ES2815498T3 - Señalización Wnt desregulada dirigida en cáncer utilizando alfa-hélices de BCL-9 estabilizadas - Google Patents

Abstract

Una composicion farmaceutica que comprende: i) un peptido estructuralmente restringido de un dominio HD2 de BCL9 (BCL9-HD2), que comprende al menos una argolla de hidrocarburo, o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en donde la argolla de hidrocarburo se posiciona para unir un primer aminoacido BCL9-HD2 seleccionado del grupo que consiste en Leu-351, Ser-352, Gln- 353, Glu-354, Gln-355, Glu-357, His-358, Arg-359, Arg-361, Ser-362, Leu-363, Thr-365, Leu-366, Ile-369, Gln-370, Met-372, Nle-372, Leu-373 y Phe-374 con un segundo aminoacido BCL9-HD2 seleccionado del grupo que consiste en Leu-351, Ser -352, Gln-353, Glu-354, Gln-355, Leu-356, Glu-357, His-358, Arg-359, Glu-360, Arg-361, Ser-362, Leu-363, Gln-364 , Thr-365, Leu-366, Arg-367, Asp-368, Ile-369, Gln-370, Arg-371, Met-372, Nle-372, Leu-373 y Phe-374, en donde el peptido comprende una cara interactiva compuesta de aminoacidos que interactua con β- catenina, en donde la cara interactiva comprende los residuos BCL9 Gln-355, His-358, Arg-359, Ser-362, Leu-363, Leu-366, Ile-369, Gln -370, Leu- 373 y Phe-374 ii) uno o mas agentes terapeuticos adicionales para la prevencion y/o el tratamiento del cancer, y iii) portador, adyuvante o vehiculo farmaceutico.

Description

DESCRIPCIÓN

Señalización Wnt desregulada dirigida en cáncer utilizando alfa-hélices de BCL-9 estabilizadas

Antecedentes

La ruta Wnt canónica regula el nivel constitutivo y la localización intracelular de p-catenina, un componente clave de una red de transducción de señal mediada por receptor estrechamente regulada, requerida tanto para el desarrollo embrionario como para la homeostasis del tejido adulto. En las células normales no estimuladas, la p-catenina se une a la poliposis adenomatosa coli (APC), la glucógeno sintasa quinasa 3p (GSK3p) y la axina, las cuales forman un complejo de destrucción que fosforila la p-catenina, dirigiéndose a la degradación proteosómica. La unión de los ligandos Wnt a los receptores de lipoproteínas de baja densidad (LRP5 y LRP6) inhibe la actividad del complejo GSK3p/APC/Axina, permitiendo que la p-catenina no fosforilada experimente una translocación nuclear para ejercer sus efectos de transcripción. La p-catenina nuclear se asocia con la familia de factores de transcripción del factor potenciador linfoide/factor de células T (LEF/TCF) para inducir la expresión de genes de proliferación celular, migración y supervivencia, tales como c-Myc y ciclina D1. Normalmente, esta vía de transcripción se desactiva cuando los ligandos Wnt se desacoplan de sus receptores. Sin embargo, una variedad de mutaciones de pérdida de función en APC y Axina, y la activación de mutaciones en la p-catenina misma, permiten que la p-catenina escape del complejo de destrucción, persista en el núcleo y conduzca la transcripción oncogénica.

En Drosophila melanogaster, la actividad de transcripción de la p-catenina depende además de dos cofactores, BCL9 y Pygopus. La formación de un complejo cuaternario que consiste en TCF, p-catenina, BCL9 y Pygopus aumenta la actividad de transcripción de Wnt dependiente de p-catenina. El gen BCL9 humano se identificó por primera vez clonando la translocación t (1;14) (q21;q32) de un paciente con leucemia linfoblástica aguda (LLA) precursora de células B. Las amplificaciones del locus del cromosoma 1q21 en donde reside el gen BCL9 se observa en una amplia gama de tipos de cáncer humano y se ha asociado con la progresión tumoral, la disminución de la supervivencia y el mal resultado clínico. Más recientemente, la mutagénesis de inserción por el transposón PiggyBac ha identificado un éxito en BCL9. Mientras que en el cáncer colorrectal (CCR), las mutaciones establecidas en APC y p-catenina impulsan el fenotipo oncogénico, en el mieloma múltiple (MM) no se han reportado tales mutaciones y la activación de Wnt es impulsada por BCL9, lo que implica este cofactor de p-catenina como un oncogén bona fide. La sobreexpresión de BCL9 se ha identificado desde entonces en un gran subgrupo de tumores humanos, pero no se expresa en las contrapartes celulares normales de las que se originan los tumores. La mejora mediada por BCL9 de la actividad de transcripción de la p-catenina aumenta la proliferación celular, la migración, la invasión y el potencial metastásico de las células tumorales al promover la pérdida de un fenotipo epitelial y la ganancia de una funcionalidad similar al mesénquima. La regulación a la baja inducida por shARN de BCL9 in vivo suprime la expresión de dianas Wnt c-Myc, ciclina D1, CD44 y VEGF, y en consecuencia aumenta la supervivencia de ratones xenoinjerto con CCR y MM al reducir la carga tumoral, la metástasis y la respuesta de angiogénesis del huésped. La sorprendente dependencia de BCL9 de estos cánceres y la expresión de BCL9 en ~30% de los tumores epiteliales proporciona una razón convincente para abordar la interacción de la proteína BCL9/p-catenina. Es importante destacar que los ratones nulos Bcl9 carecen de un fenotipo de enfermedad evidente, lo que sugiere que el bloqueo farmacológico del complejo BCL9/p-catenina puede ser relativamente no tóxico.

La ruta Wnt consiste en un sistema de transducción de señal mediada por receptor estrechamente regulado requerido tanto para el desarrollo embrionario como para la homeostasis del tejido adulto en vertebrados e invertebrados e involucra rutas Wnt canónicas y no canónicas. Se ha demostrado que varios componentes de la cascada de señalización Wnt canónica funcionan como genes supresores de tumores (TSG) o como oncogenes en una amplia gama de cánceres humanos comunes que incluyen carcinomas colorrectales, hepatocelulares, de mama, endometriales y MM. Además, la ruta Wnt canónica se ha implicado en la regulación de los procesos normales (por ejemplo, cicatrización de heridas) y patológicos (por ejemplo, diabetes). Estas observaciones subrayan la relevancia de esta vía para la oncogénesis y la necesidad de una mayor investigación de los componentes de señalización de Wnt como objetivos potenciales para la terapia del cáncer, la curación de heridas, la angiogénesis y la diabetes.

Kawamoto "Targeting the BCL9/B9L binding interaction with betacatenin as a potential anticancer strategy", PH.D. TESIS; UNIVERSITY OF MICHIGAN; 2010, páginas 20-22, 43-46, 53-56, 71-72, XP008170299 describe la síntesis de péptidos BCL9 a-helicoidales estabilizados permeables a las células.

Es un objeto de la invención diseñar y generar péptidos argollados con hidrocarburos del dominio HD2 de BCL9 (ahélices argolladas de BCL9 o SAH-BCL9) para bloquear la señalización de Wnt. También es un objeto demostrar que la unión directa de péptidos a-helicoidales estabilizados a p-catenina previene la interacción p-catenina/BCL9, la actividad de transcripción de Wnt y la expresión de dianas corriente abajo. Dichos mecanismos darían como resultado un método de tratamiento de células cancerosas con SAH-BCL9 y darían lugar a la inhibición de la proliferación, migración, angiogénesis inducida por tumores, carga tumoral, desdiferenciación (transición epitelialmesenquimal [EMT]) y metástasis en cánceres provocados por Wnt/p-catenina.

Resumen de la invención

La invención se refiere a péptidos a-helicoidales BCL9 estructuralmente restringidos, resistentes a proteasas y permeables en células, y a métodos de uso de esos péptidos como agentes terapéuticos y profilácticos. Dichos péptidos estructuralmente restringidos muestran una excelente estabilidad proteolítica, ácida y térmica, y poseen propiedades farmacocinéticas superiores en comparación con los péptidos no modificados correspondientes. Los péptidos de la invención se estabilizan con al menos una argolla de hidrocarburos, pero podrían incluir dos, tres o más argollas de hidrocarburos. La inclusión de múltiples argollas de hidrocarburos es particularmente adecuada para péptidos alfa-helicoidales que tienen 20 o más aminoácidos de longitud. Las argollas de hidrocarburos permiten que los residuos de aminoácidos en una cara en interacción se orienten adecuadamente debido a la estabilización de la estructura helicoidal del dominio BCL9 HD2.

En un aspecto, la invención proporciona un péptido estructuralmente restringido de un dominio HD2 de BCL9 (BCL9-HD2), que comprende al menos una argolla o enlace de hidrocarburo.

En la invención, el péptido comprende una cara que interactúa compuesta de aminoácidos que interactúa con la pcatenina.

Más específicamente, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende:

(i) un péptido estructuralmente restringido de un dominio HD2 de BCL9 (BCL9-HD2), que comprende al menos una argolla de hidrocarburo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la argolla de hidrocarburo se posiciona para unir un primer aminoácido BCL9-HD2 seleccionado del grupo formado por Leu-351, Ser 352, Gln-353, Glu-354, Gln-355, Glu-357, His-358, Arg-359, Arg-361, Ser-362, Leu-363, Thr-365, Leu-366, Ile-369, Gln-370, Met-372, Nle-372, Leu-373 y Phe-374 con un segundo aminoácido BCL9 HD2 seleccionado del grupo que consiste en Leu-351, Ser-352 , Gln-353, Glu 354, Gln-355, Leu-356, Glu-357, His-358, Arg-359, Glu-360, Arg-361, Ser-362, Leu-363, Gln-364, Thr-365, Leu-366, Arg-367, Asp-368, Ile-369, Gln-370, Arg-371, Met-372, Nle-372, Leu-373 y Phe-374, en donde el péptido comprende una cara de interacción compuesta de aminoácidos que interactúa con pcateína, en donde la cara que interactúa comprende los residuos BCL9 Gln-355, His-358, Arg-359, Ser-362, Leu-363, Leu-366, Ile-369, Gln-370, Leu-373 y Phe-374

(ii) uno o más agentes terapéuticos adicionales para la prevención y/o el tratamiento del cáncer, y

iii) un portador, adyuvante o vehículo farmacéutico.

La presente invención también proporciona la composición farmacéutica de la invención para usar en un método para tratar una enfermedad o trastorno mediado por la unión de BCL9/p-catenina en un sujeto, que comprende administrar al sujeto la composición farmacéutica de la invención.

La presente invención también proporciona un péptido estructuralmente restringido de un dominio HD2 de BCL9 (BCL9-HD2), que comprende al menos una argolla de hidrocarburo, en donde la argolla de hidrocarburo está posicionada para unir un primer aminoácido BCL9-HD2 seleccionado del grupo formado por Leu-351, Ser-352, Gln-353, Glu-354, Gln-355, Glu-357, His-358, Arg-359, Arg-361, Ser-362, Leu-363, Thr-365, Leu-366, Ile-369, Gln-370, Met-372, Nle-372, Leu-373 y Phe-374 con un segundo aminoácido BCL9 HD2 seleccionado del grupo que consiste en Leu-351, Ser-352 , Gln-353, Glu-354, Gln-355, Leu-356, Glu-357, His-358, Arg-359, Glu-360, Arg-361, Ser-362, Leu-363, Gln-364, Thr-365, Leu-366, Arg-367, Asp-368, Ile-369, Gln-370, Arg-371, Met-372, Nle-372, Leu-373 y Phe-374, en donde el péptido comprende una cara de interacción compuesta de aminoácidos que interactúa con pcatenina, en donde la cara que interactúa comprende los residuos BCL9 Gln-355, His-358, Arg-359, Ser-362, Leu-363, Leu-366, Ile-369, Gln-370, Leu-373, y Phe-374, para usar en un método para tratar una enfermedad o trastorno mediado por la unión de BCL9/p-catenina en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto dicho péptido estructuralmente restringido y un agente terapéutico, radiación o quimioterapia adicional.

En un ejemplo de la divulgación, la cara que interactúa comprende aproximadamente 3 a aproximadamente 20 aminoácidos.

En ciertos ejemplos de la divulgación, la cara que interactúa comprende 4-15 aminoácidos.

En diversas realizaciones, la cara que interactúa comprende 40% o más de identidad con una cara helicoidal de BCL9-HD2 que se une a p-catenina, en donde la cara que interactúa comprende residuos BCL9 Gln-355, His-358, Arg-359, Ser -362, Leu-363, Leu-366, Ile-369, Gln-370, Leu-373 y Phe-374, o, en la descripción, sustituciones conservadoras de los mismos.

En otras realizaciones más, la cara que interactúa comprende del 50% al 90% de identidad con la cara helicoidal de BCL9-HD2 que se une a la p-catenina, en donde la cara que interactúa comprende los residuos BCL9 Gln-355, His-358, Arg-359, Ser-362, Leu-363, Leu-366, Ile-369, Gln-370, Leu-373 y Phe-374, o, en la divulgación, sustituciones conservadoras de los mismos.

En una realización, la cara que interactúa representa una cara única de una hélice a.

En diversas realizaciones, la cara única de una hélice comprende una, dos, tres o cuatro columnas de aminoácidos apiladas adyacentes, en donde las columnas de aminoácidos apiladas están definidas por las posiciones a, d y g; posiciones b y e ; o posiciones c y f; en una alfa-hélice que tiene 3.6 aminoácidos por vuelta en donde los aminoácidos tienen posiciones consecutivas y en serie asignadas a-g; y posiciones a y d; posiciones b y e; o las posiciones c y f en una hélice 310 que tiene 3 aminoácidos por vuelta en donde los aminoácidos están asignados consecutivamente y en serie a las posiciones a-f; u homólogos de los mismos.

También se proporciona en el presente documento un péptido estructuralmente restringido que consiste en: entre aproximadamente 20% a 100% de homología de secuencia con los aminoácidos 351 a 374 de BCL9-HD2, SEQ ID NO: 1 (LSQEQLEHRERSLQTLRDIQRMLF),

en donde el péptido comprende entre uno y cinco argollas de hidrocarburos.

En otras realizaciones, la invención proporciona un péptido estructuralmente restringido que consiste en: entre aproximadamente 50% a 100% de homología de secuencia con los aminoácidos 351 a 374 de BCL9-HD2, SEQ ID NO: 1 (LSQEQLEHRERSLQTLRDIQRMLF),

en donde el péptido comprende entre una y cinco argollas de hidrocarburos

Una argolla o enlace de hidrocarburo puede estar entre uno o más aminoácidos naturales o no naturales.

Se puede formar una argolla o enlace de hidrocarburo mediante una reacción de metátesis de olefina.

Los aminoácidos no naturales pueden seleccionarse entre los siguientes:

En diversas realizaciones, el péptido estructuralmente restringido comprende de 1 a 5 argollas o enlaces dentro del péptido BCL9 HD2.

En otras realizaciones, una argolla o enlace se encuentra en las siguientes posiciones dentro del péptido BCL9 HD2: a) i, i+4; b) i, i+7; y c) i, i+3.

En ciertas realizaciones, otra argolla o enlace se encuentra en las siguientes posiciones dentro del péptido BCL9 HD2: a) i, i+4; b) i, i+7; y c) i, i+3.

En diversas realizaciones, cualquier otra argolla o enlace se encuentra en las siguientes posiciones dentro del péptido BCL9 HD2: a) i, i+4; b) i, i+7; y c) i, i+3.

La invención y esta divulgación proporcionan un péptido estructuralmente restringido, en donde una argolla de hidrocarburo se encuentra en las siguientes posiciones de ejemplo dentro del péptido BCL9 HD2, y se itera mediante escaneo de argollas:

LSQEQLEHRERSLQTLRDIQRBLF 374 dominio BCL9-HD2 i , .l 4 argollas individuales:

XSQEXLEHRERSLQTLRDIQRBLF

LXQEQXEHRERSLQTLRDIQRBLF

LSXEQLXHRERSLQTLRDIQRBLF

LSQXQLEXRERSLQTLRDIQRBLF

LSQEXLEHXERSLQTLRDIQRBLF

LSQEQXEHRXRSLQTLRDIQRBLF

LSQEQLXHREXSLQTLRDIQRBLF

LSQEQLEXRERXLQTLRDIQRBLF

LSQEQLEHXERSXQTLRDIQRBLF

LSQEQLEHRXRSLXTLRDIQRBLF

LSQEQLEHREXSLQXLRDIQRBLF

LSQEQLEHRERXLQTXRDIQRBLF

LSQEQLEHRERSXQTLXDIQRBLF

LSQEQLEHRERSLXTLRXIQRBLF

LSQEQLEHRERSLQXLRDXQRBLF

LSQEQLEHRERSLQTXRDIXRBLF

LSQEQLEHRERSLQTLXDIQXBLF

LSQEQLEHRERSLQTLRXIQRXLF

LSQEQLEHRERSLQTLRDXQRBXF

LSQEQLEHRERSLQTLRDIXRBLX

ⁱ, ^{^ 7 argollas:}

XSQEQLEXRERSLQTLRDIQRBLF

LXQEQLEHXERSLQTLRDIQRBLF

LSXEQLEHRXRSLQTLRDIQRBLF

LSQXQLEHREXSLQTLRDIQRBLF

LSQEXLEHRERXLQTLRDIQRBLF

LSQEQXEHRERSXQTLRDIQRBLF LSQEQLXHRERSLXTLRDIQRBLF LSQEQLEXRERSLQXLRDIQRBLF LSQEQLEHXERSLQTXRDIQRBLF LSQEQLEHRXRSLQTLXDIQRBLF LSQEQLEHREXSLQTLRXIQRBLF LSQEQLEHRERXLQTLRDXQRBLF LSQEQLEHRERSXQTLRDIXRBLF LSQEQLEHRERSLXTLRDIQXBLF LSQEQLEHRERSLQXLRDIQRXLF LSQEQLEHRERSLQTXRDIQRBXF LSQEQLEHRERSLQTLXDIQRBLX

i , i+3 argollas individuales: XSQXQLEHRERSLQTLRDIQRBLF LXQEXLEHRERS LQTLRDIQRBLF LSXEQXEHRERSLQTLRDIQRBLF LSQEXLEXRERSLQTLRDIQRBLF LSQEQXEHXERSLQTLRDIQRBLF LSQEQLXHRXRSLQTLRDIQRBLF LSQEQLEXREXSLQTLRDIQRBLF LSQEQLEHXERXLQTLRDIQRBLF LSQEQLEHRXRSXQTLRDIQRBLF LSQEQLEHREXSLXTLRDIQRBLF LSQEQLEHRERXLQXLRDIQRBLF LSQEQLEHRERSXQTXP,DI QRBLF LSQEQLEHRERSLXTLXDIQRBLF LSQEQLEHRERSLQXLRXIQRBLF LSQEQLEHRERSLQTXRDXQRBLF LSQEQLEHRERSLQTLXDIXRBLF LSQEQLEHRERSLQTLRXLQXBLF

LSQEQLEHRERSLQTLRDXQRXLF

LSQEQLEHRERSLQTLRDIXRBXF

LSQEQLEHRERSLQTLRDIQXBLX.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona un péptido estructuralmente restringido, en donde dos argollas de hidrocarburos se ubican en las siguientes posiciones de ejemplo dentro del péptido BCL9 HD2, y se iteran mediante escaneo de argollas:

351 LSQEQLEHRERSLQTLRDIQRBLF 374 dominioBCL9-HD2

i, ¹ + ³ argollas dobles:

XSQXQLEHRERSLQTLRDIQXBLX

XSQXQLEHRERSLQTLRDIXRBXF

XSQXQLEHRERSLQTLRDXQRBXF

i , 1 4 argollas dobles:

XSQEXLEHRERSLQTLRDIXRBLX

XSQEXLEHRERSLQTLRDXQRBXF

XSQEXLEHRERSLQTLXDIQRXLF

i , 1 7 argollas dobles:

XSQEQLEXRERSLQTLXDIQRBLX

XSQEQLEXRERSLQTXRDIQRBXF

XSQEQLEXRERSLQXLRDIQRXLF.

La invención y esta divulgación proporcionan un péptido estructuralmente restringido, en donde la una o más argollas o enlaces de hidrocarburos se ubican en cualquiera de las siguientes posiciones de ejemplo dentro del dominio BCL9 HD9 y se iteran mediante escaneo de argollas:

^{351 LSQEQLEHRERSLQTLRDIQRBLF 374} dominio ^BCL9-HD2

Mezcla ^{i, i+4; i, i+3; e i, i+7} argollas dobles:

XSQEXLEHRERSLQTLXDIQRBLX

XSQEXLEHRERSLQTXRDIQRBXF

XSQEXLEHRERSLQXLRDIQRXLF

XSQEXLEHRERSLQTLRDIQXBLX

XSQEXLEHRERSLQTLRDIXRBXF XSQEXLEHRERSLQTLRDXQRXLF XSQEQLEXRERSLQTLRDIXRBLX XSQEQLEXRERSLQTLRDXQRBXF XSQEQLEXRERSLQTLRXIQRXLF XSQEQLEXRERSLQTLRDIQXBLX XSQEQLEXRERSLQTLRDIXRBXF XSQEQLEXRERSLQTLRDXQRXLF XSQXQLEHRERSLQTLRDIXRBLX XSQXQLEHRERSLQTLRDXQRBXF XSQXQLEHRERSLQTLRXIQRXLF XSQXQLEHRERSLQTLXDIQRBLX XSQXQLEHRERSLQTXRDIQRBXF XSQXQLEHRERSLQXLRDIQRXLF

Secuencial i , l 4 argollas: XSQEXLEHXERSLQTLRDIQRBLF LXQEQXEHRXRSLQTLRDIQRBLF LSXEQLXHREXSLQTLRDIQRBLF LSQXQLEXRERXLQTLRDIQRBLF LSQEXLEHXERSXQT LRDIQRBLF LSQEQXEHRXRSLXTLRDIQRBLF LSQEQLXHREXSLQXLRDIQRBLF LSQEQLEXF.ERXLQTXRDIQRBLF LSQEQLEHXERSXQTLXDIQRBLF LSQEQLEHF.XRSLXTLRX IQRBLF LSQEQLEHREXSLQXLRDXQRBLF LSQEQLEHRERXLQTXRDIXRBLF LSQEQLEHRERSXQTLXDIQXBLF LSQEQLEHRERSLXTLRXIQRXLF

LSQEQLEHRERSLQXLRDXQRBXF

LSQEQLEHRERSLQTXRDIXRBLX

Secuencial j f r 3 argollas:

XSQXQLXHRERSLQTLRDIQRBLF

Sequential i, i+7 Staples:

XSQEQLEXRERSLQXLRDIQRBLF

grapas secuenciales mixtas:

XSQXQLEXRERSLQTLRDIQRBLF

XSQXQLEHREXSLQTLRDIQRBLF

XSQEXLEXRERSLQTLRDIQRBLF

XSQEXLEHRERXLQTLRDIQRBLF

XSQEQLEXREXSLQTLRDIQRBLF

XSQEQLEXRERXLQTLRDIQRBLF.

En diversas realizaciones, la invención proporciona un péptido estructuralmente restringido, que comprende además de una a cuatro argollas de hidrocarburos adicionales.

