분말 (powder)을 포함한다. 모든 경우에 있어서 상기 제형은 멸균되어야 하고 쉬운 주사성 (syringability)이 존재하는 정도까지 유동적이어야 한다. 그것은 또한 제조 및 저장의 조건하에서 안정하여야 하며, 박테리아 및 곰팡이와 같은, 미생물의 오염 작용에 대하여 보존되어야만 한다. 상기 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등), 그들의 적절한 혼합물, 및 식물유를 포함한, 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 상기 적당한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산물의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의하여 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 테메로살 등에 의하여 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장제 (isotonic agents), 예를 들면, 당 또는 소듐 클로리드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 상기 주사가능한 조성물의 길어진 흡수 (prolonged absorption)는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면, 알루미늄 및 젤라틴을 상기 조성물에 사용함으로써 달성될 수 있다.

멸균 주사용 용액은 필요에 따라, 상기 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매 중에 필요한 양의 상기 활성 화합물을 포함시킨 후, 여과 멸균에 의하여 제조된다. 일반적으로, 분산물은 다양한 멸균된 활성 성분을, 상기 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분들을 포함하는 멸균 비히클 내에 포함시킴으로써 제조된다. 멸균 주상용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은, 활성 성분 및 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 추가의 임의의 원하는 성분의 분말을 생성하는, 진공 건조 및 냉동 건조 기법이다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체 (pharmaceutically acceptable carrier)"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항곰팡이제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 그러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적 매질 또는 작용제가 본 발명의 벡터 또는 세포와 적합하지 않은 것을 제외하고는, 치료적 조성물에 그들을 사용하는 것이 고려된다. 또한 보조적 활성 성분이 상기 조성물에 포함될 수 있다.

경구 투여를 위하여, 본 발명의 상기 폴리펩티드는 부형제와 함께 포함될 수 있으며, 삼킬수 없는 구강세척제(mouthwashe) 및 치마제(dentifrices)의 형태로 사용될 수 있다. 구강세척제는 소듐 보레이트 용액 (Dobell's Solution)과 같은, 적절한 용매 중에 필요한 양의 상기 활성 성분을 포함시킴으로써 제조될 수 있다. 대안적으로, 상기 활성 성분은 소듐 보레이트, 글리세린 및 포타슘 비카르보네이트를 포함한 방부 세척제 (antiseptic wash) 중에 포함될 수 있다. 상기 활성 성분은 겔, 페이스트, 분말 및 슬러리를 포함한 치마제 중 또한 분산될 수 있다. 상기 활성 성분은 물, 결합제, 마모제(abrasives), 풍미제(flavoring agents), 폼제, 및 보습제를 포함할 수 있는 페이스트 치마제에 치료학적으로 효과적인 양으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 중성 형태 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로-허용가능한 염 (pharmaceutically-acceptable salts)은 산 첨가 염 (상기 단백질의 유리 아미노 기와 함께 형성된) 및 예를 들면, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 함께 형성된 것을 포함한다. 유리 카르복실기와 함께 형성된 염은 예를 들면, 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 또는 페릭 히드록시드와 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 또한 유래될 수 있다.

제제화 시, 용액은 투여 제형 (dosage formulation)과 적합한 방식으로 치료학적으로 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 상기 제형은 주사 용액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 투여 형태로 용이하게 투여될 수 있다. 수성 용액 중에 비경구적 투여를 위하여, 예를 들면, 상기 용액은 필요하다면 적절하게 완충되어야 하며 상기 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 포도당으로 등장으로 되어야 한다. 이들 특정 수성 용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복막내 투여에 특히 적합하다. 이러한 맥락에서, 이용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시의 관점에서 당업자에게 알려질 것이다. 예를 들면, 일 용량 (one dosage)은 1 ml의 등장 NaCl 용액 중에 용해되고, 1000ml의 피하주입 액체 (hypodermoclysis fluid)에 첨가되거나 제안된 주입 부위에 주사될 수 있다 (예를 들면, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15th Edition, pages 1035-1038 및 1570-1580 참조). 투여량의 일부 변이는 치료되어질 개체의 조건에 따라 필수적으로 일어날 것이다. 투여를 하는 자는 어떠한 경우에도, 개별 개체를 위하여 적절한 용량을 결정할 것이다. 또한, 인간 투여를 위하여, 준비물은 FDA 생물학적 표준 사무소 (Office of Biologics standards)에 의하여 요구되고 있는 멸균성, 발열성(pyrogenicity), 일반적 안전성 및 순도 표준을 충족하여야 한다.

B. 암 타입 및 개체

본 발명의 방법이 적용될 수 있는 암 세포는 MUC1을 발현하는, 더 구체적으로는, MUC1을 과발현하는 임의의 세포를 일반적으로 포함한다. 적합한 암 세포는 유방 암, 폐암, 결장암, 췌장암, 신장암, 위암, 간암, 골암, 혈액암 (예, 백혈병 또는 림프종), 신경조직암, 흑색종, 난소암, 고환암, 전립선암, 자궁경부암, 질암, 또는 방광 암 세포일 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 넓은 범위 종 예를 들면, 인간, 비-인간 영장류 (예, 원숭이, 개코원숭이 (baboon), 또는 침팬지), 말, 소(cattle), 돼지, 양, 염소, 개, 고양이, 토끼, 기니피그, 게르빌루스쥐(gerbils), 햄스터, 쥐 및 생쥐에 적용될 수 있다.

C. 치료방법

MUC1 올리고머 형성을 저해하는 펩티드 또는 유사체는 일반적으로 항-암 치료제 또는 예방제로서 유용하다. 그들은 포유류 개체 (예, 인간 유방 암 환자)에 단독으로 또는 다른 약물 및/또는 방사성요법과 조합되어 투여될 수 있다. 상기 화합물은 또한 암에 대하여 유전적으로 및/또는 환경적으로 (예를 들면, 생리학적 및/또는 환경적 인자로 인하여) 민감한 개체, 예를 들면, 암 (예, 유방암)의 가족력을 가진 개체, 만성 염증을 가진 개체 또는 만성 스트레스를 가진 개체, 또는 자연적 또는 비자연적 환경적 발암 환경 (carcinogenic conditions) (예, 햇볕, 산업적 발암물질, 또는 담배 흡연에 과도한 노출)에 노출된 개체에 투여될 수 있다.

상기 방법이 암을 가진 개체에 적용되는 경우, 화합물의 투여 전에, 상기 암은 당업계에 알려진 방법에 의하여 MUC1 발현 (MUC1 단백질 또는 MUC1 mRNA 발현)에 대하여 선택적으로 시험될 수 있다. 이런 식으로, 개체는 MUC1-발현 또는 과발현 암을 가진 것으로 확인될 수 있다. 그러한 방법은 개체로부터 얻어진 암 세포에 대하여 인 비트로에서 수행될 수 있다. 대안적으로, 예를 들면, MUC1에 특이적인 방사성표지된 항체를 사용한 인 비보 이미징 기법이 수행될 수 있다. 또한, 암을 가진 개체로부터의 체액 (예, 혈액 또는 뇨)이 MUC1 단백질 또는 MUC1 단백질 단편의 증가된 수준에 대하여 시험될 수 있다.

필요한 투여량은 투여 경로의 선택; 제형의 성질; 환자의 질병의 성질; 개체의 크기, 체중, 표면적, 나이 및 성별; 투여될 다른 약물; 및 의사의 판단에 의존한다. 적절한 투여량은 0.0001 mg/kg-100 mg/kg의 범위 내이다. 이용한 다양한 화합물 및 다양한 투여 경로의 상이한 효율의 관점에서, 필요한 투여량에 넓은 변이가 예상된다. 예를 들면, 경구 투여는 정맥 주사에 의한 투여 보다 더 높은 투여량이 요구될 것으로 예상된다. 이들 투여량 수준의 변이는 당업계에 잘 알려져 있는 최적화를 위한 표준 경험적 과정 (standard empirical routines)을 사용하여 조정될 수 있다. 투여는 단일 또는 복수 (예, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 8-, 10-, 20-, 50-,100-, 150-, 또는 그 이상 회)일 수 있다. 적절한 전달 비히클 (예, 중합체 마이크로입자 또는 이식 장치(implantable devices)) 중에 상기 폴리펩티드의 캡슐화는 전달의 효율, 특히 경구 전달의 효율을 증가시킬 수 있다.

V. 조합 요법

DNA 손상제에 대한 종양 세포 저항성은 임상 종양학에서 주요 문제이다. 현재 암 연구의 한 목적은 화학 요법 및 방사성요법의 효능을 증가시키는 방법을 발견하는 것이다. 한 방법은 그러한 전통적 요법과 유전자 요법 (gene therapy)을 조합하는 것이다. 본 발명의 맥락에서, MUC1 펩티드 요법은 화학요법적, 방사성 요법적, 또는 면역 요법적 중재와 관련되어 비슷하게 사용될 수 있을 것으로 고려된다.

본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여, 세포를 제거 (kill)하기 위하여, 세포 성장을 저해하기 위하여, 전이를 저해하기 위하여, 혈관신생을 저해하기 위하여 또는 종양 세포의 악성 표현형을 되돌리거나 감소시키기 위하여, 일반적으로 표적 세포를 MUC1 펩티드 및 하나 이상의 다른 요법제와 접촉시킬 것이다. 이들 요법들은 상기 세포를 제거하거나 증식을 저해하는 효과적인 조합된 양 (combined amount)으로 제공될 것이다. 이 과정은 상기 세포를 상기 작용제/치료제와 동시에 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 이는 상기 세포를 두 작용제를 포함하는 단일 조성물 또는 약리적 제형과 접촉시킴으로써, 또는 상기 세포를, 한 조성물은 MUC1 펩티드를 포함하고 다른 조성물은 상기 작용제를 포함하는, 두 개의 구분된 조성물 또는 제형과 동시에, 접촉시킴으로써 달성될 수 있다.

대안적으로, 상기 MUC1 치료는 분 (minutes) 내지 주 (weeks)의 범위의 간격으로 다른 치료 전에 또는 그 후에 올 수 있다. 다른 치료 및 상기 MUC1 펩티드가 별개로 상기 세포에 적용되는 구체예에서, 일반적으로 각 전달의 시간 사이에 유의한 기간이 만료되지 않도록 하여, 상기 요법이 상기 세포에 이로운 조합된 효과를 여전히 미칠 수 있도록 할 것이다. 그러한 경우, 상기 세포를 서로 약 12-24 시간 내, 서로 약 6-12 시간 내, 또는 단지 약 12 시간의 지연 시간으로 두 방법 (modalities)과 접촉시키는 것이 고려된다. 그러나, 일부 상황에서, 치료를 위한 기간을 현저하게 연장하는 것이 바람직할 수 있다; 각 투여 사이에 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7) 내지 수주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)가 경과하는 경우.

MUC1 펩티드 또는 다른 요법제 중 어느 하나의 일 이상의 투여가 바람직하게 되는 것을 또한 상상할 수 있다. MUC1 펩티드가 "A"이고, 다른 요법제가 "B"인 경우, 아래 예시된 바와 같이, 다양한 조합이 이용될 수 있다.

다른 조합도 고려된다. 다시, 세포 제거를 달성하기 위하여, 두 요법은 상기 세포를 제거하기에 효과적인 조합된 양으로 세포에 전달된다.

조합된 요법에 사용하기에 적합한 작용제 또는 인자는 세포에 적용된 경우 DNA 손상을 유발하는 임의의 화학적 화합물 또는 치료 방법을 포함할 수 있다. 그러한 작용제 또는 인자는 γ-조사, x-선, UV-조사, 마이크로파, 전자 방출 (electronic emission) 등과 같은, DNA 손상을 유발하는 방사선 (radiation) 및 파장을 포함한다. "화학 요법적 (chemotherapeutic)" 또는 "유전독성 작용제 (genotoxic agents)"로도 기술된, 다양한 화학적 화합물은 본 명세서에 기술된 상기 조합된 치료 방법에 유용할 것으로 의도된다. 본 발명에 따라 암을 치료함에 있어서, 상기 종양 세포를 상기 발현 구조체에 더하여 작용제와 접촉시킬 것이다. 이는 국재화된 종양 부위를 X-선, UV-광, γ-선 또는 심지어 마이크로파와 같은 선으로 조사함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 상기 종양 세포는 상기 개체에 치료적으로 효과적인 양의 약학적 조성물을 투여함으로써 상기 작용제와 접촉될 수 있다.

다양한 부류의 화학요법제가 본 발명의 펩티드와 조합된 사용에 고려된다. 예를 들면, 타목시펜, 4-히드록시 타목시펜 (아피목스펜), 팔소덱스, 랄옥시펜, 바제독시펜, 클로미펜, 페마렐레, 라소폭시펜, 오르멜록시펜, 및 토레미펜과 같은 선택적 에스트겐 수용체 길항제 ("SERMs").

사용될 것으로 고려된 화학요법제는 예를 들면, 캄토테신, 악티노마이신-D, 마이토마이신 C를 포함한다. 본 발명은 또한, X-선과 시스플라틴의 사용 또는 시스플라틴과 에토포시드의 사용과 같은, 방사선-기반 또는 실제적 화합물이든, 하나 이상의 DNA 손상제의 사용을 포함한다. 상기 작용제는 그것을 상기 기술된 바와 같은, MUC1 펩티드와 조합함으로써, 조합된 치료 조성물, 또는 키트로서 제조되고 사용될 수 있다.

열충격 단백질 90 (heat shock protein 90)은 많은 진핵 세포에서 발견된 조절 단백질이다. HSP90 저해제는 암의 치료에 유용한 것으로 밝혀졌다. 그러한 저해제는 겔다나마이신, 17-(알릴아미노)-17-데메톡시겔다나마이신, PU-H71 및 리파부틴을 포함한다.

DNA를 직접적으로 가교하거나 부가물 (adducts)을 형성하는 작용제는 또한 고려된다. 시스플라틴과 같은 작용제, 및 다른 DNA 알킬화제가 사용될 수 있다. 시스플라틴은 암을 치료하기 위하여, 총 3 과정 (3 courses)에 대한 매 3주 5일 동안 20 mg/m²의 임상적 적용으로 사용된 효능 용량 (efficacious doses)으로, 널리 사용되어 왔다. 시스플라틴은 경구로 흡수되지 않으므로, 정맥 내, 피하, 종양 내 또는 복막 내 주사를 통하여 전달되어야만 한다.

DNA를 손상하는 작용제는 또한 DNA 복제, 유사 분열 (mitosis) 및 염색체 분리를 간섭하는 화합물을 포함한다. 그러한 화학요법적 화합물은, 독소루비신으로 알려진 아드리아마이신, 에토포시드, 베라파밀, 포도필로톡신 등을 포함한다. 신생물 (neoplasm)을 치료하기 위한 임상적 구성 (clinincal setting)에 널리 사용되는, 이들 화합물은 독소루비신에 대하여 25일 간격으로 25-75 mg/m²의 용량으로 정맥 내 볼루스 주사를 통하여, 에토포시드에 대하여 35-50 mg/m²의 용량으로 정맥내 또는 정맥 내 용량의 두 배를 경구로 투여된다. 탁산과 같은 미세소관 저해제 (microtubule inhibitors)가 또한 고려된다. 이들 분자는 주목 속 (genus Taxus)의 식물체에 의하여 생산된 디테르펜(diterpenes)이며, 파클리탁셀 및 도세탁셀을 포함한다.

이레사 (Iressa)와 같은, 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor) 저해제,

FK506-결합 단백질 12-라파마이신 연관된 단백질 1 (FK506-binding protein 12-rapamycin associated protein 1: FRAP1)로도 알려진, mTOR, 라파마이신의 포유동물 표적은 세포 성장, 세포 증식, 세포 운동성 (cell motility), 세포 생존, 단백질 합성 및 전사를 조절하는 세린/트레오닌 단백질 키나제이다. 그러므로, 라파마이신 및 그의 유사체 ("rapalogs")는 본 발명에 따른 조합 암 요법에 사용하기 위하여 고려된다.

본 명세서에 청구된 상기 펩티드와의 다른 가능한 조합 요법제는 전신성 염증과 연관된 사이토카인 및 급성기 반응을 자극하는 사이토카인 그룹의 일원인 TNF-α (종양괴사인자-알파: tumor necrosis factor-alpha)이다. TNF의 일차 역할은 면역 세포의 조절에 있다. TNF는 또한 아포토시스 세포 사멸을 유발하고, 염증을 유발하고, 종양생성 및 바이러스 복제를 저해할 수 있다.

핵산 전구체 및 서브유니트의 합성 및 신뢰도(fidelity)를 파괴하는 작용제도 DNA 손상에 이르게 한다. 그러한 많은 핵산 전구체가 개발되었다. 광범위한 시험을 거쳤고 쉽게 이용가능한 작용제는 특히 유용하다. 그러한 것으로, 5-플루오로우라실 (5-FU)과 같은 작용제는 신생 조직에 의하여 우선적으로 사용되어, 신생 세포를 타켓팅하는데 특히 유용하게 한다. 비록 아주 독성인 5-FU는 국소를 포함한, 넓은 범위의 담체 중에 적용가능하지만, 3 내지 15 mg/kg/day의 용량 범위로 정맥 투여가 통상적으로 사용된다.

DNA 손상을 야기하고 널리 사용된 다른 인자들은 γ-선, X-선으로 통상적으로 알려진 것들 및/또는 방사성 동위원소의 종양 세포로의 지향된 전달을 포함한다. 마이크로파 및 UV-조사와 같은 DNA 손상 인자의 다른 형태가 또한 고려된다. 이들 인자의 모두는 DNA 및 DNA의 전구체에 대한 손상, DNA의 복제 및 수복, 및 염색체의 조립 및 유지의 넓은 범위에 영향을 미칠 것이다. X-선 조사량 범위 (dosage range)는 연장된 (prolonged) 기간 동안 (3 내지 4주) 50 내지 200 렌트겐의 일일 용량으로부터 2000 내지 6000 렌트겐의 단일 용량의 범위를 갖는다. 방사성 동위원소에 대한 투여량 범위는 광범위하게 변하며, 동위원소의 반감기, 방사되는 방사선의 강도 및 타입, 및 신생 세포에 의한 섭취에 의존한다.

당업자는 "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, chapter 33, 특히 624-652쪽으로 안내된다. 투여량의 일부 변이는 치료될 개체의 조건에 따라 필수적으로 일어날 것이다. 투여를 하는 자는 어떠한 경우에도, 개별 개체를 위하여 적절한 용량을 결정할 것이다. 또한, 인간 투여를 위하여, 준비물은 FDA 생물학적 표준 사무소 (Office of Biologics standards)에 의하여 요구되고 있는 멸균성, 발열성(pyrogenicity), 일반적 안전성 및 순도 표준을 충족하여야 한다.

발명자들은 암을 가진 환자에게 MUC1 펩티드의 국소적 또는 영역적 전달이 임상적 질병을 치료하기 위한 아주 효과적인 방법일 것이라는 것을 제안한다. 비슷하게, 화학- 또는 방사성요법이 개체 몸체의 특정한, 영향을 받은 영역에 대하여 지향될 수 있다. 대안적으로, 발현 구조체 및/또는 상기 작용제의 영역적 또는 전신적 전달이 특정한 환경, 예를 들면, 광범위한 전이가 일어난 경우, 적절할 수 있다.

MUC1 요법을 화학- 및 방사성 요법과 조합하는 것에 더하여, 면역요법, 호르몬 요법, 독소 요법 및 수술(surgery)과의 조합이 또한 고려된다. 특히, 아바스틴, 어비툭스 (Erbitux), 글리벡(Gleevec), 허셉틴(Herceptin) 및 리툭산(Rituxan)과 같은 표적화된 요법을 이용할 수 있다.

상기 요법의 임의의 것은 암을 치료하는데 있어서 그 자체로서 유용한 것으로 입증될 수 있다는 것이 또한 지적되어야 한다.