En otras realizaciones, la invención proporciona un péptido estructuralmente restringido, en donde las argollas de hidrocarburos adicionales se ubican en cualquiera de las siguientes posiciones de ejemplo dentro del dominio BCL9 HD2 y se iteran mediante escaneo de argollas:

351 LSQEQLEHRERSLQTLRDIQRBLF 374 dominio BCL9-HD2

if ¿ 4 argollasindividuales:

XSQEXLEHRERSLQILRDIQRBLF

LXQEQXEHRERSLQTLRDIQRBLF

LSXEQLXHRERSLQTLRDIQRBLF

LSQXQLEXRERSLQTLRDIQRBLF

LSQEXLEEXERSLQTLRDIQRBLF

LSQEQXEHRXRSLQTLRDIQRBLF

LSQEQLXHREXSLQTLRDIQRBLF

LSQEQLEXRERXLQTLRDIQRBLF

LSQEQLEHXERSXQTLRDIQRBLF LSQEQLEHRXRSLXTLRDIQRBLF LSQEQLEHREXSLQXLRDIQRBLF LSQEQLEHRERXLQTXRDIQRBLF LSQEQLEHRERSXQTLXDIQRBLF LSQEQLEHRERSLXTLRXIQRBLF LSQEQLEHRERSLQXLRDXQRBLF LSQEQLEHRERSLQTXRDIXRBLF LSQEQLEHRERSLQTLXDIQXBLF LSQEQLEHRERSLQTLRXIQRXLF LSQEQLEHRERSLQTLRDXQRBXF LSQEQLEHRERSLQTLRDIXRBLX

i , i+ 7 argollas:

XSQEQLEXRERSLQTLRDIQRBLF LXQEQLEHXER.SLQTLRDIQRBLF LSXEQLEHRXRSLQLLRDIQRBLF LSQXQLEHREXSLQTLRDIQRBLF LSQEXLEHRERXLQTLRDIQRBLF LSQEQXEHRERSXQFLRDIQRBLF LSQEQLXHRERSLXTLRDIQRBLF LSQEQLEXRERSLQXLRDIQRBLF LSQEQLEHXERSLQTXRDIQRBLF LSQEQLEHRXRSLQLLXDIQRBLF LSQEQLEHREXSLQTLRXIQRBLF LSQEQLEHRERXLQTLRDXQRBLF LSQEQLEHRERSXQFLRDIXRBLF LSQEQLEHRERSLXTLRDIQXBLF LSQEQLEHRERSLQXLRDIQRXLF LSQEQLEHRERSLQTXRDIQRBXF LSQEQLEHRERSLQTLXDIQRBLX i, i+3 single argollas: XSQXQLEHRERSLQTLRDIQRBLF LXQEXLEHRERS DQTDRDIQRBLF LSXEQXEHRERSLQTLRDIQRBLF LSQEXLEXRERSLQILRDIQRBLF LSQEQXEHXERSLQTLRDIQRBLF LSQEQLXHRXRSLQTLRDIQRBLF LSQEQLEXREXSLQTLRDIQRBLF LSQEQLEHXERXLQTLRDIQRBLF LSQEQLEHRXRSXQILRDIQRBLF LSQEQLEHREXSLXTLRDIQRBLF LSQEQLEHRERXLQXLRDIQRBLF LSQEQLEHRERSXQIXRDIQRBLF LSQEQLEHRERSLXTLXDIQRBLF LSQEQLEHRERSLQXLRXIQRBLF LSQEQLEHRERSLQTXRDXQRBLF LSQEQLEHRERSLQTLXDIXRBLF LSQEQLEHRERSLQTLRXIQXBLF LSQEQLEHRERSLQTLRDXQRXLF LSQEQLEHRERSLQTLRDIXRBXF LSQEQLEHRERSLQTLRDIQXBLX

i, i+3 argollas dobles:

XSQXQLEHRERSLQ1LRDIQXBLX XSQXQLEHRERSLQTLRDIXRBXF XSQXQLEHRERSLQTLRDXQRBXF

i, j+4 argollas dobles:

XSQEXLEHRERSLQTLRDIXRBLX XSQEXLEHRER.S LQTLRDXQRBXF

XSQEXLEHRERSLQTLXDIQRXLF

, ^t +7 argollas dobles:

XSQEQLEXRERSLQTLXDIQRBLX

XSQEQLEXRERSLQTXRDIQRBXF

XSQEQLEXRERSLQXLRDIQRXLF.

La secuencia de aminoácidos de las posiciones 351 a 374 puede seleccionarse de las siguientes:

En otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende el péptido como se describió anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención proporciona además un péptido de la invención en un vehículo farmacéutico en una forma de dosificación unitaria.

La invención se refiere a un método para inhibir la señalización canónica de Wnt/p-catenina en un sujeto, que comprende administrar un péptido de la invención.

La invención se refiere a un método para inhibir la unión de BCL9 a p-catenina en un sujeto, que comprende administrar un péptido de la invención.

La inhibición de la unión de BCL9 a p-catenina puede ser causada por el péptido estructuralmente restringido de la invención.

La invención se refiere a un método para tratar una enfermedad o trastorno mediado por la unión de BCL9/pcatenina en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un péptido de la invención.

En una realización, se ha identificado que el sujeto necesita un inhibidor de la interacción BCL9-catenina o señalización de Wnt.

En otra realización, la enfermedad es cáncer, proliferación de células tumorales, desdiferenciación y metástasis de células tumorales, migración tumoral, angiogénesis inducida por tumores, quimiorresistencia de células madre cancerosas y una enfermedad de proliferación; o implica curación de heridas, angiogénesis o diabetes.

La invención se refiere a métodos para la mejora o el tratamiento del cáncer, por ejemplo en un sujeto, mediante la administración de un péptido estructuralmente restringido de la invención al sujeto en una cantidad terapéuticamente efectiva. El método puede incluir además uno o más de identificar a un sujeto que necesita mejorar o tratar el cáncer, o monitorizar al sujeto para la prevención, mejora o tratamiento del cáncer. En ciertas realizaciones, la invención se refiere a métodos de mejora o tratamiento del cáncer en los que se identifica que el sujeto necesita modulación BCL9/p-catenina.

En una realización adicional, la enfermedad es cáncer colorrectal, mieloma múltiple, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro, cáncer de riñón, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de piel, cáncer de hueso, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer pancreático, glioma, glioblastoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma renal papilar, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, leucemias, linfomas, mielomas y tumores sólidos.

La invención se refiere a un método para tratar el cáncer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un péptido de la invención.

En una realización, el sujeto ha sido previamente identificado como necesitado de un inhibidor canónico de señalización de Wnt/p-catenina para tratar el cáncer.

En otra realización, la enfermedad implica curación de heridas, angiogénesis o diabetes.

El péptido estructuralmente restringido para el uso de la presente invención puede usarse en un método que comprende administrar al sujeto un agente terapéutico adicional, radiación o quimioterapia.

En una realización adicional, el compuesto terapéutico adicional es un compuesto anticancerígeno.

En otra realización adicional, el compuesto y el agente terapéutico adicional se administran simultánea o secuencialmente.

En otras realizaciones, el compuesto y el agente terapéutico adicional están unidos entre sí (es decir, un compuesto bifuncional).

En ciertas realizaciones, el sujeto es un humano.

En el presente documento también se proporciona un kit que comprende un péptido estructuralmente restringido de la invención e instrucciones para su uso en el tratamiento del cáncer.

La invención proporciona un método para identificar un compuesto que inhibe la unión de BCL9 a p-catenina, que comprende los pasos de poner en contacto el péptido de la invención con p-catenina y luego detectar moléculas pequeñas o compuestos que interrumpen la interacción entre péptido de la invención y p-catenina. Más específicamente, la presente invención proporciona un método para identificar un compuesto que inhibe la unión de BCL9 a p-catenina, que comprende los pasos de poner en contacto un péptido estructuralmente restringido de un dominio HD2 de BCL9 (BCL9-HD2), que comprende al menos una argolla de hidrocarburo, con p-catenina y luego seleccionar moléculas pequeñas o compuestos que interrumpen la interacción entre dicho péptido estructuralmente restringido y p-catenina, en donde la argolla de hidrocarburo se posiciona para unir un primer aminoácido BCL9-HD2 seleccionado del grupo que consiste en Leu-351, Ser-352, Gln-353, Glu-354, Gln-355, Glu-357, His-358, Arg-359, Arg-361, Ser-362, Leu-363, Thr-365, Leu- 366, Ile-369, Gln-370, Met-372, Nle-372, Leu-373 y Phe-374 con un segundo aminoácido BCL9 HD2 seleccionado del grupo que consiste en Leu-351, Ser-352, Gln-353, Glu-354, Gln-355, Leu-356, Glu-357, His-358, Arg-359, Glu-360, Arg-361, Ser-362, Leu-363, Gln-364, Thr-365, Leu-366, Arg-367, Asp-368, Ile-369, Gln-370, Arg-371, Met-372, Nle-372, Leu-373 y Phe-374, en donde el péptido comprende una cara interactiva compuesta de aminoácidos que interactúa con p-catenina, en donde la cara interactiva comprende residuos BCL9 Gln-355, His-358, Arg-359, Ser-362, Leu-363, Leu-366, Ile-369, Gln-370, Leu-373 y Phe-374.

Otras formas de realización de la invención se entenderán con base en la descripción proporcionada a continuación. Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Diseño, síntesis y caracterización de péptidos SAH-BCL9. a. El dominio alfa-helicoida1HD2 de BCL9, que se acopla directamente a un surco superficial de p-catenina, proporcionó la plantilla para la estabilización estructural mediante argollado de hidrocarburos. b. SAH-BCL9 A-C se generaron reemplazando los residuos nativos en la superficie que no interactúa del dominio HD2 con aminoácidos olefínicos no naturales, que cuando se someten a metátesis de olefina producen los péptidos argollados correspondientes. También se generó un péptido molde no modificado (BCL9 HD2). c. El análisis de CD reveló una marcada estabilización alfa-helicoidal de péptidos SAH-BCL9 en comparación con el péptido molde no modificado. d. FITC-SAH-BCL9^b y p-catenina coprecipitaron de los lisados de las células Colo320 tratadas con FITC-SAH-BCL9 mediante ensayos de extracción de anti-FITC y anti-pcatenina. TCL, lisado celular total. e-f. Tanto FITC-SAH-BCL9^b como p-catenina se localizan preferentemente en el núcleo de las células Colo320 según se controla mediante microscopía confocal y análisis de fraccionamiento celular, g. H358D y R359E mutantes de polaridad inversa de FITC-SAH-BCL9^b exhibieron un alto porcentaje de helicoidicidad similar en comparación con el SAH de tipo salvaje por análisis de CD. h. Co-inmunoprecipitación con FITC-SAH-BCL9/p-catenina deteriorada por mutagénesis puntual, con el derivado R359E como el control negativo más efectivo. i. FITC-SAH-BCL9^b y su control R359E exhiben captación celular equivalente a la dosis por las células Colo320.

Figura 2. SAH-BCL9^b interrumpe los complejos nativos de p-catenina-BCL9B9L y reprime la transcripción impulsada por Wnt/p-catenina/BCL9. a. S^a H-BCL9^b dosis-sensible interrumpió la asociación de p-catenina con BCL9 y B9L, mientras que el tratamiento celular con SAH-BCL9^b(R359E) no tuvo ningún efecto. La disociación de p-catenina de BCL9/B9L se correlacionó con la coinmunoprecipitación de p-catenina con FITC-SAH-BCL9^b. b. Las células Colo320 se transfectaron con TOP-FLASH, se incubaron con vehículo o péptidos SAH-BCL9 y se analizaron para determinar la actividad luciferasa, que se normalizó con el control de luciferasa Renilla. SAH-BCL9^b, pero no SAH-BCL9^b(R359E), inhibió la actividad informadora dependiente de Wnt. Las barras de error son medias /- s.d. para ensayos realizados por triplicado. *, P <0.01. c. El análisis qPCR reveló la represión de los genes diana Wnt v Eg F, c-Myc y Axin2, pero no GAPDH, en respuesta al tratamiento con SAH-BCL9^b. El vehículo y SAH-BCL9^b(R359E) no tuvieron efecto. Las barras de error son medias /s. d. para ensayos realizados por cuadruplicado. *, P <0.01.

Figura 3. SAH-BCL9^b bloquea la proliferación celular, la angiogénesis y la migración. a-b. El tratamiento con SAH-BCL9^b redujo el crecimiento de Colo320 y tumores primarios colorrectales (CCPT), según se monitorizó mediante la absorción de [3H]-timidina a las 24 h. *, P <0.01. c-d. SAH-BCL9^b, pero no vehículo o SAH-BCL9^b(R359E), también perjudicaron el crecimiento de células MM1S en presencia o ausencia de medio acondicionado con Wnt3A (Wnt3A-CM) y tumores primarios de mieloma múltiple (MMPT). *, P <0.01. e. SAH-BCL9^b no tuvo efecto sobre la viabilidad de las células Colo320 y MM1S según lo evaluado por CellTiter-Glo a las 72 h. f. Correspondientemente, SAH-BCL9^b no activó caspasa-3 o PARP, según lo monitorizado por análisis Western. g. El tratamiento con SAH-BCL9^b disminuyó la secreción de VEGF por las células Colo320 y MM1S medida por ELISA. *, P <0,001 h. HUVEC se cultivó con sobrenadantes recolectados de células Colo320 o MM1S incubadas con vehículo o péptidos SAH-BCL9^b y el número de tubos (flechas negras) formados por campo de alta potencia analizados por microscopía a las 5 h. SAH-BCL9^b bloqueó la formación in vitro de tubos capilares similares. *, P <0.01 (n = 3) i. SAH-BCL9^b bloqueó la migración de las células Colo320 tal como se monitorizó utilizando cámaras Matrigel Boyden. El vehículo y SAH-BCL9^b (R359E) no tuvieron efecto. *, P <0.01. Vehículo, 0.5% DMSO; péptidos SAH-BCL9, 5 |jM. Las barras de error son medias /- s.d. para experimentos realizados por triplicado.

Figura 4. SAH-BCL9^b inhibe el crecimiento tumoral, la angiogénesis y la metástasis in vivo. a. Las cohortes (n = 6) de ratones NOD/SCID que portaban células Colo320 positivas para GFP intraperitoneales se trataron con vehículo (DMSO al 2.5% en D5W) o péptidos SAH-BCL9B (20 mg/kg) administrados intraperitonealmente cada dos días para un total de seis dosis. Las imágenes de cuerpo entero y la necropsia revelaron disminución de la carga tumoral y metástasis hepáticas en ratones tratados con SAH-BCL9^b pero no en animales tratados con vehículo y SAH-BCL9^b (R359E). b. El análisis histológico del hígado reveló una disminución de la invasión tumoral y la positividad de CD44 en ratones tratados con SAH-BCL9^b. c. El número total de nódulos intraparenquimatosos para cada grupo experimental (n = 6), tal como se cuantificó examinando secciones de hígado a intervalos de 5 mm, disminuyó notablemente en ratones tratados con SAH-BCL9^b. Las barras de error son medias /- s.d. *, P <0.01. d-e. El tratamiento con SAH-BCL9^b también inhibió la angiogénesis evaluada mediante la cuantificación de los vasos sanguíneos tumorales y la inmunotinción anti-CD34. Las barras de error son medias /- s.d. *, P <0.0001 (n = 6) f-g. Cohortes de ratones SCID-hu (n = 5) con chips de hueso humano poblados por células INA-6 positivas para GFP se inyectaron localmente con vehículo (DMSO al 2.5% en D5W) o péptidos SAH-BCL9^b (5 mg/kg) cada dos días para un total de diez dosis. La carga tumoral se evaluó mediante los niveles séricos de shuIL-6R en los días indicados después de la inyección de células tumorales (f) y la obtención de imágenes fluorescentes de todo el cuerpo tras el sacrificio en el día 33 (g). El tratamiento con SAH-BCL9^b suprimió significativamente la producción de shuIL-6R y la carga tumoral, como se refleja en la disminución de la fluorescencia de las astillas óseas. h. El análisis histológico también demostró una reducción sustancial de las células INA-6 en los chips óseos de los ratones tratados con SAH-BCL9B, con células tumorales confinadas al hueso. En ratones tratados con vehículo y SAH-BCL9^b(R359E), las células tumorales migraron fuera del chip óseo e invadieron el tejido blando adyacente (flechas negras). i. La angiogénesis intratumoral se suprimió en ratones tratados con SAH-BCL9^b, tal como se monitorizó mediante cuantificación de vasos sanguíneos e inmunotinción anti-CD34.

Figura 5. Orientación de la actividad de transcripción de Wnt en cáncer usando alfa-Hélices estabilizadas de BCL9. La señalización desregulada de Wnt subyace en la patogénesis de una amplia gama de cánceres humanos, sin embargo, el desarrollo de terapias dirigidas para interrumpir la vía ha seguido siendo un desafío. La p-catenina es un efector central de la ruta Wnt canónica, activando la expresión de genes como c-Myc, ciclina D1, v Eg F y CD44 que están involucrados en la proliferación celular, la migración y la angiogénesis. BCL9 es un coactivador importante para la transcripción mediada por p-catenina, y se expresa altamente en tumores, pero no en las células de origen, presentando una oportunidad para inhibir selectivamente la actividad patológica de p-catenina. Guiados por la estructura del complejo BCL9/p-catenina, se generaron alfa-hélices estabilizadas de BCL9 (SAH-BCL9) para bloquear la señalización de Wnt en el cáncer a través de la interrupción dirigida del complejo BCL9/p-catenina. SAH-BCL9 reduce la actividad de transcripción de Wnt y la expresión de dianas de transcripción de Wnt/p-catenina, impidiendo la proliferación, migración, invasión y angiogénesis de células tumorales in vitro e in vivo.

Figura 6. BCL9 se sobreexpresa en una amplia gama de tumores. a. Los estudios inmunohistoquímicos realizados en microarreglos de tejido de colon (n = 23), mama (n = 22), pulmón (n = 32), hígado (n = 29) y carcinomas de ovario (n = 32) revelaron altos niveles de BCL9 expresión en una amplia variedad de tumores. Se muestran casos representativos de tumores con inmunotinción de BCL9 de alto o bajo nivel. b. Se realizaron experimentos de bloqueo con el péptido inmunizante BCL9 (Abcam) en muestras de cáncer colorrectal humano de acuerdo con el protocolo del fabricante y la especificidad documentada del anticuerpo BCL9.

Figura 7. Captación celular equivalente de péptidos SAH-BCL9. a. Los péptidos FITC-SAH-BCL9^b y FITC-SAH-BCL9^b(R359E) exhiben una absorción dependiente de la temperatura equivalente en las células Colo320, consistente con el mecanismo de absorción endocítica dependiente de la energía previamente documentado para péptidos argollados (Bernal, F., et al. J Am Chem Soc 129, 2456-7 (2007); Walensky, L.D. et al. Science 305, 1466­ 70 (2004)). b. Los péptidos FITC-SAH-BCL9^b y FITC-SAH-BCL9^b(R359E) exhiben una absorción celular equivalente por las células Colo320 y MM1S.

Figura 8. SAH-BCL9^b activa selectivamente la p-catenina y no interrumpe su interacción con un asociado de unión no BCL9. a. Es importante destacar que el direccionamiento de p-catenina por FITC-SAH-BCL9^b es selectivo para la interrupción del complejo BCL9/p-catenina y no afecta la coinmunoprecipitación anti-P-catenina de E-cadherina de los lisados celulares MCF7. b. El tratamiento de las células MCF7 con F|TC-SAH-BCL9^b seguido de un descenso de anti-FITC realizado en lisados celulares reveló la interacción selectiva entre FITC-SAH-BCL9^b y p-catenina, y no coinmunoprecipitación de proteínas no relacionadas como LxBa y actina. La mutagénesis de un solo punto R359E de la interfaz de unión de SAH-BCL9 anula la coinmunoprecipitación de p-catenina, lo que confirma aún más la especificidad del péptido SAH-BCL9^b. Las células MCF7 se emplearon en este ensayo ya que contienen niveles fácilmente detectables de proteína E-cadherina para controlar la interacción de p-catenina/E-cadherina.

Figura 9. La supresión de la transcripción impulsada por p-catenina/BCL9 por SAH-BCL9^b se invierte en respuesta a la dosis mediante el aumento de la expresión de BCL9. Las células HCT116 transfectadas con TOP-FLASH y pcDNA-BCL9 se trataron con péptidos de vehículo o SAH-BCL9 (5 |^j M) y se realizaron ensayos de luciferasa doble a las 24 h. La supresión de las actividades informadoras por SAH-BCL9^b se invierte en respuesta a la dosis al aumentar la expresión de la proteína BCL9, destacando la especificidad en el objetivo de la inhibición basada en SAH-BCL9^b de la transcripción impulsada por p-catenina/BCL9B. * P <0,01. Las células HCT116 se emplearon en este ensayo debido a su nivel de expresión relativamente bajo de BCL9 endógeno.

Figura 10. Inhibición de la actividad informadora de transcripción específica de Wnt por SAH-BCL9^b. SAH-BCL9^b bloqueó en respuesta a la dosis la expresión de dGFP bajo el control de transcripción de secuencias reguladoras de TCF (7xTdG) en células Colo320. En contraste, el tratamiento con SAH-BCL9^b(R359E) tuvo poco o ningún efecto. Figura 11. VEGF es una diana de transcripción directa de BCL9. a. El análisis de inmunoprecipitación por cromatina (ChIP) de células Colo320 usando anticuerpos anti-TCF-4, p-catenina y BCL9 documentó que, como c-Myc, el promotor VEGF es un objetivo del complejo de transcripción Wnt/p-catenina/BCL9. Los controles negativos incluyeron ChIP con IgG y el uso de cebadores para una región corriente arriba no específica del promotor VEGF. b. Las células Colo320 transducidas de forma lentiviral con shRNA de control o el vector de shARN BCL9 se transfectaron con plásmidos informadores de promotor VEGF-luciferasa. La actividad informadora se analizó utilizando el sistema de análisis dual de luciferasa y los resultados se normalizaron a los valores de Renilla para cada muestra. La eliminación de BCL9 disminuyó efectivamente la actividad de transcripción en el promotor v Eg F. *, P <0.001.

Figura 12. Aspecto normal de la mucosa colónica y la médula ósea en ratones tratados con SAH-BCL9. La tinción H&E de los tejidos de la mucosa colónica y de la médula ósea aislados de ratones experimentales tratados con vehículo o péptidos SAH-BCL9 no mostró evidencia de toxicidad en todas las muestras histológicas.

Figura 13. SAH-BCL9^b inhibe la proliferación de células de mieloma múltiple INA-6. a. Expresión de las proteínas BCL9 y p-catenina en células MM1S e INA-6, según lo detectado por análisis Western. b. Las células INA-6 expuestas a SAH-BCL9^b(5 j M) durante 24 h mostraron un crecimiento significativamente reducido en comparación con las células tratadas con vehículo y SAH-BCL9^b(R359E), medido por la incorporación de timidina. *, P <0.001. Las barras de error son medias /- s.d. para ensayos realizados por triplicado.

Figura 14. Ejemplos de aminoácidos olefínicos no naturales insertados en plantillas de péptidos para generar péptidos argollados con hidrocarburos mediante metátesis de olefina.

Figura 15. Ejemplos de péptidos BCL9 HD2 argollados en secuencia simple, doble y secuencialmente. X, aminoácido argollado; B, norleucina. Un escaneo de argollas permite fácilmente la producción iterativa y la prueba de distintas composiciones de argollas y sus posiciones diferenciales a lo largo de la secuencia de péptidos para identificar la alfa-hélice estabilizada óptimamente de los constructos BCL9 HD2.

Figura 16. Estructura tridimensional de los residuos 351-374 del dominio HD2 a-helicoidal de BCL9, destacando aquellos residuos de aminoácidos de la interacción BCL9 HD2 que se encuentran con la p-catenina.

Figura 17. SAH-BCL9^b interrumpe los complejos p-catenina-BCL9/B9L. a. Afinidades de unión diferencial de SAH-BCL9B y SAH-BCL9^b(R359E) para la p-catenina recombinante. b. SAH-BCL9^b complejos de p-catenina/BCL9 recombinantes disociados en respuesta a la dosis, como se demuestra mediante el ensayo desplegable GST. La mutagénesis puntual R359E redujo la actividad de SAH-BCL9^b en 6 veces.

Figura 18. SAH-BCL9^b bloquea selectivamente la transcripción Wnt. a. El análisis qRT-PCR reveló la represión dependiente de la dosis de genes diana Wnt en respuesta al tratamiento SAH-BCL9^b de células Colo320. Las barras de error son medias /- s.d. para ensayos realizados por cuadruplicado. * p <0.01. Comparación cuantitativa de genes regulados negativamente por SAH-BCL9^b y expresión TCF1/TCF4 dominante negativa en células DLD1 a través de firmas de adenoma (b) y carcinoma (c). Representación del mapa de calor de los 50 genes más regulados hacia abajo (p<0.001) del borde de ataque: los genes que más contribuyen a la correlación entre SAH-BCL9^b y TCF1/TCF4 dominante negativo, para el adenoma (d) y firmas (e) de carcinoma. f. Validación de qRT-PCR de genes diana clave de Wnt en células DLD1 tratadas con SAH-BCL9^b.