하기 도면은 본 명세서의 부분을 형성하며 및 본 발명의 특정 양상을 더 예시하기 위하여 포함된다. 본 발명은 상기 상세한 설명과 조합된 이들 도면의 하나 이상의 참조에 의하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1A-D. MUC1 / CQC 펩티드는 MUC1 올리고머화를 차단한다. (도 1A) MUC1-C 서브유니트의 도식적 표시(schematic representation) 및 MUC1-CD의 72-아미노산 서열이 나타내져 있다. N-말단 15 아미노산 (그늘질(shaded) 서열) MUC1/CQC 및 돌연변이된 MUC1/AQA 펩티드는 폴리-dArg 도입 도메인과 함께 합성되었다. (도 1B) His-MUC1-CD (1.4 mg/ml)는 BIAcore 내의 센서 칩에 고정화되었다. MUC1/CQC는 10μM로 상기 칩 상에 주입되었다. 원천 결합 데이터 (raw binding data)를 BIAevaluation software version 3.0에 의하여 분석하고, 1:1 랑그무어 결합 모델(Languir binding model)에 피팅하였다. (도 1C) 정제된 His-MUC1-CD (1.5 mg/ml)를 1시간 동안 실온에서 PBS, 200 μM MUC1/CQC 또는 200 μM MUC1/AQA와 인큐베이션하였다. 상기 단백질을 비-환원 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리하고 항-MUC1-C를 사용한 면역블롯팅에 의하여 분석하였다. (도 1D) 293 세포를 임시적으로 트란스펙션(transiently transfected)시켜 빈 벡터(empty vector) 또는 GFP-MUC1-CD 및 Flag-MUC1-CD를 발현시켰다. 트란스펙션 48 시간 후, 상기 세포를 3일 동안 5 μM MUC1/CQC 또는 MUC1/AQA로 처리하였다. 다음으로, 상기 세포 항-MUC1-C를 사용한 면역블롯팅을 위하여 수집하였다 (좌측 패널). 전 세포 용해물을 또한 항-Flag로 침전시키고, 상기 침전물을 표시된 항체를 사용하여 면역블롯팅하였다 (우측 패널).
도 2A-C. MUC1 / CQC 펩티드는 MUC1 -C의 핵 국재화(nuclear localization)를 차단한다. (도 2A) ZR-75-1 세포를 지정된 시간 동안 5 μM FITC-표지된 MUC1/CQC 펩티드와 인큐베이션한 다음, 유세포 흐름분석에 의하여 분석하였다. 평균 형광 지수(mean fluorescence index: MFI)가 각 패널에 포함되어 있다. (도 2B-C) ZR-75-1 (도 2B) 및 MCF-7 (도 2C) 세포를 3일 동안 5 μM MUC1/CQC 또는 MUC1/AQA 펩티드의 존재하에서 인큐베이션하였다. 전 세포 용해물 (WCL) (좌측 패널) 및 핵 용해물(nuclear lysates) (우측 패널)을 표시된 항체를 사용하여 면역블롯팅하였다.
도 3A-D. MUC1 / CQC 펩티드는 S 기 정지 및 괴사를 유발한다. ZR-75-1 (도 2A-B) 및 MCF-7 (도 2C-D) 세포를 3일 및 4일 동안 5 μM MUC1/CQC 또는 MUC1/AQA로 처리하였다. 세포를 고정하고 유세포 흐름분석에 의하여 세포주기 분포에 대하여 분석하였다 (도 2A 및 2C). G1, S 및 G2/M 기에 있는 세포의 백분율이 패널에 포함되어 있다. 세포를 또한 프로피디움 이오디드(propidium iodide)로 염색하고 괴사에 대하여 유세포 흐름분석에 의하여 분석하였다 (도 2B 및 2D). 괴사 세포의 백분율이 패널에 포함되어 있다.
도 4A-E. MUC1 발현 유방 암 세포에 대한 MUC1 / CQC 의 선택성. (도 4A) ZR-75-1 세포를 빈 렌티바이러스(벡터) 또는 MUC1 siRNA를 발현하는 렌티바이러스로 안정적으로 감염시겼다. 감염된 세포의 용해물을 표시된 항체로 면역블롯팅하였다. (도 4B) ZR-75-1/벡터 세포를 처리하지 않고 두거나 (다이아몬드), 및 ZR-75-1/벡터 (사각형) 및 ZR-75-1/MUC1siRNA (삼각형) 세포를 지정된 시간 동안 5 μM MUC1/CQC 펩티드로 처리하였다. 생존 세포 수를 트리판 블루 배제에 의하여 결정하였다. (도 4C) 293 세포를 처리하지 않고 두거나 (다이아몬드), 및 지정된 시간 동안 5 μM MUC1/CQC (사각형) 또는 MUC1/AQA (삼각형)로 처리하였다. 생존 세포 수를 트리판 블루 배제에 의하여 결정하였다. (도 4D) MCF-10A 세포를 처리하지 않고 두거나 (좌측 패널), 및 5 μM MUC1/CQC (가운데 패널) 또는 MUC1/AQA (우측 패널)로 처리하였다. 3일에, 세포를 세포주기 분포에 대하여 분석하였다. (도 4E) MCF-10A 세포를 처리하지 않고 두거나 (다이아몬드), 및 지정된 시간 동안 5 μM MUC1/CQC (사각형) 또는 MUC1/AQA (삼각형)로 처리하였다. 생존 세포 수를 트리판 블루 배제에 의하여 결정하였다.
도 5A-C. MUC1 / CQC 펩티드는 ZR -75-1 유방 종양 이종이식물의 성장을 차단한다. (도 5A) 4 내지 6주령 암컷 Balb-c nu/nu 생쥐에 17-β-에스트라디올 플러그를 이식시켰다. 24 시간 후, ZR-75-1 유방 암 세포 (마트리겔에 함침됨)를 옆구리 (flank)에 피하 주사하였다. 종양이 ~150 mm³일 때, 상기 생쥐를 쌍을 지어(paired matched) 그룹으로 나누고 및 매일 21일 동안 PBS (비히클 대조군; 폐쇄된 사각형), 50 mg/kg MUC1/AQA 펩티드 (대조군 펩티드; 개방된 사각형) 또는 10 mg/kg MUC1/CQC 펩티드 (폐쇄된 삼각형)를 복막에 주사하였다. 다른 그룹을 매일 6일 동 50 mg/kg MUC1/CQC 펩티드로 처리하였다 (개방된 삼각형). 생쥐는 매주 2회 무게가 측정되었고 종양 측정은 매 4일마다 이루어졌다. (도 5B 및 5C). 24일째에 (별표), 대조군 그룹 및 50 mg/kg/d x 6d로 처리된 그룹으로부터 수집된 종양을 H&E (도 5B) 및 MUC1에 대한 항체로 염색하였다 (도 5C).
도 6A-B. ZR -75-1 종양에 대한 MUC1 / CQC 펩티드의 지속된 영향 ( prolonged effects). (도 6A) 생쥐를 도 5A에 범례에서 설명된 바와 같이 ZR-75-1 세포를 주사하였다. 종양이 ~275 mm³일 때, 상기 생쥐를 쌍을 지어 그룹으로 나누고, 매일 21일 동안 PBS (비히클 대조군; 개방된 사각형) 또는 30 mg/kg MUC1/CQC 펩티드 (폐쇄된 사각형)를 복막에 주사하였다. 상기 대조군 생쥐를 종양이 ~1200 mm³에 이르렀을 때 32일째에 희생시켰다. 상기 처리된 생쥐를 52일까지 모니터링하고 종양을 H&E 염색을 위하여 수집하였다(도 6B).
도 7. MUC1 7- 머(mer)는 전립선 암종을 저해한다. DU145 전립선 암종 세포를 5 μM CQC 짧은 펩티드 (7-mer) 또는 5 μM CQC 긴 펩티드 (15-mer)로 4일 동안 처리하였다. 세포 성장을 MTT 분석에 의하여 측정하였다. 데이터는 처리되지 않은 세포 (대조군)에 대한 퍼센트 성장 저해를 나타낸다.
도 8. MUC1 - CD 스타플드 ( stapled ) 펩티드의 서열.
도 9A. H1650 비소세포폐 암종 세포의 성장에 미치는 MUC1 - CD - 스타플드 펩티드의 영향. MUC1 기능의 저해에 대한 민감성을 평가하기 위하여, H1650 NSCLC 세포 를 7일 동안 1 및 5 μM MUC1 CQC 스타플드 펩티드 (GO-200-1B)로 처리하였다. 5 μM GO-200-1B로 H1650 세포의 처리는 현저한 성장의 저해 및 그에 따라 세포수의 감소와 연관되었다.
도 9B. 세포 증식에 미치는 GO -200-2B의 영향. H-1975 비소세포폐 암종 세포주를 10% 열-불활성화된 우태아혈청, 100 units/mL 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 및 2 mmol/L L-글루타민을 포함한 DMEM 중에 성장시켰다. 세포를 처리 하루 전에 재접종하였다(reseed). 세포를 5 μM GO-200-2B로 3일 동안 처리하고, 세포 생존성(cell viability)을 트리판 블루 배제에 의하여 결정하였다.
도 10. 호르몬-의존성 유방 암종 세포의 성장에 미치는 상이한 MUC1 - CD CQC -영역 펩티드의 영향. 상이한 MUC1-CD CQC-영역 함유 펩티드에의 노출이 성장에 영향을 주는지를 결정하기 위하여, ZR-75-1 유방 암종 세포를 5 μM의 상이한 펩티드로 4일 동안 처리하고 세포 증식을 모니터링하였다. 유의하게도, 처리되지 않은 세포에 비하여 실질적인 성장 저해가 있었다.
도 11. 비소세포 암종 세포의 성장에 미치는 상이한 MUC1 - CD CQC -영역 펩티드의 영향. A549 비소세포폐 암종 세포를 5 μM GO-203, GO-203-2 또는 GO-203cyc로 7일 동안 처리하였다. 7일째에 생존 세포 수를 트리판 블루 배제에 의하여 결정하고 퍼센트 성장 저해는 처리되지 않은 세포의 세포 성장과 비교하여 계산하였다.
도 12. H1975 비소세포 암종 세포의 성장에 미치는 상이한 MUC1 - CD CQC -영역 펩티드의 영향. H1975 비소세포폐 암종 세포를 상이한 MUC1-CD CQC-영역 펩티드 5μM로 6일 동안 처리하였다. 6일 째에 생존 세포 수를 트리판 블루 배제에 의하여 결정하였다. 결과는 5 μM의 상이한 펩티드로 H1975 세포를 처리하는 것은 현저한 성장의 저해와 연관된다는 것을 입증한다.
도 13. 삼중음성 ( triple negative ) 유방 암종 세포의 성장에 미치는 상이한 MUC1-CD CQC -영역 펩티드의 영향. MDA-MB-231 삼중 음성 유방 암종 세포를 5 μM의 상이한 MUC1-CD CQC-영역 펩티드로 6일 동안 처리하였다. 6일째에 생존 세포 수를 트리판 블루 배제에 의하여 결정하였다. 결과는 상이한 펩티드로 MDA-MB-231 세포를 처리하는 것은 현저한 성장의 저해와 연관된다는 것을 입증한다.
도 14. ZR -75-1 유방 암 세포의 증식에 미치는 더 짧은 ( shorter ) GO -203 펩티드의 영향. 인간 ZR-75-1 유방 암 세포를 10% 열-불활성화된 우태아혈청, 100 units/ml 페니실린, 100 mg/ml 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI1640에서 성장시켰다. 세포를 상이한 펩티드 5 μM로 매일 4일 동안 처리하고, 세포 생존성을 트리판 블루 배제에 의하여 결정하였다. GO-210과 대조적으로, ZR-75-1 유방 암종 세포를 5 μM GO-203 (서열번호 53), GO-207 (서열번호 4), GO-208 (서열번호 50) 및 GO-209 (서열번호 54)로 매일 4일 동안 처리하는 것은 현저한 성장의 저해와 연관되었다.
도 15A-D. 상이한 항-암 약물과 조합된 GO -203의 영향. ZR-75-1 세포를 지정된 농도의 시스플라틴 (도 15A), 독소루비신 (도 15B), rh-TNF-α (도 15C) 및 탁솔 (도 15D) 단독 및 GO-203과 조합된 것에 노출시켰다. 상기 처리는 세포를 시스플라틴, 독소루비신 및 탁솔에 72 시간 동안 노출시킨 후 5 μM의 GO-203으로 72시간 동안 노출시키는, 시스플라틴, 독소루비신 및 탁솔에 대하여 순차적이었다. rh-TNF에 의한 연구에서, 세포를 상이한 농도의 rh-TNF 단독 및 5 μM의 GO-203과 조합한 것에 72 시간 동안 수반하여 (concomitantly) 노출시켰다. MTS 분석을 이용하여 세포 생존 (cell survival)을 결정하였다.
도 16. GO -203은 항암제와 상가 ( additive ) 또는 상승적( synergistic )이다. 플롯은 상이한 효과 수준에 대한 조합 지수 (영향을 받는 분율 ((fraction affected))를 나타낸다. 상기 효과 수준은 세포를 항-암 약물 및 GO-203의 지정된 조합으로 처리함으로서 얻어졌다.

VI . 실시예

하기 실시예는 본 발명의 특정한 구체예를 나타내기 위하여 포함되어 있다. 본 발명자에 의하여 발견된 대표적 기술 (techniques)을 따르는 상기 실시예에 개시된 상기 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능할 것이며 그에 따라 그의 실시를 위한 특정한 방식(mode)을 구성하는 것으로 고려될 것이라는 것은 당업자에게 이해되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 발명의 개시의 관점에서, 많은 변화가 개시되어 있는 상기 특정한 구체예에서 이루어질 수 있으며, 본 발명의 정신과 범위로부터 벗어나지 않고 유사 또는 비슷한 결과를 얻을 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

실시예 1 - 재료 및 방법

세포 배양. 인간 유방 암 ZR-75-1, ZR-75-1/벡터, ZR-75-1/MUC1siRNA (Ren et al., 2004) 세포주를 10% 열-불활성화된 우태아혈청 (HI-FBS), 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 (Invitrogen)으로 보충된 RPMI1640 배지 중에서 37℃ 및 5% CO₂에서 가습된 인큐베이터에서 성장시켰다. 인간 MCF-7 유방 암 세포 및 293 세포를 10% HI-FBS, 항생제 및 2 mM L-글루타민으로 보충된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 성장시켰다. 인간 MCF-10A 유방 상피 세포를 유방 세포 성장 배지 (mammary epithelial cell growth medium: MEGM; Lonza)에서 성장시켰다. 세포를 MIT Biopolymer Laboratory, Cambridge, MA에 의하여 합성된 MUC1/CQC 또는 MUC1/AQA 펩티드로 처리하였다. 생존성은 트리판 블루 배제에 의하여 결정하였다.

면역침전 및 면역블롯 분석. 전체 세포 및 핵 용해물을 기술된 바와 같이 준비하였다 (Leng et al ., 2007). 가용성 단백질을 항-Flag를 사용하여 면역침전시켰다 (Sigma, St. Louis, MO). 면역침전물 및 가용성 단백질을 항-His (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), 항-GFP (Millipore, Danvers, MA), 항-Flag, 항-MUC1-C (Ab1; NeoMarkers, Fremont, CA), 항-라민 B (lamin B) (EMD, La Jolla, CA) 또는 항-β-액틴 (Sigma)을 사용한 면역블롯팅에 의하여 분석하였다. 반응성을 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 2차 항체 및 화학 발광에 의하여 검출하였다.

세포 트란스펙션 . 293 세포를 기술된 바와 같이 Lipofectamine의 존재하에서 GFP, GFP-MUC1-CD 또는 Flag-MUC1-CD를 발현하는 벡터로 트란스펙션시켰다 (Leng et al ., 2007).

펩티드 섭취( uptake ). 세포를 FITC-표지된 MUC1/CQC 펩티드 (MIT Biopolymer Laboratory)와 함께 인큐베이션하고, 찬 PBS로 세척하고, 1% 파라포름알데히드/PBS 중에 고정하고 유세포 흐름분석에 의하여 형광에 대하여 분석하였다.

세포주기 분포, 아포토시스 및 괴사의 분석. 세포를 수집하고, PBS로 세척하고, 80% 에탄올로 고정하고, 40 ㎍/ml RNAse 및 40 ㎍/ml 프로피디움 이오디드를 포함한 PBS 중에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포주기 분포는 유세포 흐름분석에 의하여 결정하였다. Sub-G1 DNA 함량은 에탄올-고정되고 시트레이트-버퍼 투과성화된(permeabilized) 세포를 프로피디움 이오디드로 염색하고 기술된 바와 같이 유세포 흐름분석 (Yin et al ., 2007)에 의하여 모니터링함으로써 평가하였다. 괴사의 평가를 위하여, 세포를 실온에서 5분 동안 1 ㎍/ml 프로피디움 이오디드/PBS와 인큐베이션한 후, 기술된 바와 같이 유세포 흐름분석에 의하여 모니터링하였다 (Yin et al ., 2007).

인간 유방 종양 이종이식물 모델. Balb-c nu/nu 암컷 생쥐 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), 4-6 주령 18-22g 무게에 17-β-에스트라디올 플러그 (0.72 mg; Innovative Research, Sarasota, FL)를 투관침 건(trocar gun)을 사용하여 피하 이식하였다. 24 시간 후, Matri-Gel에 함침된 1x10⁷ ZR-75-1 세포 (BD Biosciences)를 옆구리에 피하 주사하였다. 종양이 ~150 mm³ (Cohort 1) 또는 275 mm³ (Cohort 2)에서 검출가능할 때, 상기 생쥐를 쌍을 지어 처리군 그룹과 대조군 그룹으로 나누었다. 각 그룹은 5 생쥐를 포함하고, 생쥐 각각은 귀에 태그를 붙여 연구 내내 추적되었다. 초기 투여 (initial dosing)는 쌍 매칭(pair matching)의 시간 (1일)에 투여되었다. 인산-완충 염수 (phosphate-buffered saline: 비히클), MUC1/CQC 펩티드 및 MUC1/AQA 펩티드를 매일 복막 주사로 투여하였다. 생쥐는 매주 2회 무게가 측정되었고 종양 측정은 매 4일마다 캘리퍼스를 사용하여 수행되었다. 종양 부피 (V)는 식 V=W2xL/2를 사용하여 계산하고, 여기서 W 및 L은 각각 더 작은 및 더 큰 직경이다. 희생시, 심장 투여 (cardiac administration)에 의하여, 상기 생쥐를 염수로 관류시킨 후, 인산-완충 포르말린으로 관류시켰다. 종양을 잘라내고, 4시간 동안 침지 고정시키고, 등급된 계열(graded series)의 에탄올을 통하여 탈수시키고, 통상적 파라핀 함침 (embedding)을 위하여 처리하였다. 종양을 H&E 염색에 의하여 및 기술된 바와 같이 항-MUC1에 의한 면역퍼옥시다제 염색에 대하여 평가하였다 (Kufe, 1984).

약품 및 사이토카인. 시스디아민디클로로플라티눔 (II), 독소루비신 (아드리아마이신), 탁솔 (파클리탁셀)은 Promega (Madison, WI)로부터 구입하였다. GO-203 펩티드는 Anaspec Inc.에 의하여 합성되었다.

인 비트로 세포독성 및 조합 분석. 세포를 96-웰 평평한-바닥 마이크로타이터 플레이트 (Fisher) 중에 6-일 실험에 대하여 웰당 1000 세포 또는 3-일 실험에 대하여 웰당 3000 세포를 접종하였다. 다음으로, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 항-암 약물 및 GO-203을 지정된 농도로 희석하고 상기 세포에 첨가하였다. GO-203 (5 μmol/L)를 매 24 시간 마다 72 시간 동안 첨가하였다. 세포 생존성을 세포에 MTS 시약을 첨가하고 마이크로플레이트 리더에 의하여 490 nm에서 흡광도를 읽어 결정하였다.

데이터 분석. 모든 항-암 약물에 대한 IC₅₀ 값을 Graphpad Prism (GraphPad Software, San Diego CA)을 사용하여 비선형 회귀 분석에 의하여 결정하였다. CombiTool 컴퓨터 프로그램 (version 2.001, IMB Jena Biocomputing Group)을 사용하여 5 μmol/L GO-203의 존재하에서 용량 범위 내에서 조합 지수 (combination index)를 계산하였다.