Figura 19. Supresión de la expresión del gen diana Wnt por SAH-BCL9^b. a. El análisis qRT-PCR reveló la represión de genes diana Wnt en respuesta al tratamiento SAH-BCL9^b de células MM1S a 10 |^jM. Las barras de error son medias /- s.d. para ensayos realizados por cuadruplicado. * p <0.01. b. Análisis de perfiles de expresión génica de Affimetrix de VEGF-A en células DLD1.

Figura 20. SAH-BCL9^b inhibe selectivamente la proliferación de células de cáncer de colon cultivadas que son impulsadas por señalización Wnt patológica y expresan BCL9. a. SAH-BCL9^b, pero no vehículo o SAH-BCL9^mut, redujo significativamente la proliferación de líneas celulares de CCR. Las células cancerosas susceptibles a SAH-BCL9^b expresan BCL9, mientras que la línea celular LS174T que no expresa BCL9 no mostró respuesta, vinculando el efecto inhibidor de SAH-BCL9^b con la expresión de BCL9. Como controles celulares adicionales para la especificidad de acción de SAH-BCL9^b, las células HCT116 y sus dos líneas celulares derivadas, HCT116D020 y HCT116KO58, cuya capacidad proliferativa no depende de la actividad de Wnt/p-catenina (T.A. Chan et al., Proc Natl Acad Sci USA 99, 8265 (2002)), no mostró sensibilidad a SAH-BCL9^b. b. Expresión de BCL9, B9L y p-catenina en líneas celulares de CCR, según la evaluación de Inmunoprecipitación Western.

Figura 21. SAH-BCL9^b aumenta el efecto citotóxico de los agentes quimioterapéuticos convencionales, a. Las células Colo320 se cultivaron conjuntamente con vehículo, SAH-BCL9^b o SAH-BCL9^mut y con concentraciones crecientes de 5-fluorouracilo (5-FU), y se evaluó la proliferación celular usando la incorporación de 3H-timidina. b. Las células MM1S se cultivaron conjuntamente con vehículo, SAH-BCL9^b o SAH-BCL9^mut y con concentraciones crecientes de doxorrubicina (Dox), y se evaluó la proliferación celular usando la incorporación de 3H-timidina. SAH-BCL9^b pero no SAH-BCL9^mut o vehículo mejoraron significativamente la actividad antitumoral de los agentes convencionales.

Figura 22. Aumento de la apoptosis en el tejido tumoral del colon de ratones tratados con SAH-BCL9^b. El tejido tumoral de ratones NOD/SClD con células Colo320 intraperitoneales se evaluó para la inducción de apoptosis utilizando el ensayo TUNEL (marrón). SAH-BCL9^b, pero no vehículo o SAH-BCL9^mut, notablemente mayor positividad de TUNEL. Se muestran tres archivos de potencia 40X representativos, incluida la cuantificación de la positividad TUNEL en 6 campos de alta potencia. * p<0.001.

Figura 23. La proliferación de células INA-6 depende de la actividad de transcripción de Wnt y del aumento de la apoptosis en el tejido tumoral de mieloma de ratones tratados con SAH-BCL9^b. a. Las células lNA-6 se transdujeron lentiviralmente con un vector vacío (Simulado) o un vector que expresa una forma negativa dominante de TCF4 (EdTP) y la proliferación se midió mediante la incorporación de 3H-timidina. b. Se evaluaron las secciones de tejido tumoral de chips de hueso de ratones NOD/SCID con células INA-6 para la inducción de apoptosis usando el ensayo TUNEL (marrón). SAH-BCL9^b, pero no vehículo o SAH-BCL9^mut, notablemente mayor positividad de TUNEL. Se muestran tres archivos de potencia 40X representativos, incluida la cuantificación de la positividad TUNEL en 6 campos de alta potencia. * p<0.001.

Descripción detallada

Estudios recientes han revelado que la alta actividad de señalización de Wnt se atribuye funcionalmente a la población de células madre de cáncer de colon (CSC), que es resistente a la quimioterapia convencional y se cree que es responsable de la recurrencia del tumor (Vermeulen L, et al. Nat Cell Biol 12: 468, 2010). Por lo tanto, bloquear la ruta de señalización de Wnt puede ser más potente contra estas células. Además, la ruta Wnt canónica se ha implicado en la angiogénesis fisiológica y patológica (Dejana E. Circulation Research. 107: 9432010), lo que subraya la relevancia de esta vía para el descubrimiento de fármacos diana y el desarrollo terapéutico (Barker, N. and Clevers, H. Nat Rev Drug Discov 5: 997, 2006).

La estructura cristalina del complejo p-catenina BCL9/TCF-4 reveló que el sitio de unión de BCL9 en p-catenina es distinto de otros asociados de unión en que el dominio HD2 a-helicoidal de BCL9 (residuos 352-374) se une a surco superficial formado por las a-hélices 2 y 3 del armadillo repiten 1 de p-catenina (Figura 1a) (Sampietro, J. et al. Mol Cell 24, 293-300 (2006)). Es importante destacar que la mutagénesis en alanina de los residuos clave en la interfaz de unión de BCL9, como H358A o R359A, bloqueó la capacidad de BCL9 para unirse a p-catenina, anulando la transactivación. Para aprovechar este motivo de unión natural a la p-catenina, se aplicó argollado de hidrocarburos (Schafmeister, C., P^o, J. and Verdine, G. J Am Chem Soc 122, 5891-5892 (2000); Walensky, L.D. et al. Science 305, 1466-70 (2004)) para generar péptidos a-helicoidales estructuralmente reforzados basados en el dominio BCL9 HD2. Los aminoácidos no naturales con cadenas laterales olefínicas se sustituyeron en las posiciones (i, i+4) seguidos de una metátesis de olefina catalizada con rutenio para producir los péptidos A-C SAH-BCL9 (Figura 1b). El análisis por dicroísmo circular (CD) confirmó que el argollado de hidrocarburos mejoró constantemente la helicoidicidad a del péptido en comparación con el péptido no modificado correspondiente (BCL9 HD2) (Figura 1c). Las células tratadas con derivados fluorescentes de los péptidos, seguidas de lavado, tripsinización y extracción, contenían FITC-SAH-BCL9 A-C pero no el péptido FITC no modificado correspondiente en los lisados, documentando la absorción celular de péptidos SAH (Figura Id). Tanto la FITC como la inmunoprecipitación de pcatenina identificaron a SAH-BCL9^b como el interactor de p-catenina más efectivo in situ (Figura Id). La microscopía confocal de inmunofluorescencia demostró una localización nuclear predominante de p-catenina y SAH-BCL9^b en el núcleo (Figura 1 e), con el enriquecimiento nuclear de SAH-BCL9^b confirmado por fraccionamiento celular (Figura 1f). Para desarrollar un péptido SAH-BCL9^b de control negativo para estudios biológicos, se generaron SAH-BCL9^b(H358D) y SAH-BCL9^b(R359E) y contienen mutantes únicos de punto de polaridad inversa de residuos de la interfaz de unión clave (Figura 1a). En comparación con SAH-BCL9^b, ambos mutantes mostraron una mejora helicoidal a similar (Figura 1g) y captación celular (Figura 1h), pero demostraron una interacción deteriorada de pcatenina por análisis de coinmunoprecipitación (Figura 1h), con mutagénesis R359E el efecto más perjudicial. Por lo tanto, SAH-BCL9^b y su correspondiente mutante R359E fueron seleccionados para estudios funcionales en las líneas celulares dependientes de p-catenina/BCL9 Colo320 y MM1S (Mani, M. et al. Cancer Res 69, 7577-86 (2009); Ilyas, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 10330-4 (1997)), que muestran una captación equivalente a la dosis de los dos péptidos (Figura 1i).

Se realizó una serie de análisis de coinmunoprecipitación para determinar si el direccionamiento de p-catenina por SAH-BCL9B interrumpía las interacciones endógenas de p-catenina con BCL9 y su homólogo cercano B9L (Brembeck, F.H. et al. Genes Dev 18, 2225-30 (2004)), que contiene un dominio HD2 idéntico (Sampietro, J. et al. Mol Cell 24, 293-300 (2006)). Sorprendentemente, sAh-BCL9^b, pero no su derivado R359E, causó la interrupción sensible a la dosis de los complejos p-catenina-BCL9/B9L en estudios de inmunoprecipitación anti-BCL9 y B9L (Figura 2a). De manera correspondiente, FITC-SAH-BCL9^b, pero no SAH-BCL9^b(R359E), coinmunoprecipitado en respuesta a la dosis con p-catenina (Figura 2a), vinculando el direccionamiento de p-catenina por SAH-BCL9^b con el desacoplamiento de la p-catenina- Complejos BCL9/B9L. Dadas las toxicidades documentadas asociadas con agentes que se dirigen a la p-catenina e interrumpen ampliamente sus interacciones proteicas, se confirmó que FITC-SAH-BCL9^b no tuvo ningún efecto sobre la interacción homeostática de p-catenina con E-caderina, lo que es consistente con la ubicación distinguible sin solapamiento del sitio de unión de BCL9/p-catenina. La selectividad basada en la diana de FITC-SAH-BCL9^b se documentó adicionalmente mediante el descenso de anti-FITC, que coprecipita la p-catenina, pero no otras proteínas celulares no relacionadas como kBa y actina.

Para examinar las consecuencias funcionales de la disrupción compleja mediada por SAH-BCL9^b, se evaluaron los efectos de SAH-BCL9^b y SAH-BCL9^b(R359E) en un ensayo de transcripción del gen informador TCF específico de Wnt (Mani, M. et al. Cancer Res 69, 7577-86 (2009); Sustmann, C., et al. Mol Cell Biol 28, 3526-37 (2008)). Mientras que el tratamiento con SAH-BCL9^b redujo la actividad informadora en casi un 50%, el vehículo y el SAH-B^c L9^b(R359E) no mostraron ningún efecto (Figura 2b). Es importante destacar que la especificidad del efecto de SAH-BCL9 se documentó al demostrar que el efecto inhibidor de SAH-BCL9 se anuló selectivamente por la transfección con cantidades crecientes de pcDNA-BCL9, y que SAH-BCL9^b no tuvo ningún efecto en un gen de transcripción del gen informador NF^kB ensayo (Figura 2b). En un segundo ensayo de informador específico de Wnt que monitoriza dGFP, que está bajo el control de transcripción de secuencias reguladoras de TCF, SAH-BCL9^b, pero no vehículo o SAH-BCL9^b(R359E), la expresión de dGFP bloqueada en respuesta a la dosis. El análisis de PCR cuantitativa (qPCR) se empleó para medir los efectos del vehículo, SAH-BCL9^b y SAH-BCL9^b(R359E) en la expresión de genes diana de p-catenina/BCL9, incluido VEGF. SAH-BCL9^b, pero no vehículo o SAH-BCL9^b(R359E), redujo significativamente los niveles de ARNm de VEGF, c-Myc y Axin2, pero no GAPDH, un gen diana de la ruta no Wnt (Figura 2c).

Para examinar las consecuencias fenotípicas de la alteración farmacológica del complejo p-catenina/BCL9, se realizaron ensayos de proliferación celular, angiogénesis y migración. Surgió un patrón consistente por el cual SAH-BCL9^b, pero no vehículo o SAH-BCL9^b(R359E), redujo la proliferación de Colo320, MM1S y células CRC y MM primarias (Figura 3a-d). Es de destacar que el tratamiento con SAH-BCL9^b no indujo la muerte celular, según lo evaluado por los ensayos de viabilidad y el análisis de Western para caspasa-3 y activación de PARP (Figura 3e-f). Para determinar el efecto de SAH-BCL9^b sobre la angiogénesis inducida por células tumorales, las células Colo320 y MM1S se trataron con vehículo y péptidos de SAH-BCL9^b y luego se cuantificaron los niveles de VEGF en los medios. De acuerdo con el análisis qPCR, solo SAH-BCL9^b redujo el nivel de VEGF secretado (Figura 3g). En un ensayo de angiogénesis in vitro, se cultivaron células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) con sobrenadantes de células Colo320 o MM1S tratadas y luego se puntuaron para la formación de formaciones de tubos capilares por microscopía. Las células HUVEC expuestas al sobrenadante de las células tratadas con SAH-BCL9^b mostraron una formación reducida de tubos capilares en comparación con los controles tratados con vehículo y SAH-BCL9^b(R359E) (Figura 3h). SAH-BCL9^b también disminuyó el potencial adhesivo e invasivo de las células Colo320, como se refleja en una reducción significativa en la capacidad de las células tratadas con SAH-BCL9^b para pasar a través de la matriz extracelular, según lo evaluado usando cámaras de invasión recubiertas con Matrigel (Figura 3i). Tomados en conjunto, estos datos demuestran que SAH-BCL9^b interrumpe específicamente una serie de procesos fisiológicos regulados por el complejo de transcripción BCL9/p-catenina.

Para explorar el potencial terapéutico de dirigir la interacción BCL9/p-catenina, se examinó in vivo la capacidad de SAH-BCL9^b para suprimir el crecimiento tumoral. Se inyectaron células Colo320 que expresan GFP (1x106) en el peritoneo de ratones NOD/SCID irradiados subletalmente. Dos días después de la inyección celular, las cohortes de ratones (n = 6) se trataron con vehículo (DMSO al 2.5% en D5W), péptidos de S^a H-BCL9^b o SAH-BCL9^b(R359E) (20 mg/kg) para un total de 6 dosis administradas intraperitonealmente cada dos días. En el día 40 del experimento, se sacrificó a los ratones y se evaluó la carga tumoral y la metástasis mediante imágenes de todo el cuerpo y examen histológico de tejidos positivos para GFP recolectados. La fluorescencia tisular global se redujo notablemente en ratones tratados con SAH-BCL9^b en comparación con el vehículo y los animales tratados con SAH-BCL9^b(R359E) (Figura 4a). Estos datos fueron consistentes con una reducción general de los nódulos tumorales metastásicos observados en los hígados de ratones tratados con SAH-BCL9^b (Figura 4b-c). Curiosamente, el tejido tumoral de ratones tratados con SAH-BCL9^b también mostró una disminución de la inmunorreactividad de las células tumorales CD44 (Figura 4b), una reducción en el número de vasos sanguíneos intratumorales (Figura 4d) y una inmunorreactividad capilar CD34 menos intensa (Figura 4e), lo que sugiere que la supresión mediada por SAH-BCL9^b del crecimiento tumoral y la metástasis puede derivarse al menos en parte de la reducción de la migración celular y la angiogénesis. Es importante destacar que no se observaron cambios histológicos en los tejidos murinos normales en los grupos de tratamiento tras la necropsia.

En un segundo modelo in vivo, se examinó el impacto del tratamiento con SAH-BCL9^b en el crecimiento de células INA-6 MM dentro de un injerto óseo humano implantado en el flanco de ratones SCID-hu (Tassone, P. et al. Blood 106, 713-6 (2005)). Las células INA-6 marcadas con GFP (5 x 106), que expresan BCL9 y p-catenina y son suprimidas por SAH-BCL9^b in vitro, se inyectaron en injertos óseos cuatro semanas después de la implantación. Dos días después, las cohortes de ratones (n = 5) se trataron mediante inyección local con vehículo (2.5% DMSO en D5W), péptidos SAH-BCL9^b o SAH-BCL9^b(R359E) (5 mg/kg) para un total de 10 dosis administradas cada dos días. Para controlar la carga tumoral, se midió el nivel sérico del receptor de interleucina-6 humano soluble (shuIL-6R), que primero se detecta 3-4 semanas después del injerto de tumor INA-6. Mientras que los ratones tratados con vehículo y SAH-BCL9^b(R359E) mostraron un aumento progresivo en los niveles de shuIL-6R que reflejan el crecimiento tumoral, los ratones tratados con SAH-BCL9^b mantuvieron niveles bajos a indetectables durante todo el período de evaluación (Figura 4f). Los ratones se sacrificaron 33 días después de la inyección de células INA-6 y se evaluó la carga tumoral MM mediante imágenes de fluorescencia, análisis histológico y tinción anti-CD34. De acuerdo con los niveles medidos de shuIL-6R, la carga tumoral dentro del chip óseo se redujo significativamente en ratones tratados con SAH-BCL9^b (Fig. 4g-h). Curiosamente, las células tumorales presentes en los ratones tratados con SAH-BCL9^b residían dentro de los límites del chip óseo, mientras que los ratones tratados con vehículo y SAH-BCL9^b(R359E) demostraron invasión en el tejido blando circundante (Figura 4h, flechas negras). Similar al modelo CRC, la angiogénesis local se suprimió en ratones SCID-hu tratados con SAH-BCL9^b, según se monitorizó mediante tinción anti-CD34 y cuantificación de vasos sanguíneos (Figura 4i). Por lo tanto, en dos modelos distintos de ratón de cáncer impulsado por Wnt, SAH-BCL9 suprimió eficazmente el crecimiento tumoral, la invasión y la angiogénesis de una manera específica de secuencia.

El complejo de transcripción de p-catenina es un objetivo farmacológico de alta prioridad debido a su papel patológico en una amplia gama de cánceres. Debido a que la p-catenina participa en una variedad de funciones homeostáticas y compromete a la mayoría de sus asociados de interacción usando la misma superficie de unión (Barker, N. & Clevers, H. Nat Rev Drug Discov 5, 997-1014 (2006)), lograr la actividad y la selectividad contra el cáncer sigue siendo un desafío apremiante. Por ejemplo, PKF115-584, una molécula pequeña identificada por el cribado de alto rendimiento para los inhibidores de la interacción p-catenina/TCF, bloqueó la actividad de transcripción específica de Wnt y redujo el crecimiento de células de cáncer de colon (Lepourcelet, M. et al. Cancer Cell 5, 91-102 (2004)), pero indujo hipoplasia severa de médula ósea, anemia y desgaste generalizado de ratones tratados (Sukhdeo, K. et al. Proc Natl Acad Sci USA 104, 7516-21 (2007)). Dirigirse a la interfaz p-catenina-BCL9 como una estrategia alternativa es atractivo porque BCL9 (1) impulsa la actividad de transcripción patológica de pcatenina, (2) compromete a p-catenina en un sitio de unión único (Sampietro, J. et al. Mol Cell 24, 293-300 (2006)), y (3) se encuentra predominantemente en el tejido tumoral en lugar de las células de origen (Mani, M. et al. Cancer Res 69, 7577-86 (2009)). Es importante destacar que la eliminación de la interacción BCL9/p-catenina mediante la eliminación genética de Bcl9 en un modelo de ratón no tuvo consecuencias fenotípicas manifiestas (Deka, J. et al. Cancer Res 70, 6619-28). Por lo tanto, se aplicó argollado de hidrocarburos para estabilizar estructuralmente el dominio HD2 a-helicoidal de BCL9 que se acopla directamente a la p-catenina. Al hacerlo, se determinó que SAH-BCL9^b se dirige a la p-catenina in situ y altera selectivamente los complejos de p-catenina-BCL9/B9L. El bloqueo farmacológico de estas interacciones coincidió con la inhibición de la actividad de transcripción dependiente de pcatenina y la expresión génica diana, y la supresión del crecimiento de células tumorales, la angiogénesis y la metástasis sin daño manifiesto a los tejidos normales. Por lo tanto, estos experimentos de prueba de principio documentan que el direccionamiento selectivo de la interfaz p-catenina-BCL9 en el cáncer es una estrategia prometedora para interrogar y combatir la señalización oncogénica de Wnt.

La invención se basa, al menos en parte, en los resultados proporcionados aquí, así como en PCT/US2009/000438 (documento WO 2009/108261; presentado el 23 de enero de 2009) que demuestra que los péptidos alfa-helicoidales estabilizados tienen excelentes proteínas proteolíticas estructurales, ácido y estabilidad térmica. También se ha determinado que los péptidos alfa-helicoidales estabilizados son altamente efectivos para interferir con la señalización de Wnt/p-catenina, lo que indica que el péptido puede usarse para el tratamiento del cáncer. Además, los péptidos alfa-helicoidales estabilizados tienen propiedades farmacológicas superiores in vivo en comparación con sus contrapartes no modificadas, reduciendo la frecuencia y cantidad de péptido alfa-helicoidal estabilizado que debe administrarse en comparación con una secuencia de péptidos nativos, y asegurando que la exposición sea sostenida

A partir de este momento, el término "reticulación estabilizadora" o derivaciones de la misma, se referirá a su homónimo u otra reticulación covalente o iónica, tal como, pero sin limitación, un disulfuro, amida, éster, 1,2,3-triazol u otro bioconjugado o reticulación biocompatible. A partir de este momento, el término "argolla de hidrocarburos" o "reticulación de hidrocarburos" o derivación de los mismos, se referirá a su homónimo u otros enlaces cruzados covalentes o iónicos, bioconjugados o biocompatibles de hidrocarburos.

En los péptidos proporcionados en el presente documento, el dominio alfa hélice HD2 se estabiliza con al menos una ligadura molecular, por ejemplo, una argolla de hidrocarburo, pero puede incluir dos, tres o más argollas de hidrocarburo. La inclusión de múltiples argollas de hidrocarburos es particularmente adecuada para péptidos alfahelicoidales que tienen 16 o más aminoácidos de longitud. La inclusión de más de uno (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, dependiendo de la longitud del péptido) proporciona argollas de hidrocarburos excepcionales para una estabilidad proteolítica, estructural, ácida y térmica excepcional de los polipéptidos modificados, produciendo péptidos bioactivos con propiedades farmacológicas notablemente mejoradas in vivo (ref Bird et al, PNAS, 2010).

En los compuestos proporcionados aquí, el dominio HD2 está estructuralmente restringido por una o más modificaciones de la secuencia nativa. La alfa-hélice del dominio HD2 se puede estabilizar usando una ligadura molecular como una argolla de hidrocarburo. Alternativamente, o, además, se pueden hacer sustituciones de aminoácidos en o adyacentes a la región para incluir aminoácidos naturales o no naturales para promover la estructura deseada del péptido, para promover o mantener el ángulo deseado entre las dos hélices o para orientar las hélices entre sí, o para mejorar las propiedades farmacológicas. En una realización, al menos una de las hélices del dominio HD2 incluye una ligadura molecular tal como una argolla de hidrocarburo para promover o mantener la naturaleza helicoidal del dominio. En otra realización, las dos hélices del dominio HD2 incluyen una(s) ligadura(s) molecular(es) como la(s) argolla(s) de hidrocarburo para promover o mantener la naturaleza helicoidal del dominio. Argollado de hidrocarburos de polipéptidos

Preferentemente, el dominio de alfa-hélice o HD2 se estabiliza con al menos una argolla de hidrocarburo. Las argollas de hidrocarburos adecuadas para usar con cualquiera de los polipéptidos modificados se describen en el presente documento y en las Publicaciones de los Estados Unidos Nos. 2005/0250680, 2010/0234563, 2007/0197772, 2006/0008848, 2006/0014675; Patentes de los Estados Unidos Nos. 7,723,469, 7,192,713 y 7,084,244; Publicaciones Internacionales Nos. WO 2009/108261) y WO 2010/148335; y Kawamoto, S.A. et al., J. Med. Chem 55, 1137-1146 (2012); Mahon, A.B. and Arora, P.S., Chem. Commun. 48, 1416-1418 (2012); and Chapman, R.N. et al., J. Am. Chem Soc. 126, 12252-3 (2004). El argollado de hidrocarburos permite que un polipéptido, predispuesto a tener una estructura secundaria helicoidal, mantenga su conformación helicoidal nativa y aumente su estabilidad y eficacia. En una realización, el polipéptido modificado tiene al menos 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% o más de helicoidicidad en una solución acuosa según lo determinado por el dicroísmo circular. Los ensayos para determinar el dicroísmo circular se conocen en la técnica y se describen en este documento.

Los polipéptidos argollados con hidrocarburos incluyen una ligadura (enlace) entre dos aminoácidos, en donde la ligadura mejora significativamente la estructura secundaria helicoidal del polipéptido. Generalmente, la ligadura se extiende a lo largo de una o dos vueltas helicoidales (es decir, 3, 4 o 7 aminoácidos). En consecuencia, los aminoácidos posicionados en i e i+3; i e i+4; o i e i+7 son candidatos ideales para la modificación química y la reticulación. Por lo tanto, cualquiera de los residuos de aminoácidos de los polipéptidos modificados de la invención puede estar ligado (por ejemplo, reticulado) de conformidad con lo anterior. Las ligaduras adecuadas se describen en este documento y en las Publicaciones de los Estados Unidos Nos. 2005/0250680, 2010/0234563, 2007/0197772, 2006/0008848, 2006/0014675; Patentes de los Estados Unidos Nos. 7,723,469, 7,192,713 y 7,084,244; Publicaciones Internacionales Nos. WO 2009/108261) y WO 2010/148335; and Kawamoto, S.A. et al., J. Med. Chem 55, 1137-1146 (2012); Mahon, A.B. and Arora, P.S., Chem. Commun. 48, 1416-1418 (2012); and Chapman, R.N. et al., J. Am. Chem Soc. 126, 12252-3 (2004). Se entiende que las ligaduras, como las argollas de hidrocarburos, se pueden colocar a otros intervalos para promover variantes helicoidales (por ejemplo, con diferentes pasos, ángulos o residuos y fracciones de los mismos por vuelta) o estructuras distintas de las hélices. En una realización adicional, la(s) argolla(s) de hidrocarburo se posiciona(n) para unir un primer aminoácido (i) y un segundo aminoácido (i+3) que está 3 aminoácidos corriente abajo del primer aminoácido. En otra realización, la argolla de hidrocarburo une un primer aminoácido (i) y un segundo aminoácido (i+4) que es 4 aminoácidos corriente abajo del primer aminoácido. En otra realización más, la argolla de hidrocarburo une un primer aminoácido (i) y un segundo aminoácido (i+7) que está a 7 aminoácidos corriente abajo del primer aminoácido.

Los polipéptidos modificados de la invención generalmente incluirán la estructura de Fórmula (I), (II) o (III) proporcionada más adelante.

Cualquiera de los polipéptidos modificados descritos en el presente documento puede estar presente en una composición (por ejemplo, composición farmacéutica) o kit. En algunas realizaciones de la invención, la composición o kit comprende dos o más polipéptidos modificados.

Péptidos SAH-BCL9

Los polipéptidos modificados de la invención incluyen los péptidos HD-2 (aminoácidos 352 a 374 de los siguientes)

Los péptidos correspondientes a análogos del dominio HD2 truncados o péptidos BCL9 de longitud completa, descritos anteriormente, pueden ser contemplados por la invención. El término "análogos del dominio HD2", como se usa en el presente documento, se refiere a un péptido que se reconoce o se identifica que tiene un dominio análogo repetido o un dominio BCL9. Los métodos para la repetición de polipéptidos análogos son conocidos en la técnica, por ejemplo, programas de bioinformática basados en correlaciones de residuos por pares (por ejemplo, en la red mundial en: ch.embnet.org/software/COILS_form.html), que tienen la capacidad de reconocer bobinas de secuencias de proteínas y modelar sus estructuras (véase Lupas, A., et al. Science 1991. 252: 1162-1164). Además, dichos péptidos modificados exhiben actividad anticancerígena. Los métodos para identificar BCL9 HD2 y otros homólogos de BCL9 son conocidos en la técnica y se pueden realizar usando los criterios establecidos aquí.

Mutaciones, truncamientos y extensiones del dominio HD2 y péptidos BCL9

Las sustituciones de aminoácidos pueden ser de naturaleza conservada o no conservada. Las sustituciones de aminoácidos conservadas consisten en reemplazar uno o más aminoácidos de la secuencia de péptidos HD2 con aminoácidos de características similares de carga, tamaño y/o hidrofobicidad. Las sustituciones no conservadas consisten en reemplazar uno o más aminoácidos de la secuencia del dominio HD2 con aminoácidos que poseen características de carga, tamaño y/o hidrofobicidad diferentes. Las sustituciones pueden incluir el uso de aminoácidos no naturales conservados o no conservados.

Las inserciones de aminoácidos pueden consistir en residuos de aminoácidos individuales o tramos de residuos. Las inserciones se pueden realizar en el extremo terminal carboxi o amino del dominio HD2 de longitud completa o truncada o péptido BCL9, así como en una posición interna al péptido. Dichas inserciones generalmente variarán de 2 a 15 aminoácidos de longitud. Se contempla que las inserciones realizadas en el extremo carboxi o amino del péptido de interés pueden ser de un rango de tamaño más amplio, prefiriéndose aproximadamente 2 a aproximadamente 50 aminoácidos. Se pueden introducir una o más de tales inserciones en el dominio HD2 de longitud completa o truncada o en el péptido BCL9, siempre que tales inserciones den como resultados péptidos modificados que todavía pueden exhibir actividad anticancerígena.

Las eliminaciones del dominio HD2 de longitud completa o truncado o péptido BCL9 también están dentro del alcance de la invención. Dichas eliminaciones consisten en la eliminación de uno o más aminoácidos del dominio HD2 o péptido BCL9; o dominio HD2 o secuencia peptídica de tipo péptido BCL9, siendo la longitud límite inferior de la secuencia peptídica resultante 4, 5 o 6 aminoácidos. Dichas eliminaciones pueden implicar una sola porción contigua o mayor que una porción discreta de las secuencias peptídicas. Se pueden introducir una o más de tales eliminaciones en el dominio de HD2 de longitud completa o en el péptido BCL9, siempre que tales eliminaciones den como resultados péptidos que todavía pueden exhibir actividad anticancerígena.

Además, un experto en la materia reconocería que la interacción entre el péptido argollado con hidrocarburos y su proteína diana forma un complejo en donde, en el péptido puede definirse, una cara interactiva y una cara no interactiva. Las mutaciones a lo largo de la cara que no interactúa se pueden realizar fácilmente, mientras que las mutaciones en la cara que interactúa no se toleran, de modo que los residuos en la cara que interactúan son el componente principal del complejo y, como tales, deben conservarse y mantenerse en argollas de hidrocarburos diseñadas péptidos Como tal, más del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% de los residuos en la cara interactiva del dominio BCL9 HD2 en el complejo p-catenina/BCL9 no debe modificarse o cambiarse a un residuo de aminoácido estructural o químicamente similar.

Estabilización del dominio HD2 y péptidos BCL9

Los polipéptidos modificados de la presente invención son helicoidales estructuralmente restringidos (por ejemplo, estabilizados, argollados) y/o incluyen una o más modificaciones de la secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia nativa (es decir, de tipo natural o de otro modo natural) para incorporar aminoácidos naturales y/o no naturales para limitar la flexibilidad estructural del péptido en comparación con la secuencia nativa, que pierde forma bioactiva cuando se saca del contexto fisiológico. Preferiblemente, los polipéptidos incluyen al menos una ligadura molecular tal como una argolla de hidrocarburo. El argollado de hidrocarburos se describe en las Publicaciones de los Estados Unidos Nos. 2005/0250680, 2010/0234563, 2007/0197772, 2006/0008848, 2006/0014675; Patentes de los Estados Unidos Nos. 7,723,469, 7,192,713 y 7,084,244; Publicaciones Internacionales Nos. WO 2009/108261) y WO 2010/148335; and Kawamoto, S.A. et al., J. Med. Chem 55, 1137­ 1146 (2012); Mahon, A.B. and Arora, P.S., Chem. Commun. 48, 1416-1418 (2012); y Chapman, R.N. et al., J. Am. Chem Soc. 126, 12252-3 (2004).

El péptido a-hélice participa en interacciones proteicas críticamente importantes al presentar residuos de aminoácidos específicos en una disposición ordenada y precisa sobre un área de superficie de contacto relativamente grande (Chittenden, T., et al., Embo Journal, 1995. 14(22): p. 5589-5596; Kussie, P.H., et al. Science, 1996. 274(5289): p. 948-953; Ellenberger, T.E., et al., Cell, 1992. 71(7): p. 1223-1237). Los dominios alfahelicoidales y otras características estructurales de la proteína se estabilizan con frecuencia mediante secuencias de armazón en el resto de la proteína, que facilitan la formación y/o el mantenimiento de una estructura helicoidal, por ejemplo, una estructura a-helicoidal. Cuando se saca de contexto, los motivos de péptidos a-helicoidales pueden desplegarse, lo que lleva a la pérdida de actividad biológica. Los desafíos críticos en el desarrollo de péptidos ahelicoidales incluyen promover y/o mantener su estructura a-helicoidal natural y preparar péptidos que puedan resistir la degradación proteolítica, ácida y térmica, y así permanecer intactos in vivo.

El argollado de hidrocarburos se refiere a un proceso para reticular de manera estable un polipéptido a través de al menos dos aminoácidos sustituidos (o un enlace no nativo, por ejemplo, carbono-carbono, de dos aminoácidos naturales) que ayuda a otorgar conformacionalmente al nativo estructura secundaria de ese polipéptido. El argollado de hidrocarburos promueve y mantiene una estructura secundaria alfa-helicoidal en péptidos que favorecen termodinámicamente una estructura alfa-helicoidal. Esta estructura secundaria aumenta la resistencia del polipéptido a la escisión proteolítica y al calor, y también puede aumentar la hidrofobicidad. Por consiguiente, los polipéptidos argollados con hidrocarburos (estructuralmente restringidos, por ejemplo, reticulados) descritos en el presente documento tienen una actividad biológica mejorada en relación con un polipéptido argollado no hidrocarbonado correspondiente (no estructuralmente restringido). Los polipéptidos reticulados descritos en este documento pueden usarse terapéuticamente, por ejemplo, para tratar el cáncer.

Los polipéptidos argollados con hidrocarburos incluyen una ligadura (enlace) entre dos aminoácidos, la ligadura mejora significativamente la estructura secundaria helicoidal del polipéptido. Generalmente, la ligadura se extiende a lo largo de una o dos vueltas helicoidales (es decir, aproximadamente 3-3.6 o aproximadamente 7 aminoácidos). En consecuencia, los aminoácidos posicionados en i e i+3; i e i+4; o i e i+7 son candidatos ideales para la modificación química y la reticulación. Así, por ejemplo, donde un péptido tiene la secuencia ... X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9 ..., enlaces cruzados entre X1 y X4, o entre X1 y X5, o entre X1 y X8 son útiles como lo son los enlaces cruzados entre X2 y X5, o entre X2 y X6, o entre X2 y X9, etc. El uso de enlaces cruzados múltiples (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) también se ha logrado, lo que agrava los beneficios de los aductos argollados individuales (por ejemplo, mejora de la helicoidicidad y la actividad; mejora de la helicoidicidad y la estabilidad térmica; mejora de la helicoidicidad y la estabilidad del ácido; mejora de la helicoidicidad y las propiedades farmacológicas). El uso de enlaces cruzados "argollados" también se ha logrado, mediante el cual los enlaces dobles se hacen de un origen común (por ejemplo, X1, X5 y X9, donde X5 es el punto de anclaje para ambas argollas). Por lo tanto, la invención abarca la incorporación de uno o más enlaces cruzados dentro de la secuencia de polipéptidos para estabilizar aún más la secuencia o facilitar la estabilización estructural, resistencia proteolítica, estabilidad térmica, estabilidad ácida, propiedades farmacológicas y mejora de la actividad biológica de estiramientos de polipéptidos más largos.

En algunas realizaciones de la invención, las ligaduras, por ejemplo, argollas de hidrocarburos se usan para estabilizar estructuras distintas de las hélices. En tales casos, los extremos de las ligaduras se pueden colocar a intervalos distintos de i, i+3, i+4 e i+7.

En una realización, los polipéptidos modificados de la invención tienen la fórmula (I),

en donde;

cada Ri y R2 son independientemente H o un alquilo Ci a C10, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilalquilo o heterociclilalquilo;

R3 es alquilo, alquenilo, alquinilo; [R4---K--R4K cada uno de los cuales está sustituido con 0-6 R5;

R4 es alquilo, alquenilo o alquinilo;

R5 es halo, alquilo, OR⁶, N(R6)2, SR⁶, SOR⁶, SO2R6, CO2R6, R⁶, una unidad estructural fluorescente o un radioisótopo;

K es O, S, SO, SO2, CO, CO2, CONR⁶ o

R⁶ es H, alquilo o un agente terapéutico;

n es un número entero de 1-4;

x es un número entero de 2-10;

cada y es independientemente un número entero de 0-100;

z es un número entero de 1-10 (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10); y

cada Xaa es independientemente un aminoácido.

Los polipéptidos modificados pueden incluir una secuencia de aminoácidos que forma una alfa-hélice y es 30% o más idéntica a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-7; en donde X es cualquier aminoácido e identifica adicionalmente los residuos de aminoácidos que están unidos por una argolla de hidrocarburo, y B es norleucina. La ligadura puede incluir una unidad estructural alquilo, alquenilo o alquinilo (por ejemplo, alquilo C5, Cs o C11 o un alquenilo C5, Cs o C11, o alquinilo C5, Cs o C11). El aminoácido ligado puede estar disustituido en alfa (por ejemplo, C1-C3 o metilo).

En algunos casos, x es 2, 3 o 6.

En algunos casos, cada y es independientemente un número entero entre 3 y 15.

En algunos casos, cada y es independientemente un número entero entre 1 y 15.

En algunos casos, R1 y R2 son cada uno independientemente H o alquilo C1-C6.

En algunos casos, R1 y R2 son cada uno independientemente alquilo C1-C3.

En algunos casos, al menos uno de R1 y R2 son metilo. Por ejemplo, R1 y R2 son ambos metilo.

En algunos casos, R3 es alquilo (por ejemplo, alquilo Cs) y x es 3.

En algunos casos, R3 es alquilo C11 y x es 6.

En algunos casos, R3 es alquenilo (por ejemplo, alquenilo Cs) y x es 3.

En algunos casos, x es 6 y R3 es alquenilo C11.

En algunos casos, R3 es un alquilo, alquenilo o alquinilo de cadena lineal.

En algunos casos, R3 es --CH2-CH2-CH2-CH=CH-CH2-CH2-CH2--.

En ciertas realizaciones, los dos estereocentros alfa, alfa disustituidos están en la configuración R o en la configuración S (por ejemplo, reticulado i, i+4), o un estereocentro es R y el otro es S (por ejemplo, I, i+7 reticulado). Por lo tanto, donde la fórmula I se representa como

los estereocentros disustituidos C' y C "pueden estar ambos en la configuración R o ambos pueden estar en la configuración S, por ejemplo, cuando X es 3. Cuando x es 6, el estereocentro disustituido C' está en la configuración R y el C" el estereocentro disustituido está en la configuración S. El doble enlace R3 puede estar en la configuración estereoquímica E o Z.

En algunos casos, R3 es [R4--K--R4K y R4 es un alquilo, alquenilo o alquinilo de cadena lineal.

En algunas realizaciones, el polipéptido modificado comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50 o más aminoácidos de un dominio repetido o similar a repetido, por ejemplo, un dominio BCL9 HD2. Cada [Xaa]y es un péptido que puede comprender independientemente al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25 o más aminoácidos ácidos de un dominio repetido o similar a repetido, por ejemplo, un dominio HD2. [Xaa]x es un péptido que puede comprender 3 o 6 aminoácidos de un dominio repetido o similar a repetido.

El polipéptido modificado puede comprender 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más aminoácidos de un dominio repetido o similar a repetido, por ejemplo, un dominio HD2, por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-7, en donde dos aminoácidos que están separados por dos, tres o seis aminoácidos son reemplazados por sustitutos de aminoácidos que están unidos a través de R3. Por lo tanto, al menos dos aminoácidos pueden ser reemplazados por aminoácidos ligados o sustitutos de aminoácidos ligados. Por lo tanto, donde la fórmula (I) se representa como

[Xaa]y' y [Xaa]y- pueden comprender cada uno secuencias de polipéptidos de la misma o diferente repetición de heptad o dominios similares de repetición de heptad.

La invención presenta polipéptidos reticulados que comprenden 10 (11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más) aminoácidos de un dominio repetido o similar a repetido, por ejemplo, un dominio HD2, por ejemplo, un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-7 en donde los carbonos alfa de dos aminoácidos que están separados por dos, tres o seis aminoácidos están unidos mediante R3, uno de los dos carbonos alfa está sustituido por R1 y el otro está sustituido por R2 y cada uno está unido mediante enlaces peptídicos a aminoácidos adicionales.

En otra realización, los polipéptidos modificados de la invención tienen la fórmula (II),

en donde

cada R1 y R2 son independientemente H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo; heteroarilalquilo; o heterociclilalquilo;

cada n es independientemente un número entero de 1 a 15;

x es 2, 3 o 6

cada y es independientemente un número entero de 0 a 100;

z es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10);

cada Xaa es independientemente un aminoácido.

En otra realización más, los polipéptidos modificados de la invención tienen la fórmula (III),

en donde;

cada R1 y R2 son independientemente H, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilalquilo, cicloalquilalquilo, heteroarilalquilo o heterociclilalquilo;

R3 es alquilo, alquenilo, alquinilo; [R⁴--K--R⁴]n o una cadena lateral de aminoácidos natural; cada uno de los cuales está sustituido con 0-6 R5;

R4 es alquilo, alquenilo o alquinilo;

R⁵ es halo, alquilo, OR⁶, N(R6)2, SR⁶, SOR⁶, SO2R6, CO2R6, R⁶, una unidad estructural fluorescente o un radioisótopo;

K es O, S, SO, SO2, CO, CO2, CONR⁶ o

R⁶ es H, alquilo o un agente terapéutico;

R7 es alquilo, alquenilo, alquinilo; [R⁴--K--R⁴]n o una cadena lateral de aminoácidos natural; cada uno de los cuales está sustituido con 0-6 R5;

n es un número entero de 1-4;

x es un número entero de 2-10;

cada y es independientemente un número entero de 0 a 100;

z es un número entero de 1 a 10 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10); y

cada Xaa es independientemente un aminoácido.

También son contemplados por la invención los péptidos enlazados que se divulgan al menos en PCT/US2008/058575 (WO 2008/121767).

Los polipéptidos modificados pueden incluir una secuencia de aminoácidos que forma una alfa-hélice y es idéntica en un 20% o más, o contiene al menos 7 aminoácidos de una secuencia de aminoácidos, o al menos dos aminoácidos de una cara de una hélice formada por un péptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1-7; en donde X es cualquier aminoácido e identifica adicionalmente los residuos de aminoácidos que están unidos por una argolla de hidrocarburo, y B es norleucina. En ciertas realizaciones, los polipéptidos modificados pueden incluir una secuencia de aminoácidos que forma una alfa-hélice y es 30% o más idéntica a un péptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1-7. En ciertas realizaciones, la secuencia de aminoácidos en la alfa-hélice es 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% o más idéntica a un péptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1-7.

Aunque se han descrito ligaduras de hidrocarburos, también se prevén otras ligaduras. Por ejemplo, la ligadura puede incluir uno o más de una unidad estructural éter, tioéter, éster, amina o amida. En algunos casos, se puede incorporar una cadena lateral de aminoácidos de origen natural en la ligadura. Por ejemplo, una ligadura se puede acoplar con un grupo funcional como el hidroxilo en serina, el tiol en cisteína, la amina primaria en lisina, el ácido en aspartato o glutamato, o la amida en asparagina o glutamina. De acuerdo con esto, es posible crear una ligadura usando aminoácidos naturales en lugar de usar una ligadura hecha mediante el acoplamiento de dos aminoácidos no naturales. También es posible usar un solo aminoácido no natural junto con un aminoácido natural.

Se prevé además que la longitud de la ligadura se puede variar. Por ejemplo, se puede usar una longitud de ligadura más corta donde es deseable proporcionar un grado relativamente alto de restricción en la estructura secundaria, mientras que, en algunos casos, es deseable proporcionar menos restricción en la estructura secundaria y, por lo tanto, puede desearse una ligadura más larga. Se entiende además que la inserción de la ligadura en un sitio o en una secuencia de aminoácidos cuando la secuencia de aminoácidos no tiene tendencia a formar una hélice no dará como resultado la formación de la hélice.

Además, mientras que los ejemplos de ligaduras que abarcan desde los aminoácidos i a i+3, i a i+4; e i a i+7 se han descrito con el fin de proporcionar una ligadura que se encuentra principalmente en una sola cara de la alfa-hélice, las ligaduras se pueden sintetizar para abarcar cualquier combinación de números de aminoácidos para promover y/o mantener las estructuras que las alfa-hélices.

Como puede apreciar el experto en la materia, los métodos de síntesis de los compuestos de los descritos en el presente documento serán evidentes para los expertos en la materia. Además, los diversos pasos sintéticos se pueden realizar en una secuencia u orden alternativo para dar los compuestos deseados. Las transformaciones químicas sintéticas y las metodologías de grupos protectores (protección y desprotección) útiles para sintetizar los compuestos descritos en este documento son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, los descritos en R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T. W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); y L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995), y sus ediciones posteriores. El método específico de síntesis de los péptidos no es una limitación de la invención.

Síntesis de péptidos.

Los péptidos de esta invención pueden prepararse mediante métodos de síntesis química, que los expertos en la materia conocen bien y se describen en el presente documento. Véase, por ejemplo, Fields et al., Capítulo 3 en Synthetic Peptides: A User Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., Nueva York, N.Y., 1992, p. 77; y Bird, G. H., et al., Methods Enzymol 446, 369-86 (2008). Por lo tanto, los péptidos pueden sintetizarse usando las técnicas automatizadas de Merrifield de síntesis en fase sólida con el alfa-NH2 protegido por la química t-Boc o Fmoc usando aminoácidos protegidos de cadena lateral en, por ejemplo, un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems Modelo 430A o 431 o el sintetizador multicanal AAPPTEC A^p EX 396.

Una manera de hacer los péptidos descritos en este documento es usando síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS). El aminoácido C-terminal es unido a una resina de poliestireno reticulada a través de un enlace lábil ácido con una molécula enlazadora. Esta resina es insoluble en los disolventes utilizados para la síntesis, por lo que es relativamente simple y rápido eliminar el exceso de reactivos y subproductos. El extremo N está protegido con el grupo Fmoc, que es estable en ácido, pero extraíble por base. Cualquier grupo funcional de la cadena lateral está protegido con grupos estables a la base, lábiles a los ácidos.

También se pueden preparar péptidos más largos uniendo péptidos sintéticos individuales usando ligadura química nativa. Alternativamente, se pueden sintetizar péptidos sintéticos más largos mediante técnicas de ADN recombinante bien conocidas. Dichas técnicas se proporcionan en manuales estándar bien conocidos con protocolos detallados. Para construir una secuencia de codificación que codifica un péptido de esta invención, la secuencia de aminoácidos se traduce inversamente para obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos, preferiblemente con codones que son óptimos para el organismo en donde se va a expresar el gen. A continuación, se realiza una secuencia de codificación, típicamente sintetizando oligonucleótidos que codifican el péptido y cualquier elemento regulador, si es necesario. La secuencia de codificación se inserta en un vector de clonación adecuado y se transfecta en una célula huésped. Además, la célula huésped está diseñada para poder incorporar los aminoácidos no naturales para la argolla de hidrocarburos. El péptido se expresa luego en condiciones adecuadas apropiadas para el sistema de expresión y el huésped seleccionados. Véanse Liu et al. Proc. Nat. Acad. Sci (Estados Unidos), 94: 10092-10097 (1997). El péptido se purifica y se caracteriza por métodos estándar.

Los péptidos pueden prepararse de manera combinatoria de alto rendimiento, por ejemplo, usando un sintetizador combinatorio multicanal de alto rendimiento como el disponible de Advanced Chemtech/APPTTEC, Thuramed o CEM.