실시예 2 - 결과

MUC1 / CQC 펩티드가 MUC1 올리고머 형성에 미치는 영향. MUC1 세포질 도메인 (MUC1-CD)은 올리고머의 형성 및 핵 국재화(nuclear localization)에 필요한 CQC 모티프를 포함한다 (Leng et al ., 2007). 작은 분자가 올리고머화를 차단하도록 설계될 수 있는지 결정하기 위하여, 발명자들은 CQC 모티프를 포함하는 MUC1-CD의 N-말단 영역으로부터 유래된 펩티드를 합성하였다 (MUC1/CQC 펩티드; 도 1A). 상기 펩티드의 세포 내로의 유입을 촉진하기 위하여 폴리-D-아르기닌 도입 도메인을 상기 합성물(synthesis)에 포함시켰다 (Fischer, 2007) (도 1A). 대조군으로서, CQC 모티프가 AQA로 변경된 비슷한 펩티드를 합성하였다 (MUC1/AQA 펩티드; 도 1A). 상기 펩티드가 MUC1-CD에 결합하는 것을 평가하기 위하여, 발명자들은 His-태그된 MUC1-CD를 BIAcore 센서 칩에 고정화시켰다. 상기 MUC1/CQC 펩티드는 30 nM의 해리상수 (Kd)로 His-MUC1-CD에 결합하였으며(도 1B), 이는 MUC1-CD 올리고머에 의하여 얻은 것과 비슷하다 (Leng et al., 2007). 대조적으로, MUC1/AQA 펩티드의 결합은 없었다 (데이터는 보이지 않음). 정제된 His-태그된 MUC1-CD는 폴리아크릴아미드 겔 중의 전기영동에 의하여 검출된 바와 같이 올리고머를 형성한다 (도 1C). His-MUC1-CD를 MUC1/CQC 펩티드와 인큐베이션하는 것은 올리고머 형성을 상당히 감소시켰고 단량체를 증가시켰다 (도 1C). 또한, MUC1/AQA 펩티드와 인큐베이션하는 것은 있다하더라도 거의 효과가 없었다 (little if any effect) (도 1C). 인 비보 MUC1 올리고머화에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 293 세포를 GFP-MUC1-CD 및 Flag-MUC1-CD를 발현하는 벡터로 트란스펙션시켰다 (도 1D, 좌측). GFP-MUC1-CD 및 Flag-MUC1-CD의 복합체가 펩티드에 노출되지 않은 세포로부터 얻은 용해물(lysate)의 공동침전에 의하여 검출되었다 (도 1D, 우측). 인 비트로 결과와 일치하게, 트란스펙션된 293 세포를 MUC1/CQC 펩티드와 인큐베이션하는 것은 Flag-MUC1-CD 및 GFP-MUC1-CD 사이의 상호작용의 파괴와 연관되었다 (도 1D, 우측). 더욱이, MUC1/AQA 펩티드는 어떠한 효과도 없었다 (도 1D, 우측). 이들 결과는 MUC1/CQC 펩티드가 MUC1-CD에 결합하고 인 비트로 및 세포 중에서 MUC1-CD 올리고머 형성을 차단한다는 것을 나타낸다.

MUC1 / CQC 펩티드는 MUC1 -C의 핵으로의 타켓팅을 차단한다. 인간 ZR-75-1 및 MCF-7 유방 암 세포는 내재적 MUC1를 과발현하고, 그에 따라 MUC1/CQC 펩티드의 영향을 평가하기 위한 잠재적 모델을 나타낸다 (Ramasamy et al ., 2007). 섭취를 평가하기 위하여, ZR-75-1 세포를 5 μM FITC-MUC1/CQC 펩티드와 함께 인큐베이션하였다 (도 2A). 2 시간에, 유세포 흐름분석에 의한 세포 분석결과는 평균형광강도 (MFI) 145로 실질적인 증가(substantial increase)를 보였다 (도 2A). MFI의 추가적인 증가는 6 시간 및 24 시간에 확인되었다 (도 2A). MUC1-C의 올리고머화는 그의 핵 유입 (nuclear import)에 필요하다 (Leng et al ., 2007). ZR-75-1 세포를 MUC1/CQC 또는 MUC1/AQA 펩티드로 처리하면 세포 MUC1-C 수준에는 영향을 미치지 않았다 (도 2B). 그러나, 올리고머화에 대한 영향과 일치하게, MUC1/CQC 펩티드로 처리하는 것은 핵 MUC1-C 수준의 감소와 연관되었으나, MUC1/AQA 펩티드로 처리하는 것은 연관되지 않았다 (도 2B). MUC1/CQC 펩티드의 처리에 반응하여 핵 MUC1-C 수준의 하향조절 (down-regulation)을 보여, 비슷한 효과가 MCF-7 세포에서 관찰되었다 (도 2C). 이들 발견은 MUC1/CQC 펩티드가 MUC1-C 올리고머화를 차단하고, 그에 따라 MUC1-C의 핵으로 타켓팅을 차단한다는 것을 나타낸다.

MUC1 / CQC 펩티드는 성장을 차단하고 괴사를 유발한다. MUC1/CQC 펩티드가 성장에 미치는 영향을 결정하기 위하여, ZR-75-1 세포를 5 μM MUC1/CQC로 72 시간 동안 처리하고, 세포주기 분포에 대하여 모니터링하였다. 유의하게도, 처리되지 않았거나 MUC1/AQA 펩티드로 처리된 세포의 G 기에 비하여 S 기의 실질적인 정지 (arrest)가 있었다 (도 3A). 96 시간까지, 잠재적으로는 세포 사망에 의한 소모를 통하여, S 기 집단이 감소하였다 (도 3A). sub-G1 DNA 함량을 가진 세포의 축적은 있다하더라도(little if any accumulation) 거의 없어, 아포토시스의 유발을 지지하였다 (도 3A). 그러나, ZR-75-1 세포를 MUC1/CQC로 처리하는 것은 72 시간 및 더 분명하게는 96 시간에 검출될 수 있는, 괴사의 유도와 연관되었으나, MUC1/AQA 펩티드의 처리는 연관되지 않았다 (도 3B). S 기 중의 성장의 정지 (도 3C) 및 괴사의 유도 (도 3D)를 보이는, MCF-7 세포는 MUC1/CQC 펩티드에 비슷하게 반응하였다. 이들 발견은 MUC1/CQC 펩티드가 인간 유방암 세포의 성장을 저해하고 괴사를 유도한다는 것을 나타낸다.

MUC1 / CQC 펩티드의 MUC1 발현 암종 세포에 대한 특이성. MUC1/CQC 펩티드가 내재적 MUC1을 과발현하는 유방 암종 세포에 대하여 선택적인 활성을 가지고 있는지를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 MUC1 발현이 MUC1siRNA에 의하여 안정적으로 침묵화된 ZR-75-1 세포를 처리하였다 (도 4A). 대조군 ZR-75-1/벡터 세포의 성장 정지 및 사멸과는 대조적으로, MUC1/CQC 펩티드는 ZR-75-1/MUC1siRNA 세포에 대하여 상당히 적은 영향을 미쳤다 (도 4B). 또한, MUC1/CQC 펩티드는 MUC1-음성 293 세포의 성장에는 영향을 미치지 않았다 (도 4C). MUC1를 발현하지만, ZR-75-1 및 MCF-7 세포에서 발견된 것보다 낮은 수준으로 발현하는(Ahmad et al ., 2007), MCF-10A 형질전환되지 않은 유방 상피세포주(non-transformed mammary epithelial cell line)에 대하여 또한 연구가 수행되었다 (Muthuswamy, 2001; Soule, 1990). 뚜렷하게도(notably), ZR-75-1 및 MCF-7 세포와는 대조적으로, MUC1/CQC 펩티드는 MCF-10A 세포주기 분포 (도 4D) 및 성장 (도 4E)에는 영향을 미치지 않았다. 이들 발견은 MUC1/CQC 펩티드는 내재적 MUC1을 과발현하는 유방 암종 세포에 대하여 선택적인 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.

MUC1 / CQC 펩티드는 인 비보에서 종양생성능( tumorigenicity )을 저해한다. MUC1/CQC 펩티드의 투여가 체중에 미치는 영향과 연관이 있는지를 결정하기 위하여, 다섯 암컷 누드 (nu/nu) 생쥐에 매일 한번 용량 50 mg/kg을 복막에 주사하였다 (IP). 11일에 걸쳐 상기 펩티드의 투여는 개별 생쥐의 체중에는 영향을 미치지 않았다. 또한, MUC1/CQC 투여 중단 후 28일에 걸쳐서도 체중에 대한 뒤이은 효과는 없었다 (데이터는 보이지 않음). 항-종양 활성을 평가하기 위하여, ZR-75-1 세포 (1x10⁷)를 누드 생쥐의 옆구리에 피하 이식하였다. 12일 후, 약 150 mm³의 종양을 갖는 생쥐를 용량 10 및 50 mg/kg/d로 MUC1/CQC 펩티드를 처리하였다. 대조군으로서, 생쥐를 비히클만 또는 MUC1/AQA 펩티드로 처리하였다. 10 mg/kg/d x 21 d의 MUC1/CQC 펩티드 투여는 50 mg/kg/d로 MUC1/AQA 펩티드에 의하여 얻어진 것에 비하여 성장이 느렸다 (도 5A). 또한, 50 mg/kg/d의 MUC1/CQC 펩티드 투여는 처리 초기 7일에 걸쳐 성장을 차단하였다 (도 5A). 그 결과, 처리를 중단하고, 상기 생쥐가 재성장하는지에 대하여 모니터링하였다. 유의하게도, 다음 17일에 걸쳐 상기 종양의 성장이 검출되지 않았다 (도 5A). 상기 활성에 대한 부분적 근거를 평가하기 위하여, 대조군 및 처리된 생쥐로부터 종양을 수집하고 조직병리에 의하여 검사하였다. MUC1/CQC (10 및 50 mg/kg) 처리된 생쥐 유래의 종양은 상기 비히클 또는 MUC1/AQA 펩티드로 처리된 생쥐 유래의 것에 비하여 현저하게 괴사가 많았다 (도 5B 및 데이터는 보이지 않음). 그러나, 뚜렷하게도, 종양 세포는 또한 괴사의 영역 주변에서 검출가능하였다 (도 5B). 상기 종양의 절편을 MUC1에 대한 항체로도 염색하였다. MUC1/AQA 펩티드로 처리하는 것은 대조군 종양에서 및 MUC1/AQA 펩티드로 처리된 종양에서의 발현에 비하여 MUC1 발현의 현저한 하향 조절과 연관되었다. (도 5C 및 데이터는 보이지 않음).