Definiciones

Un "agente" se entiende en el presente documento que incluye un compuesto terapéuticamente activo o un compuesto potencialmente terapéutico activo. Un agente puede ser un compuesto previamente conocido o desconocido. Como se usa en el presente documento, un agente es típicamente un compuesto no basado en células, sin embargo, un agente puede incluir un agente terapéutico biológico, por ejemplo, péptido o ácido nucleico terapéutico, citoquina, etc.

Como se usa en el presente documento, "mejora" o "tratamiento" se entiende que significa disminuir o disminuir al menos un signo, síntoma, indicación o efecto de una enfermedad o afección específica. La mejora y el tratamiento pueden requerir la administración de más de una dosis de un agente, ya sea solo o junto con otros agentes terapéuticos e intervenciones. La mejora o el tratamiento no requieren que la enfermedad o afección se cure.

El término "aminoácido" se refiere a una molécula que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo. Los aminoácidos adecuados incluyen, sin limitación, los isómeros D y L de los 20 aminoácidos naturales que se encuentran en los péptidos (por ejemplo, A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V (como se conoce por las abreviaciones de una letra)) así como los aminoácidos naturales y no naturales, incluidos los betaaminoácidos y aminoácidos a, a disustituidos, preparados por síntesis orgánica u otras rutas metabólicas y que pueden aplicarse para usos especializados como el aumento de la diversidad química, la funcionalidad, la capacidad de unión, la mimesis estructural y la estabilidad.

El término "cadena lateral de aminoácidos" o "grupo R de aminoácidos" se refiere a una unidad estructural unida al carbono a en un aminoácido. Por ejemplo, la cadena lateral de aminoácidos o el grupo R para alanina es metilo, la cadena lateral de aminoácidos para fenilalanina es fenilmetilo, la cadena lateral de aminoácidos para cisteína es tiometilo, la cadena lateral de aminoácidos para el aspartato es carboximetilo, la cadena lateral de aminoácidos para la tirosina es 4-hidroxifenilmetilo, etc. También se incluyen otras cadenas laterales de aminoácidos no naturales, por ejemplo, las que se producen en la naturaleza (por ejemplo, un metabolito de aminoácidos) o las que se fabrican sintéticamente (por ejemplo, un aminoácido alfa, alfa-disustituido, un beta-aminoácido).

Como se usa en el presente documento, se entiende que una muestra o sujeto "modificado en comparación con un control" tiene un nivel del analito o indicador de diagnóstico o terapéutico para ser detectado a un nivel que es estadísticamente diferente de una muestra con respecto a una muestra normal, no tratada o muestra de control. Las muestras de control incluyen, por ejemplo, células en cultivo, uno o más animales de prueba de laboratorio, o uno o más sujetos humanos. Los métodos para seleccionar y analizar muestras de control están dentro de la capacidad de los expertos en la materia. Un analito puede ser una sustancia natural que se expresa o produce característicamente por la célula u organismo o una sustancia producida por una construcción informadora (por ejemplo, p-galactosidasa o luciferasa). Dependiendo del método utilizado para la detección, la cantidad y la medición del cambio pueden variar. La determinación de la significación estadística está dentro de la capacidad de los expertos en la materia. "Coadministración", como se usa en el presente documento, se entiende como la administración de uno o más agentes a un sujeto de modo que los agentes estén presentes y activos en el sujeto al mismo tiempo. La administración conjunta no requiere la preparación de una mezcla de los agentes o la administración simultánea de los agentes.

Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la cual el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Por ejemplo, las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). También pueden producirse otras sustituciones de aminoácidos conservadas en las familias de cadenas laterales de aminoácidos, como cuando se sustituye una asparagina por ácido aspártico para modificar la carga de un péptido. Por lo tanto, un residuo de aminoácido predicho en un péptido de dominio h D2, por ejemplo, se reemplaza preferiblemente con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral u homólogos entre familias (por ejemplo, asparagina para ácido aspártico, glutamina para ácido glutámico). Los cambios conservadores pueden incluir además la sustitución de aminoácidos no naturales químicamente homólogos (es decir, un aminoácido hidrófobo no natural sintético en lugar de leucina, un aminoácido aromático no natural sintético en lugar de triptófano).

"Ponerse en contacto con una célula" se entiende en el presente documento como proporcionar un agente a una célula de prueba, por ejemplo, una célula por tratar en cultivo o en un animal, de modo que el agente o la célula aislada pueda interactuar con la célula de prueba o la célula por tratar, puede ser absorbida por la célula de prueba o la célula por tratar, y tiene un efecto sobre la célula de prueba o la célula por tratar. El agente o la célula aislada se puede administrar a la célula directamente (por ejemplo, mediante la adición del agente al medio de cultivo o mediante inyección en la célula o tejido de interés), o mediante la administración al organismo por una vía de administración enteral o parenteral para administración por circulación, linfática u otros medios.

Como se usa en el presente documento, "detectar", "detección" y similares indican un ensayo realizado para la identificación de un analito específico en una muestra, un producto de una construcción informadora en una muestra, o una actividad de un agente en una muestra.

Por "diagnóstico", como se usa en el presente documento, se hace referencia a una evaluación clínica u otra de la condición de un sujeto basada en observación, prueba o circunstancias para identificar a un sujeto que tiene una enfermedad, trastorno o afección basada en la presencia de al menos un signo o síntoma de la enfermedad, trastorno o afección. Típicamente, el diagnóstico usando el método de la invención incluye la observación del sujeto en busca de otros signos o síntomas de la enfermedad, trastorno o afección.

Los términos "cantidad efectiva" o "dosis efectiva" se refieren a esa cantidad de un agente para producir el resultado farmacológico, terapéutico o preventivo deseado. La cantidad farmacológicamente efectiva da como resultado la mejora de uno o más signos o síntomas de un trastorno proporcionado en este documento, o previene la propagación del trastorno. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva se refiere preferiblemente a la cantidad de un agente terapéutico que disminuye la tasa de propagación del cáncer, en al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o más en comparación con un sujeto control no tratado. Se puede requerir más de una dosis de un agente para proporcionar una dosis efectiva.

Como se usa en el presente documento, los términos "efectivo" y "efectividad" incluyen tanto la efectividad farmacológica como la seguridad fisiológica. La efectividad farmacológica se refiere a la capacidad del tratamiento para producir un efecto biológico deseado en el paciente. La seguridad fisiológica se refiere al nivel de toxicidad u otros efectos fisiológicos adversos a nivel celular, de órganos y/u organismos (a menudo denominados efectos secundarios) resultantes de la administración del tratamiento. Por otro lado, el término "inefectivo" indica que un tratamiento no proporciona suficiente efecto farmacológico para ser terapéuticamente útil, incluso en ausencia de efectos nocivos, al menos en la población no estratificada. (Tal tratamiento puede ser ineficaz en un subgrupo que puede identificarse por el perfil o los perfiles de expresión). "Menos efectivo" significa que el tratamiento da como resultado un nivel terapéuticamente más bajo de efectividad farmacológica y/o un nivel terapéuticamente mayor de efectos fisiológicos adversos.

Por lo tanto, en relación con la administración de un fármaco, un fármaco que es "efectivo" contra una enfermedad o afección indica que la administración de una manera clínicamente apropiada da como resultado un efecto beneficioso para al menos una fracción estadísticamente significativa de pacientes, tales como una mejora de los síntomas, una cura, una reducción de los signos o síntomas de la enfermedad, la extensión de la vida, la mejora de la calidad de vida u otro efecto generalmente reconocido como positivo por los médicos familiarizados con el tratamiento del tipo particular de enfermedad o afección.

Como se usa en el presente documento, la "cara" de una hélice, por ejemplo, una alfa-hélice o una hélice 310, se entiende como los aminoácidos que están "apilados" en una hélice de una proteína para que cuando la hélice esté colocada verticalmente, los aminoácidos en una sola cara se representan como uno encima del otro. Por ejemplo, una alfa-hélice tiene alrededor de 3.6 aminoácidos por vuelta. Por lo tanto, cuando un péptido que tiene una secuencia abcdefga'b'c'd'e'f'g 'forma una alfa-hélice, los aminoácidos cuarto y quinto (i+3 e i+4), es decir, los aminoácidos d y e, se "acumularán" sobre el primer aminoácido (posición 1 -3. 6 aminoácidos), y el octavo aminoácido, el aminoácido a' (i+7), se acumulará sobre el aminoácido a para formar una cara de la hélice y comenzando una nueva vuelta con el aminoácido a'. En una alfa-hélice, el aminoácido b, el segundo aminoácido, se "apilará" con los aminoácidos quinto y sexto, es decir, los aminoácidos e y f en las posiciones 3 y 4, y con el aminoácido b' en la posición 7 para formar una cara de la hélice. Las caras en hélices que comienzan con el aminoácido c, d, e, f y g se pueden determinar fácilmente con base en la divulgación anterior. Además, la cara de una hélice puede incluir dos columnas adyacentes, tres adyacentes o cuatro adyacentes de residuos "apilados".

Un ejemplo de una "cara" de una hélice incluye la "cara interactiva" de la hélice. Un residuo de aminoácido de "cara interactiva" es un residuo que hace contacto con una o más hélices en el haz de hélices, da como resultado la supresión o la supresión sustancial de la actividad funcional del polipéptido. La supresión sustancial se entiende como la reducción de la actividad funcional de un péptido BCL9 a menos de aproximadamente 50%, menos de aproximadamente 40%, menos de aproximadamente 30% del péptido de tipo salvaje en un ensayo apropiado. Las unidades estructurales de aminoácidos de la cara que interactúa de los péptidos BCL9 se pueden determinar fácilmente mediante métodos bien conocidos en la técnica y se describen en el presente documento. En una realización, un residuo de aminoácido esencial está en la posición "a" o "d" de un dominio BCL9 HD2, mientras que los aminoácidos no esenciales pueden aparecer en una posición "b", "c", "e", "f" o "g". El término residuo de aminoácido de "cara interactiva", como se usa en el presente documento, incluye sustituciones conservadoras de los aminoácidos de la cara que interactúa que no interrumpen la función de la secuencia. Generalmente, los residuos de aminoácidos de la "cara interactiva" se encuentran en la cara interactiva de la alfa-hélice.

Los análogos de dominio BLC9, similar a BCL9 y HD2 y dominio HD2 son fácilmente identificables por aquellos que poseen habilidades ordinarias en la técnica por homología basada en secuencia, homología estructural y/u homología funcional. Dichos métodos son bien conocidos en la técnica e incluyen programas de bioinformática basados en correlaciones de residuos por pares (por ejemplo, ch.embnet.org/software/COILS_form.html), que tienen la capacidad de reconocer bobinas de secuencias de proteínas y modelar sus estructuras (véase Lupas, A., et al. Science 1991. 252(5009); p. 1162-1164).

En una realización, el polipéptido modificado de la invención es 20% o más similar en la cara que interactúa con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-7. En otra realización, el polipéptido modificado de la invención es 30% o más similar en la cara que interactúa con la secuencia de aminoácidos de SEQ ED NO: 1-7. En otra realización, el polipéptido modificado de la invención es 40% o más similar en la cara que interactúa con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-7. En otra realización, el polipéptido modificado de la invención es 50% o más similar en la cara que interactúa con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-7. En otra realización, el polipéptido modificado de la invención es 60% o más similar en la cara que interactúa con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-7. En otra realización, el polipéptido modificado de la invención es 70% o más similar en la cara que interactúa con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-7. En otra realización, el polipéptido modificado de la invención es 80% o más similar en la cara que interactúa con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-7. En otra realización, el polipéptido modificado de la invención es 90% o más similar en la cara que interactúa con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-7. La cara que interactúa del péptido BCL9 puede ser la cara que interactúa con la p-catenina. La "cara de interacción" de la alfa-hélice incluye aquellos residuos de aminoácidos que interactúan con otros residuos de aminoácidos en otras proteínas y/o en otras hélices. Los métodos para identificar repeticiones y los residuos de la cara que interactúa son bien conocidos en la técnica y se describen en este documento.

Como se usa en el presente documento, el término "argollado de hidrocarburos" se refiere a un proceso para reticular de manera estable un polipéptido que tiene al menos dos aminoácidos que ayuda a otorgar conformacionalmente la estructura secundaria nativa de ese polipéptido. El argollado de hidrocarburos promueve o mantiene una estructura secundaria helicoidal en un péptido predispuesto a tener una estructura secundaria helicoidal, por ejemplo, estructura secundaria alfa-helicoidal, para lograr o mantener su conformación alfa-helicoidal nativa. Esta estructura secundaria aumenta la resistencia del polipéptido a la escisión proteolítica y al calor, y también puede aumentar la hidrofobicidad.

Los polipéptidos argollados con hidrocarburos incluyen una o más ligaduras (enlaces) entre dos aminoácidos no naturales (o un enlace no nativo, por ejemplo, carbono-carbono, de dos aminoácidos naturales), ligadura que aumenta significativamente la estructura secundaria helicoidal del polipéptido. En general, para promover una estructura helicoidal, la ligadura se extiende a lo largo de uno o dos giros helicoidales (es decir, aproximadamente 3, 4 o 7 aminoácidos). En consecuencia, los aminoácidos posicionados en i e i+3; i e i+4; o i e i+7 son candidatos ideales para la modificación química y la reticulación. Así, por ejemplo, donde un péptido tiene la secuencia ... X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9 ..., y el aminoácido X se selecciona independientemente para cada posición, enlaces cruzados entre X1 y X4, o entre X1 y X5, o entre X1 y X8 son útiles como lo son los enlaces cruzados entre X2 y X5, o entre X2 y X6, o entre X2 y X9, etc. El uso de enlaces cruzados múltiples (por ejemplo, 2, 3, 4 o más) también se contempla. El uso de múltiples enlaces cruzados es efectivo para estabilizar y optimizar el péptido, especialmente al aumentar la longitud del péptido. El uso de enlaces cruzados "argollados" también se ha logrado mediante el cual los enlaces dobles se hacen de un origen común (por ejemplo, X1, X5 y X9, donde X5 es el punto de anclaje para ambas argollas). Por lo tanto, la invención abarca la incorporación de uno o más enlaces cruzados dentro de la secuencia de polipéptidos. El uso de múltiples enlaces cruzados es efectivo para estabilizar y optimizar el péptido, especialmente al aumentar la longitud del péptido. Por lo tanto, la invención abarca la incorporación de uno o más enlaces cruzados dentro de una secuencia de polipéptidos, incluyendo enlaces cruzados argollados en los que surgen dos argollas de un origen común.

Como se usa en el presente documento, el término "escaneo de argollas" se refiere a la síntesis de una biblioteca de péptidos argollados mediante la cual la ubicación de i e i+3; i e i+4; e i e i+7 argollas simples o múltiples, o enlaces, se colocan secuencialmente a lo largo de la secuencia del péptido, muestreando todas las posiciones posibles, para identificar las propiedades y actividades deseadas u óptimas para los constructos argollados o enlazados.

Como se usa en el presente documento, los términos "identidad" o "porcentaje de identidad" se refieren a la similitud de secuencia de subunidades entre dos moléculas poliméricas, por ejemplo, dos polinucleótidos o dos polipéptidos. Cuando una posición de subunidad en las dos moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica, por ejemplo, si una posición en cada uno de los dos péptidos está ocupada por serina, entonces son idénticos en esa posición. La identidad entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones coincidentes o idénticas, por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, 5 posiciones en un polímero de 10 subunidades de longitud), de las posiciones en dos secuencias de péptidos o compuestos son idénticas, entonces las dos secuencias son 50% idénticas; si el 90% de las posiciones, por ejemplo, 9 de 10 coinciden, las dos secuencias comparten el 90% de identidad de secuencia. La identidad entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones coincidentes o idénticas. Por lo tanto, si una parte de la secuencia de referencia se elimina en un péptido en particular, esa sección eliminada no se cuenta con el propósito de calcular la identidad de la secuencia. La identidad a menudo se mide utilizando un software de análisis de secuencias, por ejemplo, BLASTN o BLASTP (disponible en (www.ncbi.nih.gov/BLAST). Los parámetros predeterminados para comparar dos secuencias (por ejemplo, someter a "Blast" dos secuencias entre sí), por BLASTN (para secuencias de nucleótidos) son recompensa por coincidencia = 1, penalización por falta de coincidencia = -2, brecha abierta = 5, brecha de extensión = 2. Cuando se usa BLASTP para secuencias de proteínas, los parámetros predeterminados son recompensa por coincidencia = 0, penalización por falta de coincidencia = 0, brecha abierta = 11, y brecha de extensión = 1. En la técnica se conocen programas informáticos adicionales para determinar la identidad.

Como se usa en el presente documento, "aislado" o "purificado" cuando se usa en referencia a un polipéptido significa que un polipéptido o proteína natural se ha eliminado de su entorno fisiológico normal (por ejemplo, proteína aislada de plasma o tejido) o se sintetiza en un ambiente no natural (por ejemplo, sintetizado artificialmente en un sistema de traducción in vitro o usando síntesis química). Por lo tanto, un polipéptido "aislado" o "purificado" puede estar en una solución libre de células o colocado en un entorno celular diferente (por ejemplo, expresado en un tipo de célula heteróloga). El término "purificado" no implica que el polipéptido sea el único polipéptido presente, sino que es esencialmente libre (aproximadamente 90-95%, hasta 99-100% puro) de material celular u orgánico asociado naturalmente con él, y por lo tanto se distingue del polipéptido natural. Del mismo modo, un ácido nucleico aislado se elimina de su entorno fisiológico normal. "Aislada" cuando se usa en referencia a una célula significa que la célula está en cultivo (es decir, no en un animal), ya sea cultivo celular o cultivo de órganos, de una célula primaria o línea celular. Las células pueden aislarse de un animal normal, un animal transgénico, un animal que tiene cambios genéticos espontáneos y/o un animal que tiene una enfermedad o afección genética y/o inducida.

Como se usa en el presente documento, se entiende que los "kits" contienen al menos un reactivo de laboratorio no estándar para su uso en los métodos de la invención. Por ejemplo, un kit puede incluir al menos uno de, preferiblemente al menos dos de al menos un péptido, e instrucciones de uso, todo en un embalaje apropiado. El kit puede incluir además cualquier otro componente requerido para practicar el método de la invención, como polvos secos, soluciones concentradas o soluciones listas para usar. En algunas realizaciones, el kit comprende uno o más recipientes que contienen reactivos para usar en los métodos de la invención; dichos recipientes pueden ser cajas, ampollas, botellas, viales, tubos, bolsas, bolsillos, blísteres u otras formas de recipientes adecuados conocidos en la técnica. Dichos recipientes pueden estar hechos de plástico, vidrio, papel laminado, papel de aluminio u otros materiales adecuados para contener reactivos.

Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede ser alterado a partir de la secuencia de tipo salvaje de un polipéptido sin suprimir o alterar sustancialmente su actividad/estructura secundaria (estructura alfa-helicoidal). "Obtención" se entiende en este documento como la fabricación, la compra o la posesión de otra manera.

Como se usa en el presente documento, "unido operativamente" se entiende como unido, preferiblemente por un enlace covalente, por ejemplo, uniendo un extremo amino de un péptido a un extremo carboxilo de otro péptido, de manera que los dos o más componentes que están operativamente unidos o retienen su actividad original, o ganan una actividad al unirse de manera que la actividad de las porciones operativamente unidas se puede analizar y tener actividad detectable usando al menos uno de los métodos proporcionados en los ejemplos.

La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" es reconocida en la técnica e incluye un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, adecuado para administrar compuestos de la presente invención a mamíferos. Los vehículos incluyen material de relleno líquido o sólido, diluyente, excipiente, disolvente o material de encapsulación, involucrado en portar o transportar el agente objetivo desde un órgano, o parte del cuerpo, a otro órgano, o parte del cuerpo. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no ser perjudicial para el paciente. Por ejemplo, los vehículos farmacéuticamente aceptables para la administración de células típicamente son vehículos aceptables para la administración por inyección, y no incluyen agentes tales como detergentes u otros compuestos que podrían dañar las células que se administren. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes reguladores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; la solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones reguladoras de fosfato; y otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.

Agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en las composiciones.

Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, a-tocoferol y similares; y agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.

Las formulaciones de la presente invención incluyen aquellas adecuadas para administración oral, nasal, tópica, transdérmica, bucal, sublingual, intramuscular, intraperotineal, rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquier método bien conocido en la técnica de la farmacia. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una sola forma de dosificación generalmente será la cantidad del compuesto que produce un efecto terapéutico.

Como se usa en el presente documento, se entiende que "pluralidad" significa más de uno. Por ejemplo, una pluralidad se refiere al menos a dos, tres, cuatro, cinco o más.

Un "polipéptido" o "péptido" como se usa en el presente documento se entiende como dos o más aminoácidos naturales o no naturales seleccionados independientemente unidos por un enlace covalente (por ejemplo, un enlace peptídico). Un péptido puede incluir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos naturales o no naturales unidos por enlaces peptídicos. Los polipéptidos como se describen en el presente documento incluyen proteínas de longitud completa (por ejemplo, proteínas completamente procesadas) así como secuencias de aminoácidos más cortas (por ejemplo, fragmentos de proteínas naturales o fragmentos de polipéptidos sintéticos).

Una "muestra", como se usa en el presente documento, se refiere a un material biológico que está aislado de su entorno (por ejemplo, sangre o tejido de un animal, células o medios condicionados del cultivo de tejidos) y se sospecha que contiene, o se sabe que contiene un analito, como un virus, un anticuerpo o un producto de un constructo informador. Una muestra también puede ser una fracción parcialmente purificada de un tejido o fluido corporal. Una muestra de referencia puede ser una muestra "normal", de un donante que no tiene la enfermedad o el fluido de la condición, o de un tejido normal en un sujeto que tiene la enfermedad o la condición (por ejemplo, tejido no infectado frente a un tejido infectado). Una muestra de referencia también puede ser de un donante no tratado o cultivo celular no tratado con un agente activo (por ejemplo, sin tratamiento o administración de vehículo solamente). También se puede tomar una muestra de referencia en un "punto de tiempo cero" antes de poner en contacto la célula o el sujeto con el agente por analizar.

"Similitud" o "porcentaje de similitud" en el contexto de dos o más secuencias de polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos, o sustituciones conservadoras de los mismos, que son iguales cuando se comparan y se alinean para obtener la correspondencia máxima, medida con uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias, o mediante inspección visual.

El término "estable" o "estabilizado", como se usa en este documento con referencia a un polipéptido, se refiere a polipéptidos que han sido argollados con hidrocarburos para promover y/o mantener la estructura helicoidal y/o mejorar la resistencia a la proteasa y/o mejorar estabilidad a ácido y/o mejorar la estabilidad térmica y/o mejorar las propiedades farmacológicas. Los polipéptidos estabilizados son un tipo de polipéptidos estructuralmente restringidos.

Como se usa en el presente documento, se entiende que los "péptidos estructuralmente restringidos" y similares incluyen péptidos modificados que tienen cualquier modificación química (es decir, al menos una), por ejemplo, mutación de la secuencia original o nativa con un aminoácido natural o no natural; modificación química para incorporar una ligadura molecular; modificación química para promover la formación de un puente disulfuro; etc., de modo que el péptido estructuralmente restringido adopta un número más limitado de estructuras que el péptido no modificado. Un péptido estructuralmente restringido puede incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más mutaciones en comparación con la secuencia nativa de tipo salvaje. Por ejemplo, las ligaduras moleculares pueden incluir argollas de hidrocarburos para promover la formación de estructuras helicoidales estables, especialmente estructuras alfa-helicoidales y 310, o angulaciones dependiendo de las posiciones de los extremos de las ligaduras y las longitudes de las ligaduras. Los aminoácidos naturales o no naturales se pueden emplear para promover angulaciones (por ejemplo, curvas en la estructura según lo definido por los ángulos variables entre las dos estructuras adyacentes) u otras confirmaciones preferidas. Por ejemplo, la prolina de aminoácidos naturales puede inducir una deformación en un péptido debido a la estructura del grupo de aminoácidos R y la falta de un donante de enlace de hidrógeno. Los aminoácidos no naturales, particularmente aquellos que tienen grupos R grandes y/o cargados, o amidas N-metiladas, glicinas N-sustituidas, alfa cíclico, disustitución alfa, disustitución cíclica en N,N- y beta-aminoácidos pueden promover confirmaciones específicas, deseadas. Se entiende que una población de péptidos "estructuralmente restringidos" en solución puede no tener la confirmación deseada todo el tiempo. En cambio, en una población de péptidos estructuralmente restringidos en solución, la confirmación deseada está presente al menos aproximadamente 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% o más del tiempo que la secuencia de péptidos nativa u original en solución antes de la modificación química. La estructura de una población de péptidos en solución se puede determinar mediante varios métodos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, dicroísmo circular y espectroscopía de RMN. La cristalografía de rayos X se puede aplicar para determinar la estructura de un péptido restringido cuando se empaqueta en forma de cristal.

"Molécula pequeña", como se usa en el presente documento, se entiende como un compuesto, típicamente un compuesto orgánico, que tiene un peso molecular de no más de aproximadamente 1500 Da, 1000 Da, 750 Da o 500 Da. En una realización, una molécula pequeña no incluye un polipéptido o ácido nucleico que incluye solo aminoácidos y/o nucleótidos naturales.

Un agente, polipéptido, ácido nucleico u otro compuesto "se une específicamente" a una molécula diana, por ejemplo, antígeno, polipéptido, ácido nucleico u otro compuesto, cuando la molécula diana se une con al menos 100 veces, preferiblemente a al menos 500 veces, preferiblemente al menos 1000 veces, preferiblemente al menos 5000 veces, preferiblemente al menos 10.000 veces preferiblemente en comparación con un compuesto no específico, o un conjunto de compuestos no específicos. Específicamente, las uniones pueden usarse en relación con la unión de uno de dos o más compuestos relacionados que tienen estructuras relacionadas físicamente. Las preferencias y afinidades de unión, absolutas o relativas, se pueden determinar, por ejemplo, determinando la afinidad para cada par por separado o mediante el uso de ensayos de competencia u otros métodos bien conocidos por los expertos en la materia.

Un "sujeto" como se usa en el presente documento se refiere a organismos vivos. En ciertas realizaciones, el organismo vivo es un animal. En ciertas realizaciones preferidas, el sujeto es un mamífero. En ciertas realizaciones, el sujeto es un mamífero domesticado. Ejemplos de sujetos incluyen humanos, monos, perros, gatos, ratones, ratas, vacas, caballos, cabras y ovejas. Un sujeto humano también puede ser denominado paciente.

Un sujeto "que padece o se sospecha que padece" una enfermedad, afección o síndrome específico tiene una cantidad suficiente de factores de riesgo o presenta una cantidad o combinación suficiente de signos o síntomas de la enfermedad, afección o síndrome de tal forma que una persona competente diagnosticaría o sospecharía que el sujeto padecía la enfermedad, afección o síndrome.

"Cantidad terapéuticamente efectiva", como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad de un agente que es efectivo, tras la administración de dosis única o múltiple a la célula o sujeto, para prolongar la supervivencia del paciente con dicho trastorno, reduciendo uno o más signos o síntomas del trastorno, previniendo o retrasando la infección, previniendo o retrasando la progresión de una enfermedad o trastorno y similares más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento.

Se puede administrar un agente a un sujeto, solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos, como una composición farmacéutica en mezcla con un excipiente convencional, por ejemplo, un vehículo farmacéuticamente aceptable, o tratamientos terapéuticos.

Los agentes farmacéuticos pueden administrarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica, por ejemplo, cómo se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1985). Las formulaciones para administración parenteral pueden contener como excipientes comunes tales como agua estéril o solución salina, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. En particular, el polímero de lactida biocompatible, biodegradable, el copolímero de lactida/glicólido o los copolímeros de polioxietilenopolioxipropileno pueden ser excipientes útiles para controlar la liberación de ciertos agentes.

Se apreciará que las cantidades preferidas reales de compuestos activos usadas en una terapia dada variarán de acuerdo con, por ejemplo, el compuesto específico que se utiliza, la composición particular formulada, el modo de administración y las características del sujeto, por ejemplo, la especie, sexo, peso, estado general de salud y edad del sujeto. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente las tasas de administración óptimas para un protocolo de administración dado usando pruebas de determinación de dosis convencionales realizadas con respecto a las pautas anteriores.

Como se usa en el presente documento, "susceptible a" o "propenso a" o "predispuesto a" una enfermedad o afección específica y similares se refiere a un individuo que, con base en factores genéticos, ambientales, de salud y/u otros factores de riesgo, es más probable que desarrolle una enfermedad o afección que la población general. Un aumento en la probabilidad de desarrollar una enfermedad puede ser un aumento de aproximadamente 10%, 20%, 50%, 100%, 150%, 200% o más.

El término "alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo que puede ser una cadena lineal o una cadena ramificada, que contiene el número indicado de átomos de carbono. Por ejemplo, C1-C10 indica que el grupo puede tener de 1 a 10 átomos de carbono (inclusive) en él. En ausencia de cualquier designación numérica, "alquilo" es una cadena (lineal o ramificada) que tiene de 1 a 20 (inclusive, es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20) átomos de carbono en el mismo. El término "alquileno" se refiere a un alquilo divalente (es decir, --R--).

El término "alquenilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo que puede ser una cadena lineal o una cadena ramificada que tiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono. La unidad estructural alquenilo contiene el número indicado de átomos de carbono. Por ejemplo, C2-C10 indica que el grupo puede tener de 2 a 10 átomos de carbono (inclusive) en él. El término "alquenilo inferior" se refiere a una cadena alquenilo C2-C8. En ausencia de cualquier designación numérica, "alquenilo" es una cadena (lineal o ramificada) que tiene de 2 a 20 átomos de carbono (inclusive).

El término "alquinilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo que puede ser una cadena lineal o una cadena ramificada que tiene uno o más triples enlaces carbono-carbono. La unidad estructural alquinilo contiene el número indicado de átomos de carbono. Por ejemplo, C2-C10 indica que el grupo puede tener de 2 a 10 átomos de carbono (inclusive) en él. El término "alquinilo inferior" se refiere a una cadena de alquinilo C2-C8. En ausencia de cualquier designación numérica, "alquinilo" es una cadena (lineal o ramificada) que contiene de 2 a 20 átomos de carbono (inclusive).

El término "arilo" se refiere a un sistema de anillo aromático monocíclico de 6 carbonos o bicíclico de 10 carbonos en donde 0, 1, 2, 3 o 4 átomos de cada anillo pueden estar sustituidos por un sustituyente. Ejemplos de grupos arilo incluyen fenilo, naftilo y similares. El término "arilalquilo" o el término "aralquilo" se refiere a alquilo sustituido con un arilo. El término "arilalcoxi" se refiere a un alcoxi sustituido con arilo.

El término "cicloalquilo" como se emplea en este documento incluye grupos hidrocarburo cíclicos saturados y parcialmente insaturados que tienen de 3 a 12 carbonos, preferiblemente de 3 a 8 carbonos, y más preferiblemente de 3 a 6 carbonos, en donde el grupo cicloalquilo adicionalmente puede estar opcionalmente sustituido. Los grupos cicloalquilo preferidos incluyen, sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentenilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, cicloheptilo y ciclooctilo.

El término "halo" se refiere a cualquier radical de flúor, cloro, bromo o yodo.

El término "heteroarilo" se refiere a un sistema de anillo aromático monocíclico de 5-8 miembros, bicíclico de 8-12 miembros o tricíclico de 11-14 miembros que tiene 1-3 heteroátomos si es monocíclico, 1-6 heteroátomos si es bicíclico o 1- 9 heteroátomos si son tricíclicos, dichos heteroátomos seleccionados de O, N o S (por ejemplo, átomos de carbono y 1-3, 1-6 o 1-9 heteroátomos de N, O o S si son monocíclicos, bicíclicos o tricíclicos, respectivamente), en donde 0, 1, 2, 3 o 4 átomos de cada anillo pueden estar sustituidos por un sustituyente. Ejemplos de grupos heteroarilo incluyen piridilo, furilo o furanilo, imidazolilo, bencimidazolilo, pirimidinilo, tiofenilo o tienilo, quinolinilo, indolilo, tiazolilo y similares. El término "heteroarilalquilo" o el término "heteroaralquilo" se refiere a un alquilo sustituido con un heteroarilo. El término "heteroarilalcoxi" se refiere a un alcoxi sustituido con heteroarilo.

El término "heterociclilo" se refiere a un sistema de anillo monocíclico no aromático de 5-8 miembros, bicíclico de 8­ 12 miembros o tricíclico de 11-14 miembros que tiene 1-3 heteroátomos si es monocíclico, 1-6 heteroátomos si es bicíclico o 1- 9 heteroátomos si son tricíclicos, dichos heteroátomos seleccionados de O, N o S (por ejemplo, átomos de carbono y 1-3, 1-6 o 1-9 heteroátomos de N, O o S si son monocíclicos, bicíclicos o tricíclicos, respectivamente), en donde 0, 1, 2 o 3 átomos de cada anillo pueden estar sustituidos por un sustituyente. Ejemplos de grupos heterociclilo incluyen piperazinilo, pirrolidinilo, dioxanilo, morfolinilo, tetrahidrofuranilo y similares.

El término "sustituyentes" se refiere a un grupo "sustituido" en un grupo alquilo, cicloalquilo, arilo, heterociclilo o heteroarilo en cualquier átomo de ese grupo. Los sustituyentes adecuados incluyen, sin limitación, grupos halo, hidroxi, mercapto, oxo, nitro, haloalquilo, alquilo, alcarilo, arilo, aralquilo, alcoxi, tioalcoxi, ariloxi, amino, alcoxicarbonilo, amido, carboxilo, alcanosulfonilo, alquilcarbonilo y ciano.

Se entiende que los intervalos proporcionados en el presente documento son abreviaciones para todos los valores dentro del intervalo. Esto incluye todas las secuencias individuales cuando se proporciona un rango de SEQ ID NOs: Por ejemplo, se entiende que un rango de 1 a 50 incluye cualquier número, combinación de números o sub-rango del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50.

A menos que se indique específicamente o sea obvio por el contexto, como se usa en el presente documento, se entiende que el término "o" es inclusivo.

A menos que se indique específicamente o sea obvio por el contexto, como se usa en el presente documento, los términos "un", "una" y "el/la" se entienden en singular o plural.

A menos que se indique específicamente o sea obvio por el contexto, como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" se entiende dentro de un rango de tolerancia normal en la técnica, por ejemplo, dentro de 2 desviaciones estándar de la media. Aproximadamente se puede entender como dentro del 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% o 0.01% de valor establecido. A menos que el contexto aclare lo contrario, todos los valores numéricos proporcionados en este documento pueden modificarse con el término aproximadamente.

La citación de una lista de grupos químicos en cualquier definición de una variable en el presente documento incluye definiciones de esa variable como cualquier grupo único o combinación de grupos listados. La citación de una realización para una variable o aspecto en el presente documento incluye esa realización como cualquier realización individual o en combinación con cualquier otra realización o partes de la misma.

El símbolo

cuando se usa como parte de una estructura molecular se refiere a un enlace simple o un enlace doble trans o cis. Cualquier composición o método proporcionado en este documento puede combinarse con una o más de cualquiera de las otras composiciones y métodos proporcionados en este documento.

Composiciones farmacéuticas y vías de administración.

Uno o más péptidos estructuralmente restringidos de la presente invención se pueden usar en una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno proporcionado aquí. El método de tratamiento proporcionado en este documento se puede realizar usando una combinación de péptidos estructuralmente restringidos, que se pueden seleccionar y combinar para tratar el trastorno en el sujeto. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la presente invención puede incluir 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más péptidos estructuralmente restringidos. Los péptidos estructuralmente restringidos también se pueden combinar con otros agentes, por ejemplo, agentes anticancerígenos o inhibidores de la angiogénesis.

Como se usa en el presente documento, los compuestos de esta invención se definen para incluir derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. Un "derivado farmacéuticamente aceptable" significa cualquier sal, éster, sal de un éster u otro derivado farmacéuticamente aceptable de un compuesto de esta invención que, tras la administración a un receptor, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto de esta invención. Los derivados particularmente favorecidos son aquellos que aumentan la biodisponibilidad de los compuestos de esta invención cuando tales compuestos se administran a un mamífero (por ejemplo, permitiendo que un compuesto administrado por vía oral se absorba más fácilmente en la sangre, para aumentar la estabilidad del suero o disminuir la velocidad de eliminación del compuesto) o que mejoran la administración del compuesto original a un compartimento biológico (por ejemplo, el cerebro o el sistema linfático) en relación con la especie original. Los derivados incluyen derivados en los que un grupo que mejora la solubilidad acuosa o el transporte activo a través de la membrana intestinal se adjunta a la estructura de las fórmulas descritas aquí.

Los compuestos de esta invención pueden modificarse añadiendo funcionalidades apropiadas para mejorar las propiedades biológicas selectivas. Dichas modificaciones son conocidas en la técnica e incluyen aquellas que aumentan la penetración biológica en un compartimento biológico dado (por ejemplo, sangre, sistema linfático, sistema nervioso central), aumentan la disponibilidad oral, aumentan la solubilidad para permitir la administración por inyección, alteran el metabolismo y alteran la velocidad de excreción. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de esta invención incluyen las derivadas de ácidos y bases inorgánicos y orgánicos farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de sales ácidas adecuadas incluyen acetato, adipato, benzoato, bencenosulfonato, butirato, citrato, digluconato, dodecilsulfato, formiato, fumarato, glicolato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, lactato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, palmoato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, salicilato, succinato, sulfato, tartrato, tosilato y undecanoato. Las sales derivadas de bases apropiadas incluyen sales de metales alcalinos (por ejemplo, sodio), metales alcalinotérreos (por ejemplo, magnesio), amonio y N-(alquil)4+. Esta invención también prevé la cuaternización de cualquier grupo básico que contenga nitrógeno de los compuestos descritos aquí. Se pueden obtener productos solubles o dispersables en agua o aceite mediante dicha cuaternización.

Los compuestos de la invención pueden administrarse, por ejemplo, por inyección, por vía intravenosa, intraarterial, subdérmica, intraperitoneal, intramuscular o subcutánea; o por vía oral, bucal, nasal, transmucosa, intravaginal, cervical, tópica, en una preparación oftálmica, o por inhalación, con una dosis que varía de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, o de acuerdo con los requisitos del medicamento particular y más preferiblemente de 0.5-10 mg/kg de peso corporal. Los métodos del presente documento contemplan la administración de una cantidad efectiva de compuesto o composición de compuesto para lograr el efecto deseado o establecido.

La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con los materiales de vehículo para producir una forma de dosificación única variará dependiendo del huésped tratado y el modo particular de administración. Una preparación típica contendrá de aproximadamente 1% a aproximadamente 95% de compuesto activo (p/p). Alternativamente, tales preparaciones contienen de aproximadamente 20% a aproximadamente 80% de compuesto activo.

Pueden requerirse dosis más bajas o más altas que las mencionadas anteriormente. La dosis específica y los regímenes de tratamiento para cualquier paciente en particular dependerán de una variedad de factores, incluida la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la tasa de excreción, la combinación de medicamentos, la gravedad y el curso de la enfermedad, afección o síntomas, la disposición del paciente a la enfermedad, afección o síntomas y el criterio del médico tratante.

Tras la mejora de la condición de un paciente, se puede administrar una dosis de mantenimiento de un compuesto, composición o combinación de esta invención, si es necesario. Posteriormente, la dosis o frecuencia de administración, o ambas, pueden reducirse, en función de los síntomas, a un nivel en donde se conserve la condición mejorada. Sin embargo, los pacientes pueden requerir un tratamiento intermitente a largo plazo ante cualquier recurrencia de los síntomas de la enfermedad.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención comprenden compuestos de la invención o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos; un agente adicional que incluye, por ejemplo, uno o más agentes terapéuticos para la prevención y/o el tratamiento de un trastorno proporcionado aquí, particularmente para la prevención y/o el tratamiento del cáncer, y cualquier vehículo, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones alternativas de esta invención comprenden un compuesto de la invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y un vehículo, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones delineadas aquí incluyen los compuestos de la invención delineados aquí, así como agentes terapéuticos adicionales si están presentes, en cantidades efectivas para lograr una modulación de la enfermedad o síntomas de la enfermedad, incluyendo cáncer o síntomas de los mismos.

El término "vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo o adyuvante que puede administrarse a un paciente, junto con un compuesto de esta invención, y que no destruye la actividad farmacológica del mismo y no es tóxico cuando se administra en dosis suficiente para administrar una cantidad terapéutica del compuesto.

Los vehículos, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en las composiciones farmacéuticas de esta invención incluyen, pero no se limitan a, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, sistemas de administración de fármacos autoemulsionantes (SEDDS) tales como succinato de da.-tocoferol polietilenglicol 1000, tensioactivos utilizados en formas de dosificación farmacéutica como Tween® u otras matrices de suministro polimérico similares, proteínas séricas como albúmina sérica humana, sustancias reguladoras como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y lanolina. También se pueden usar ventajosamente ciclodextrinas tales como alfa, beta y gamma-ciclodextrina, para mejorar la administración de compuestos de las fórmulas descritas aquí.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar enteralmente, por ejemplo, por administración oral, parenteral, por inhalación, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante un depósito implantado, preferiblemente por administración oral o vaginal o administración por inyección. Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden contener cualquier vehículo, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable no tóxico convencional. En algunos casos, el pH de la formulación puede ajustarse con ácidos, bases o reguladores farmacéuticamente aceptables para mejorar la estabilidad del compuesto formulado o su forma de administración. El término parenteral, como se usa en el presente documento, incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intrarraquídea, intratecal, intralesiones e intracraneal.

Ejemplos de formas de dosificación incluyen, pero no se limitan a: tabletas; capsuletas, cápsulas, tales como cápsulas de gelatina elásticas blandas; obleas; trociscos; pastillas; dispersiones supositorios; ungüentos; cataplasmas (emplastos); pastas; polvos; apósitos; cremas; apósitos; soluciones; parches; aerosoles (por ejemplo, aerosoles nasales o inhaladores); geles; formas de dosificación líquidas adecuadas para administración oral o mucosa a un paciente, incluidas suspensiones (por ejemplo, suspensiones líquidas acuosas o no acuosas, emulsiones de aceite en agua o emulsiones líquidas de agua en aceite), soluciones y elíxires; formas de dosificación líquidas adecuadas para administración parenteral a un paciente; y sólidos estériles (por ejemplo, sólidos cristalinos o amorfos) que pueden reconstituirse para proporcionar formas de dosificación líquidas adecuadas para la administración parenteral a un paciente.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una preparación inyectable estéril, por ejemplo, como una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión puede formularse de acuerdo con técnicas conocidas en el arte usando agentes dispersantes o humectantes adecuados (tales como, por ejemplo, Tween® 80) y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden emplearse se encuentran el manitol, el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como solvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, como el ácido oleico y sus derivados de glicéridos, son útiles en la preparación de inyectables, al igual que los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, como el aceite de oliva o el aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones de aceite también pueden contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga, o carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares que se usan comúnmente en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables tales como emulsiones y/o suspensiones. Otros tensioactivos de uso común tales como Tweens o Spans y/u otros agentes emulsionantes similares o potenciadores de biodisponibilidad que se usan comúnmente en la fabricación de formas farmacéuticas sólidas, líquidas u otras formas farmacéuticas también pueden usarse para fines de formulación.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse por vía oral en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable que incluye, pero no se limita a, cápsulas, tabletas, emulsiones y suspensiones, dispersiones y soluciones acuosas. En el caso de las tabletas para uso oral, los vehículos que se usan comúnmente incluyen lactosa y almidón de maíz. Los agentes lubricantes, como el estearato de magnesio, también se suelen agregar. Para la administración oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando las suspensiones y/o emulsiones acuosas se administran por vía oral, el ingrediente activo se puede suspender o disolver en una fase oleosa y se combina con agentes emulsionantes y/o de suspensión. Si se desea, se pueden agregar ciertos agentes edulcorantes y/o aromatizantes y/o colorantes.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención también se pueden administrar en forma de supositorios para administración rectal. Estas composiciones pueden prepararse mezclando un compuesto de esta invención con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperatura ambiente pero líquido a la temperatura rectal y, por lo tanto, se fundirá en el recto para liberar los componentes activos. Dichos materiales incluyen, entre otros, manteca de cacao, cera de abejas y polietilenglicoles.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse por vía tópica o intravaginal. La composición farmacéutica se formulará con una pomada adecuada que contiene los componentes activos suspendidos o disueltos en un vehículo. Los vehículos para la administración tópica de los compuestos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, petróleo líquido, petróleo blanco, propilenglicol, compuesto de polioxietilenpolioxipropileno, cera emulsionante y agua. Alternativamente, la composición farmacéutica puede formularse con una loción o crema adecuada que contiene el compuesto activo suspendido o disuelto en un vehículo. En otra realización más, la composición farmacéutica se formula como un anillo vaginal. Los vehículos adecuados incluyen, pero no se limitan a, aceite mineral, monoestearato de sorbitán, polisorbato 60, cera de ésteres de cetilo, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua. Las composiciones farmacéuticas de esta invención también pueden aplicarse tópicamente al tracto intestinal inferior mediante formulación de supositorio rectal o en una formulación de enema adecuada. Los parches tópicamente transdérmicos y la administración iontoforética también se incluyen en esta invención.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse mediante aerosol nasal o inhalación. Dichas composiciones se preparan de acuerdo con técnicas bien conocidas en la técnica de formulación farmacéutica y se pueden preparar como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de absorción para mejorar la biodisponibilidad, fluorocarbonos y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes conocidos en la técnica.

Cuando las composiciones de esta invención comprenden una combinación de un compuesto de las fórmulas descritas en este documento y uno o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales, tanto el compuesto como el agente adicional deben estar presentes en niveles de dosificación de entre aproximadamente 1 y 100%, y más preferiblemente entre aproximadamente 5 y 95% de la dosis administrada normalmente en un régimen de monoterapia. Los agentes adicionales pueden administrarse por separado, como parte de un régimen de dosis múltiple, a partir de los compuestos de esta invención. Alternativamente, esos agentes pueden ser parte de una única forma de dosificación, mezclada junto con los compuestos de esta invención en una única composición.

Las dosis efectivas de los péptidos de la invención por administrar se pueden determinar mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia que abordan parámetros tales como la vida media biológica, la biodisponibilidad y la toxicidad.

Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a esa cantidad del compuesto suficiente para producir una mejoría de los síntomas o una prolongación de la supervivencia en un paciente. La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación DL50/DE50. Se prefieren los compuestos que exhiben grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un rango de dosis para uso en humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un rango de concentración plasmática circulante que incluya la IC50 (por ejemplo, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición semimáxima de la interacción de la proteína BCL9/b-catenina o un sustituto funcional del mismo según se mide mediante un ensayo relativo a la cantidad del evento en ausencia del compuesto de prueba) como se determina en cultivo celular. Dicha información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o espectrometría de masas (MS). Kits

La presente invención también abarca un producto farmacéutico o reactivo de laboratorio terminado, empaquetado y etiquetado. Este artículo de fabricación incluye las instrucciones apropiadas para su uso en un recipiente o contenedor apropiado, como un vial de vidrio u otro recipiente que esté sellado herméticamente. Un producto farmacéutico puede contener, por ejemplo, un compuesto de la invención en una forma de dosificación unitaria en un primer recipiente, y en un segundo recipiente, agua estéril o adyuvante para inyección. Alternativamente, la forma de dosificación unitaria puede ser un sólido adecuado para administración oral, transdérmica, intranasal, intravaginal, cervical o tópica.

En una realización específica, la forma de dosificación unitaria es adecuada para administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, oral, intravaginal, cervical, tópica o subcutánea. Por lo tanto, la invención abarca soluciones, sólidos, espumas, geles, preferiblemente estériles, adecuados para cada ruta de administración. Como con cualquier producto farmacéutico, el material de embalaje y el contenedor están diseñados para proteger la estabilidad del producto durante el almacenamiento y el envío. Además, los productos de la invención incluyen instrucciones de uso u otro material informativo que aconseja al médico, técnico o paciente sobre cómo prevenir o tratar adecuadamente la enfermedad o trastorno en cuestión. En otras palabras, el artículo de fabricación incluye instrucciones que indican o sugieren un régimen de dosificación que incluye, entre otros, dosis reales, procedimientos de monitorización (por ejemplo, detección y cuantificación de infección) y otra información de monitorización.