더 큰 종양(~275 mm³)에 대하여도 연구를 수행하였다 (도 6A). 중간 용량의 30 mg/kg/dx21d의 MUC1/CQC 펩티드 투여는 종양 성장의 정지와 연관되었다 (도 6A). 또한, 처리 후 다음 31일에 걸쳐 재성장이 없었고 (도 6A), 이는 다시 MUC1/CQC 펩티드가 종양 성장을 정지시키는데 효과적이라는 것을 나타낸다. 52일째에 수집된 종양은 광범위한 영역의 괴사 (도 6B) 및 MUC1 발현의 하향 조절을 보였다. 이들 발견은 MUC1/CQC 펩티드가 MUC1 발현을 하향조절하고 괴사의 유도 및 종양 성장의 지속된 정지(prolonged arrest)와 연관된다는 것을 나타낸다.

MUC1 -C-말단 CQC 스타플드 펩티드. 많은 생물학적 경로를 지배하는 세포내 단백질-단백질 상호작용은 단백질의 α-나선 (α-helix) 구조에 의하여 종종 매개된다. 나선 펩티드는 또한 단백질-단백질 상호작용을 간섭하거나 안정화시킬 수 있다. 천연 나선 펩티드는 낮은 강도, 불안정성 및 세포로의 효율적이지 않은 전달로 인한 치료제로서 주요한 단점을 가지고 있다. 최근 연구에 의하면, 이들 문제점들은 탄화수소 스타플링(hydrocarbon stapling)으로 명명된 α-나선 펩티드의 화학적 변형에 의하여 극복될 수 있다는 것을 밝혔다.

본 발명자들은 MUC1-C 말단 내재적 펩티드 서열 (AIVYLIALAVCQCRRKNYG)을 사용하고 탄화수소 스타플링을 이용하여 두 개의 α-나선 펩티드, GO-200-1B 및 GO-200-2B를 생성하였다:

GO-200-1B에의 노출에 의하여 비소세포폐 암종 세포의 성장이 영향을 받는지를 결정하기 위하여, H-1650 세포를 7일 동안 1 및 5 μM GO-200-1B로 처리하고 성장을 모니터링하였다. 상기 결과는 세포를 5 μM GO-200-1B로 처리하는 것은 현저한 성장의 저해와 연관된다는 것을 입증한다 (도 9A). 또한, 다른 비소세포폐 암종 세포주, H-1975를 3일 동안 5 μM GO-200-2B로 처리하고 세포 성장 및 세포 사멸을 모니터링하였다. 상기 결과는 H-1975 세포를 3일 동안 GO-200-2B로 처리하는 것은 세포 증식의 80%이상의 저해와 연관된다는 것을 입증한다. 더욱이, GO-200-2B는 또한 세포 사멸의 현저한 유도와도 연관되었다 (도 9B). 이들 발견은 스타플드 MUC1-C 펩티드는 인간 MUC1-양성 암 세포의 성장 정지 및 사멸 유도에 효과적이다는 것을 나타낸다.

GO -203 유사체( analogs ). 발명자들의 최근 연구는, MUC1 C-말단 펩티드 (CQCRRKNYGQLDIFP)는 복수의 (multiple) 암종 세포주의 성장을 저해하는데 활성적이다는 것을 밝혔다. 그들은 또한 더 짧은 MUC1-C-말단 펩티드, CQCRRKN이 종양 세포를 제거(kill)하는데 활성적이다는 것을 밝혔다. 그러나, 이들 MUC1-C-말단 펩티드는 L-아미노산으로 구성된다. 중요하게도, L-아미노산을 가진 펩티드는 단백질 분해 효소에 의한 분해에 민감한 반면, D-아미노산을 가진 것들은 더 안정하다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 그들은 L-아미노산이 D-아미노산으로 변화된, 상기 기술된 더 짧은 MUC1 C-말단 펩티드의 모두-덱스트로(all-dextro) 형을 생성하였다 (GO-203). 또한, 세포 제거 활성을 보유하는데 필요한 MUC1-C-말단 영역으로부터의 최소 아미노산 잔기를 결정하기 위하여, 도 8에 기술된 바와 같은 많은 상이한 버전의 GO-203를 또한 생성하였다. 복수의 종양 세포주 (ZR-75-1 호르몬-의존성 유방 암종; MDA-MB-231 삼중 음성 유방 암종; A549 비소세포폐 암종; H-1975 비소세포폐 암종)를 10% 열-불활성화된 우태아혈청, 100 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 2 mmol/L L-글루타민으로 보충된 RPMI-1640 중에서 성장시켰다. 세포를 개별적으로 5 μM의GO-203의 상이한 유사체로 3 내지 7일 동안 처리하고 (도 8), 생존성을 트리판 블루 배제에 의하여 결정하였다. 상이한 세포주의 증식은 비히클만으로 처리된 세포에 대비되었다. 결과는 복수의 종양 세포주를 5 μM의 GO-203의 상이한 유사체로 처리하는 것은 현저한 성장의 저해와 연관된다는 것을 입증한다 (도 10-14).

조합 치료. CombiTool program에 의하여 생성된 조합 지수 (combination index: CI) 값을 상기 약물 조합에 대하여 영향을 받은 분율에 대하여 플롯팅하였다. 상기 CI 값은 시스플라틴 및 GO-203에 대하여는 1에 가까웠으며, 이는 상가적 상호작용을 나타낸다. 독소루비신 (25, 50, 100, 200 nM), 탁솔 (25, 50, 100 nM) 및 TNF (10,20,40 ng/ml)와 GO-203에 대하여 얻어진 상기 CI 값은 1보다 작으며, 강한 상가 효과 또는 상승작용(synergism)을 뒷받침한다 (도 15A-D 및 16).

실시예 3 - 토의

MUC1 / CQC 펩티드는 MUC1 올리고머화를 차단한다. MUC1의 과발현은 부착-비의존성 성장 및 종양생성능의 유발에 대하여 충분하다 (Li et al ., 2003a; Huang et al., 2003; Huang et al ., 2005). 뚜렷하게도, 그러나, 상기 MUC1 형질전환 기능은 세포질 도메인 중의 CQC 모티프의 AQA로의 돌연변이에 의하여 제거되었다 (Leng et al ., 2007). MUC1은 올리고머를 형성하며, CQC 모티프는 이 올리고머화에 필요하다 (Leng et al ., 2007). 또한, 올리고머 형성은 MUC1-C 서브유니트의 핵으로의 타켓팅에 필수적이다 (Leng et al ., 2007). Wnt/β-카테닌 및 IKKβ->NF->kB 경로의 활성화와 같은, MUC1-C 서브유니트의 다른 기능은 또한 MUC1-C 올리고머의 형성에 의존적이다 (공개되지 않은 데이터). 이들 발견에 기초하여, 본 발명자들 작은 분자에 의한 MUC1 올리고머화의 파괴는 MUC1 형질전환 기능을 차단하기 위한 잠재력을 갖는다는 것을 설명하였다 (reason). 그러한 맥락에서, 그들은 CQC 모티프 및 세포내 유입을 위한 폴리-Arg 세포 전달 도메인을 포함하는 MUC1-유래 펩티드를 합성하였다. 이 MUC1/CQC 펩티드를 사용한 초기 연구는 그것이 인 비트로에서 MUC1-CD의 올리고머화를 저해한다는 것을 밝혔다. BIAcore 분석에 의하여 이전에 밝혀진 바와 같이, MUC1-CD은 해리상수 (Kd) 33 nM로 다이머를 형성한다 (Leng et al ., 2007). 상기 MUC1/CQC 펩티드는 비슷하게 Kd 30 nM로 MUC1-CD와 결합하였다. 또한, MUC1/AQA 펩티드는 있다 해도, 거의 MUC1 올리고머화에 영향을 미치지 않는다는 입증은 CQC 모티프에 대한 의존성에 대한 지지를 제공하였다. MUC1/CQC는 또한 세포 중에서 MUC1-CD 올리고머화를 차단하는데 효과적이었으나, MUC1/AQA는 그렇지 않았다. 따라서, 이들 발견은 상기 MUC1/CQC 펩티드가 MUC1 올리고머화를 파괴하는데, 잠재적으로 그에 따라 인간 유방 암종 세포 중에서 MUC1 기능을 파괴하는데 사용될 수 있다는 것을 나타내었다.

MUC1 / CQC 펩티드의 MUC1 를 과발현하는 암종 세포에 대한 선택성. 폴리-D-Arg과 같은 세포 전달 도메인, 및 그들의 접합체는 적어도 대부분, 세포내이입(endocytosis)에 의하여 세포내로 들어간 다음, 그들의 의도된 표적에 다다를 필요가 있다 (Fischer, 2007). MUC1/CQC 펩티드의 ZR-75-1 유방 암 세포로의 유입(entry)은 용이하게 검출될 수 있고 24 시간 이상 동안 지속된다. 유의하고도 올리고머화에 의존적인 MUC1의 핵 타켓팅과 일관되게 (Leng et al ., 2007), MUC1/CQC 펩티드의 섭취는 핵에서 MUC1-C 수준의 하향 조절과 연관되었다. 비슷한 결과는 MCF-7 유방 암 세포를 사용하여서도 얻어졌으며, 이는 MUC1/CQC 펩티드에 대한 이 반응이 세포 특이적이 않다는 것을 나타낸다. 더욱이 및 뚜렷하게, 이들 세포를 MUC1/CQC에 노출시키는 것은 성장 정지 및 괴사의 유도와 연관되었으나, MUC1/AQA는 그렇지 않았다. 중요한 것은 MUC1/CQC가 그의 의도된 표적의 발현에 의존적인 기작에 의하여 사멸을 유도하는지 또는 MUC1/CQC가 비특이적 세포독소인지이다. 그러한 맥락에서, ZR-75-1 세포 중의 MUC1를 침묵화시키는 것은 MUC1/CQC 세포독성 효과를 폐기시켰다. 대조적으로, 비악성 MCF-10A 유방 상피 세포를 MUC1/CQC 펩티드에 노출시키는 것은 거의 영향이 없었다. 이들 발견은 MUC1/CQC 펩티드에 대한 민감성은 MUC1의 과발현에 의존적이고 MUC1의 기능은 악성 표현형과 연관되어 있다는 것을 나타낸다. 따라서, MUC1/CQC 펩티드는 MUC1를 과발현하는 암종 세포에 선택적인 우성-음성 활성(dominant-negative activity)을 가진 것처럼 보인다.