Específicamente, la invención proporciona un artículo de fabricación que incluye material de embalaje, tal como una caja, botella, tubo, vial, recipiente, pulverizador, insuflador, bolsa intravenosa (i.v.), sobre y similares; y al menos una forma de dosificación unitaria de un agente farmacéutico contenido dentro de dicho material de embalaje, en donde dicho agente farmacéutico comprende un compuesto de la invención, y en donde dicho material de embalaje incluye medios de instrucción que indican que dicho compuesto puede usarse para manejar, tratar y/o mejorar uno o más síntomas asociados con una enfermedad proporcionada en este documento, administrando dosis específicas y utilizando regímenes de dosificación específicos como se describe en este documento.

Los siguientes ejemplos se proporcionan simplemente como ilustrativos de diversos aspectos de la invención y no se interpretarán como limitantes de la invención de ninguna manera.

Trastornos tratados por la invención.

En ciertas realizaciones, la enfermedad o trastorno tratado por los péptidos estabilizados de la invención está asociada con la angiogénesis. En ciertas realizaciones, la enfermedad se selecciona entre: crecimiento tumoral o de cáncer (neoplasia), trastornos de la piel, neovascularización, enfermedades inflamatorias y artríticas, retinoblastoma, edema macular cistoide (CME), degeneración macular exudativa relacionada con la edad (DMAE), retinopatía diabética, edema macular diabético o trastornos inflamatorios oculares.

En diversas realizaciones, los péptidos estructuralmente restringidos de la invención pueden usarse para superar la quimiorresistencia y la radiorresistencia (resistencia al tratamiento) de células madre cancerosas.

En ciertas realizaciones, la enfermedad o trastorno es tumor o crecimiento de cáncer (neoplasia). En una realización adicional, la enfermedad o trastorno es cáncer ocular, cáncer rectal, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer cervical, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer oral, tumores benignos y malignos, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer pancreático , cáncer de pulmón, cuerpo uterino, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer renal, cáncer de cerebro/sistema nervioso entérico, cáncer de garganta, mieloma múltiple, melanoma de piel, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielógena aguda, sarcoma de Ewing, sarcoma de Kaposi, carcinoma de células basales y carcinoma de células escamosas, cáncer de pulmón de células pequeñas, coriocarcinoma, rabdomiosarcoma, angiosarcoma, hemangioendotelioma, tumor de Wilms, neuroblastoma, cáncer de boca/faringe, cáncer de esófago, cáncer de laringe, linfoma, neurofibromatosis, esclerosis tuberosa, hemangiomas y linfagiogénesis.

En otras realizaciones, la enfermedad o trastorno es un trastorno de la piel. En una realización adicional, la enfermedad o trastorno es psoriasis, acné, rosácea, verrugas, eccema, hemangiomas, linfangiogénesis, síndrome de Sturge-Weber, úlceras venosas de la piel, neurofibromatosis y esclerosis tuberosa.

En ciertas realizaciones, la enfermedad o trastorno es neovascularización. En una realización adicional, la enfermedad o trastorno es retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, rechazo del injerto corneal, glaucoma neovascular, fibroplasias retrolentales, queratoconjuntivitis epidémica, deficiencia de vitamina A, sobreuso de lentes de contacto, queratitis atópica, queratitis límbica superior, queratitis pterigiónica, Sjogren , acné rosácea, flectenulosis, sífilis, infecciones por micobacterias, degeneración lipídica, quemaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras fúngicas, infecciones por herpes simple, infecciones por herpes zóster, infecciones por protozoos, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneración marginal de Terrien, queratólisis marginal, trauma, artritis reumatoide, lupus sistémico, poliarteritis, sarcoidosis de Wegener, escleritis, enfermedad de Stevens-Johnson, penfigoide, queratotomía radial, rechazo de injerto de córnea, edema macular, degeneración macular, anemia falciforme, sarcoide, sífilis, pseudoxantoma elástico, enfermedad de Paget, oclusión venosa, oclusión arterial, enfermedad obstructiva carotídea, uveitis/vitritis crónica, infecciones micobacterianas, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso sistémico, retinopatía del prematuro, enfermedad de Eales, enfermedad de Behcet, infecciones que causan retinitis o coroiditis, histoplasmosis ocular presunta, enfermedad de Best, miopía, fosas ópticas, enfermedad de Stargardt, pars planitis, desprendimiento de retina crónico, síndromes de hiperviscosidad, toxoplasmosis, trauma y complicaciones posteriores al láser, y enfermedades asociadas con la rubeosis (neovascularización del tobillo).

En ciertas realizaciones, la enfermedad o trastorno es enfermedad inflamatoria y artrítica. En una realización adicional, la enfermedad o trastorno es artritis reumatoide, osteoartritis, lupus, esclerodermia, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, psoriasis, sarcoidosis, lesiones cutáneas, hemangiomas, enfermedad de Osler-Weber-Rendu, telangiectasia hemorrágica hereditaria y osteoartritis.

En otras realizaciones, la enfermedad o trastorno afecta dermis, epidermis, endometrio, retina, heridas quirúrgicas, tracto gastrointestinal, cordón umbilical, hígado, riñón, sistema reproductivo, sistema linfoide, sistema nervioso central, tejido mamario, tracto urinario, sistema circulatorio, huesos, músculos o tracto respiratorio.

Ejemplos

Ejemplo 1. Síntesis de péptidos y dicroísmo circular

Para generar alfa-hélices estabilizadas del dominio BCL9 HD2, que interactúa directamente con la b-catenina (Figura 16), se realizaron síntesis de péptidos argollados con hidrocarburos (Figura 14, 15) como se describió previamente (Walensky, L.D. et al. al. Science 305, 1466-70 (2004); Bird, G.H., et al., Methods Enzymol 446, 369-86 (2008); Bird et al. PNAS 107, 14093-8, (2010)). Los péptidos se produjeron en un sintetizador automático de péptidos Apex 396 (Aapptec) usando resina Rink amida AM LL (EMD Biosciences, 0.2 mmol/g de resina), a una escala de 50 mmol. El protocolo estándar de Fmoc empleó 2 x 10 minutos de desprotección en 20% de piperidina/NMP seguido de un par de lavados consecutivos con metanol y dimetilformamida (DMF). Los aminoácidos no naturales incorporados se trataron con 4 x 10 minutos de incubación en 20% de piperidina/NMP para lograr la desprotección completa. El acoplamiento de aminoácidos se realizó usando soluciones madre 0.4 M de aminoácidos protegidos con Fmoc, 2-(6-cloro-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio hexafluorofosfato (HCTU) 0.67 M y N,N-diisopropil etilamina (DIEA) 2 M, produciendo 1 ml de éster activo 0.2 M (4 equivalentes). La frecuencia de acoplamiento y los tiempos de incubación fueron 2 x 30 min para los residuos estándar, 2 x 45 min para los aminoácidos olefínicos no naturales y 3 x 45 min para el residuo después de un aminoácido no natural. Una vez completada la síntesis automatizada, el extremo amino se acetiló o se cubrió con Fmoc-p-Ala para la derivación con FITC. Para generar argollas de hidrocarburos mediante metátesis de olefina, la resina se cargó con una solución 10 mM de dicloruro de bis(triciclohexilfosfina)-benciliden rutenio (IV) (catalizador de primera generación de Grubbs) en 1,2-dicloroetano y se agitó durante 2 horas dos veces. Para la derivación de FITC, Fmoc-p-Ala se desprotegió con piperidina en NMP y luego se hizo reaccionar con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y trietilamina en dimetilformamida durante la noche. El péptido se escindió de la resina y se desprotegió en TFA/triisopropil silano (TIS)/agua (95%, 2.5%, 2.5%), y se precipitó con éter dietílico/hexanos. Los péptidos argollados se purificaron por HPLC de fase inversa (Agilent) usando una columna C18 (Zorbax), caracterizada por LC/MS (espectros de masas obtenidos usando electroaspersión en modo de iones positivos), y se cuantificaron por análisis de aminoácidos (AAA) en un analizador de aminoácidos Beckman 6300 de alto rendimiento. Se generaron soluciones madre de trabajo disolviendo el polvo liofilizado en DMSO al 100% a 1 a 10 mM. El polvo de SAH-gp41 y las soluciones DMSO se almacenaron a -20°C. La determinación de la a-helicoidicidad se realizó como se describió previamente (Walensky, L. D. et al. Science 305, 1466-70 (2004); Bird, G. H., et al., Methods Enzymol 446, 369-86 (2008)). Véanse los resultados experimentales en las Figura 1a-1c, 1g.

Ejemplo 2. Producción y purificación de proteínas

Se clonó BCL9 humano recombinante (214-493) en pET-23a(+)en el vector pET-23a (+) (Novagen) que contenía la etiqueta de hexahistidina carboxiterminal. Se transformaron células competentes de E. coli BL21 (DE3) (Stratagene), se incubaron a 37°C hasta que se alcanzó A600 = 0.6 y luego se indujeron con isopropil-p-D-tiogalactósido 1 mM (IPTG) durante 3 h. Las células se cosecharon por centrifugación y se sometieron a lisis por sonicación en Na2HPO4 50 mM, pH 8.0, regulador NaCl 0.3M. Los lisados se centrifugaron y se cargaron en gel de afinidad de níque1HIS-Select (Sigma) y se lavaron con regulador de lavado (NaH2PO450 mM, pH 8.0, NaCl 0.3 M e imidazol 10 mM). La proteína se eluyó en Na2HPO450 mM, pH 8.0, NaCl 0.3 M e imidazol 250 mM y se dializó durante la noche en 1x PBS estéril. Los constructos de p-catenina humana (por ejemplo, los residuos 1-781, 138-683, 273-684) se clonaron en pGEX4T1/pGEX4T2, pET-28a y pET-23a, respectivamente. Las proteínas de fusión etiquetadas con His se generaron como se describió anteriormente para BCL9. Para constructos etiquetados con GST, se cultivó E. coli BL21 transformada (DE3) a 37°C a A600 = 0.6 y se indujo con IPTG 1 mM durante 4 h. Las células se sedimentaron, se resuspendieron y se sometieron a sonicación en regulador A (Tris 50 mM, pH 8.0, NaCl 150 MM, sacarosa 20%, ditiotreitol (DTT) 5 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, 2 mg/ml de aprotinina y 0.7 mg/ml de pepstatina). Las proteínas solubilizadas se adsorbieron en perlas de glutatión-Sefarosa 4B (GE), que luego se eluyeron en regulador A con glutatión 20 mM y se dializaron contra regulador PBS suplementado con tabletas de cóctel inhibidor de proteasa (Roche).

Ejemplo 3. Ensayos de precipitación de GST

Se incubaron cantidades iguales (0.5 |^jM) de BCL9 marcado con His y p-catenina etiquetada con GST unida a perlas de glutatión-Sefarosa 4B (GE) con o sin cantidades crecientes de péptidos HD2 o SAH-BCL9 durante 1 h a 4°C en un volumen final de 1000 j l de PBS. Los complejos de proteínas se sedimentaron por centrifugación a 2000 rpm durante 2 minutos y las perlas se lavaron cuatro veces con regulador PBS. Luego se recolectaron las perlas en regulador de carga SDS-PAGE, se sometieron a ebullición y se realizó SDS-PAGE para visualizar proteínas unidas mediante tinción con Coomassie.

Ejemplo 4. Muestras de pacientes y líneas celulares

Se obtuvieron muestras de médula ósea de pacientes con MM de acuerdo con la aprobación de la Dana-Farber Cancer Institute Review Board y el consentimiento informado realizado de conformidad con la Declaración de Helsinki. Se purificaron células plasmáticas CD138+ primarias usando perlas magnéticas como está descrito (Sukhdeo, K. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 7516-21 (2007)). Las muestras de tumor primario de CCR se obtuvieron del Brigham and Women's Hospital de acuerdo con las políticas de su Institutional Review Board. Para generar suficientes células tumorales primarias CCR para la experimentación, los tumores primarios se expandieron primero por vía subcutánea en ratones NOD/SCID (Jackson Laboratory). Después de que los tumores alcanzaron los 2 cm de diámetro, los ratones se sacrificaron de acuerdo con las pautas institucionales y los xenoinjertos de tumor subcutáneo se picaron con un bisturí y se digirieron mediante incubación con colagenasa IV (Worthington Biomedical Corporation) y DNasa I al 0.01% (Sigma-Aldrich) a 37°C durante 30 minutos, seguido de una desagregación mecánica adicional utilizando un dispositivo Stomacher (Seward Laboratory Systems Inc.). Las muestras se filtraron a través de un filtro de células de 70 |jm y se lavaron con PBS. Los glóbulos rojos se sometieron a lisis usando regulador de lisis ACK (BioWhittaker, Lonza) y las células tumorales viables se enriquecieron mediante centrifugación en gradiente Ficoll-Paque (GE Healthcare). Para purificar solo células tumorales viables, las muestras se trataron con H-2Kd anti-ratón conjugado con APC (clon SF1-1.1.1, eBioscience), anticuerpos EpCAM anti-humanos conjugados con FITC (clon Ber-EP4, Dako) y Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich), y luego la clasificación por flujo FACSAria (BD Biosciences) se usó para aislar las células tumorales primarias EpCAM-positivas, H-2Kd-negativas y Hoechst-negativas. Las líneas celulares cultivadas se mantuvieron como se describió previamente (Mani, M. et al. Cancer Res 69, 7577-86 (2009)). Véanse los resultados en la Figura 3b, 3d.

Ejemplo 5. Inmunotransferencia y coinmunoprecipitación

La inmunotransferencia Western, realizada como se describe (Sukhdeo, K. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 7516-21 (2007)), empleó los siguientes anticuerpos primarios: BCL9 (6109) (Mani, M. et al. Cancer Res 69, 7577-86 (2009)), BCL9 (ab37305, Abcam), B9L (AF4967, R&D Systems), p-catenina (CAT5-H10, Zymed), FITC (ab19224, Abcam), Actin-HRP (C-11, Santa Cruz), Caspase3 (#9662, Señalización celular), kBa (#9242, Señalización celular), PARP (#9542, Señalización celular), E-cadherina (#3195, Señalización celular) y Lamina B (sc-6217, Santa Cruz). Se adquirieron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante de Santa Cruz and SouthernBiotech. La coinmunoprecipitación se realizó como se describe (Walensky, L. D. et al. Science 305, 1466­ 70 (2004)). En resumen, las células se sometieron a lisis en Tris 50 mM, NaCl 150 mM y regulador CHAPS al 1% que contenía inhibidores de proteasa y fosfatasa. Los lisados se prefiltraron con perlas de proteína A/G PLUS-agarosa (Santa Cruz Biotechnologies) durante 3 horas seguidas de incubación durante la noche a 4°C con los anticuerpos respectivos. Luego se añadieron perlas de agarosa A/G durante 4 h, se granularon y se lavaron como se describe (Walensky, L. D. et al. Science 305, 1466-70 (2004)). Véanse los resultados en las Figuras 1d, 1h, 2a, 8. Ejemplo 6. Análisis de captación y localización celular de SAH-BCL9

Para la evaluación por microscopía de fluorescencia, las células se prepararon usando una citocentrífuga (Thermo Shandon) y se fijaron como se describió previamente (Sukhdeo, K. et al. Proc Natl Acad Sci USA 104, 7516-21 (2007); Mani, M. et al. al. Cancer Res 69, 7577-86 (2009)). Se emplearon anticuerpos secundarios conjugados con anti-p-catenina y rodamina (5 jg/ml; Southern Biotechnology). Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio confocal de barrido láser BioRad Radiance 2000. La permeabilidad celular de SAH-BCL9^b y SAH-BCL9^b(R359E) se determinó por microscopía de fluorescencia de células tratadas con derivados de FITC de los péptidos argollados descritos anteriormente y también por barrido de transferencia/fluorescencia, realizado como se describió previamente (Pitter, K. et al. Methods Enzymol, 446, (2008), 387-408; Walensky, L.D. et al. Science 305, 1466-70 (2004). Véanse los resultados en las Figuras 1e, 7.

Ejemplo 7. Análisis histopatológico e inmunohistoquímica

Las secciones de tejido se procesaron como se describe (Sukhdeo, K. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. 104, 7516­ 21 (2007)). Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios (5 jg/ml) o la fracción de IgG correspondiente del suero preinmune durante la noche a 4°C en solución de bloqueo (3% BSA/PBS). Se emplearon anticuerpos BCL9 (ab37305, Abcam), CD34 de ratón (RAM34, eBiosciences), CD34 humano (M7165, Dako) y CD44H humano (2C5, R&D Systems). La formación de vasos sanguíneos en los modelos CRC y MM se evaluó usando anticuerpos anti-CD34 de ratón y anti-CD34 humano, respectivamente, y los anticuerpos biotinilados correspondientes acoplados a estreptavidina peroxidasa (Vector). El número de vasos sanguíneos se determinó contando el número medio de vasos sanguíneos independientes en 5 campos seleccionados al azar con un aumento de 50x como se destaca por la tinción de CD34 (color marrón). Véanse los resultados en las Figuras 4b, 4e, 4i, 6.

Ejemplo 8. Transcripción inversa cuantitativa-PCR

Se extrajo ARN con reactivo TRIzol (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN total (2 jg) se transcribió inversamente (kit de síntesis de ADNc VILO SuperScript, Invitrogen) y se realizó qPCR usando un sistema de PCR en tiempo real de Applied Biosynthesis 7500. El análisis de genes diana se realizó por cuadruplicado utilizando POWER SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) con conjuntos de cebadores descritos previamente. Los niveles de transcripciones se normalizaron a la expresión de p-actina. Estos experimentos se repitieron tres veces. Véanse los resultados en las Figuras 2b, 2c.

Ejemplo 9. Perfiles de expresión génica

El ARN de SAH-BCL9^b y las células tratadas con vehículo (DMSO al 0.1%) se procesaron en un chip de matriz Affymetrix U133A 2.0 como se describe (Mollering et al., Nature 462, 182-8 (2009). Los análisis estadísticos se realizaron en R (http://www.r-project.org). Los datos de la matriz se normalizaron con el método rma (Bolstad, B.M., et al. Bioinformatics 19, 185-93 (2003)) tal como se implementa en el paquete Affy (http: //www.bioconductor.org/packages/2.6/bioc/html/affy.html) y expresión diferencial calculada con la reducción empírica de Bayes de los errores estándar hacia un valor común con LIMMA (http://www.bioconductor.org/packages /2.6/bioc/html/limma.html) (McCarthy, D.J. & Smyth, G.K. Bioinformatics 25, 765-71 (2009); Smyth, G.K. Stat Appl Genet Mol Biol 3, Artícle3 (2004)). El análisis de enriquecimiento del conjunto de genes fue realizado utilizando el software GSEA (versión 2.06) y mSigDB (versión 2.5) (Subramanian, A. et al. Proc Natl Acad Sci USA 102, 15545-50 (2005)).

Ejemplo 10. Proliferación celular, ensayo de viabilidad y detección de apoptosis

Los ensayos de proliferación celular se realizaron como se describe (Sukhdeo, K. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104, 7516-21 (2007)). La viabilidad celular se midió usando el ensayo CellTiter-Glo (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La apoptosis se evaluó mediante caspasa-3 activada y transferencia Western PARP. Véanse resultados en las Figuras. 3a-f, 13 y 20.

Ejemplo 11. Ensayos de angiogénesis e invasión

La angiogénesis se evaluó como se describió previamente (Mani, M. et al. Cancer Res 69, 7577-86 (2009)) usando un kit de ensayo de angiogénesis in vitro (Millipore). Para el análisis de la formación de tubos capilares, se cultivaron HUVEC en gel matriz polimerizado y se expusieron a medios sobrenadantes recolectados de células Colo320 o MM1S tratadas con vehículo (0.5% DMSO), péptidos SAH-BCL9^b (5 |^j M) durante 24 h. El número de tubos capilares formados después de 5 h de tratamiento a 37°C se determinó contando 5 campos seleccionados al azar con 40 aumentos, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron HUVEc cultivados en medios VEGF y medios libres de VEGF como controles positivos y negativos, respectivamente. Los ensayos de invasión celular se realizaron utilizando cámaras Matrigel Boyden (BD Biosciences) como se describe (Mani, M. et al. Cancer Res 69, 7577-86 (2009)). Los datos informados representan el promedio de tres experimentos independientes realizados por triplicado. Véanse los resultados en la Figura 3h-3i.

Ejemplo 12. Efecto antitumoral in vivo de SAH-BCL9 ^b (modelos de xenoinjerto)

Se generaron células Colo320 positivas para GFP como se informó previamente (Mani, M. et al. Cancer Res 69, 7577-86 (2009)). Las células se sedimentaron, se resuspendieron en 1x PBS estéril y se inyectaron intraperitonealmente (1 x 106 células/ratón) en ratones NOD.CB 17-PrkdcSCID/J de 5 semanas de edad (Laboratorio Jackson) (n = 6 por cohorte). Dos días después de la inoculación celular, los ratones fueron tratados mediante inyección intraperitoneal con vehículo (DMSO al 2.5% en D5W) o péptidos SAH-BCL9 (20 mg/kg) en días alternos para un total de 6 dosis. Cuarenta días después de la inyección de células tumorales, los ratones fueron sacrificados y se visualizó el tumor positivo para GFP usando un ImageQuant LAS-4000 (GE Healthcare). Se realizaron necropsias completas para cada animal experimental y los hígados se seccionaron en su totalidad a intervalos de 5 mm para cuantificar las metástasis tumorales. Los tejidos se sometieron a tinción con H&E y análisis inmunohistoquímico usando anticuerpos anti-CD34 y anti-CD44.

Para el modelo murino SCID-hu de MM humano, se implantaron subcutáneamente injertos óseos fetales humanos que miden 1.5 x 0.5 cm en ratones SCID CB-17 machos de ocho semanas (Taconic) como se describió previamente (Tassone, P. et al. Blood 106, 713-6 (2005)). Cuatro semanas después de la implantación ósea, se inyectaron 5 x 106 células INA-6 MM positivas para GFP directamente en cada implante óseo. Dos días después, los ratones fueron tratados con inyecciones de 100 j l de vehículo (DMSO al 2.5% en D5W) o péptidos SAH-BCL9 (5 mg/kg) incrustados adyacentes a las astillas de hueso en días alternos para un total de 10 dosis. Los sueros de ratón se monitorizaron en serie para determinar los niveles de shuIL-6R mediante ELISA (R&D Systems). Treinta y tres días después de la inyección de células tumorales, los ratones fueron sacrificados y analizados para determinar la carga tumoral mediante imágenes de fluorescencia y análisis histológico de los injertos óseos. Véanse resultados en las Figuras 4a-i. Además, la tinción de TUNEL se realizó en muestras obtenidas de los ratones. Los resultados demostraron que hay un aumento en las células tumorales apoptóticas en animales tratados con SAH-BCL9^b en comparación con el vehículo o los ratones tratados con SAH-BCL9^mut. Véanse resultados en las Figuras 22 y 23. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Dana-Farber Cancer Institute Animal Care and Use Committee.

Ejemplo 13. Efecto in vivo de SAH-BCL9 ^b sobre la actividad del informador Wnt

Las células HCT116 se transfectaron con el plásmido pOT-Luc o un plásmido de control UbC-Luc. Las células HCT116-pOT-Luc se implantaron en ratones (n = 2) en el flanco izquierdo y las células de control constitutivas de UbC-Luc en el flanco derecho. Los animales se sometieron a imágenes de referencia, seguidas de inyección de SAH-BCL9^b o SAH-BCL9^b(R359E) e imágenes en serie en los puntos de tiempo indicados. La actividad del informador pOT-Luc se normalizó a la actividad de UbC-Luc. Véanse los resultados en la Figura 9.

Ejemplo 14. ELISA VEGF

El ELISA VEGF se realizó como se describió previamente (Mani, M. et al. Cancer Res 69, 7577-86 (2009)). En resumen, las células (1x106) se trataron con vehículo y péptidos SAH-BCL9 (5 |^jM) durante 24 h. Los niveles de VEGF en el sobrenadante se midieron de acuerdo con el protocolo ELISA del fabricante (DuoSet, R&D Systems). Ejemplo 15. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

El anticuerpo (3 jg) se preunió durante 8 horas a las perlas magnéticas de la proteína A y la proteína G Dynal (Dynal Biotech, Noruega) y se lavó 5 veces con PBS helado que contenía BSA al 5%, y luego se añadió a la cromatina diluida para inmunoprecipitación durante la noche usando los siguientes anticuerpos: TCF-4 (Upstate #05-511), control de isotipo IgG2a de ratón (Sigma, M5409) e IgG de conejo (sc-2027, Santa Cruz). Los complejos de perlas magnéticas-cromatina se recolectaron y se lavaron 6 veces en regulador RIPA (HEPES 50 mM [pH 7.6], e DtA 1 mM, desoxicolato de Na al 0.7%, NP-40 al 1%, LiCl 0.5 M). El ADN se eluyó de las perlas como se describió previamente (Clevers, H. Cell 127, 469-80 (2006)). La amplificación se realizó con un controlador térmico programable PTC-200 (MJ Research) después de una desnaturalización inicial a 94°C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de PCR utilizando el siguiente perfil de temperatura y tiempo: desnaturalización a 94°C durante 0.5 min., fusión del cebador a 59°C durante 0.5 min, extensión del cebador a 72°C durante 0.5 min y una extensión final de 72°C durante 10 min. Los productos de PCR se visualizaron por electroforesis en gel al 2%. Se emplearon los siguientes conjuntos de cebadores promotores: (1) VEGF: F (avance): 5'-gcgtgtctctggacagagttt-3' y R (reverso): 5'-agcctcagcccttccaca-3'; (2) VEGF corriente arriba: F: 5'-gaggctatgccagctgtagg-3' y R: 5'-cccttttcctccaactctcc-3'; (3) c-Myc: F: 5'-actcccccggctcggtccacaagc-3', y R: 5'-cccaatttctcagccaggtttcag-3' (Klaus, A. and Birchmeier, W. Nat Rev Cancer 8, 387-98 (2008)). Véanse los resultados en la Figura 11 a.

Ejemplo 16. Ensayos de luciferasa del promotor VEGF

Los constructos de luciferasa impulsadas por el promotor VEGF (2.6 kb) fueron un regalo amable de Soumitro Pal (Transplantation Research Center, Children's Hospital Boston and Brigham and Women's Hospital) (Basu, A. et al. Cancer Res 68, 5689-98 (2008)). Las células se transfectaron con los constructos de luciferasa VEGF usando el reactivo de transfección FuGENE (Roche) y la actividad de luciferasa se midió usando el sistema de ensayo de informador de luciferasa dual (Promega) como se describió previamente (Sukhdeo, K. et al. Proc Natl Acad Sci USA 104, 7516-21 (2007)). Véanse los resultados en la Figura 11b.

Ejemplo 17. Vectores lentivirales

Un vector informador lentiviral que contenía siete motivos de unión TCF/LEF-1 y un promotor mínimo que impulsaba la expresión de GFP desestabilizada (7xTdG) se obtuvo del vector lentiviral TOP-dGFP, que contiene tres motivos de unión TCF/LEF-1 (Sukhdeo, K. et al, Proc Natl Acad Sci USA 104, 7516-21 (2007)). Se diseñaron dos oligonucleótidos complementarios sintéticos (ADN-IDT) con cuatro motivos de unión TCF/LEF-1 (GATCAAAGG) para generar extremos colgantes compatibles para la fusión a un sitio de restricción Xba1. Los oligonucleótidos se recocieron calentando a 95°C y enfriando lentamente a temperatura ambiente, seguido de ligamiento en el vector TOP-dGFP linealizado con Xba1, produciendo 7xTdG. Para la construcción del vector de control que lleva siete sitios FOP (7xFdG), el casete 7xTOP se retiró del vector 7xTdG mediante digestión de restricción con Xma1 y Age1. Se insertó un casete sintético con siete sitios FOP (GGCCAAAGG) pero idéntico al casete 7xTOP retirado, produciendo 7xFdG. Los vectores lentivirales de shARN BCL9 y shARN de control se generaron tal como se informa (Sampietro, J. et al. Mol Cell 24, 293-300 (2006)). Véanse los resultados en las Figuras 10, 11b.

Ejemplo 18. Producción e infección de lentivirus

Las células HEK293T se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 10 cm y se cotransfectaron con 10 jg de vector lentiviral (7xTdG o 7xFdG), 10 jg de pCMV-dR8.91 y 2 jg de pMD2.G (Naldini et al, PNAS, 1996) utilizando 60 jL de LipoD293 (Signagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El medio se reemplazó después de 12 h con FCS al 30% que contenía DMEM (Gibco) y se acondicionó durante 36 h. El medio acondicionado se filtró luego a través de filtros de jeringa de 0.45 jm (Millipore), se mezcló 1:1 con DMEM reciente y luego se usó directamente para la infección de células Colo320 (ATCC) cultivadas. Se añadió Polybrene (Sigma) a una concentración final de 8 jg/mL para mejorar la eficacia de la infección. Las infecciones por shARN de lentivirus para la expresión de BCL9 suprimida se realizaron como se describió previamente (Logan, C. Y. y Nusse, R. Annu Rev Cell Dev Biol 20, 781­ 810 (2004)). En resumen, se produjeron shARN recombinantes de BCL9 y lentivirus de control mediante transfección transitoria de células 293T. Colo320 se transdujeron con sobrenadante de virus que contenía Polybrene y las células que expresan GFP fueron clasificadas por FACS. Véanse los resultados en las Figuras 10, 11b.

Ejemplo 19. Establecimiento de cultivos de células individuales

Las células Colo320 se sometieron a infección durante 72 h con lentivirus 7xTdG o 7xFdG, y las células transducidas y no transducidas de control se tripsinizaron, se lavaron y luego se analizaron en un clasificador de flujo FACSaria. La tinción Hoechst 33258 se usó para excluir las células muertas. Las células Colo320-7xTdG positivas para GFP individuales se clasificaron en placas de 96 pozos usando una cerradura estricta en altura y ancho de dispersión frontal/lateral para excluir dobletes. La presencia de una sola célula por pozo se confirmó microscópicamente después de la clasificación y luego los cultivos de una sola célula se expandieron para su uso posterior. Véanse los resultados en la Figura 11b.

Ejemplo 20. Inmunoprecipitación de cromatina

Se preunieron tres microgramos de anticuerpo durante 8 h a perlas magnéticas Dynal de proteína A y proteína G (Dynal Biotech, Noruega) y se lavaron 5x con PBS helado que contenía BSA al 5%, y luego se añadieron a la cromatina diluida para inmunoprecipitación durante la noche utilizando los siguientes anticuerpos: TCF-4 (Upstate #05-511), control de isotipo IgG2a de ratón (Sigma, M5409) e IgG de conejo (sc-2027, Santa Cruz).

Los complejos de perlas magnéticas-cromatina se recolectaron y se lavaron 6 veces en regulador RIPA (HEPES 50 mM [pH 7.6], EDTA 1 mM, desoxicolato de Na al 0.7%, NP-40 al 1%, LiCI 0.5 M). El ADN se eluyó de las perlas como se describió previamente (Shang, Y., et al. Cell 103, 843-52 (2000)). La amplificación se realizó con un controlador térmico programable PTC-200 (MJ Research) después de una desnaturalización inicial a 94°C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de PCR utilizando el siguiente perfil de temperatura y tiempo: desnaturalización a 94°C durante 0.5 min., fusión del cebador a 59°C durante 0.5 min, extensión del cebador a 72°C durante 0.5 min y una extensión final de 72°C durante 10 min. Los productos de PCR se visualizaron por electroforesis en gel al 2%. Se emplearon los siguientes conjuntos de cebadores promotores: (1) VEGFB: F (adelante): 5'- gcgtgtctctggacagagttt-3' y R (reversa): 5'-agcctcagcccttccaca-3'; (2) VEGF corriente arriba: F: 5'-gaggctatgccagctgtagg-3' y R: 5'-cccttttcctccaactctcc-3'; (3) c-Myc: F: 5'-actcccccggctcggtccacaagc-3', y R: 5'-cccaatttctcagccaggtttcag-3'. Véanse los resultados en la Figura 11a.

Ejemplo 21. Ensayos de informador

La actividad de luciferasa se midió usando el sistema de ensayo de informador de luciferasa dual (Promega) como se describió previamente (Sukhdeo, K. et al. Proc Natl Acad Sci USA 104, 7516-21 (2007)). Para medir la actividad informadora Wnt o NFkB, las células Colo320 se transfectaron con plásmido TOP-FLAs H, FOP-FLASH (Millipore Corporation) o el informador de luciferasa NFkB (Stratagene), junto con un plásmido de control interno Renilla (hRL-nulo). La transfección se realizó utilizando FuGENE (Roche) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los resultados se normalizaron para controlar la actividad de Renilla. Los datos informados representan el promedio de tres experimentos de transfección independientes realizados por triplicado. Véanse resultados en las Figuras. 9, 10.

Ejemplo 22. Disociación selectiva del complejo BCL9/p-catenina por SAH-BCL9 ^b

Para evaluar la unión por ELISA, se incubaron placas de microtitulación de glutatión (Pierce) con 50 ng de GST-pcatenina recombinante en 100 |^jL de regulador ELISA (PBS, BSA al 1%, Tween-20 al 0.05%) por pozo y se hicieron rotar (200 rpm) a 37°C durante 1 hora, seguido de 4 ciclos de lavado automático de placas con PBS, Tween-20 al 0.05%. La dilución en serie doble de péptidos conjugados con FITC en regulador ELISA se preparó en una placa separada de 96 pozos y se transfirió (100 ^j L) a la placa unida a p-catenina. La placa experimental se incubó durante 2 horas a 37°C (200 rpm), se sometió a un lavado automático de la placa, y luego se transfirieron a cada pozo 100 j L de una dilución 1:7500 de HRP conjugado con anti-FITC en regulador ELISA para una incubación adicional de 1 hora a 37°C (200 rpm), seguido de lavado automático de placas. Los pozos se desarrollaron agregando 50 ^j L de solución de tetrametilbencidina (TMB), incubando a temperatura ambiente durante 20 minutos, y luego deteniendo la reacción con 50 j L de H2SO42 M. La absorbancia a 450 nm se leyó en un lector de microplacas (Molecular Devices) y se trazaron las isotermas de unión y se determinaron los valores de EC50 mediante análisis de regresión no lineal usando el software Prism (GraphPad). Los ensayos de unión se realizaron por triplicado y se repitieron al menos dos veces con proteínas recombinantes recién preparadas. De acuerdo con la capacidad reducida de FITC-SAH-BCL9^mut (SAH-BCL9^b(R359E)) para inmunoprecipitar la p-catenina nativa (véase Figura 1H), la mutagénesis puntual R359E causó una disminución de 5 veces en la actividad de unión directa a la proteína p-catenina recombinante. Véanse los resultados en la Figura 17A.

Para evaluar la capacidad de SAH-BCL9 para alterar los complejos preformados de BCL9/p-catenina, la actividad biológica requerida para el bloqueo de señalización de Wnt, BCL9 humano recombinante (residuos 243-469) clonado en el vector pET-23a (+) que contiene carboxi de hexahistidina terminal (His-BCL9) y p-catenina humana de longitud completa clonadas en el vector pGEX-4T-1 con una etiqueta de glutatión-S-transferasa (GST) aminoterminal (GST-p-catenina recombinante) expresado y purificado como se informó previamente (J. Sampietro et al., Mol Cell 24, 293 (2006)). Cantidades iguales (1 nM) de BCL9 marcado con His y p-catenina etiquetada con GST unidas a perlas de glutatión-Sefarosa 4B (GE) se incubaron durante la noche a 4°C en regulador de ensayo (Na2PO4 100 mM [pH7.4], 100 jg/ml de albúmina de suero bovino, 0.01% Triton X-100 y 4% DMSO). Los complejos de BCL9 marcado con His unido a p-catenina marcada con GST inmovilizada con perlas se aislaron por centrifugación, se resuspendieron en 1 ml de regulador de ensayo y se incubaron 50 |jL de suspensión en presencia o ausencia de SAH-BCL9^b o SAH-BCL9^mut (SAH-BCL9^b(R359E)) en 500 j l de regulador de ensayo durante 2 horas a temperatura ambiente. Las proteínas unidas a perlas de glutatión se lavaron dos veces por centrifugación, se eluyeron y se resolvieron por electroforesis en gel. Se detectó GST-p-catenina mediante tinción con azul de Coomassie y se detectó la presencia de His-BCL9 retenido mediante análisis de inmunotransferencia (anti-His 23655, señalización celular) y se cuantificó usando el software ImageJ (msbweb.nih.gov/ij). El experimento fue repetido tres veces con resultados similares. Los resultados demostraron que SAH-BCL9^b podría disociar el complejo en dosis con una IC50 de 135 nM, mientras que la mutagénesis de punto único redujo la actividad en 6 veces. Véanse resultados Figura 17B.

Ejemplo 23. SAH-BCL9 ^b inhibe la actividad de transcripción de Wnt

Para medir los efectos del vehículo, SAH-BCL9^b y SAH-BCL9^mut en la expresión de genes diana de Wnt/p-catenina, incluido VEGF, en las líneas celulares Colo320 (Figura 18) y MM1S (Figura 19), se realizó un análisis cuantitativo por PCR (qRT-PCR). El ARN se extrajo con reactivo TRIzol (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN total (2 jg ) se transcribió inversamente (kit de síntesis de ADNc VILO SuperScript, Invitrogen) y se realizó qPCR usando un sistema de PCR en tiempo real de Applied Biosynthesis 7500. Los cebadores de PCR se diseñaron de la siguiente manera:

FOXQ1: cgcggactttgcactttgaa; agctttaaggcacgtttgatggag

CDK4: atgttgtccggctgatgga; caccagggttaccttgatctcc

Axin2: cggaaactgttgacagtggat; ggtgcaaagacatagccagaa

VEGF: catgaactttctgctgtcttgg; atgattctgccctcctcctt

LGR5: ctcccaggtctggtgtgttg; gtgaagacgctgaggttgga

CMYC: tttttcgggtagtggaaaacc; gcagtagaaatacggctgcac

CD44: tttgcattgcagtcaacagtc; tgagtccacttggctttctgt

CLDN2: cggtgtggctaagtacaggc; caaagctcacgatggtggtct

LEF-1: catcccttcctcattccttcaac; aggcttcctaaaaggtggtgg

El análisis de genes diana se realizó por cuadruplicado utilizando POWER SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) como se describió anteriormente (M. Mani et al., Cancer Res 69, 7577 (2009)). Los niveles de transcripciones se normalizaron a la expresión de p-actina. Estos experimentos se repitieron tres veces. El tratamiento con SAH-BCL9^b, pero no con vehículo o SAH-BCL9^mut, redujo en correspondencia con la dosis los niveles de ARNm de VEGF, c-MYC, LGR5, LEF1 y AXIN2 (Figuras 18A y 19A). La actina, un gen diana de la ruta no Wnt, se utilizó como referencia en las células Colo320 y no mostró cambios en la respuesta al tratamiento con SAH-BCL9^b (Figura 18A). LGR5 se redujo en las células Colo320, pero no en las células MM1S, de acuerdo con la especificidad celular de la transcripción del gen diana Wnt. Para investigar más a fondo la especificidad de SAH-BCL9^b en el bloqueo de la actividad de transcripción de Wnt, se realizó una comparación de los análisis de expresión del genoma amplio comparativo de genes diana de Wnt en la línea celular de cáncer de colon DLD1, para los cuales se ha descrito una firma de ruta de transcripción de Wnt (LG Van der Flier et al., Gastroenterology 132, 628 (2007)). El ARN de triplicado SAH-BCL9^b- y muestras de DLD1 tratadas con vehículo (10 jM cada una durante 12 horas) se aisló para análisis de perfiles de expresión génica. Las matrices Affymetrix Human U133 Plus 2.0 se procesaron utilizando la función del paquete bioconductor affy (URL http://www.R-project.org.). Los conjuntos de genes fueron compilados de Van der Flier et al. y el enriquecimiento del conjunto de genes y análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GSEA (http://www.broad.mit.edu/GSEA) y una prueba t de dos colas, respectivamente. Los datos de microarreglos se han depositado en el Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) y cumplen con los estándares de anotación MIAME.

Los conjuntos de datos por triplicado de SAD-BCL9^b y DLD1 tratados con vehículo generados usando microarreglos de oligonucleótidos Affimetrix se compararon con datos de expresión génica publicados de células DLD1 que llevan formas inducibles negativas dominantes de TCF1 y TCF4 (L.G. Van der Flier et al., Gastroenterology 132, 628 (2007)). El análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (GSEA) reveló una correlación fuerte y estadísticamente significativa entre los genes regulados negativamente por SAH-BCL9^b y las formas negativas dominantes de TCF1 y TCF4 en ambos adenomas (Figura 18B, error familiar (FWER) valor-p <0.001; valor q de tasa de descubrimiento falso (FDR) <0.001) y carcinoma (Figura 18C FWER y FDR <0.01), destacando la especificidad de SAH-BCL9^b en el bloqueo de la actividad de transcripción de Wnt. Axin2, un gen diana Wnt robusto y específico (3), se encontraba entre los genes más regulados negativamente por el tratamiento SAH-BCL9^b, además de otras dianas de Wnt implicadas en la metástasis celular (CD44, CLDN2), la proliferación celular (CyclinA2, CDK4) y EMT (FOXQ1) (Figuras. 18D y 18E). Estos hallazgos fueron luego validados por qRT-PCR (Figura 18F). VeGF-A se

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende:

i) un péptido estructuralmente restringido de un dominio HD2 de BCL9 (BCL9-HD2), que comprende al menos una argolla de hidrocarburo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde la argolla de hidrocarburo se posiciona para unir un primer aminoácido BCL9-HD2 seleccionado del grupo que consiste en Leu-351, Ser-352, Gln-353, Glu-354, Gln-355, Glu-357, His-358, Arg-359, Arg-361, Ser-362, Leu-363, Thr-365, Leu-366, Ile-369, Gln-370, Met-372, Nle-372, Leu-373 y Phe-374 con un segundo aminoácido BCL9-HD2 seleccionado del grupo que consiste en Leu-351, Ser -352, Gln-353, Glu-354, Gln-355, Leu-356, Glu-357, His-358, Arg-359, Glu-360, Arg-361, Ser-362, Leu-363, Gln-364 , Thr-365, Leu-366, Arg-367, Asp-368, Ile-369, Gln-370, Arg-371, Met-372, Nle-372, Leu-373 y Phe-374, en donde el péptido comprende una cara interactiva compuesta de aminoácidos que interactúa con pcatenina, en donde la cara interactiva comprende los residuos BCL9 Gln-355, His-358, Arg-359, Ser-362, Leu-363, Leu-366, Ile-369, Gln -370, Leu- 373 y Phe-374

ii) uno o más agentes terapéuticos adicionales para la prevención y/o el tratamiento del cáncer, y

iii) portador, adyuvante o vehículo farmacéutico.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde el uno o más agentes terapéuticos adicionales es un agente anticancerígeno o inhibidor de la angiogénesis

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 o 2, en donde el uno o más agentes terapéuticos adicionales es un péptido estructuralmente restringido.

4. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 o 2, en donde el uno o más agentes terapéuticos adicionales es 5'-fluorouracilo o doxorrubicina.

5. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el péptido y el agente terapéutico adicional están unidos entre sí (es decir, un compuesto bifuncional).

6. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para usar en un método de tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por la unión de BCL9/p-catenina en un sujeto, que comprende administrar al sujeto la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un péptido estructuralmente restringido de un dominio HD2 de BCL9 (BCL9-HD2), que comprende al menos una argolla de hidrocarburo, en donde la argolla de hidrocarburo está posicionada para unir un primer aminoácido BCL9-HD2 seleccionado del grupo que consiste en Leu-351, Ser-352, Gln-353, Glu-354, Gln-355, Glu-357, His-358, Arg-359, Arg-361, Ser-362, Leu-363, Thr-365, Leu-366, Ile-369, Gln-370, Met-372, Nle-372, Leu-373 y Phe-374 con un segundo aminoácido BCL9 HD2 seleccionado del grupo que consiste en Leu-351, Ser-352, Gln-353, Glu-354, Gln-355, Leu-356, Glu-357, His-358, Arg-359, Glu-360, Arg-361, Ser-362, Leu-363, Gln-364, Thr-365, Leu-366, Arg-367, Asp-368, Ile-369, Gln-370, Arg-371, Met-372, Nle-372, Leu-373 y Phe-374, en donde el péptido comprende una cara interactiva compuesta de aminoácidos que interactúa con p-catenina, en donde la cara que interactúa comprende los residuos BCL9 Gln-355, His-358, Arg-359, Ser-362, Leu-363, Leu-366, Ile-369, Gln-370, Leu-373 y Phe-374, para usar en un método de tratamiento en una enfermedad o trastorno mediado por la unión de BCL9/p-catenina en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto dicho péptido estructuralmente restringido y un agente terapéutico, radiación o quimioterapia.

8. El péptido estructuralmente restringido para el uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde se ha identificado que el sujeto necesita un inhibidor de la interacción BCL9/p-catenina de la señalización de Wnt.

9. El péptido estructuralmente restringido para el uso de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en donde la enfermedad es cáncer, proliferación de células tumorales, desdiferenciación y metástasis de células tumorales, migración tumoral, angiogénesis inducida por tumores, quimiorresistencia de células madre cancerosas o una enfermedad de proliferación; o implica curación de heridas, angiogénesis o diabetes.

10. El péptido estructuralmente restringido para el uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la enfermedad es cáncer colorrectal, mieloma múltiple, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro, cáncer de riñón, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de piel, cáncer de huesos, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer de páncreas, glioma, glioblastoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma renal papilar, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, leucemia, linfoma, mieloma o tumor sólido.

11. El péptido estructuralmente restringido para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde el agente terapéutico adicional es un compuesto anticancerígeno.

12. El péptido estructuralmente restringido para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en donde el péptido estructuralmente restringido y el agente terapéutico adicional se administran simultánea o secuencialmente.

13. El péptido estructuralmente restringido para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en donde el péptido estructuralmente restringido y el agente terapéutico adicional están unidos entre sí (es decir, un compuesto bifuncional).

14. Un método para identificar un compuesto que inhibe la unión de BCL9 a p-catenina, que comprende los pasos de poner en contacto un péptido estructuralmente restringido de un dominio HD2 de BCL9 (BCL9-HD2), que comprende al menos una argolla de hidrocarburo, con p-catenina y luego seleccionar moléculas pequeñas o compuestos que interrumpen la interacción entre dicho péptido estructuralmente restringido y p-catenina, en donde la argolla de hidrocarburo se posiciona para unir un primer aminoácido BCL9-HD2 seleccionado del grupo que consiste en Leu-351, Ser-352, Gln-353, Glu-354, Gln-355, Glu-357, His-358, Arg-359, Arg-361, Ser-362, Leu-363 , Thr-365, Leu-366, Ile-369, Gln-370, Met-372, Nle-372, Leu-373 y Phe-374 con un segundo aminoácido BCL9 HD2 seleccionado del grupo que consiste en Leu-351, Ser-352, Gln-353, Glu-354, Gln-355, Leu-356, Glu-357, His-358, Arg-359, Glu-360, Arg-361, Ser-362, Leu-363, Gln-364, Thr-365, Leu-366, Arg- 367, Asp-368, Ile-369, Gln-370, Arg-371, Met-372, Nle-372, Leu-373 y Phe-374, en donde el péptido comprende una cara interactiva compuesta de aminoácidos que interactúa con la p-catenina, en donde la cara interactiva comprende los residuos BCL9 Gln-355, His-358, Arg-359, Ser-362, Leu-363, Leu-366, Ile-369, Gln-370, Leu-373 y Phe-374.