MUC1 / CQC 펩티드의 항-종양 활성. 세포 전달 도메인은 치료적 카고(therapeutic cargos)를 전달하기 위하여 사용되고 있다 (Fischer, 2007). 그러나, 이들 약제 (agents)의 임의의 것과 마찬가지로, 우선적인 사안 (overriding issue)은 상기 MUC1/CQC 펩티드가, 항-종양 활성 및 허용가능한 독성 프로필인 효과적인 치료 지수 (effective therapeutic index)로 인 비보로 전달될 수 있는지이다. 이 사안을 해결하는데 있어서, 발명자들은 21일 동안 10 및 30 mg/kg/d의 상기 MUC1/CQC 펩티드의 투여가 외견상 급성 독성이 없이 잘 용인된다는 것을 발견하였다. 또한, 그들은 이들 용량의 처리가 종양 성장을 폐기시키는데 효과적이다는 것을 발견하였다. 이들 결과는 어떠한 항-종양 활성을 보이지 않은, 21일 동안 50 mg/kg/d의 MUC1/AQA 펩티드를 투여하는 것과 대조되었다. 더욱이 및 다소 놀랍게도, 21일 동안 30 mg/kg/d의 투여 (dosing) 후 종양 재성장에 대한 어떠한 증거도없었다. 7일 동안 50 mg/kg/d의 MUC1/CQC 펩티드의 투여는 또한 종양 성장이 처리 후 연장된 기간 동안 정지된 채로 유지된다는 것을 입증하였다. 이들 결과는 MUC1/CQC 펩티드에 의한 처리가 종양 괴사의 유도와 연관된다는 발견에 의하여 저어도 부분적으로 설명된다.

MUC1/CQC 7-머의 인 비트로 활성은 MUC1/CQC 15-머 만큼 강력하다. 이들 발견에 기초하여, 당업자가는 MUC1/CQC 7-머가 인 비보 종양 모델에서도 항-종양제로서 활성이 있을 것이라는 것을 예기할 것이다.

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본 명세서에 개시된 및 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본 개시의 관점에서 과도한 실험 없이 만들어질 수 있고 실행될 수 있다. 본 발명의 상기 조성물 및 방법은 바람직한 구체예의 관점에서 기술되었을지라도, 본 명세서에 기술된 상기 조성물 및/또는 방법 및 상기 방법의 단계들에 또는 상기 단계들의 순서에 (sequence) 본 발명의 개념, 정신 및 범위로부터 벗어남이 없이 변형이 적용될 수 있다는 것은 당업자에게 분명할 것이다. 더욱 구체적으로, 동일 또는 비슷한 결과가 달성되면서 화학적으로 및 생리학적으로 관련된 특정 약제(agent)가 본 명세서에 기술된 약제를 치환할 수 있다는 것은 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 그러한 비슷한 치환물 및 변형물은 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 정신, 범위 및 개념 내인 것으로 여겨질 것이다.

VII . 참조문헌

하기 참조문헌들은, 그들이 본 명세서에 개시된 것들에 보충적인 예시적인 과정 또는 다른 상세한 내용을 제공하는 정도까지, 원용에 의하여 본 명세서에 특이적으로 포함된다.

U.S. Patent 5,440,013

U.S. Patent 5,446,128

U.S. Patent 5,475,085

U.S. Patent 5,597,457

U.S. Patent 5,618,914

U.S. Patent 5,670,155

U.S. Patent 5,672,681

U.S. Patent 5,674,976

U.S. Patent 5,710,245

U.S. Patent 5,790,421

U.S. Patent 5,840,833

U.S. Patent 5,859,184

U.S. Patent 5,889,155

U.S. Patent 5,929,237

U.S. Patent 6,093,573

U.S. Patent 6,261,569

U.S. Patent Appln. 2005/0015232

Abe 및 Kufe, Cancer Res., 49(11):2834-2839, 1989.

Ahmad et al ., Nat . Cell Biol., 9:1419-1427, 2007.

Baldus et al ., Clin . Cancer Res., 10(8):2790-2796, 2004.

Bodanszky et al ., J. Antibiot ., 29(5):549-53, 1976.

Cohen et al ., J. Med . Chem., 33:883-894, 1990.

Culver et al ., Science, 256(5063):1550-1552, 1992.

Duraisamy et al ., Gene, 373:28-34, 2006.

Fischer, Med . Res . Rev ., 27(6):755-796, 2007.

Gendler et al ., J. Biol . Chem., 263:12820-2823, 1988.

Gronenborn et al ., Anal . Chem., 62(1):2-15, 1990.

Hodel et al ., Mol . Cell, 10(2):347-58, 2002.

Huang et al ., Cancer Biol Ther., 2:702-706, 2003.

Huang et al ., Cancer Res ., 65:10413-10422, 2005.

Jackson, Seminars in Oncology , 24:L164-172, 1997.

Johnson et al ., In: Biotechnology 및 Pharmacy, Pezzuto et al . (Eds.), Chapman 및 Hall, NY, 1993.

Jones et al ., J. Med . Chem., 39:904-917, 1996.

Kau et al ., Nat . Rev . Cancer, 4(2):106-17, 2004.

Kinlough et al ., J. Biol . Chem ., 279(51):53071-53077, 2004.

Kufe et al ., Hybridoma , 3:223-32, 1984.

Kufe, Cancer Biol . Therapy, 7:81-84, 2008.

Leng et al ., J. Biol . Chem., 282:19321-19330, 2007.

Levitan et al ., J. Biol . Chem ., 280:33374-3386, 2005.

Li et al ., Cancer Biol . Ther ., 2:187-193, 2003b.

Li et al ., J. Biol . Chem., 276:35239-35242, 2001.

Li et al ., J. Biol . Chem., 276:6061-6064, 2001.

Li et al ., Mol . Cancer Res ., 1:765-775, 2003c.

Li et al ., Mol . Cell Biol ., 18:7216-7224, 1998.

Li et al ., Oncogene, 22:6107-6110, 2003a.

Ligtenberg et al ., J. Biol . Chem., 267, 6171-177, 1992.

Macao, Nat . Struct . Mol . Biol ., 13, 71-6, 2006.

McPherson, J. Biol . Chem ., 251:6300-6306, 1976.

Merlo et al ., Cancer Res., 49, 6966-971, 1989.

Merrifield, J. Am . Chem . Soc ., 85:2149-2154, 1963.

Muthuswamy, Nat . Cell Biol ., 3(9):785-92, 2001.

Navia et al ., Curr . Opin . Struct . Biol ., 2:202-210, 1992.

PCT Appln. PCT/US00/03745

PCT Appln.PCT/US00/14667

PCT Appln.PCT/US99/11913

PCT Appln.PCT/US99/18441

펩티드 Synthesis, 1985

Percipalle et al ., J. Mol . Biol., (4):722-32, 1997.

Perey et al ., Cancer Res., 52(22):6365-6370, 1992.

Protective Groups in Organic Chemistry, 1973

Protein NMR Spectroscopy, Principles 및 Practice, J. Cavanagh et al ., Academic Press, San Diego, 1996.

Raina et al ., EMBO J., 25:3774-3783, 2006.

Raina et al ., J. Biol . Chem., 279:20607-20612, 2004.

Ramasamy et al ., Mol . Cell, 27:992-1004, 2007.

Remington's Pharmaceutical Sciences, 15^th Ed., 1035-1038 및 1570-1580, 1990.

Remington's Pharmaceutical Sciences, 15^th Ed., 3:624-652, 1990.

Ren et al ., Cancer Cell, 5:163-175, 2004.

Ren et al ., J. Biol . Chem., 277:17616-17622, 2002.

Ren et al ., Oncogene , 25:20-31, 2006.

Ryan 및 Wente, Curr . Opin . Cell Biol ., 12(3):361-71, 2000.

Schroeder et al ., J. Biol . Chem., 276(16):13057-13064 2001.

Schroeder et al ., Oncogene, 23:5739-747, 2004.

Siddiqui et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 85:2320-323, 1988.

Solid Phase Peptide Synthelia, 1984

Soule et al ., Cancer Res ., 50(18):6075-6086, 1990.

Suh 및 Gumbiner, Exp . Cell Res., 290(2):447-56, 2003.

Truscott et al ., J Cell Biol ., 163(4):707-713, 2003.

Vermeer et al ., Nature, 422(6929):322-6, 2003.

Weber, Advances Protein Chem ., 41:1-36, 1991.

Wei et al ., Cancer Cell, 7:167-178, 2005.

Weis, Cell, 112(4):441-51, 2003.

Wen et al ., J. Biol . Chem., 278:38029-8039, 2003.

Wider, BioTechniques, 29:1278-1294, 2000.

Yamamoto et al ., J. Biol . Chem., 272:12492-12494, 1997.

Yin et al ., J. Biol . Chem., 278:35458-35464, 2003b.

Yin et al ., J. Biol . Chem., 279:45721-45727, 2004.

Yin et al ., J. Biol . Chem ., 282:257-266, 2007.

Young et al ., Cell . 112(1):41-50, 2003.

SEQUENCE LISTING <110> DONALD, KUFE W. KHARBANDA, SURENDER <120> MUC-1 CYTOPLASMIC DOMAIN PEPTIDES AS INHIBITORS OF CANCER <130> GENU:022WO <140> UNKNOWN <141> 2009-10-16 <150> 61/177,109 <151> 2009-05-11 <150> 61/106,380 <151> 2008-10-17 <160> 62 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 72 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Cys Gln Cys Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala 1 5 10 15 Arg Asp Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His 20 25 30 Gly Arg Tyr Val Pro Pro Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys 35 40 45 Val Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala 50 55 60 Val Ala Ala Thr Ser Ala Asn Leu 65 70 <210> 2 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Gly Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile 1 5 10 15 Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala 20 25 30 Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val 35 40 45 Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val 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Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 1 5 10 15 Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 26 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 26 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15 Ala Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 27 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 27 Met Gly Leu Gly Leu His Leu Leu Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Gly 1 5 10 15 Ala Lys Ser Lys Arg Lys Val 20 <210> 28 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 28 Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 1 5 10 15 Ala Ala Ala Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu 20 25 <210> 29 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 29 Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp 1 5 10 15 Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro 20 25 <210> 30 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 30 Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn 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Leu Pro Pro Arg Ile Pro Pro 20 25 30 <210> 36 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 36 Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His 1 5 10 15 Arg Leu Leu Arg Lys 20 <210> 37 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 37 Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe 1 5 10 15 Val Gly Glu Ile Met Asn Ser 20 <210> 38 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 38 Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Gln Asn Ile Arg 1 5 10 15 Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln Ala 20 25 30 Thr Gln Ile Ala Lys 35 <210> 39 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 39 Ala Leu Trp Met Thr Leu Leu Lys Lys Val Leu Lys Ala Ala Ala Lys 1 5 10 15 Ala Ala Leu Asn Ala Val Leu Val Gly Ala Asn Ala 20 25 <210> 40 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 40 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln 20 25 <210> 41 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 41 Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 1 5 10 <210> 42 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 42 Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Pro Lys 1 5 10 15 Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Gly Gly Ser Gly Gly Gln 20 25 30 Glu <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 43 Leu Ala Lys Trp Ala Leu Lys Gln Gly Phe Ala Lys Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 44 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 44 Ser Met Ala Gln Asp Ile Ile Ser Thr Ile Gly Asp Leu Val Lys Trp 1 5 10 15 Ile Ile Gln Thr Val Asn Xaa Phe Thr Lys Lys 20 25 <210> 45 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic peptide <400> 45 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Claims (50)

1. 4 연속 MUC1 잔기 이상 및 20 연속 MUC1 잔기 이하이고 서열 CQC (서열번호 4)를 포함하는 MUC1 펩티드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 중의 MUC1-양성 종양 세포를 저해하는 방법으로서, CQC의 아미노-말단 시스테인은 천연 MUC-1 막통과 서열에 대응할 필요가 없는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의하여 그 NH₂-말단 상에서 덮혀진 것인 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 5, 6, 7 또는 8 연속 MUC1 잔기 이상을 포함하는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 MUC1의 10 연속 잔기, 11 연속 잔기, 12 연속 잔기, 13 연속 잔기, 14 연속 잔기, 15 연속 잔기, 16 연속 잔기, 17 연속 잔기, 18 연속 잔기 또는 19 연속 잔기 이하를 포함하는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 MUC1-양성 종양 세포는 암종 세포, 백혈병 세포 또는 골수종 세포인 것인 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 암종 세포는 전립선 또는 유방 암종 세포인 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 세포 전달 도메인에 융합된 것인 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 세포 전달 도메인은 폴리-D-R, 폴리-D-P 또는 폴리-D-K인 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 투여하는 단계는 정맥내, 동맥내, 종양내, 피하, 국소(topical) 또는 복막내 투여를 포함하는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 투여하는 단계는 국소(local), 영역(regional), 전신, 또는 연속(continual) 투여를 포함하는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 저해하는 단계는 상기 종양 세포의 성장 정지, 상기 종양 세포의 아포토시스 및/또는 상기 종양 세포를 포함하는 종양 조직의 괴사를 유발하는 것을 포함하는 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 개체에 제2 항암 요법을 투여하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 제2 항암 요법은 수술, 화학요법, 방사성요법, 호르몬 요법, 독소 요법, 면역치료 및 냉동치료인 것인 방법.
13. 제11항에 있어서, 상기 제2 항암 요법은 상기 펩티드 전에 투여되는 것인 방법.
14. 제11항에 있어서, 상기 제2 항암 요법은 상기 펩티드 후에 투여되는 것인 방법.
15. 제11항에 있어서, 상기 제2 항암 요법은 상기 펩티드와 동시에 투여되는 것인 방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 개체는 인간인 것인 방법.
17. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 0.1-500 mg/kg/d로 투여되는 것인 방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 10-100 mg/kg/d로 투여되는 것인 방법.
19. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 매일 투여되는 것인 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 펩티드는 7 일, 2 주, 3 주, 4 주, 1 개월, 6 주, 8 주, 2 개월, 12 주, 또는 3 개월 동안 매일 투여되는 것인 방법.
21. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 매주 투여되는 것인 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 펩티드는 2 주, 3 주, 4 주, 6 주, 8 주, 10 주, 또는 12 주 동안 매주 투여되는 것인 방법.
23. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 모두 L 아미노산을 포함하는 것인 방법.
24. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 모두 D 아미노산을 포함하는 것인 방법.
25. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 L 및 D 아미노산의 혼합(mix)을 포함하는 것인 방법.
26. 제1항에 있어서, 상기 펩티드를 투여하기 전에 상기 개체의 종양 세포 중의 MUC1의 발현을 평가하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
27. 제1항에 있어서, 상기 개체의 종양 세포 중의 MUC1의 발현에 대한 상기 펩티드의 영향을 평가하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
28. (a) 4 연속 MUC1 잔기 이상 및 20 연속 MUC1 잔기 이하이고 서열 CQC를 포함하는 MUC1 펩티드로서, CQC의 아미노-말단 시스테인은 천연 MUC-1 막통과 서열에 대응할 필요가 없는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의하여 그 NH2-말단 상에서 덮혀진 것인MUC1 펩티드, 및 (b) 약학적으로 허용가능한 담체, 버퍼 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
29. 제28항에 있어서, 상기 펩티드는 5, 6, 7 또는 8 연속 MUC1 잔기 이상인 것인 약학적 조성물.
30. 제28항에 있어서, MUC1의 10 연속 잔기, 11 연속 잔기, 12 연속 잔기, 13 연속 잔기, 14 연속 잔기, 15 연속 잔기, 16 연속 잔기, 17 연속 잔기, 18 연속 잔기 또는 19 연속 잔기 이하인 것인 약학적 조성물.
31. 제28항에 있어서, 상기 펩티드는 세포 전달 도메인 또는 세포 도입 도메인 (cell transduction domain)에 융합된 것인 약학적 조성물.
32. 제31항에 있어서, 상기 세포 도입 도메인은 HIV tat 세포 도입 도메인인 것인 약학적 조성물.
33. 제31항에 있어서, 상기 세포 전달 도메인은 폴리-D-R, 폴리-D-P 또는 폴리-D-K인 약학적 조성물.
34. 제28항에 있어서, 상기 펩티드는 길이가 8 잔기 이상이고, 그들의 측쇄를 통한 브릿지로부터 2이상의 비이웃 잔기인 것인 약학적 조성물.
35. 제34항에 있어서, 상기 브릿지는 링커, 화학적으로 변형된 측쇄, 또는 탄화수소 스타플링(stapling)을 포함하는 것인 약학적 조성물.
36. 제34항에 있어서, 상기 링커는 상기 펩티드의 알파-나선 구조를 안정화시키는 변형을 포함하는 것인 약학적 조성물.
37. 제28항에 있어서, 상기 버퍼는 β-머캅토에탄올, 글루타티온 또는 아스코르브산을 포함하는 것인 약학적 조성물.
38. MUC1-발현 세포를 4 연속 MUC1 잔기 이상 및 20 연속 MUC1 잔기 이하이고 서열 CQC를 포함하는 MUC1 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하고, CQC의 상기 아미노-말단 시스테인은 천연 MUC-1 막통과 서열에 대응할 필요가 없는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의하여 그 NH₂-말단 상에서 덮혀진 것인 세포 중의 MUC1-올리고머화 및 핵 이송(transport)을 저해하는 방법.
39. 제38항에 있어서, 상기 펩티드는 MUC1의 5, 6, 7 또는 8 연속 잔기 이상인 것인 방법.
40. 제38항에 있어서, MUC1의 10 연속 잔기, 11 연속 잔기, 12 연속 잔기, 13 연속 잔기, 14 연속 잔기, 15 연속 잔기, 16 연속 잔기, 17 연속 잔기, 18 연속 잔기 또는 19 연속 잔기 이하인 방법.
41. 제38항에 있어서, 상기 펩티드는 세포 전달 도메인에 융합된 것인 방법.
42. 제41항에 있어서, 상기 세포 전달 도메인은 폴리-D-R, 폴리-D-P 또는 폴리-D-K인 것인 방법.
43. 제43항에 있어서, 상기 MUC1-발현 세포는 종양 세포인 방법.
44. 제43항에 있어서, 상기 MUC1-양성 종양 세포는 암종 세포, 백혈병 세포 또는 골수종 세포인 방법.
45. 제44항에 있어서, 상기 암종 세포는 전립선 또는 유방 암종 세포인 방법.
46. 제43항에 있어서, 상기 종양 세포는 살아 있는 개체에 위치하는 것인 방법.
47. 제46항에 있어서, 상기 살아 있는 개체는 인간 개체인 것인 방법.
48. 4 연속 MUC1 잔기 이상 및 20 연속 MUC1 잔기 이하이고 서열 CQC를 포함하는 MUC1 펩티드의 구조 및 MUC-1 결합 능력을 모사하는 펩티드 모사체 (peptide mimetic)로서, CQC의 상기 아미노-말단 시스테인은 천연 MUC1 막통과 서열에 대응할 필요가 없는 하나 이상의 아미노산 잔기에 의하여 그 NH₂-말단 상에서 덮혀진 것인 펩티드 모사체.
49. 4 연속 MUC1 잔기 이상 및 20 연속 MUC1 잔기 이하이고 서열 CQC를 포함하는 MUC1 펩티드로서, 상기 펩티드의 모든 아미노산 잔기는 D-아미노산인 것인 MUC1 펩티드.
50. 제49항에 있어서, KRRCQC의 서열을 포함하는 것인 MUC1 펩티드.

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